Wywoływanie i pomiar fluorescencji rozdzielonych dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych. Proponuje się różne wa

runki inkubacji dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych z mocnym ługiem w celu uzyskania produktów fluoryzujących /tubl. 15/. W opracowanej metodzie fluorescencje wywoływano w środowisku 611

WaOH i 0,066/0 H20? w 38° przez 60 min. Wywoływanie fluorescencji w ^empera turze pokojowej jest niewystarczające, ze względu na Rmiejezą precyzję oznaczenia /tabl. 1 6/. Przy stosowaniu do wy­ woływania fluorescencji inkubacji w 33° krzywa kalibracyjnu wzorcowego roztworu KAD+ wykazuje prostoliniowość w badanym za­ kresie ilości 0 - 1 ,5nmoli w próbie /rys. 11/. Precyzja końcowego 0znaczania fluorymetrycznego wynosi -4»1%* Potwierdzono, że w eto- kowanych warunkach wywoływana molarna fluorescenc ja N A D f i I. A Di + jest taka sama, oraz że istnieje pełna addytywność fluorescencji dwunukleotydów utlenionych przy oznaczaniu w mieszaninie /tabl.

17/.

Obecność H^Oo w środowisku wywoływania fluorescencji wynika z konieczności utlenienia NADH+H+ obecnego w końcowym roztworze Przy oznaczaniu tkankowych UAD+ i NADH+H+ . Wykazano, że stosowa- ne stężenie H202 /O,066%/ jest wystarczające do ilościowego utle­

nienia nadh+h+ /tabl. 18/.

W początkowym okresie badań pomiary fluorescencji wykonywa­ ne na fluorymetrze Farranda, Model A /Farrand Optical Co.Inc., ^ew York, USA/ w kuwetach cylindrycznych pojemności 3 ml,stosując w edług Lowry * ego i wsp. /183/ i Basshama i wsp. /8/ filtr pier­ wotny dla światła wzbudzającego nr 5860 i filtry wtórne dla fluo- rescenęji wzbudzonej nr 4308 i 3389. Filtr pierwotny maksymalnie

Przepuszcza światło lampy rtęciowej w zakresie 365 nm /183/, filtry wtórne posiadają maksimum transmisji przy 480 nm /278/.

%S, I

• • Krzywa kalibracji waorcowogo roztworu NAD4

Sgosób badania paramitru: Do 0 , 3 ml próby wzorcowego roztworu

WAD dodawano 0,6 ml mieszaniny NaOH-HgO . Po 60 min. inkubacji w 38 dodano 1,4 ml H^O i wykonano pomiar łluore&cencji tia fluorymetrze Farrauda. Punkty na wykresie przedstawiają wartość średnią 5 oznaczeń *S.D.

r U n k i viy\Koł^vjanla f l u o r e s e e n c j i ługowej d w u n i i k l e o t y d ó w n i k o

ynaraidoadeniuowych stosowana p r z e z różnych a u t o r ó w

A u t o r środowisko inkubacj i Temperatura inkubacji Czas inkubacji /min./ LowrJ i wsp./183/ 6 N NaOH 0 coK\ _{3 0} 6łJ NaOH O 0 0 60 6N NaOH pokojowa 60 B a s s h a m i wsp./ 8 / 7N NaOH 3 8 ° 60 Kaplan i wsp./4l/ _{5N NaOH} l u b 100° ₅ 5N KOI! K a p ł a n i W s p . / 1 4 8 / 5N NaOH _{pokojowa 30} N e u h o f f /206/ _{5N NaOH 100°} 5 J o u a n y / 1 3 9 / 7N NaOH _{37° 60} ______________________ ...

