mgr biologii Jerzy Andrzej Sokal Z M I A N Y Z A W A R T O Ś C I I S T A N U 0 K S ¥ D O f i E D U K C Y J N E G 0 D W U N U K L E O T Y D 0 u I K 0 T Y N A M I D O A D E N I N O W Y C H W Z A T R U -0 I A C H O S T R Y C H N I E K T fi fi Y I I Z W I Ą Z K A M c H Ii M I C Z N Y M I
Praca na stopierf doktora nauk przyrodniczych wykonana w Zakładzie Biochemii Instytutu Medycyny Pracy w Łodzi
Promotor: JJoo. dr Leokadia Kłyszejko~3tefariowicz
R Ps i 7 7 4
Pani Docent Leokadii Kłyszejko-Stefanowicz składam serdeczne podziękowanie za przyjęcie obo wiązków promotora, wnikliwe przejrzenie tekstu,
przeanalizowanie i dyskusję wyników oraz cenną pomoo w przygotowywaniu rękopisu#
Panu Profesorowi Jerzemu Noferowi, Dyrektoro wi Instytutu Medycyny Pracy w Łodzi składam wyrazy wdzięczności za umożliwienie przeprowadzenia tych badazS w Instytucie.
Pragnę gorąco podziękować Pani Doktor Teresie Wrońskiej-Nofer, Kierownikowi Pracowni Biochemii Ogólnej oraz Panu Docentowi Jerzemu Piotrowskiemu, Kierownikowi Zakładu Biochemii za pomoc w czasie
prowadzenia badarf i cenne uwagi w czasie opracowy wania wyników#
u
S p i s t r e ś c i Wstęp
I
STRUKTURA. METABOLIZM I ROLA FIZJOLOGICZNA DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTY1I- AMIDOADENINOWYCH
1.1. STRUKTURA CHEMICZNA DWUflUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH 1.2. METABOLIZM DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH
1.2.1. Biosynteza dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych 1.2.1.1. Biosynteza NAD+ z nikotynianu
1.2.1.2. Biosynteza NAD+ z nikotynamidu 1.2.1.3. Biosynteza N A D f z tryptofanu
1.2.2. Rozkład enzymatyczny dwunukleotydów nikotynamidoadenino wych
1.2.2.1. Rozkład wiązania nikotynamid-ryboza /glikohydrolaza NAD+ , 3.2.2.5/
1.2.2.2. Rozkład wiązania pirofosforanowego /nukleotydohydro- laza dwunukleotydu, 3,6.1.9/
1.2.2.3. Inne drogi rozpadu NAD+
1.3. ROLA DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH W METABOLIZMIE KOMÓRKOWYM
1.3.1* Dwunukleotydy nikotynamidoadeninowe .lako koenzymy proce sów oksydoredukcy.lnych
1.3.2. Udział dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w metabo lizmie komórkowym .jako czynnika działającego na innej zasadzie niż oksydoredukc.la rdzenia pirydynowego niko- tynamldu
BADANIA MAD OZNACZANIEM DWUNUKLEOTYDÓW N IKOTYN AMIDOADEI'1INOWYCH W TKANKACH SZCZURA
11.1. PRZEGLĄD METOD OZNACZANIA DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADENI- NOWYCH W TKANKACH /DANE Z PIŚMIENNICTWA/
11.1.1. Ekstrakcja dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych z tkanek
11.1.2. Rozdział czterech postaci dwunukleotydów nikotynamido adeninowych /NAD^, NADH+H*. NADP*« NADPH+H*/ w ekstrak tach tkankowych
11.1.3. Ilościowe oznaczanie rozdzielonych dwunukleotydów niko- tynamidoadeninowych w ekstraktach tkankowych
11.1.3.1. Metody recykliczne 11.1.3.2. Metody bezpośrednie
11.1.4. Zawartość dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych
w tkankach szczurów /rozmieszczenie wewnątrzkomórkowe/ 11.2. MODYFIKACJA METODY FLUORYMETRYCZNEJ OZNACZANIA DWUNUKLEOTY DÓW NIKOTYN AMIDO ADEi) IN OWYCH; WARUNKI ROZDZIELNEGO OZNACZA NIA WSZYSTKICH POSTACI DWUNUKLEOTYDÓW /NAD+, NADH+H+ , NADP+ , NADPH+H+ W WĄTROBIE SZCZURA
11.2.1. Zasada metody 11.2.2. Parametry metody
II.2.2.1. Ekstrakcja dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych z wątroby
, II.2.2.2. Rozdział NAD+ od NADP+ oraz NADH+H+ od NADPH+H+ w ekstraktach tkankowych
11.2.2.3. Wywoływanie i pomiar fluorescencji rozdzielonych dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych
11.2.2.4. Wpływ warunków rozkładu NADP na odzyskanie NAD oraz fluorescencję próby zerowej
11.2.2.5. Odzyskanie wzorcowych roztworów dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych
11.2.2.6. Przechowywanie ekstraktów do analizy 11.2.3. Opis metody
11.2.3.1. Odczynniki i roztwory specjalne IIs2 {3»2. Materiał
11.2.3.3. Postępowanie przy oznaczaniu dwunukleotydów utlenionych /NAD+ , NADP4/
11.2.3.4. Postępowanie przy oznaczaniu dwunukleotydów zre dukowanych /NADH+H*, NADPH+H*/
11.2.3.5. Postępowanie przy pomiarze fluorescencji roztwo rów wzorcowych NAD+ i NADPH+II*
11.2.3.6. Obliczanie wyników
11.3. OZNACZANIE1 PLUOR'iMETRYCZNE DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAlvlIDOADE NIN OWYCH UTLENIONYCH /NAD+ + NADP+/ I ZREDUKOWANYCH /NADH+H* + NADPH+H4*/ WE KRWI SZCZURA
II.3.1. Zasada metody 11.3*2. Parametry metody 11.3.3. Opis metody
11.3.3.1. Odczynniki i roztwory specjalne 11.3*3.2. Materiał
11.3.3*3* Postępowanie przy oznaczaniu dwunukleotydów utle nionych /NAD+ + NADP+/
II.3.3.4* Postępowanie przy oznaczaniu dwunukleotydów zre dukowanych /MADH+H+ + NADPH+II+/
II.3.3.5* Obliczanie wyników
II.4. 0 ZEAGZAKIE FLUORYMETRYCZNE DWUNUKLEOTYDÓW NIKO TYNAMIDOADE-NINOWYCH UTLENIONYCH /NAD+ + NADP+/ I ZREDUKOWANYCH /NADH+Hf + NADPH+H+/ W MÓZGU SZCZURA
11.4.1. Zasada metody 11.4.2. Parametry metody
11.4.2.1. Wpływ zamrażania mózgu w ciekłym azocie na wyniki oznaczeń dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych przy zastosowaniu sposobu ekstrakcji stosowanego do wątroby i krwi
11.4.2.2. Dobór warunków ekstrakcji dwunukleotydów nikoty namidoadeninowych z mózgu zamrożonego dla ozna
czeń fluorymetrycznych i
11.4.2.3. Wpływ czasu trwania ischemii po dekapitacji na zawartość 1 stan oksydoredukcyjny dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w mózgu
11.4.3* Opis metody
11.4.3.1. Odczynniki i roztwory specjalne 11.4.3.2. Materiał
11.4.3.3. Postępowanie przy oznaczaniu dwunukleotydów niko tynamidoadeninowych utlenionych /NAD+ + NADPł/ i zredukowanych /NADH+H+ + NADPH+H*/
11.4.3.4. Obliczanie wyników
II. 5. ZAY/ARTOSc DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH W NIEKTÓ RYCH TKANKACH SZCZURÓW, KRÓLIKÓW I LUDZI
II.6. OMÓWIENIE BADAfo WŁASNYCH NAD OZNACZANIEM DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYBAMIDOADENINOWYCH
c
BADAMI A ZAWARTOŚCI I STANU OKSYDOR^DUKCYJNKGO jjWUMj t l L ^
TYKAMIDOAT)ENINOWYCH W TRAWKACH SZCZURv)W W ZATRUCIACH._Q_^RXęiŁilJJ=. KTÓRYMI SUBSTANCJAMI TOKSYCZNYMI OKAZ W WARUNKACH D 0 ^ L I M G M I i ™ 2 NIEDOTLENIENIA
111*1. DANE Z PIŚMIENNICTWA NA TEMAT WPŁYWU ZWIAZK&W CHEMICZNYCH
I CZYNNIKbW FIZYCZNYCH NA ZAWARTOŚĆ I METABOLIZM DW1JNUKLEO-
TYDbw NIKOTYN AMIDOADENINOWYCH
111.1.1. Wpływ związków chemicznych o działaniu rakotwórczym na zawartość i. przemianę dwunukleotyłów nikot.ynamldo- adeninowych
111.1.2. Wpływ związków chemicznych uszkadzających wątrobę na zawartość.i przeraianę w te.i tkance dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych
III.1*3. Wpływ inhibitorów metabolicznych na zawartość i stan okgydoredukcyjny dwunukleotydów nlkotynamidoadenino- w.ych
III. 1.4. Y/pływ promieniowania .jonizującego /X/ na zawartość i metabolizm dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych III.2. ZMIANY ZAWARTOŚCI I STANU OKSYDOREDUKCYJNEGO DWUNUKLKOTY-
Dbw NIKOTYNAMIDOADEKIŁOWYCH W TKANKACH SZCZURÓW W OSTRYM ZATRUCIU C Z TERO ETYLKIEM OŁOWIU
