Poszukiwanie regionów DNA sprzężonych
z tolerancją wegetatywnych podkładek
jabłoni na niskie temperatury poprzez analizę
transkryptomu i ocenę stopnia polimorfizmu genów
kandydujących
Identification of the genome regions correlated with cold hardiness of apple
rootstocks by transcriptomic analysis of differentially expressed candidate genes
Sylwia Keller-Przybyłkowicz
, Mariusz Lewandowski
Instytut Ogrodnictwa w Skierniewicach,
e-mail: sylwia.keller@inhort.pl, tel. 46 8345254
Prace zostały wykonane w ramach badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej na podstawie decyzji Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi nr HOR.hn.802.4.2019, Zadanie nr 73.
Słowa kluczowe: adnotacja, EST, jabłoń, NGS, qPCR, RNAseq, sekwencjonowanie transkryptom
Celem tematu była analiza fenotypowa 17 podkładek jabłoni z kolekcji IO w opar-ciu o ocenę nasilenia reakcji obronnej bada-nych roślin po przemrożeniu oraz ocena zmian ekspresji genów kandydujących (CG) (qPCR), wytypowanych na podstawie sekwencjonowania transkryptomu dwóch podkładek wzorcowych i zweryfikowanych dla 15 innych z kolekcji Insty-tutu dla poszerzenia dotychczasowej bazy marke-rów mrozoodporności.
Badania fenotypowe prowadzono na pod- kładkach jabłoni: P 2, P 14, P 16, P 22, P 59, P 60, P 66, P 67, P 68, M.7, M.9, M.26, MM.106, CG 11, CG 16, PB-4 i Antonówka (seria P – hodow-la polska, M/MM –Wielka Brytania, CG – USA, PB-4 –Białoruś, Antonówka – Rosja) sztucz-nie przemrażanych w komorze BINDER GmbH (temp: -10oC, -12oC i -14oC). Próby kontrolne stanowiły podkładki nie traktowane ww. tempe-raturami.
Ocenę stopnia reakcji badanych obiektów po zastosowaniu niskich temperatur, przepro-wadzono w układzie genotyp/podkładka/tempe-ratura. Dla wszystkich badanych podkładek wykonano pomiary: średnicy pędu przewodni-kowego podkładki (mm), stopnia regeneracji podkładek (skala 1‒5); wysokości pędu prze-wodnikowego podkładki (cm); długości przyro-stów jednorocznych (cm); świeżej masy korzeni podkładek (g).
W przeprowadzonym doświadczeniu zaob-serwowano, że żadna z zastosowanych ujemnych temperatur nie spowodowała śmierci całej puli podkładek reprezentujących wszystkie badane genotypy, niemniej kondycja roślin traktowanych była słabsza niż roślin kontrolnych.
Podkładki P 66, P 67 i P 68 wykazywały słab-szą reakcję na przemrażanie niż standardowe M.9 i M.26. Dla tych podkładek odnotowano więk-szy przyrost i średnicę pędu przewodnikowego, większą długość pędów bocznych, a także więk-szą świeżą masę korzeni niż dla podkładek M.9 i M.26.
Bazując na wartościach średnich badanych parametrów dla trzech temperatur w obrębie ocenianych podkładek można wyróżnić dwie grupy – mniej i bardziej wrażliwe na przema-rzanie. Do pierwszej grupy zakwalifikowa-no podkładki P 59, P 60, P 66, P 67, P 68, M.7, MM.106, PB-4 i Siewkę Antonówki, a do grupy drugiej podkładki P 2, P 14, P 16, P 22, CG 11, CG 16, M.9 i M.26.
Odczyty sekwencji transkryptomów genów o zróżnicowanej ekspresji oraz różnym typie regulacji (up/down regulation), uzyskanych z eksperymentów RNAseq (2015 – 2018) podda-no weryfikacji metodą qPCR. W tym celu, z tej samej puli 17 podkładek, do oceny zmian ekspresji genów kandydujących (CG) (qPCR) zachodzących w podkładkach wzorcowych oraz
w podkładkach z kolekcji Instytutu, wyizolowa-no matryce RNA (Zeng i Yang 2000). Całkowite RNA (1µg) poddano transkrypcji do stabilnego cDNA (AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit, Agilent). Do amplifikacji fragmentów dscDNA użyto par oligonukleotydów zaprojektowanych dla 30 adnotowanych genów (EST, analiza transkryp-tomu NGS 2017 i 2018) o zróżnicowanej ekspresji w genomach wzorcowych podkładek jabłoni trakto-wanych niskimi temperaturami.