°rówaanie sposobu wywoływania fluoreseencji NAD+ w temperaturze po­ kojowej i 38°

^££^.^b badan|a parametru: Do 0 f3 n’l wzorcowego roztworu NAD /1 nmol/ dodano 0,6 ml mieszaniny NaOH-HgOg. Inkubowano porównawczo w 38°

'■ temperaturze pokojowej przez 60 min. Dodano 1,4 ml HgO i wykona­

no pomiar fluorescencji na fluorymetrze Farranda. Wartości średnie 5

oznaczeń

Warunki wywoływania fluoresoen- Fluorescencja Współczynnik

cji

śred. /od-do/ zmienności /%/

60 Oin., 38° _37/37-38/ 3

^o^escencja NAl)+ i NADP+ wywoływana, rozdzielni© oraz w mieszaninie

^SSgLJŻMania Darawftt.ni! Próby /0,3 ml/ zawierające wykazane w ta- bltcy ilości NAD+ i NADP+ mieszano z 0,6 ml roztworu NaOH-HgOg. Po

inkubacji w 38° przez 60 min. dodawano 1 , 4 ml H20 i wykonywano pomiar

luorescencjt na fluoru/metrze Farranda. Wartości średnie 4 oznaczeń

Zawartość dwunukleotydów w próbie /nmol/ Fluorescencja śred. /o d-do/ NAD+ HADP+ 1 - 37/36,5 - 37,5/ 1 _{37/36,5 - 37,5/} 0,5 _{0,5 37/36,0 - 37,5/} —

----Wywoływanie fluorescenc;}i NADH+H+ po utlenieniu roztworem NaOH-HgO^

porównaniu z fluorescencją NAD+

.badania pa m ^ t n , . próby /0 , 3 ml/ zawierające wykazywane

w tablicy ilości NAD+ lub NADH+H+ mieszano z 0,6 ml roztworu NaOH-HgOg. P° lftkubacji w 38° przez 60 min. dodawano 1,4 ml H.,0 i wykonywano po- miau flubreEcencji na fluorymetrze Farranda. Wartości średnie 3 oznaczeń

Zawartość NAD* lub NADH+H* w Próbie /nmola/

Fluorescencja

NAD NADH+H

•Po otrzymaniu spektrofluorymetru /Spektrofluorymetr "Optor!” Model pi-"r« o i

pomiary fluorescenoji wykonywano za pomocą tego P ratu stosując wzbudzanie światłem o długości fali 370 nm

ansmisję fluorescencji wzbudzonej przy 460 nm. Wykazano /rys

1 2/

» ^e w tym zakresie długości fali znajduje się maksimum

udzania oraz transmisji fluorescencji "ługowej” dwunukleoty- dów *

ni*-otynoTnid0adenInowyoh, co jest zgodne z danymi piśmien- twa /1'33,205/. Precyzja końcowego oznaczenia fluorymetryczne- WAD na tym spektrofluorymetrze wynosi - 2 ,6 % .

1968 r. doniesiono /92/, że fluorescencja ługowa dwunu- ieotydów nikotynamidoadeninowych jest znacznie większa jeśli

udzenie prowadzi się w środowisku etanolu. Jak wykazano

sperymencie własnym /rys. 1 3/ fluorescencja wzbudzana w śro- sku 50& etanolu jest ponad dwa razy większa niż przy wzbu­

dzaniu w Środowisku wodnym. Spostrzeżenie to wykorzystano do zeń dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w mózgu, gdzie z

wartość dwunukleotydów zredukowanych jest niska. Precyzja koń-go oznaczenia fluorymetrycznekoń-go NAD+ w tych warunkach jest bardzo wysoka i wynosi * 1,2%.

H.2.2.4. Wpływ warunków rozkładu KADPf na odzyskanie uorcscencj-^ próby ślepej. W oryginalnych metodach

°wiy ego i Wsp. /183/ oraz Basshama i wsp. /O/ rozkład dwunu- kleotydów utlenionych w procesie enzymatycznego rozdziału dwunu-

©otydów prowadzono w środowisku alkalicznym' w 60°. W opracowa­ nej modyfikacji etap ten prowadzono w 40°, ponieważ wykazano,że " *>° nie 0d2^u k u .e a i „. i l o ,ciowo egaogennego

KADH+H+ /tabl. 19/.

Istotny jest również dobór odpowiedniego stężenia NaOH

a rozkładu NADP+ . Stężenie NaOH przy rozkładzie NADP4 musi

yó wystarczające do ilościowego rozkładu NADP+ lecz jednoczeń-

tyle niskie, by praktycznie nie powodować wywoływania

lorescencji ługowej NADP4 wzrastającej prawie liniowo ze

Rys.