111.2.1. Wprowadzenie 111.2.2. Sposób badania III.2.3* Wyniki
f
111.3. m IANY ZAWARTOŚCI I STANU OKSYDOREDUKCYJNEGO DY/UNUKLEÓTY- Dbw NIKOTYN/MIDOADENINOWYCH W TKANKACH SZCZURÓW W OSTRYM ZATRUCIU GAZEM ŚWIETLNYM /TLENKIEM WĘGLA/
111.3.1. Wprowadzenie 111.3 .2 . Sposób badania III.3.3* Wyniki
111.3.4. Omówien ie wyników i wnioski
111.4. ZMIANY ZAWARTOŚCI I STANU OKSYDOREDUKCYJNEGO DWUNUKLEOTY-
d5\Y NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH W TKANKACH SZCZURÓW W OSTRYM ZATRUCIU AKRYLONITRYLEM
111,4*1* Wprowadzenie 111,4.2* Sposób badania III.4.3* Wyniki
111.4.4. Omówienie wyników i wnioski
111.5. ZMIANY ZAWARTOŚCI I STANU OKSYDOREDUKCYJNEGO DWUNUKLEOTY- DbW NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH W TKANKACH SZCZURÓW W OSTRYM
ZATRUCIU TRbj- I C Z T ERO CHLO RO ETYL EN EM III.5*1• Wprowadzenie
111.5.2. Sposób badania 111.5.3. Wyniki
111.5.4. Omówienie wyników i wnioski
111.6. ZMIANY ZAWARTOŚCI I STANU OKSYDOREDUKCYJNEGO DWUNUKLEOTY- Dbw NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH W WARUNKACH DOŚWIADCZALNEGO NIEDOTLENIANIA
III.6.1., Wprowadzenie III.6.2. Sposób badania
III
III.6.3. Wyniki
111*6*4. Omówienie wyników., i^wpioskl. 7. DYSKUSJA OGÓLNA
ADH s dehydrogenaza alkoholowa DCPIP = 2,6-dwuchlorofenoloindofenol
DH * dehydrogenaza
13*4 Pb » czteroetylek ołowiu /fit3Pb/+ S trójetylek ołowiu G-6-P = D-glukozo-6-fosforan GSH glutation zredukowany GSSG = glutation utleniony LDH s dehydrogenaza mleczanowa M.F. s metosiarczan fenazoniowy MA =3 nikotynian MAm ss nikotynamid MMN ZX nikotynamidomononukleotyd P «• ortofosforan
PRPP S 5-f osf o- Ą -D-i^ybozy lo-1 -pirof osf oran
TCA s kwas trójchlorooctowy 6-P-glukon ss 6-fosfo-D-glukonian
Nomenklatura enzymów omawianych w pracy /wg zaleceń Międzynarodowej Onii Biochemicz
nej z roku 1964 dotyczących nomenklatury i klasyfikacji enzymów/
\
Ł.p. Numer Nazwa systematyczna Nazwa potoczna
1 . 1 . 1 . 1 . 1 . oksydoreduktaza alkohol: NAD dehydrogenaza alkoholowa 2 . 1 . 1 «1 . 8 . oksydoreduktaza L-glice- ro-3-fosforan: NAD dehydrogenaza glicero- 3-fosforanowa 3. 1 . 1 . 1. 27. oksydoreduktaza L-mle- czan: NAD dehydrogenaza mleczano- wa 4. 1 . 1 . 1. 37. oksydoreduktaza L-jabł- czan: NAD dehydrogenaza jabłcza- nowa 5. 1 . 1 . 1 . 40. oksydoreduktaza L-jabł-
czen: NADP+ /dekarboksy- lująca/
dehydrogenaza jabłcza- nowa /dekarboksylująca/ /NADP+/
6 . 1 . 1 . 1. 42. oksydoreduktaza tr^o-D^
izocytrynian: NADP /de- karboksylująca/
dehydrogenaza izocytry- nianowa /NADP+/
7. 1 . 1 . 1. 44. oksydoreduktaza 6-fosfo~
D-glukonian: NADP /de- karboksyluj ąca/
dehydrogenaza fosfoglu- konianowa /dekarboksy lująca/
8 . 1 . 1 . 1 . 49. oksydoreduktaza D-g|uko-
zo-6-fosforan: NADP'
dehydrogenaza glukozo- 6-fosforanowa 9. 1 . 2 . 1 . 1 2 . oksydoreduktaza alde hyd 3~fosfo-D-glicerynowy: NAD /fosforylująca/ dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego, de hydrogenaza triozofosfo- ranowa 1 0 . 1 . 2 . 4. 1 . oksydoreduktaza pirogro-
nian; liponian /acetylu- jąca akceptor/ dehydrogenaza pirogronia- n owa 1 1 . 1 . 3. 99. 1. oksydoreduktaza burszty- nian: /akceptor/ dehydrogenaza bursztynia- nowa 1 2 . 1 . A. 1. 3. oksydoreduktaza L-gluta- minian: NAD+/P//dezami nuj ąca/ dehydrogenaza glutami- nianowa /ŃAD+/Py/ 13. 1 . A. 3. 4. oksydoreduktaza monoami-
na: tlen /dezaminująca/
Ł.p. Numer Nazwa systematyczna Nazwa potoczna
14. 1 . 6 . 4. 2 . oksydoreduktaza zreduko
wany NAD/{# utleniony glu- tatlon
reduktaza glutationowa
15. 1 . 6 . 99. 1> oksydoreduktaza zreduko
wany NADP: /akceptor/
dehydrogenaza zreduko wanego NADP
16. 1 . 6 . 99. 3. oksydoreduktaza zreduko
wany NAD: /akceptor/
dehydrogenaza zreduko wanego NAD 17. 1 . 9. 3. 1. oksydoreduktaza ferro- cytochrom c: tlen oksydaza cytochromowa 18. 1 . 13. 1. 6 . oksydoreduktaza 3-hydrok- syantranilan: tlen oksygenaza 3-hydroksy- antranilanowa 19. 1. 14. 1 . 2 . oksydoreduktaza L-kinure-
nina, zredukowany NADP:
tlen /3-hydroksylująca/
3-hydrcksylaza kinure- ninowa
20. 1 . Brak Brak reduktaza cytochromu
P-450 /raikrosomalna/ oksydoreduktaza NADPH+H+ ; cytochrom P-450 /mikro- somalna/
2 1 . 1 . Brak Brak reduktaza cytochromu
P-450 /mitochondrialna/ oksydoreduktaza NADPH+H+ : cytochrom P-450 /mito chondrialna/ 2 2 . 2 . 4. 2 . 1 1 . fosforybozylotransfera- za nukleotyd nikotynia- nowy: pirofosforan fosforybozylotransfera za nikotynianowa 23. 2 . 4. 2 . 1 2 . fosforybozylotransferaza nukleotyd nikotynamidowy: pirofosforan pirofosforylaza NMN 24. 2 . 7. 1. 23. 2*-fosfotransferaza ATP: NAD* kinaza NAD*
25. 2 . 7. 1. 40. fosfotransferaza ATP: pi-
rogronian kinaza pirogronianowa 26. 2 . 7. 5. 1 . fosfotransferaza «>c-D-glu- kozo-1 ,6-dwufosforan: ot-D-glukozo-1-fosforan fosfoglukorautaza, fosfo- mutaza glukozowa 27. 2 . 7. 7. 1. adenylilotransferaza ATP: NMN pirofosforylaza NAD+
L.p. Numer Nazwa systematyczna Nazwa potoczna 28. 2 . 7. 7. 1 8 . adenylilotransferaza ATP: nikotynianomononukleotyd pirofosforylaza dezami- do-NAD+ 29. 2 . Brak fosforybozylotransfera-za chinolinianowa 30. 2 . Brak rybozylotransferaza nukleotyd nikotynamido- w y: ortofosforan 31. 3. 1 . 1 . 8 . acylohydrolaza acylocholi- ny cholinoesteraza
32. 3. 2 . 2 . 5. glikohydrolaza NAD+ nukleozydaza NAD+
33. 3. 5. 4. 4. aminohydrolaza adenozyny dezaminaza adenozynowa
34. 3. 6 . 1 . 1 . fosfohydrolaza pirofosfo- pirofosfataza nieorga
ranu niczna
35. 3. 6 . 1 . 3. fosfohydrolaza ATP ATPaza
36. 3. 6 . 1 . 9. nukleotydohydrolaza dwu-
nukleotydu
pirofosfataza nukleoty- dowa
37. 3. 7. 1. 3. hydrolaza L-kinureniny kinureninaza
38. 3 . Brak amidohydrolaza
nikotyn-arnidu /dezamidaza niko- tynamidu/
39. 3. Brak fosfohydrolaza
rybonu-kleotydu nikotynianowe-go 40. 4. 1 . 2 . 13. D-gliceraldehydo-3-fosfo- rano-liaza fruktozo-1 ,6- dwufosforanu aldolaza fruktozo-dwu~ fosforanowa
41. 4. Brak karboksylaza pikolinia-
nowa
42. 6 . 3. 5. 1 . amido-ligaza dezamido-NAD+ :
L-glutamina /AMP/
Struktura chemiczna leków omawiaaych w pracy
Nazwa farmakologiczna Struktura chemiczna
Cetab bromek cetylotrójmetyloamoaiowy ♦ / - CH3 CH3-/CH2 / 15 -K<" CH^ . Br" Fenobarbital 5-etylo-5-feaylobarbituran ^ C O - NIK Halotan 2-bromo-2-chloro-1 #1 f1-trójfluoroetan F Br • I F » C - C - H I I F Cl Kardiazol 1 ,5-pentomdtylenotetrazol f a - ch2 - CH2 X - N CH2 - CB2 - C C l N - N Ksylokaina «£-dwuetyloamino-2 f6-dwumetyloacetanilid CH, I 3 2 5\ J V _ > » - CH2 - CO - NH— 'p C2H5 1---. _________ . . CH3 ______
Largaktil 2-chloro-10~/3-dwumetyloaminopropylo/~feno-tiazyna
LSD
dwuetyloamid kwasu lizergowego
Nuperkaina Prometazyna 2-butoksy-chinolino~4-karboksy-/5-dwu-etyloamlnoetyloamid c2h5 C2H5 10-/2-dwumetyloaminopropylo/-fenotlazyna / CH3
\
CH, Rezorcyna m-dwuhydroksybenzen V OH Uretanester etylowy kwasu karbaminowego
Ą f
Wykaz wzorów stosowanych do analizy statystycznej wyników /wg W.Ok.tabyt Elementy statystyki matematycznej i metodyka doświadczalnictwa, PWN, Łódź— Warszawa 1965, str. 124 oraz wg T.Dutkiewicza, I.Kęsy-Dąbrowskiej i J.Pio trowskiego; Oznaczanie związków toksycznych w powietrzu, PZWL, WarBzawa 1965, str. 40/.
