Molekularna charakterystyka wpływu elementów
mobilnych na zmienność genetyczną w zbożowych
kulturach in vitro
Molecular characterization of the impact of transposable elements on genetic
variation in cereals tissue cultures
Renata Orłowska
, Piotr Tomasz Bednarek, Sławomir Bany
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin – Państwowy Instytut Badawczy, e-mail: r.orlowska@ihar.edu.pl, tel. 22 7334538
Prace zostały wykonane w ramach badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej na podstawie decyzji Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi nr decyzji HOR.hn.802.3.2019 Zadanie nr 89.
Słowa kluczowe: jęczmień, kultury tkankowe, MSTD, retrotranspozony, transpozony DNA
Roślinne kultury tkankowe są środowiskiem stresogennym, mogącym być źródłem zmien-ności indukowanej w kulturach in vitro (Mach-czyńska i in. 2015, Orłowska i in. 2016) oraz zmienności stabilnie dziedziczonej w kolejnych cyklach generatywnych (Han i in. 2018). Zmien-ność ta na poziomie DNA może być wynikiem zmian w jego metylacji lub sekwencji, te ostatnie mogą być powodowane np. aktywacją elemen-tów mobilnych, które w warunkach stresu mogą ulegać migracji (Hirochika i in. 1995). Elementy mobilne (EM) to fragmenty DNA, które posiada-ją zdolność przemieszczania się w genomie, gdy w wyniku czynników biotycznych lub abiotycz-nych zajdą procesy umożliwiające ich aktywację. Takim czynnikiem może być demetylacja DNA, zachodząca podczas regeneracji roślin w kultu-rach in vitro. U zbóż zidentyfikowano wiele EM a ich klasyfikacja jest złożona. Dane literaturowe sugerują, że nie wszystkie EM zidentyfikowane w genomie rośliny muszą być zawsze aktywne (Ishizaki i in. 2005). Wydaje się, że aktywacja, niektórych nadrodzin może zależeć od rodzaju stresu, jakiemu poddawane są rośliny.
Znanych jest wiele technik markerowych do analizy zmienności genetycznej i metylacyj-nej, wśród nich są takie jak MSAP czy metA-FLP, a niektóre z nich np. IRAP, REMAP, SSAP czy MSTD umożliwiają badanie aktywności EM. Metodą zaproponowaną w tym zadaniu jest wariant MSTD (Methyl-Sensitive Transpo-son Display) oparty na technice metAFLP. Taka kompilacja metod pozwoli na powiązanie zjawisk
dotyczących zmiany metylacji DNA z aktywno-ścią poszczególnych nadrodzin EM w warunkach regeneracji roślin w kulturach in vitro. Celem całego zadania jest badanie poziomu zmienności indukowanej in vitro oraz dziedziczonej w cyklu generatywnym będącej wynikiem aktywacji EM, następnie określenie, jakie nadrodziny EM mogą być aktywne u jęczmienia, jako rośliny mode-lowej, oraz zbadanie, w jakim stopniu zmia-ny powodowane migracją poszczególzmia-nych EM są powiązane ze zmianami metylacji genomowe-go DNA zachodzącymi podczas regeneracji roślin metodą kultur in vitro.
W roku sprawozdawczym 2019 zaplanowano do wykonania cztery tematy badawcze z następu-jącymi celami:
— Zliczanie autoradiogramów, przygotowanie matryc zerojedynkowych i określenie pozio-mu zmian genetycznych oraz metylacyjnych dla DNA regenerantów jęczmienia.
— Uzyskanie genomowego DNA z potomstwa generatywnego regenerantów jęczmienia do analiz technikami RP-HPLC oraz MSTD. — Oszacowanie poziomu globalnej metylacji
DNA dla 90 roślin potomnych regenerantów jęczmienia przy użyciu techniki RP-HPLC. — Przygotowanie preparatów DNA z
potom-stwa generatywnego regenerantów do analiz techniką MSTD oraz wstępne sprawdzenie preparatów.