Widmo iluoreseencji produktów działania 6 N NaOH na dwunukleotydy

nikotynamldoadeninowe

widmo światła wzbudzającego /transmisja fłuorescencji przy A60 ntn/

/-— / widmo fluoresceacji wzbudzonej /wzbudzanie przy 3?0 nm/

A - Wzorcowy roztwór NAD* /3 nmole w próbie/

B - Wzorcowy roztwór NADP* / 3 nmole w próbie/

C ~ Ekstrakt kwaśny wątroby /5 mg wątroby w próbie/

b&danią parametru: Próby /0,3 ml/ zawierające wykazane ilości AD i NADP łub kwaśnego ekstraktu 'wątroby mieszano z 0,6 rai 9H NaOH

Po inkubacji v/ 38° przez 60 min. dodawano 3,1 ml H.,0 i wykonywano po­

miary fluorescencji na spektrofluorymetrze “Opton", Model PM^-2. Od­

powiednie próby ślepe zawierały 0 , 3 ml HgO /przy badaniu widm wzor­

cowych roztworów NAD+ i NADP*/ lub ekstraktu kwaśnego, w którjrn dwu­

nukleotydy y.ostały rozłożone przy pomocy słabego ługu /przy badaniu

3* Krzywa kalibracji wzorcowego roztworu NAD^ w środowisku wodnym i etanolu.

Sposób badania parametru} Do 0,4 ml próby wzorcowego roztworu HAD+ dodawano 0,8 ml 9N NaOH. Po 60 min. inkubacji w 38° doda-,

wano 2 , 8 ml H^O lub 50% etanolu i wykonywano pomiar fluorescen-

cji na spektrofluorymetrze "Opton", Model PM(J-2. Punkty na wy­

% s . 14. Fluorescenc ja próby ślepej przy różnym stężeniu NaOH stosowaneg, do rozkładu nukleotydów utlenionych

Sposób badania parametru: Do 0,5 ml próby zawierającej wzorcowy roztwór NAD* oraz odczynniki w ilościach wynikających z procedu­

ry oznaczania dwunukleotydów /roztwór po etapie 4 i 5 » z pomi­

nięciem ADH rys. 10b/dodawano 0,1 ml 1N HC1 i po 5 min. stania w temp. pokojowej dodawano 0,25 ml NaOH, aby otrzymać wykazane na rysunku końcowe stężenie NaOH, Następnie próby inkubowano w 40° przez 15 min., chłodzono i uzupełniano do 1 ml wodą. Do 0,3 ml tego roztworu dodawano 0,6 ml mieszaniny Na0H-Ho0 o. Po 60 min. inkubacji w 38l dodawano 1,4 ml H^O i wykonywano pomiar fluorescencji na fluorymetrze Farranda. Punkty na wykresie przed'

[

Żal

J 2n°ść odzyskania NAl)+ dodanego do, ekstraktu kwaśnego od

teil*peratury rozkładu NADP+

""•^^-k-badanla parametru; Do kwaśnego ekstraktu 1,5 6 wątroby

0dawano wzorcowy roztwór NAD+ /400 nmoli/ i NADP+ /400 nmoli/.

P° 6tiaymatycznej redukcji NAD+ i rozkładzie NADP+ przez działa-

tlle NaOH w 60° lub 40° oznaczono NAD*. Endogenny NAD+oznaczono

W rowtl°ległej próbie ekstraktu. Wartości średnie 8 oznaczeń

i9mP* rozkładu NADP+ Odzysk Is.d. / % /

.-__ NAD+ NADP^+• o o K O 84 t 9 ⁶ 40° 98 i 2 " o.

II.2.2.5. Odzysk wzorcowych roztworów dwunukleotydów niko­ tynamidoadeninowych. Wykazano, że odzysk wzorcowych roztworów dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych utlenionych /badano EAD+ , NAD]?+/ i zredukowanych /badano NADH+H+/ jest praktycznie całko­ wity zarówno przy dodawaniu egzogennych dwunukleotydów do odpo­ wiednich ekstraktów tkankowych /tabl. 2 0/ jak i do odpowiednich

*

s*'odowiak ekstrakcyjnych przed ekstrakcją dwunukleotydów z wą- tr°by /tabl. 21 a i b/.

H.2.2.6. Przechowywanie ekstraktów tkankowych do analizy.