1. Średnie standardowe odchylenie / d % S.D./ obliczano według wzoru;
w którym; x - wynik określonego oznaczenia w grupie, x - średni wynik całej grupy, n - liczba oznaczeń w grupie*
2. Precyzję oznaczenia wyliczano przy użyciu wzoru:
v / = - f - 100
W którym; V /a,, - precyzja oznaczenia /współczynnik zmienności/ w procen-
/aY
tach, Sa - średnie standardowe odchylenie współczynnika kalibracji, a - średnia wartość współczynnika kalibracji.
3. Oceny istotności różnic w wariancjach porównywanych grup oznaczeń do konywano przy użyciu testu F Snedecora o funkcji testowej postaci:
pO _ £ a - x / 2 . E /i-x/2
V ~ - 1 ! n2 - 1
gdzie: n^ i n2 - liczba oznaczeń w porównywanych grupach, l^/x-x/ 2 i
X7 y - y/ 2 - sumy kwadratów odchyleń od średnich w porównywanych grupach.
Wartość graniczną ^ odczytywano z tablic F Snedecora przy k^ = n^-1
* ^2 = rł2“' 1 stopniach swobody.
Jeżeli F° F,-. .. , to możemy wnioskować, że różnice w porównywanych
wariancjach są istotne statystycznie.
Jeżeli F° FQ Q^, to brak podstaw do wnioskowania o istotnych różni
/ t c
4. Ocena istotności dla różnicy wartości średnich porównywanych grup: a/ Jeżeli wariancje dwóch porównywanych grup oznaczeń nie różniły się
istotnie, to stosowano test istotności t Studenta o funkcji testowej postaci:
Wartcćć graniczną tQ odczytywano z tablic t Studenta przy
k * n^+ Bg - 2 stopniach swobody
V Jeżeli wariancje dwóch porównywanych grup oznaczeń różniły się is totnie, to stosowano test istotności Cochrana~Coxa oparty na funkcji
testowej postaci:
C° = — i. i V Z1 ♦ *2
gdzie: z. = , . z _ ~ y/f
*> “1/n1- V * 2 - n2/ a 2 - 1/
Wartość graniczną wyliczano według wzoru:
C - V l + *2*2
0,05 " z^ + z2
w którym t^ i tg - wartości graniczne odczytywane z tablic t Studenta
Pr*y k^ = n1 - 1 i k2 s n2 -1 stopni swobody.
leżeli C > C 0 ^05, to możemy wnioskować, że różnica jest istotna statys- yczniej J®żeli C ^ CQ ^Q^ t to brak podstaw do wnioskowania o istotnych róż- Qicach w średnich porównywanych grup.
We wszystkich analizach statystycznych przyjmowano, że różnica dwóch średnich jest istotna, jeżeli P <0,05.
W S T Ę P ł
W poszukiwaniu mechanizmu zatruć różnymi związkami chemicz nymi wiele uwagi przykładano do zmian aktywności poszczególnych enzymów i układów enzymatycznych. W tej pracy postanowiono zwró cić uwagę na koenzymy, niezbędne do prawidłowego funkcjonowania całych grup enzymów.
Wybrane do badań trucizny /czteroetylek ołowiu, akrylonitryl, gaz świetlny, trój- i czterochloroetylen/ różnią się strukturą chemiczną, właściwościami fizycznymi oraz typem działania na ustrój, jednak we wszystkich przypadkach wykazano lub sugeruje
się istotną rolę zaburzeń przemiany glukozy w biochemicznym me chanizmie powstawania wywoływanych przez nie zatruć. Ponadto wy mienione trucizny stanowią obecnie istotny problem w praktyce
toksykologicznej. Wychodząc z tych przesłanek postanowiono zbadać zachowanie się dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych, koenzymów przemiany glukozy w tkankach zwierząt, w doświadczalnych zatru ciach ostrych powyższymi związkami toksycznymi.
Dla rozwiązania tego zagadnienia okazało się konieczne opra cowanie metod oznaczania dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych umożliwiających w naszych warunkach badania rutynowe tych koenzy mów w tkankach wybranych do doświadczeń /krew, wątroba, mózg/.
Z kolei możliwe było postawienie pytania, czy w trakcie ostrych zatruć badanymi związkami toksycznymi dochodzi do zmian zawartości i stanu oksydoredukcyjnego dwunukleotydów
nikotynami-doadeninowych, mając na względzie możliwość oceny zarówno stopnia zatrucia jak i mechanizmu biochemicznego działania odnośnych tru cizn.
Wobec niedostatku w piśmiennictwie prac dotyczących dwunukleo tydów nikotynamidoadeninowych w aspekcie problemów toksykologicz nych, podjęte badania miały również ogólnie wskazać na możliwości zastosowania oznaczeń tych koenzymów do rozwiązywania konkretnych zagadnień biochemii ostrych zatruć.
STRUKTURA. METABOLIZM I ROLA FIZJOLOGICZNA DWUNUKLEOTYpUW MUtOTYHAMIDOADEMIMOWYCH
1.1. STRUKTURA CHEMICZNA DMEUKLEOTYDbW NIKOTYNAMIDOADEMIHOWYCH Istnienie termostabilnego, dializującego czynnika niez będnego do przebiegu procesu fermentacji alkoholowej drożdży zostało dostrzeżone po raz pierwszy przez Hardena i Younga już w 1904 r, Jednakże wyizolowanie tego kofaktora w stanie czys
tym, zidentyfikowanie odrębności chemicznej NAD+ i NADP+
i określenie ich funkcji biologicznej nastąpiło dopiero w la tach trzydziestych naszego stulecia w laboratoriach von Eulera i Warburga /por. poz. 4 3,1 4 4/.
Ogólnie przyjętą obecnie budowę chemiczną dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych utlenionych i zredukowanych przedsta wia rysunek 1. Została ona potwierdzona drogą syntezy chemicz nej /103,116/. Uo zaproponowanych przez von Eulera 1 Warburga wzorów chemicznych dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych wprowadzono w dalszych latach szereg uzupełnień. Stwierdzono,
że obydwie pentozy w cząsteczce dwunukleotydu są ugrupowaniem L-rybozy /242/ dodatkowa grupa fosforanowa w cząsteczce MADP* jest związana z atomem C-2 rybozy w adenozynie /160/, a reduk cja cząsteczki dwunukleotydu następuje w pozycji para rdzenia nilcotynamidu /HAm/ /18,60,178,190,231/. N-glikozydowe wiązanie obydwu mononukleotydów ma konfigurację przestrzenną*3/52,116,
144/. Dwunukleotydy zredukowane mają konfigurację zagiętą /folded configuration/, w której pierścień dwuhydropirydynowy i adenina są ułożone naprzeciwko siebie /rys. 2/ /4 3,1 3 4,195, 282/. Sugerowano nawet istnienie wewnątrzcząsteczkowego
kompleksu, w którym grupa aminowa adeniny mogłaby być połą czona wiązaniem wodorowym z tlenem grupy karboksyamidowej
NAm /43,282/. Prawdopodobnie zbliżoną konfigurację zagiętą po
siadają również utlenione postacie dwunukleotydow nikotynami— doadeninowych /43,134/. Jest ora charakterystyczna dla dwunu kleotydów nikotynamidoadeninowych wolnych / nie związanych
2 białkiem /. Sugeruje się możliwość zmiany konfiguracji przestrzennej tych koenzymów przy wiązaniu z białkiem enzyma tycznym /43,134/. W tym wypadku następowałoby "wyprostowanie" cząsteczki /open configuration/.
Nomenklatura dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych zosta ła ujednolicona w r. 1964 przez Komisję Enzymową Międzynarodo wej Unii Biochemicznej /'63/. Zalecane przez nią nazwy oraz sy nonimy stosowane w przeszłości zestawia tablica 1.