Wykonano rozdziały MSTD dla 80 regener-antów jęczmienia, oraz dla odpowiadających im roślin donorowych (4 rośliny) w dwóch układach
enzymów restrykcyjnych – Acc65I/MseI (A) i KpnI/ MseI (K) wykorzystując 10 par selektywnych starte-rów. Amplifikowano w sumie 384 fragmenty DNA (od 24 do 68) w obydwu układach enzymów restryk-cyjnych, średnio każda para starterów powielała 38 fragmentów. Dla układu enzymów restrykcyjnych KpnI/MseI uzyskano 209 polimorficznych fragmen-tów DNA odpowiadających zmianom w sekwencji DNA, zaś dla Acc65I/MseI – 211, te dane odzwier-ciedlają zarówno zmiany w sekwencji jak i metyla-cji DNA. Różnice wynikające z zestawienia ze sobą profili uzyskiwanych dla KpnI/MseI i Acc65I/MseI skutkowały wyekstrahowaniem informacji doty-czących tylko zmian w metylacji DNA. Poziom polimorfizmu określony jako procent polimorficz-nych loci (%P) wynosił 27,02% dla układu enzy-mów KpnI/MseI oraz 33,72% dla układu enzyenzy-mów Acc65I/MseI.
Analiza skupień oparta na danych moleku-larnych odnoszących się zarówno do wyników uzyskanych z cięcia DNA enzymami KpnI/MseI jak i Acc65I/MseI wykazała grupowanie się danych ze względu na pochodzenie regenerantów (skupia-nie się regenerantów pochodzących od jednej rośli-ny donorowej). W przypadku darośli-nych dla układu enzymów Acc65I/MseI rośliny donorowe JDH70 i JDH72 tworzyły jedną grupę, zaś JDH68 i JDH69 nie były razem zgrupowane, natomiast były umiej-scowione w jednej grupie ze swoimi regenerantami (rys. 1). Podobny układ grupowania danych obser-wowano dla wyników uzyskanych z cięcia DNA enzymami KpnI/MseI.
Bazując na danych molekularnych określo-no całkowity poziomu zmienokreślo-ności indukowanej w kulturze in vitro (TTCIV), dla danych odnoszą-cych się do retrotranspozonów oraz transpozonów DNA. Wartości te wynosiły odpowiednio 39% dla transpozonów DNA oraz ok. 14% dla retrotranspo-zonów. ANOVA wykazała istotne różnice między w/w typami elementów mobilnych. Ponadto anali-za danych wykonana w obrębie typów elemen-tów mobilnych wykazała istotne różnice między poszczególnymi charakterystykami metAFLP. Wśród charakterystyk metAFLP dla obydwu typów elementów mobilnych najwyższe wartości odnoto-wano dla zmienności sekwencyjnej (SV), natomiast zmiany odnoszące się do metylacji DNA były czte-rokrotnie niższe. Zarówno dla retrotranspozonów jak i transpozonów DNA zaobserwowano przewagę demetylacji (DMV) nad zdarzeniami odnoszącymi się do metylacji de novo (DNMV) (tab. 1).
Pozyskano DNA z 90 roślin potomnych rege-nerantów jęczmienia genotypu 2dh/8. Jakość DNA wyizolowanego z liści sprawdzono w żelu
agarozowym. Uzyskano preparaty DNA o odpo-wiedniej czystości i integralności do dalszych prac badawczych.
Zbadano poziom globalnej metylacji DNA u 90 roślin będących generatywnym potomstwem regenerantów uzyskanych na drodze androgenezy z czterech różnych roślin donorowych (D68, D69, D70, D72). Analiza całkowitej metylacji cytydyny (5mdC) genomowego DNA wykonana techniką RP-HPLC wykazała, że średnio około 20% cytydy-ny uległo metylacji.