W pierwszym etapie badań przeprowadzono ocenę zmian profilu 15 fragmentów EST (RNAseq 2017) w genomach 17 podkładek jabłoni. Wytypo-wane sekwencje genów kodują: białko z rodziny auksyn odpowiedzialnych za regulację procesów roślinnych w okresie ich spoczynku (dormancy), (Md285927, Md32326), komponenty błon komór-kowych oraz białka uczestniczące w transporcie między- i wewnątrzkomórkowym makrocząste-czek i jonów (Md432351, Md818613, Md240736, Md139165, Md165140, Md247173, Md843015, Md312901), białka z grupy hydrolaz o funkcji wiązania kationów – uczestniczące w metabolizmie wody (Md222724, Md425030), białko uczestni-czące w odpowiedzi komórek na czynniki stresu (Md835497), białko uczestniczące w produkcji i przemianie farnesanu (Md668869), który bierze udział w utrzymaniu osmozy komórkowej.
Na podstawie przeprowadzonej oceny zmian profili ekspresji badanych EST zaobserwowa-no: wzrost ilości transkryptu genów o adnotacji Md285927 oraz Md312901 w podkładkach wraż-liwych (M.9, MM106, CG11, PB4) po zasto-sowaniu odpowiednio temp. przemrażania -14 i -12°C. Ponadto spadek aktywności transkryptów w podkładkach tolerancyjnych P 66, P 60, P 2, CG16 odnotowano dla genów o adnotacjach Md8343015, Md247173, Md385927, Md139165 i Md668869 po zastosowaniu temp. -10 i -14°C, natomiast wzrost ekspresji badanych genów w tej samej puli przemrażanych podkładek zaobserwowano w przy-padku genów Md425030, Md222724, Md32326, Md163192. W wyniku analizy przeprowadzo-nej dla genu o adnotacji Md165140 odnotowano spadek ilości transkryptu u podkładek wrażliwych MM106, Antonówka, M.9 potraktowanych temp. -10°C, natomiast silny wzrost poziomu transkryp-tów genów Md318613 oraz Md240736 oszacowano dla puli wszystkich badanych podkładek traktowa-nych temp. -14°C.
W drugim etapie badań przeprowadzono ocenę zmian w profilu ekspresji kolejnych 30 EST (RNAseq 2018). Ocenę tą przeprowadzo-no dla podkładek wzorcowych: wrażliwej M.9
i tolerancyjnej P 60.
Wytypowane do badań geny: biorą udział w wiązaniu kationów regulujących reakcje chemiczne (Md280910 i Md154241); kodują biał-ka błon komórkowych oraz białbiał-ka transportowe (Md258197, Md141228, Md135041, Md241358, Md893990, Md786461, Md496872, Md228548, Md198091, Md255592, Md137638); kodują biał-ka z grupy hydrolaz, zawartych również chloro-plastach, (Md280910, Md154241, Md352930) jak również białka receptorowe błony komórkowej (Md773609) oraz białka aktywowane podczas czynników abiotycznych i uczestniczące w regula-cji komórkowych systemów naprawczych (Velasco i in. 2010, Bai i in. 2014)
Analiza sekwencji deEST wytypowanych z eksperymentu RNA-seq (sezon IV), przepro-wadzona dla podkładek wzorcowych M.9 (W) oraz P 60 (T) pozwoliła na zidentyfikowanie grupy genów podlegających inhibicji (Md141228, Md496812) oraz silnej aktywacji (Md467354, Md515106, Md629440, Md836749, Md920349) u obu przemrażanych podkładek.