Rys.
i *
OH R
• Struktura chemiczna dwunukłaotydów nikotynamidoadeninowych
I - dwunukleotydy utlenione, NAD+,R = -OH, NADP*,R * -OPO/OH/g II - pierścień dwuhydropirydynowy postaci zredukowanych
Rys. . Proponowana zagięta konfiguracja /folded c o n figuration/
Ą ~ NADH
Płaszczyzny pierścieni adeniny i NAai są ułożone rownolegla do płaszczyzny papieru; NAro powyżej, natomiast adenina po niżej tej płaszczyzny. Wiązania pozostałych składników czą steczek są ułożone w innej płaszczyźnie i dlatego mają róż ną długość na rysunku# Wg Velicka /cyt. wg 43/
Nomenklatura dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych wg zaleceń Międzynarodowej Unii Biochemicznej z roku 1964 dotyczących no menklatury i klasyfikacji enzymów /63/
Nazwa polecana Synonimy historyczne
dwunukleotyd nikotynamido- adeninowy /NAD, HAD+/
kozymaza, kodehydrogenaza I, koenzym I /Co I/, nukleotyd dwufosfopirydynowy /DPN/
fosforan dwunukleotydu niko- tynamidoadeninowego /NADP, n a d p+/
fosfokozymaza, kodehydrogenaza II, koenzym II /Co II/, nukleotyd trój- fosfopirydynowy /TPN/
•iwunukleotyd nikotynamidoade- kinowy zredukowany /NADH+H* ,
edukowany NAD /
nukleotyd dwuhydrodwufosfopirydynowy, nukleotyd dwufosfopirydynowy zredu kowany /DPNH, DPNHg/
1.2. METABOLIZM DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYN A M I D OADENINOWYCH 1*2.1. Biosynteza dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych
Historia badań nad mechanizmem biosyntezy dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych liczy około 20 lat. Na obecnym etapie badań przyjmuje się, że NAD"*" jest syntetyzowany w tkankach ssa~ ków z trzech prekursorów? nikotynianu /NA/» NAm i tryptofanu /■J22„123/ /rys.3/.
1.2,1.1. Biosynteza NAD* z nikotynianu. Mechanizm syntezy KAD+ z tego prekursora został ustalony w 1958 r • w laboratorium Handlera i Preisa /228,229/ i do tej pory jest powszechnie
i akceptowany /rys.3, tf.l i .2 etap 2,3,4/. Punktem wyjścia w bio syntezie NAD z NA je&t jego reakcja z 5-fosfo-«^-D-rybozylo-Pirofosforanem /PRPP/:
NA ■+ : rybonukleotyd nikotynianowy + pirofosforan /PP/ Ten etap jest katalizowany przez fosforybozylotransferazę nulcleotyd nikotynianowy : PP i jak wykazano później /127/ wymaga obecności ATP. Powstały rybonukleotyd nikotynianowy w reakcji z A'l:p przy Udziale jonów Mg++ ulega przekształceniu do dezami-do-NAD+ ;
ATP • rybonukleotyd nikotynianowy = PP + dezamido-NAD+
Enzym warunkujący ten proces /adenylilotransferaza ATP:
1'Aikotynianomononukleotyd/ jest prawdopodobnie identyczny z wy izolowaną wcześniej /157/ adenylilotransferazą ATPtNMN, katali- zującą reakcję rybonukleotydu nikotynamidowego /NMN/ z ATP /229/.
Ostatnim etapem syntezy KAD"* jest amidacja dezamido-NAD+ Przy udziale amido-ligazy dezamido-WAD+ t L-glutamina /AMP/,
jonów Mg++ i K+ :
ATP + dezamido-KAD+ + L-glutamina + HgO * AMP + PP + MAD+ + L-glutaminian
In vitro glutamina może być zastąpiona przez amoniak, jednak w warunkach in vivo stężenie amoniaku wydaje się być zbyt niskie do przeprowadzenia tej reakcji /229/.
** |aTP, 6ŁuHHt
InaŁP*! 4-^- (
NAP*]-*--Biosynteza dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach ssaków
Do schematu wprowadzono proces dezamidacji NAm /etap 1/ oraz fosforylacji NAD+ /etap 5/« Opis poszczególnych etapów przed stawiono w tablicy 2. Wg Ichiyamy i wsp. /122/
Biosynteza dwunukleotydów nikotynaaldoadonlnowych w tkankach ssaków, mechanizm enzyaatyceny reakcji pośrednich /aestawienie własne s danych piśmiennictwa/ W rubryce "aubstraty" podano w nawiasach donatory odpowiednich grup
Nr ata-pu blo- Hjnta*» /r»s.3/
Subatraty Produkt Enzym katalizujący
reakcje koeuzyay i ko lektory reak cji Piśmiennictwo 1. NAm NA amidohydrolaza nlkotynaaidu Petrack i wsp. /222,223*224/ Ichiyaaa i wsp. /123/
2. NA/PRPP/ rybonukleotyd niko-
tynianowy
fosforybozylotrans- feraza nikotynianowa
ATP, Mg**
3. rybonukleotyd
nlkotynlanowy /ATP/ dezamido-NAD+
pirofosforylaza
dezamido-NAD Mg**
Pralaa 1 wap, /228, 229/
4. de*aaldo-NAD*
/glu-NH2,ATP/ NAD* B y n U t a i a NAD* M g * \ K+ •
5. NAD* /ATP/ NADP* Klnaia NAD* Mg** Hang 1 wap./279,280/
Korobarg /158/
6. kinuranina >**hydroksykinurenina 3-hydroksyla«a kinu-
reninowa NADPH+H*, ryboflawina Kapłan /-W5/ 7. 3-hydroksyklnure-nlna
3-hydroksyantranilan klnurenlnaza fosforan pi-
rydoksalu Oplenska- Blauth 1 wap. /215/ Ichiyana 1 wap. / 1 2 V 8. 3-hydroksyantrani-lan aemiald«hydo-2~a«iino- -3-karboksyaukonian oksygenaza 3-hydro-
ksyantrani łanowa Fe**
9.
semialdehydo-2-ami-no-3-karboksyaukonian chlnollnian reakcja spontanicz
na -Ichlyo.a 1 wap. /122/ Nlshltuka 1 wap 10. chlnollnian /PRPP/ rybonukleotyd nlkotynlanowy fosforybozylotrans- feraza chlnollnianowa Nakaaura i wsp. /200/ 11. NA*/PRPP/ NMN pirofosforylaza NMN
Mg**, ATP Preisa i wap.
/227/
12. NMN /ATP/ NAD* pirofosforylaza
NAD
Mg** Kornberg
Jest interesujące, że fosforybOzylotransferaza nukleotyd nikotynianowy: PP i amido-ligaza dezamido-HAD+ : L-glutamina
/AMP/ Są zlokalizowane we frakcji rozpuszczalnej komórki /127, 229/ natomiast adenylilotransferaza ATP: nikotynianomononukle- otyd w jądrach komórkowych /198,229/. W ten sposób utworzony w cytoplazmie rybonukleotyd nikotynianowy przekształca się w ją
drach w dezamido-NAD+ , który znowu w cytoplazmie podlega amida- cji do M i r ,
HA jest najbardziej efektywnym prekursorem syntezy WAD+ in vivo w mózgu, wątrobie i erytrocytach ssaków /53,104,123, 124,227,228/. Aktywność fosforybozylotraneferazy nukleotyd ni kotynianowy: PP wykazano we wszystkich badanych tkankach i na rządach /9 4,1 0 4,1 2 5,1 2 7,2 2 9/, Przy czym w wątrobie przewyższa ona znacznie aktywności stwierdzone w innych tkankach /nerka, mięsień sercowy, mózg, gruczoły mleczne, śledziona, mięsień
szkieletowy, jądra, jelita, płuca/ wymienionych w kierunku mniejszej aktywności /104,125/•
Brak ścisłych informacji na temat ilościowego udziału tej drogi biosyntezy HAD+ in vivo w większości tkanek poza wątrobą, krwią i mózgiem. Wiadomo jedynie, że w gruczołach mlecznych HAD+ nie powstaje z tego prekursora /94/ z powodu braku amido-
ligazy dezamido-NAD+ : L-glutamina /AMP/, natomiast w komórkach raka Ehrlicha pełni prawdopodobnie rolę podrzędną w biosyntezie
tego koenzymu /9 7/ •
Fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego powstaje w organizmie w wyniku fosforylacji N A D ł przez V -fosfotranste-
ATP + NAD+ « ADP + NADP*
Enzym izolowany z drożdży katalizuje fosforylacja zarówno NAD+ jak i NADH+H+ /158/, enzym z wątroby wyłącznie M D -1 /279/.
1*2*1*2. Biosynteza NAD+ z nikotynamidu. Włączanie tego pre kursora w cząsteczkę NAD* może zachodzić dwiema drogami: bezpoś rednio, przez włączanie cząsteczki NAm do NADf /rys. 3» tabl. 2» etap 1 1 i i pośrednio po dezamidacji do MA /rys. 3» tabl. 2, etap 1,2,3,4/.
Wcześniej poznano mechanizm bezpośredniego włączania czą steczki NAm do NAD* /157,227/. Pierwszą reakcją jest utworzenie NMH z NAm i PRPPt
NAm + pbpp «
mm
+ PPReakcję tę katalizuje fosforybozylotransferaza nukleotyd nikotyn- amidowy: PP /227/ i wykazano odrębność tego enzymu od
fosforybozylotransferazy nukleotyd nikotynianowy: PP /56,57,229/. Adenylilotransferaza ATP:NMN /157/ w reakcji z ATP prze kształca w NAD'f powstały NMN5
ATP + NMN = PP + NAD+
Aktywność fosforybozylotransferazy nukleotyd nikotynamidowy: ^P wykazano we wszystkich badanych tkankach i narządach /56,57, 94,104,125/ lecz jest ona na ogół znacznie niższa od aktywności fosforybozylotransferazy nukleotyd nikotynianowy: PP /104.125/.