Pozyskany DNA przygotowano odpowiednio do analiz techniką MSTD. Wstępna faza analiz molekularnych obejmowała rozdziały elektrofo-retyczne preparatów DNA z dwoma parami selek-tywnych starterów do reakcji PCR: BARE-1-5980/ CpG-GCA oraz BAGY-1-C2043/CpXPG-AGA. W sumie amplifikowano 60 fragmentów DNA dla badanych par starterów. Analiza danych będzie możliwa po wykonaniu całości tematu badawczego w przyszłym roku, gdy analizy zostaną rozszerzone o kilka kolejnych par starterów.
Metoda MSTD oparta na założeniach tech-niki metAFLP pozwoliła oszacować zmiany genetyczne i epigenetyczne dla badanych regener-antów związane z obecnością różnych elementów mobilnych w genomie.
Badane typy elementów mobilnych różniły się między sobą w ramach całkowitej zmienności indu-kowanej in vitro, transpozony DNA wykazywały najwyższy poziom polimorfizmu.
Zmiany sekwencyjne były zdecydowanie wyższe niż zmienność związana z metylacją DNA.
Podjęte prace pozwoliły na przygotowanie preparatów DNA z potomstwa generatywnego rege-nerantów jęczmienia do analiz molekularnych.
Wykonana w temacie badawczym analiza RP-HPLC określiła poziom globalnej metylacji DNA dla 90 roślin będących generatywnym potom-stwem regenerantów jęczmienia.
Wstępne analizy molekularne uzyskanych preparatów DNA w oparciu o profile prążków DNA, pozwoliły na sprawdzenie jakości uzyskiwa-nych profili DNA w technice MSTD.
Wytypowano pary selektywnych starterów do analiz przewidzianych w kolejnym roku realiza-cji tematu.
Literatura
Han, Z., Crisp, P. A., Stelpflug, S., Kaeppler, S. M., Li, Q. i Springer, N. M. (2018). Heritable Epigenomic Changes to the Maize Methylome Resulting from Tissue Culture. Genetics. 209(4): 983–995.
61
BIULETYN IHAR Nr 291 (1) / 2020 Hirochika, H. i Otsuki, H. (1995). Extrachromosomal circular
forms of the tobacco retrotransposon Tto. Gene. 165: 229 –232. Ishizaki, T. i Kato, A. (2005). Introduction of the tobacco retro-transposon Tto1 into diploid potato. Plant Cell Reports. 24(1): 52–58.
Machczyńska, J., Zimny, J. i Bednarek, P. (2015). Tissue cultu-re-induced genetic and epigenetic variation in triticale
(× Triticosecale spp. Wittmack ex A. Camus 1927) rege-nerants. Plant Molecular Biology. 89(3): 279–292. Orłowska, R., Machczyńska, J., Oleszczuk, S., Zimny, J.
i Bednarek, P. T. (2016). DNA methylation changes and TE activity induced in tissue cultures of barley (Hordeum
vulgare L.). Journal of biological research (Thessalonike,
Greece). 23: 19–19.
Tabela 1. ANOVA oraz średnie wartości charakterystyk metAFLP dla poszczególnych typów elementów mobilnych. TTCIV-całko-wita zmienność indukowana in vitro, SV-zmienność sekwencyjna, DMV-demetylacja, DNMV-de novo metylacja. Litery
oznaczają grupowanie wykonane testem Tukeya. F-wartość statystyki, p-prawdopodobieństwo.
Charakterystyki metAFLP ANOVA TTCIV SV DMV DNMV F 783,281 504,327 161,834 132,080 p 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 Elementy mobilne Retrotranspozony 14,59a 7,37a 1,68a 1,32a Transpozony DNA 39,00b 20,41b 6,91b 4,86b
Rysunek 1. Analiza aglomeracji (UPGMA) w oparciu o metodę Warda dla danych MSTD uzyskanych dla DNA ciętego enzymami Acc65I/MseI dla roślin donorowych (JDH68, JDH69, JDH70, JDH72) oraz ich regenerantów (oznaczenia 68-72
Komunikat
Short communication
BIULETYN INSTYTUTU HODOWLI I AKLIMATYZACJI ROŚLIN Nr 291 (1) / 2020: 63–65 E-ISSN: 2657–8913