Dla podkładki wrażliwej M.9 traktowanej temperaturą -10°C zaobserwowano aktywację genów o adnotacjach Md134238, Md198091, Md241358, Md255592, Md258197, Md352930 Md187047, Md230387, Md827881 oraz spadek aktywności genu Md893990. Natomiast w przy-padku podkładki tolerancyjnej P 60 ekspresja wyty-powanych genów była zależna od zastosowanej temperatury przemrażania. Dla genów o adnotacji Md141221, Md496812 oraz Md235041 odnoto-wano spadek ilości transkryptu po zastosowaniu temperatury -10oC, natomiast obniżenie tempe-ratury do -14°C powodowało wzrost aktywności ww. genów oraz dodatkowo genów o adnotacjach Md187047 oraz Md230387. Wzrost ekspresji genów, zależny od zastosowanej temperatury, odno-towano także dla genów Md134238, Md198091, Md255592, Md893990 (-12°C), Md241358 (-10°C) oraz Md258197, Md289101, Md352930 (-14°C).
Na podstawie analiz przeprowadzonych w oparciu o pomiary ekspresji wytypowanych sekwencji EST (2018), celem weryfikacji uzyska-nych profili ekspresji wytypowauzyska-nych dotychczas genów, przeprowadzono analizę porównawczą typu regulacji poziomu ich transkryptów (up/down regulation) w eksperymencie RNAseq oraz teście qPCR. Dla pięciu genów, spośród wytypowanych w roku bieżącym, odnotowano ten sam rodzaj regulacji w testach qPCR, jak i w eksperymen-tach RNAseq. Do grupy tej należą geny o adnota-cjach: Md258197, Md141228 (M.9, -10°C/down), Sylwia Keller-Przybyłkowicz, Mariusz Lewandowski
229
BIULETYN IHAR Nr 291 (1) / 2020 Md496812 (M.9, -12°C/down), Md893990 (P 60,
-12°C/up) i Md198091 (P 60, -10°C/down)
W ramach realizowanego zadania w wyniku przeprowadzonych testów walidacyjnych (RNAseq vs. qPCR) (Imelfort i Edwars 2009) dotychczas wytypowano 18 fragmentów EST, dla których odnotowano zróżnicowaną regulację w układzie genotyp/gen/temperatura przemrażania.
Sekwencje EST o potwierdzonym typie regu-lacji ekspresji, stanowić będą potencjalne markery funkcjonalne do monitorowana poziomu tolerancji podkładek jabłoni na stres niskich temperatur.
Wnioski
1. Podkładki P 66, P 67 i P 68 lepiej znoszą przemrożenie niż podkładki M.9 i M.26, można je więc uznać za tolerancyjne na stres niskich temperatur.
2. Poziom ekspresji badanych genów zależy od genotypu podkładki, badanej tkanki roślin-nej (ksylem/korzeń) i stosowaroślin-nej temperatury przemrażania.
3. Wytypowane i adnotowane sekwencje tran-skryptomu jabłoni poszerzają bazę danych, z której wstępnie wyłoniono 18 przypuszczal-nych markerów funkcjonalprzypuszczal-nych badanej cechy podkładek jabłoni.
Literatura
Bai Y, Dougherty, L., Xu, K. (2014). Towards an improved apple reference transcriptome using RNA-seq. Mol. Genet Genomics, vol. 289: 427–438.
Imelfort, M., Edwards, D. (2009). De novo sequencing of plant genomes using second-generation technologies.
Briefings in Bioinformatics, Vol. 10, Issue 6:609–618
Velasco, R., Zharkikh, A., Affourtit, J., Dhingra, A., Cesta-ro, A., Kalyanaraman, A., Fontana, P., et al. (2010). The genome of the domesticated apple (Malus x domestica Borkh.). Nature Genetics 42(10): 833–841.
Xu, (2010). The Apple genome: A delicious promise. New York Fruit Quarterly, 18(4)
Żurawicz, E., Lewandowski, M. (2014). Controlled Freezing as a Low-Temperature Tolerance Test for Apple Root-stocks. Acta Horticulture 1058: 451–456.
Komunikat
Short communication
E-ISSN: 2657–8913
Mariusz Lewandowski, Sylwia Keller-Przybyłkowicz, Edward Żurawicz