Ta droga biosyntezy NAD+ , chociaż najwcześniej poznana, by ła uważana do niedawna za nieefektywną w warunkach in vivo, ze W2ględu na małe powinowactwo fosforybozylotransferazy nukleotyd
nikotynamidowy: PP do substratu /53 , 2 2 1 / • Wykazano istotnie, że
4*
w wątrobie i mózgu udział tego mechanizmu w biosyntezie NAD
in vivo jest minimalny /53»104* 124,202/, jednak ostatnio sugeru- 3© się znaczną jego rolę w innych tkankach /56»57»94»97/» Udo wodniono np., że w gruczołach mlecznych jest to jedyna droga biosyntezy NAD+ /94/ natomiast w komórkach raka Ehrlicha - rów noważna lub przeważająca /97/.
Drugą, tj. pośrednią drogą biosyntezy NAD+ z NAm jest jego dezamidacja z kolejną inkorporacją powstałego NA w cząsteczkę NAD+ opisanym szlakiem Handlera i Preisa /228,229/ /rys.3» tabl.
2 » etap 1,2,3,4/. Mechanizm ten sugerowany wcześniej dla ssaków "tylko na podstawie dowodów pośrednich /171»202/ zyskał realne
Potwierdzenie po zidentyfikowaniu enzymu /amidohydrolaza nikotyn- amidu/ odpowiedzialnego za tę reakcję /1 5 3*2 2 2,2 2 3*2 7 0/ i uwa żanego za regulatora syntezy NAD+ in vivo /222,223/» Ilościowa rola procesu dezamidacji NAm w biosyntezie NAD* nie jest jeszcze zupełnie jasna. Według Petrack i wsp. /222,223,224/ dezamidacja NAm w wątrobie jest źródłem NA jako prekursora syntezy NAD* dla tego narządu jak i dla innych tkanek. Natomiast Ichiyama i wsp. /104,123,124/ uważają, że in vivo dezamidacja NAm w wątrobie nie ma decydującego znaczenia w biosyntezie NAD*, natomiast istotny
biologicznie proces dezamidacji zachodzi w przewodzie pokarmowym /104,123,124/. Jednak aktywność amidohydrolazy nikotynamidu
w innych tkankach jest tak niska lub niewykrywalna /94,153/, że według niektórych /94/ ten szlak biosyntezy NAD+ ma ograniczone
znaczenie w tkankach pozawątrobowych.
- a
-ilości dowodów pośrednich /możliwość zastępowania HA w diecie, zwiększanie metabolitów NA w moczu i poziomu NAD* w tkankach zwierząt obciążonych tryptofanem/ i bezpośrednich /zidentyfiko wanie znaczonego węgla i azotu w metabolitach NA i w cząsteczce NAD*/ wiadomo, że tryptofan jest prekursorem dwunukleotydów ni kotynamidoadeninowych w tkankach ssaków /104,105,107,106,140,
165,235,244/. Wprawdzie mechanizm przemiany tryptoianu do 3-hy~ droksyantranilnu był od dawna akceptowany /por. poz. 145,21.5/, nie było jednak dostatecznych dowodów na powstawanie z tego me
tabolitu wolnego NA /122.194,207,215/. Intensywne badania w os tatnich latach grupy japońskich uczonych wyjaśniły przemianę 3-hydroksyantranilanu i mechanizm syntezy NAD* z tryptofanu w tkankach ssaków /77,104,121,122,123,124,207,208/ /rys. 3, tabl. 2/. Według tych autorów przemiana semialdehydo-Samino-3-karboksymukonianu zachodai in vivo u ssaków w trzech kierun kach:; 1/ do chinolinianu /reakcja spontaniczna/, 2/ do pilcoli- nianu /reakcja katalizowana przez karboksylazę pikolinianową/
oraz 3/ do glutaranu. Możliwość tworzenia wolnego NA według ■tych autorów nie istnieje /207/.
Chinolinian w reakcji z PRPP ulega przekształceniu do rybo- nukleotydu nikotynianowego. Specyficzny enzym, katalizujący tę
reakcję zoBtał w znacznym stopniu /1500 razy/ oczyszczony /76/ i nazwany fosforybozylotransferazą chinolinianową. Jest on zlo kalizowany we frakcji rozpuszczalnej komórki /207/. W ten spo
sób na etapie rybonukleotydu nikotynianowego łączy się szlak biosyntezy NAD* z tryptofanu oraz z wolnego NA /rys. 3, tabl. 2, etap 2 i 10/
Tryptofan i chinolinian są bezpośrednimi prekursorami jedynie w wątrobie i w nerce ssaków ponieważ aktywność foeforybozylotransferazy chinolinianowej stwierdzone tylko w
tych narządach /104.125/. Jednak ze względu na wysoką aktywność tego enzymu wysunięto spekulatywną hipotezę /122/, że inn
tkanki mogą korzystać z M uwolnionego z rybonukleotydu niko- tynionowego lub I\lAD+ . Przy niskim stężeniu ATP, MA może uwalniać się w wyniku enzymatycznego rozkładu rybonukleotydu nikotynia- nowego do rybonukleozydu nikotynianowego pod wpływem odpowied niej fosfohydrolazy rybonukleotydu nikotynianowego z następ
czym fosforolitycznyra rozkładem tego związku do BA i rybozylo- 1-fosforanu /122/. Ci sami badacze sugerują /122/, fce szybkosć biosyntezy MAD+ z tryptofanu jest zależna od stężenia ATP oka zującego wpływ na stopień włączania rybonukleotydu nikotyniano wego w MAD* oraz od aktywności karboksylazy pikolinianu, która reguluje ^wewnątrzkomórkowe stężenie Bemialdehydo-2-amino-3-kar-boksymukonianu.
1.2.2 Rr>7.Vłftd enzymatyczny dwirnuy^ot^rd^ nikotynamidoadeninowych...
Enzymatyczny rozkład WAD* może zachodzić w czterech miej scach jego cząsteczki /129,144/ /rys. 4/, jednak w tkankach zwierząt najbardziej istotne jest hydrolityczne rozszczepienie H-3-giikozydowego połączenia MAm-ryboza, a także pirofosforano- wego, łączącego WMK z nukleotydera adeninowym /145/*
Rozkład enzymatyczny dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych NAD+,R = -OH; NADP+,R = -OPO/OH/g
1 - nukleozydaza NAD+, 2 - pirofosfataza nukleotydowa, 3 - piro- fosforylaza NAD+, 4 - dezaminaza adenozynowa. W oparciu o poz.129
1.2.2,1. Rozkład wiązania nikotynamid-ryboza /glikohydrola- za HAD+/ Hydrolityczny rozkład cząsteczki NAD+ lub NADP przez
Slikohydrolazę NAD+ zachodzi sumarycznie w sposób następujący /145/s
+ E
KRPPRA + H20 --- * REPRA + N + H+
+ P E P
MRPpIa + H 20^ ---^ RPPRA + N + H+
gdzieś N a nikotynamid, R * ryboza, A * adenina, E * glikohydro- laza NAD+
Stwierdzono /272,273,293/, że glikohydrolaza NAD* wykazuje pod wójną aktywność enzymatyczną, tj. transglikozydazy oraz hydrola-
zy i działa według następującego schematu /145/s AcRPPRA + E
| AcP ARBPRN + E --- - ARPi>R “ E * M
--- - |h2o
ARPPR ♦ E + H* gdzie: AcP * acetylopirydyna
Glikohydrolaza NAD* specyficzna w stosunku do utlenionych posta ci dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych, występuje powszechnie w tkankach ssaków rozkładając zarówno NAD* jak i NAD! /55»130»
145,186,272,273,293/. Jedynie we krwi królika i nasieniu byka sugeruje się istnienie specyficznych enzymów dla NAD'* i NADP"*
/2.111,172/. Oprócz cech wspólnych dla wszystkich enzymów tego typu u ssaków /aktywność hydrolazy i transglikozydazy, lokali zacja w komórce w strukturach membranowych, głównie w mikroso- mach lub w stromie erytrocytów, wrażliwość na zahamowanie iiAm/ glikohydrolaza MAD* wykazuje zróżnicowanie tkankowe i gatunkowe
takich właściwości jak ciężar cząsteczkowy, względna aktywność w stosunku do KAD* i M D P + , stosunek aktywności transglikozydo- Wej do hydrolitycznej oraz innych właściwości kinetycznych /130,
144,145,272/. Przypisuje się jej rolę jednego z bezpośrednich regulatorów poziomu MAD* v; komórce /90,91/.
1.2.2.2. Rozkład wiązania pirofosforanowego /nukleotydohy- drolaza dwunukleotydu/. Przebieg rozkładu cząsteczki NAl)f lub
NAI)P+ przez nukleotydohydrolassę dwunukleotydową można podsumować na-atęPująco /1 4 5/ s '
+ E +
NRPPRA + H20 --- > NRP + PRA + H +
+ P _ P
II £ + II
MRPPRA + H g O --- > IJRP + PRA + H +
Enzymy rozkładające dwanukleotydy nikotynamidoadeninowe w miej scu wiązania pirofosforanowego występują powszechnie w tkankach ssaków /130,144,145/ lecz są grupą bardzo zróżnicowaną. Wystę pują w jądrach komórkowych /243/» mikrosomach /130/ i frakcji rozpuszczalnejx /130/. W większości rozkładają zarówno postacie utlenione jak 3. zredukowane dwunukleotydów nikotynamidoadenino wych /130,159/, niektóre enzymy rozkładają jednak tylko posta-
x
eupernatant po odwirowaniu /1 0 5.000 g» 60 min/ homogenatu w 0,44M sacharozie
°ie zredukowane /129,130/. Są one mało specyfi zne, gdyż rozkła dają również inne nukleotydy zawiex-ające ugrupowanie pirofoa- foranowe, np. FAD /129/, ATP, ADP, UTP i in. /243/.
1.2.2.3. Inne drogi rozpadu NAD+ . Znane są enzymy mogące rozszczepiać dwunukleotydy nikotynamidoadeninowe w inny niż
opisany wyżej sposób, np. niespecyficzna aminohydrolaza adeno zyny z takadiastazy usuwa hydrolitycznie grupę aminową adeniny
z cząsteczki NAD+ , lecz nie atakuje NADP* /147/, adenyli- lotransferaza A T P : M W może katalizować fosforolityczny rozpad NADf w miejscu wiązania pirofosforanowego /161/.
W erytrocytach ludzkich znaleziono i w znacznym stopniu oczyszczono specyficzny enzym /rybozylotransferaza nukleozyd nikotynamidowy:P/, rozkładający fosforolitycznie wiązanie niko-
tynarnid-ryboza w cząsteczce rybozydu nikotynamidowego /96/. Enzym ten nie atakuje jednak NAD+ i NADP+ .
Kie wiadomo, czy te drogi rozpadu NAD+ mają jakieś znacze- nie w katabolizmie dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych
w tkankach in vivo.
I *3. Rola DWUTSUKLEO TYDÓW NIKOTYNAMIDOADENINOWYCH W METABOLIZMIE KOMÓRKOWYM
Obecność dwunukleotydów nikotynaiuidoadeninowych wykazano we wszystkich dotychczas badanych organizmach żywych /144/. Zna- czen a ich w organizmie można rozpatrywać z punktu widzenia
indywidualnych reakcji, w których biorą udział lub procesów metabolicznych, do przebiegu których są niezbędne. Ze względu na bardzo szeroki zakres omawianego zagadnienia zostaną omówione
jedynie niektóre jego aspekty.
Obecnie można już zaryzykować podział reakcji i procesow, w których uczestniczą dwunukleotydy nikotynamidoadeninowe na dwa rodzaje: 1/ reakcje i procesy metaboliczne, w których dwu nukleotydy nikotynamidoadeninowe biorą udział jako koenzymy reakcji oksydoredukcyjnych oraz 2/ reakcje i procesy metabolicz ne, w których sugeruje się udział tych związków na innej zasa dzie niz oksydoredukcja.
1.3.1. Dwunukleotydy nikotynamidoadeninowe .jako koenzymy procesów oksydoredukcy.jnych
Od czasu fundamentalnych badań Warburga i Christiana /por, poz. 43/ tego rodzaju rola dwunukleotydów nikotynamido adeninowych jest dobrze znana i do niedawna wydawało się, że jedyna.
W powiązaniu ze specyficznymi enzymami dwunukleotydy ni kotynamidoadeninowe biorą udział w oksydoredukcji setek fizjo
logicznych substratów przemiany cukrowej, białkowej, tłuszczo wej i kwasów nukleinowych /por. poz. 14/. Olbrzymia ilość ka
talizowanych reakcji przez NAD+ i NADP+ skłania do prześledze nia losów wodorów postaci zredukowanych tych koenzymów w orga nizmie.
Zróżnicowanie chemiczne dwunukleotydów nikotynamidoadeni nowych /!AD+ i NADP+/ nasuwało od dawna podejrzenie o ich
zróżnicowaniu funkcjonalnym. Udowodniono, że in vivo atomy wo doru przenoszone w procesach odwodorowania naturalnych substra tów na KAD+ są w większości włączane w cząsteczkę wody w rnito- chondrialnym łańcuchu spalań końcowych, natomiast wodory
NADPH+H+ odnajdywane są głównie w cząsteczkach złożonych związ ków organicznych jak kwasy tłuszczowe, cholesterol, sterydy
i in. /70,71,149,151/. Stąd powstał pogląd o ogólnym znaczeniu funkcjonalnym obydwu dwunukleotydów; NADH+li* jako generatora energii w organizmie oraz NADPH+H+ jako donatora protonów do biosyntez redukujących szeregu ważnych biologicznie związków /glikogen, związki pośrednie cyklu cytrynianowego, L-glutami- aian i jego pochodne, kwasy tłuszczowe nasycone i nienasycone,
sfingozyna, tyrozyna, ksanturenian, szereg hormonów i in. /13. 155,226/.
Tezę o zróżnicowaniu funkcjonalnym obydwu postaci dwunu kleotydów nikotynamidoadeninowych wydaje się potwierdzać porów nanie zawartości postaci ufosforylowanych i nieufosforylowanych
tych koenzymów w różnych tkankach oraz mitochondriach różnych tkanek. Dostrzeżono /por. również tabl. 8,9,10 i 11/, że narzą dy /również mitochondria tych narządów/ wykazujące wybitną aktywność syntetyczną jak nerka, kora nadnerczy, a w szczegól ności wątroba zawierają względnie dużo NADP , przeważnie w zre
dukowanej postaci, natomiast tkanki o znacznym, z racji swej funkcji, zapotrzebowaniu na energię /mózg, mięsień szkieletowy, Przepona/ zawierają w przeważającej ilości NAD , głównie w po
staci utlenionej i tylko minimalną ilość NADP /155,179/* Hysu- nek 5 przedstawia schematycznie powiązanie NAD+ z procesami
energetycznymi komórki z uwzględnieniem kompartmenta^izacji, a rysunek 6-powiązanie NADP* z ważniejszymi procesami biosyntez redukcyjnych komórki. Istnienie w komórce aktywności transhydro genazowej, pozwalającej na bezpośrednie przenoszenie wodorów- z NADEH+I1* na WAD* i odwrotnie umożliwia zużytkowanie odwodoro- wań zależnych od NAD+ do biosyntez redukcyjnych, a zależnych
ftys, 5« Powiązania cytoplazmatycznej i mitochondrialnej puli NAD z przemianą energetyczną komórki
Skróty: G- 6 - P = D-glukozo-6-fosforan, G-1-P = D-glukozo-1-fosforan,
Pi = ortofosforan, F-6-P = D-fruktozo-*6 -fosforan, FDP = D-fruktozo-
1,6-dwufosforan, GAD = aldehyd 3-fosfo-D-glicerynowy, DAF = fosfo-
dwuhydroks,yaceton, 1,3-di-PGS = 1 ,3-dwufosfo-D-glicerynian,
3-PGS s. 3-fost'o-D-glicerynian, 2-PGS = 2-fosfo-D-glicerynian,
PEP = fosfo—enolopirogronian, M s L-jabłczan, OAA = szczawiowooe— tan,GL-l-P = glicerolo-l-fosforan / U. -glicerofosforan/, o*.-OGS = 2-oksoglutaran, Q = ubichinon. Schemat dla wątroby wg Hohorsta
i z o c y W y r a ia r i, g lu k o z o 6 j b s -f o r a n * G-fosfogUiko-/* laiari ' V yybozo- ~5-fosforan w u k l e o t y d y NADPH, 4 N A D P * yriteiy id u k c y jr t aminokwasy y* kwasy tłuszczów* fosfolipidy e d u k c y j r z e dehydrogenaza jabtczarjowa choUsWol stevydy gli/tatioa zredukowany kwas tetwahydroj-oUoiJy -*■ jabtcŁaa ( d e k a v b o k 8 y lu jq c a ) NADPH — oksydaza
specyficzne redukcje metaboUciae
m etabolizm clat obcych RNA< k DNA -- u r a c y l ■ t y m i n a • d e g r a d a c j a ' p te r s c ie m a - * d w u k y d ^ o - ^ ' p i r y m i d y n o w e g o t y m , m a
B* 6 . Powiązanie układu NADP+-NADPH+H+ z ważniejszymi procesami bio
syntez komórkowych, metabolizmem ciał obcych i przemianą kwasów nukleinowych w komórce.Wg Kunza i wsp. /168/
Obecność tego rodzaju enzymów stwierdzono zarówno w mitoohon-X ■ XX / driach /117,150/, jak i we frakcji rozpuszczalnej /98 ,119 przy czym pozamitochondrialna aktywność transhydrogenazowa
jest raczej wynikiem działania oksydoreduktaz hydrokeysterydo- wych, współdziałających zarówno z M D * jak i WADI /119»133/ niż specyficznego dla tej reakcji enzymu, co jednak było także
sugerowane /98/. Pewne znaczenie w utrzymywaniu równowagi mię dzy obydwoma dwunukleotydami, może mieć również fosforylacja MAD+ do NADP+ /218/, a przede wszystkim mechanizmy pośredniej
transhydrogenacji /1 1 5,1 5 5,164,179,218,247/, Przykł»d ilustruje rysunek 7*
'supernatant po odwirowaniu i 57 000 g/ homogenatu w 0,25M
sacharozie
.supernatant po odwirowaniu /105 000 g, 60 min./ homogenatu w 0,25. M aacharozie
utleńiONy Substrat SZCZAUlOWOOCTAN PlROGRONIAN SUBSTRAT DABfcUAK NADP
s* ł• Schemat mechanizmu pośredniej transhydrogenacji .Wg Pande’a
Sugeruje się, że w warunkach in vivo zawartość i etan oksydoredukcyjny układów NAD* - NADH+H i NADP - NADPH+H
3est jednym z mechanizmów regulacji związanych z nimi procesów metabolicznych /2 0,1 1 3,162,168,189,191,226,234,283,284,286/.
Szczegółowe mechanizmy tego rodzaju regulacji są obecnie przed miotem intensywnych badań. Przykładem ich efektywności może być wyjaśnienie mechanizmu powiększania wątroby pod wpływem niektó
rych leków reoksydujących cytoplazmatyczny NADPH+H* /168/, regu lacja cyklu pentozowego /169,226/, czy propozycja mechanizmu za leżności wzajemnej intensywności glukoneogenezy i ketogenezy
2 Procesami utleniania kwasów tłuszczowych /283,284,286/. We wszystkich podanych przykładach pierwotną przyczyną łancucha zmian biochemicznych jest zmiana zawartości i stanu okeydore- dukcyjnego cytoplazmatycznego układu 1MADP+ - NADPH+H /l68,l6^, 226/ lub mitochondrialnego układu NAD* - NADH+H* /284,285,286/.
Na rysunku 6 pokazano, że jedną z dróg konsumpcji NADPH-+ w komórce jest jego utlenienie katalizowane przez większość oksygenaz hydroksylujących. Ogólny sposób działania tych enzy mów jest znany od 10-15 lat, lecz mechanizm transportu elelct.ro- nów z NADPH+II* na tlen został lepiej poznany dopiero w kilku ostatnich latach. Okazało się, że w mitochondriach kory nadner c z y oraz w retikulum endoplazmatycznym /głównie we frakcji mi- krosomów gładkopowierzchniow^ch - smooth surfaced microsomes/ wątroby obecny jest specyficzny w stosunku do NADPH+II łańcuch
oddechowy /rys. 8/. Ten dodatkowy łańcuch oddechowy kończy się hemoproteidem, cytochroinem P-450 /214/, który bezpośrednio reaguje z tlenem cząsteczkowym. Nazwa "cytochrom P-450" wywodzi
się z faktu , że zredukowana postać tego pigmentu /P/ tworzy kompleks z tlenkiem węgla wykazujący maksimum absoipcji przy 450nm. Obecność cytochromu P-450 stwierdzono w mikrosomach wą troby, nerki, kory nadnerczy i śluzówki jelita oraz w mitochon- driach kory nadnerczy /81/. Możliwe jest występowanie różnych cytochromów tego typu, wykazujących pewną specyficznośc w sto sunku do katalizowanych reakcji /100,109/« Transport elektronow z HADPH+H+ na cytochrom P-450 katalizują oksydoreduktazy NADPH
*ł“ •
+H * cytochrom P-450, przy czym system oksydoreduktazy mitochon-drialnej składa się z flawoproteidu i niehemowego żelazoproteidu /152/ natomiast system oksydoreduktazy mikrosomalnej - z flawo proteidu identycznego ze znaną wcześniej /225/ oksydoreduktazą NADPH+H+j cytochrom c /152/ oraz niezidentyfikowanego faktora x /81»216/. Są to odrębne systemy enzymatyczne /81,216/.
Rys, MltockoadUŁo, puogrcwan iaWcza n r+ N A OH C0% / NAOPH . i \ Ff4 rr i NH3P / l 1 l C-S P-V
Łańcuch oddechowy oksydaz mieszanej funkcji /hydroksylaz/ i tworzenie NADPH+H+ w korze nadnerczy
Skróty; Fp1 » flawoproteid, ?p2 = flawoproteid /dehydrogenaza
zredukowanego NAD^, Fp-, = flawoproteid /dehydrogenaza burszty-j
nienowa/, Fp^ s flawoproteid, x = niezidentifikowany faktor, P-450 e cytochrom P-450, NHIP * żelazoproteid, burszt. = bur- sztynian, fum = fumaran, OAA = szczwiowooctan, 0 = ubichinon, C-s = cytochromy łaiicucha oddechowego, TCA-c = cykl kwasów trójkarboksyIowyeh.Wg Simpsona i wsp. /247/
Zainteresowanie biochemików mechanizmem działania okuyge- naz hydroksylujących wynika między innymi z możliwości regulacji,
etapie działania tych enzymów , przemiany ich fizjologicz nych substratów, w szczególności hormonow sterydowych /100,
24?/, zaś farmakologów i toksykologów ze względu na ich istotną rolę w mikroBomalnym metabolizmie ciał obcych: leków, przemy słowych związków toksycznych, związków o działaniu rakotwór czym /4 5 , 7 2,80,81/.
Mikrosomalne oksydazy zależne od NADPH+H* są w stanie przeprowadzić wiele typów reakcji oksydacyjnych, przy czym
większość tych reakcji można traktować, przynajmniej pośrednio, jako reakcje hydroksylacji /81, por. tabl. 3/*
Typy reakcji oksydacyjnych katalizowanych przez zależne od NADPH+H' enzymy
mikrosomów wątroby. Wg Gillette*a /8 1/
Typ reakcji Przebieg reakcji z uwzględnieniem mechanizmu hydroksylacj i
Sydroksylacja pierścienia aromatycznego EyćLroksylacja łańcucha alifatycznego K - aealkilacja 0 - aealkilacja Dezaminacja £ - oksydacja w - oksydacja CH _C O -ffR - Cg K [oh] R—CH-, [oh] s-c h2-o h C E _-C O -N H -C g H ^-O H §>h) R-NH-CH, .... -» [h-NH-CH90h]
3
[°R1
R—0—CH- "■> [i-0-CEp0H] ROH + HCOH
R - C H / 2 J K „ /- C E , - ^ 4 [ S - C / 0 H / / N H 2 / - C H 3 ] --- » R -C O -C H j +
UH-s - UH-s - R 1 ' - M > [ k s o h-s1 ] ł -> R-SO-R1 + H+
Od dawna znany jest fakt, źe wprowadzenie do organizmu zwierzęcia ciała obcego na ogół powoduje zwiększenie szybkości Przemiany tego związku w mikrosomach /45»72,80/. Zjawisko to jest spowodowane indukcją systemów enzymatycznych polegającą
syntezie de novo białka enzymatycznego oraz wszystkich kom ponentów łańcucha oddechowego w mikrosomach /45»72,81,216/. Indukowana synteza enzymów pociąga za sobą tworzenie nowego
mKHA /2l6/, chociaż, nie wiadomo, co jest bezpośrednim czynnikiem stymulującym ten proces. Orrenius i wsp. /216/ sugerują pośred-- nią rolę hormonów sterydowych w tym mechanizmie, uważając, że oddziaływacie między ciałem obcym i aparatem genetycznym jąder wydaje się być nieprawdopodobne, ze względu na dużą ilość czyn ników indukcyjnych,czasem bardzo różnych pod względem struktury
chemicznej. Hipoteza Orreniusa i wsp. /216/ o regulacji przez hormony sterydowe aktywności enzymów hydroksylujących i ich
indukcji oparta jest na następujących obserwacjach: 1/ Przy inku- ^acji substratu egzogennego z hormonem sterydowym /substrat endo genny/ i mikrosomaini wątroby w obecności NADPH+H4 i Or^t hydro- ^sylacja jednego i drugiego zachodzi wolniej niż gdyby inkubować każdy a nich oddzielnie, 2/ U zwierząt po usunięciu nadnerczy i kastracji, co powoduje zmniejszenie się ilości hormonów stery dowych w wątrobie, następuje spadek zdolności hydroksylacji mikrosomów zarówno w stosunku do związku obcego jak i fizjolo gicznego • Jednocześnie spada zawartość cytochromu P-450 w mikro somach. 3/ Podanie w injekcji hormonów sterydowych zwierzętom za zmniejszoną zawartością hormonów sterydowych w wątrobie pizywraca do normy zarówno zawartość cytochromu P-450 jak
i właściwości hydroksylujące mikrosomów. 4/ Powtarzalna injek- ci5a związku obcego indukuje aktywność hydroksylującą i zawar
tość cytochromu P-450 w mikrosomach szczurów kastrowanych i adre- nalektominizowanych tylko w nieznacznym stopniu, podczas gdy
jednoczesna injekcja hormonów sterydowych prowadzi do takiej sa- m ej ilościowo indukcji jak u szczurów nieoperowanych.
i.3.2. Udział dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w metabo^. lizmie komórkowym .jako czynnika działaj ac^/r.o na innej.
zasadzie niż oksydoredukc .ja rdzenia pirydynowego nikotyn namidu
Dotychczasowe poglądy na rolę dwunukleotydow nikotynamido- edeninowych w komórce faworyzowały wyłącznie ich udział w pro
cesach oksydoredukcyjnych z przyjęciem jedynie możliwej in vivo reaktywności tych związków, tj.odwracalnej redukcji rdzenia Pirydynowego UAm /rys. 1/. Ostatnio jednak pojawiły się nowe koncepcje na temat roli NAD+ w metabolizmie komórkowym. Pod kreśla się możliwość udziału NAD+ w procesie oksydacyjnej fos forylacji jako składnika poszukiwanego od dawna i nie zindenty- fikowanego do dzisiaj wysokoenergetycznego pośrednika w synte zie ATP /20/. Wykazano również, że w jądrach wątroby ssaków istnieje układ enzymatyczny, który polimeryzuje cząsteczki adenozyno-5*-dwufosforan-ryboza z utworzeniem związku /ADP-ry-
boza/n, przy czym specyficznym substratem tej reakcji okalał się 1\1AD+ /209,271/. Sugeruje się, że polimeryzacja ta następuje przez powstanie wiązania glikozydowego między 0-1 rybozy NMN i t~2 lub (j-3 rybozy adenozyny /232/; prawdopodobnie miejscem
wiijsa-nia w cząsteczce adenozyny jest pozycja 2 ’ /3 2/.
Ostatnio udało się wyizolować z Azotobacter vinelandii
postać dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego. adenozyno-5*~dwu- f°sforan-ryboza-NAD+ , w którym NAD+ związany jest z ADP-rybozą wiązaniem glikozydowym między C— 1 rybozy części ADP-ryboza
i Pozycją 2* lub V w NMN /126/. Związek ten nie ulega enzyma tycznej redukcji, ani działaniu glikohydrolazy NAD . Rola iizjo-
logiczna polimerów /ADP-ryboza/n i ADP-rybozylo-NAD+ nie jest dotychczas znana, jest jednak oczywiste, że w ich syntezie NAD pełni rolę specyficznego donatora grup ADP-ryboza.
Niedawne badania 0 1ivery i wsp. /170,2 1 1,212,213/ sugerują, że NAD+ jest istotnym, specyficznym czynnikiem niezbędnym do en2ymatycznego /joining enzyme/ łączenia łańcuchów polinukleo- tydowych w cząsteczce DNA* W tej sytuacji dwunukleotyd nikoty- namidoadeninowy mógłby uczestniczyć w przemianach DNA i repa racji uszkodzonej jego cząsteczki na drodze wykorzystania
energii wiązania pirofosforanowego do utworzenia wiązania
fos-fodwuestrowego.
Przedstawione dane wykazują, że oksydoredukcja nie jest
Prawdopodobnie jedyną funkcją NAD4 w komórce. Obecny etap ba dań nie pozwala na wyciąganie wniosków uogólniających, skłania
jednak do nowego spojrzenia na rolę NAD+ jako dwunukleotydu o wielorakich funkcjach biologicznych.
II
M S Ą M IA. KAP OZNACZAM i m DWUNUKLEOTYDÓW N IK 0 T Y N AM ID O A D EM INUWYCH
L l KAMKAĆH S7.ny.TTRA
II.1. PRZEGLĄD METOD OZNACZANIA DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADE NINOWYCH W TKANKACH /DANE Z PIŚMIENNICTWA/
W ponad 30~letniej historii badań nad dwunukleotydami niko- tynamidoadeninowymi stosowano do ilościowego oznaczania tycb z w i ą z k i bardzo dużą ilość metod i modyfikacji wykorzystujących różne rodzaje pomiaru: spektrofotometrię w zakresie nadfioletu '41,8 8,1 14,136,1 5 4»2 0 6,2 6 7/ i światła widzialnego /8 2,2 5 8,2 9 1/, fluorymetrig /8,17,30,41,65,128,139,177,182,183,205,217/, mano metrię /wg 182/, polarografię /9 3/ i technikę izotopową /6 4,2 1 9i/.
&azda metoda oznaczania składa się ogólnie z trzech etapów:
1 ekstrakcji dwunukleotydów z tkanek, 2/ rozdziału poszczegól ni oh postaci dwunukleotydów oraz 3/ oznaczania rozdzielonych dwunukleotydów. Każdy z nich zawiera oddzielne problemy anali-
yczne, jednak różnorodność opisanych metod dotyczy głównie spo sobu końcowego oznaczania ilościowego. V/ niniejszym przeglądzie °Btaną więc omówione oddzielnie poszczególne etapy oznaczania WUllukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach.
' * * Mistrakc.Ta dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych z tka nek
Dwu-nukleotydy nikotynamidoadeninowe, zarówno utlenione jak edukowane, są łatwo rozpuszczalne w wodzie; wymycie ‘ich
Bezpośrednia pojedyncza ekstrakcja wszystkich postaci dwunukleotydów /HAD+ ,NADP+ ,HADH+H+ , M D P H + H +/ w środowisku wod nym obojętnym lub zbliżonym do obojętnego nie jest jednak możli wa ze względu na bardzo szybki rozpad enzymatyczny dwunukleoty
dów w toku ekstrakcji /8,136/. Zjawisku temu zapobiega NAm /8, 131/, co zostało wykorzystane do badań wewnątrzkomórkowego roz mieszczenia dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych, gdzie niez
będny jest znaczny oki^es czasu do r o z f r a k cjonowania komórki
/10,84,1 3 1,176,252/. Natomiast w metodach oznaczania dwunukleoty dów nikotynamidoadeninowych w nienaruszonych tkankach enzymy rozszczepiające te dwunukleotydy dezaktywuje się przez natych miastowe ogrzanie tkanki w środowisku obojętnym lub zbliżonym do obojętnego /przy ekstrakcji wszystkich postaci dwunukleotydów/ alkalicznym /w trakcie ekstrakcji dwunukleotydów zredukowanych/
lub kwaśnym /w trakcie ekstrakcji dwunukleotydów utlenionych/. •Przy stosowaniu kwasów odbiałczających ekstrakcję prowadzi się w niskich temperaturach /0-20/.
Przeprowadzona równolegle ekstrakcja alkaliczna i kwaśna dwóch części tkanki daje jednocześnie możliwość wykonania w spo- sóo najbardziej pi^osty rozdziału dwunukleotydów utlenionych od zredukowanych i dlatego jest powszechnie stosowana.
W nielicznych tylko metodach stosuje się pojedynczą ekstrak cje wszystkich postaci dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych buforem Tris-HCl o pH 8,2 /183/, buforem węglanowym o pH 7,4 /26?/, zbuforowanym /Tris-HCl o pH 7,2/ nasyconym fenolem /205, 206/ lub zimnym 0,04-N NaOH /21/. Pojedyńczą ekstrakcję kwaśną
dwu-Qukleotydów nikotynamidoadeninowych Held i wsp. /1 0 6/, ozni.c<..3
Óąc produkty rozpadu dwunukleotydów zredukowanych.
Szybki enzymatyczny rozpad dwunukleotydów nikotynamidoade ninowych w homogenacie tkankowym zwrócił uwagę na możliwość pośmiertnych zmian ich zawartości w tkankach, co należy
uwzględnić przy czynnościach preparatywnych oznaczenia. Jak vyka zano /tabl.4/ całkowita zawartość dwunukleotydów nikotynamidoade ninowych w tkankach nie zmienia się lub zmienia się w sposób praktycznie nieistotny w czasie wystarczającym do wypreparowania
świeżej tkanki. Szybsze zmiany dotyczą jednak poszczególnych po staci dwunukleotydów /szczególnie NADH+H^, co związane jest
z przejściem ze stanu aerobowego do anaerobowego po dekapitacji. W warunkach badania czystej ischemii in situ /zatrzymanie obie
gu krwi/, a także anoksji in vivo lub na wyizolowanych narządach wykazano, że zmiany zawartości NADH+H+ są bardzo duże w takich
tkankach jak mięsień sercowy, mózg, natomiast mniejsze w wątro bie i nerce /por. również poz. 33#87,241/*
Zalany sawartośol dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach Bzciura pod wpływem niedotlenienia* /Opracowanie własna s danych piśmiennictwa/
Nledotl
~ n
•niania
Kierunek 1 wielkość zmian Indywidualnych dwunukleotydów ora* au»
róinych postaci dwunukleotydów / % /
Sposób cr.no
/■In./
NAD* NADH+H* NADP* NADPH+H* NAD*
NADH+H* NADP* NADPH+H* Zawar tość całko wita Autor 2 1 -3 +16 -7 ♦4 - - - Burch 1 wsp. / 2 3 / 2 2 -19 +19 >- - -14 - - Brosnan i wsp. /15/ 1 rJ 3 -2 ♦77 -42 -6 +13 -21 +1 Jauany /139/ 4 3 - +130 - ♦15 - - - Scholz 1 wap. /240/ 1 4-5 -44 ♦33 -51 -6 -25 -24 -24 Jauany /139/ 1 5 -- -25 ♦5 - -10 - Burcb wap. /22/ 1 6 -22 +46 ♦6 -28 -9 -19 -13 Slatar 1 wap. /258/ 1 4-10 -20 -2 - - -13 - - Splrtaa 1 wap. /267/ 1 60 -29 -1 - - -18 - - Jed.lkln 1 wap. /13 6/ i—1 0 ,5 -25 +1720 -48 +58 +12 -4 +10 Chanc. 1 wap. /35/ 3 -16 +730 -12 ♦44 ♦10 ♦16 +10 5 0,5-2 +5 ♦55 - - +9 - - Lowry 1 wap. 5 8 -13 ♦245 - - +8 - -/180/
Dana dla *yazy
. . .
I X Ł J ic iu,dwunuklaotydy nlkotynanldoad.nlnowe z wątroby ekstrahowano natychalast
po upływie cauau wykazanego w tablicyt 2 przerwanie dopływu krwi do wątroby, 3 -parfl^d /95? NZ + 5* C 0 ^ l" V l V 0 ' * " “ ok8* * /95 % " 2 + 5* C02/ narządu wyizolowanego,
ndowanagoj 5 _ zaaraianle głowy natychmiast 1 w wykapanym w tablicy ozaale po
