Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, e-mail: sylwia.mikolajczyk@up.poznan.pl
Prace zostały wykonane w ramach badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej na podstawie decyzji Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi, HOR.hn.802.9.2019, Zadanie nr 86.
Słowa kluczowe: androgeneza, , ISSR, kultury pylników, RAPD, SERC, SNAC1
Temat Badawczy 1:
Ocena przydatności wyselekcjonowanych markerów RAPD i ISSR do selekcji form o podwyższonej zdolności do androgenezy oraz analiza ekspresji 2 wybranych genów: SERC i
SNAC1.
Ze względu na szereg problemów związanych z indukcją haploidów żyta konieczne jest rozpo-znanie podłoża molekularnego procesu androge-nezy w połączeniu z poszukiwaniem markerów molekularnych powiązanych ze zdolnością do androgenezy żyta w aspekcie genetycznego uwarunkowania tej cechy.
Za odpowiedź w kulturach tkankowych żyta (TCR tissue culture responce) odpowiadają geny SERK (SERK – Somatic Embryogenesis Recep-tor-like Kinase). Geny SERK zostały uznane jako markery molekularne dla procesu embriogenezy somatycznej. Związek genów SERK z embrioge-nezą somatyczną został opisany u wielu gatunków między innymi Dactylis glomerata, Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula (Somleva i in., 2000; Hecht i in., 2001). Poziom ekspresji genów SERK wydaje się być kluczowym czynnikiem w różnicowaniu się komórek i oddziaływaniu auksyn na indukcję embriogenezy somatycznej (Santos i Aragão, 2009).
Kolejnym analizowanym genem był gen SNAC1, który odpowiada za reakcję na stres abiotyczny indukowany przez ABA (Taka-saki i in., 2015). Geny z rodziny czynników
transkrypcyjnych NAC odgrywają kluczową rolę w regulacji transkrypcji powiązanej z odpowie-dzią roślin na czynniki stresowe o charakterze abiotycznym i biotycznym (Nuruzzaman i in., 2013).
Celem tematu badawczego 1 była ocena poli-morfizmu DNA za pomocą markerów RAPD i ISSR oraz poszukiwanie markerów DNA powią-zanych z efektywnością indukcji androgenezy i regeneracji roślin zielonych w kulturach pylni-ków 16 genotypów żyta dla selekcji genotypów o wysokiej podatności na haploidyzację oraz analiza ekspresji genów SERK i SNAC1 techniką RT-PCR w aspekcie oceny ich przydatności do selekcji form o wysokiej embriogenności mikro-spor i poszukiwania form żyta o wysokiej embrio-genności mikrospor i pylników.
Wyniki:
Genotypy żyta (16 genotypów będących materiałami hodowlanymi o zróżnicowanym pochodzeniu) poddane indukcji androgenezy w kulturze pylników stanowiły materiał roślinny do analizy polimorfizmu DNA z zastosowaniem markerów RAPD i ISSR oraz analizy ekspre-sji genów SERK i SNAC1. Do analizy polimor-fizmu DNA techniką RAPD i ISSR zastosowano 40 starterów nukleotydowych, które wybrano na podstawie literatury i badań własnych.
Z przetestowanych 40 starterów oligonu-kleotydowych otrzymano polimorfizm prążko-wy, który pozwolił na określenie podobieństwa
BIULETYN IHAR Nr 291 (1) / 2020
68
genetycznego pomiędzy badanymi 16 obiekta-mi żyta. Podobieństwo genetyczne badanych 16 obiektów żyta za pomocą techniki RAPD mieści-ło się w zakresie od 74,4% pomiędzy genotypami S1321/18 i S1322/18 do 27,5% pomiędzy genoty-pami S1128/18 i PHR3/19. Podobne wartości podo-bieństwa genetycznego (GS) otrzymano techniką ISSR pomiędzy badanymi materiałami hodowlany-mi żyta wyniosło od 78% dla genotypów PHR3/19 i PHR5/19 do 23% dla S1128/18 i S1278/18.
Na podstawie analizy produktów otrzymanych w reakcji ze starterami specyficznymi dla genów SERK i SNAC1 stwierdzono obecność pojedyn-czych produktów polimorficznych niejednoznacz-nie różnicujących 16 badanych obiektów żyta. Na podstawie analizy ekspresji genów SERK i SNAC1 wykazano, że najwyższy średni wzrost poziomu ekspresji badanych genów stwierdzono po 2 i 7 dniach traktowania kłosów temperaturą 4oC, nato-miast po 14 dniach traktowania kłosów niską tempe-raturą poziom ekspresji 2 badanych genów spadał.
Wnioski:
W wyniku przetestowania 40 starterów (20 losowych 10 nukleotydowych dla RAPD i 20 o wybranej znanej sekwencji powtarzalnej nukleoty-dów dla ISSR) stwierdzono, że w reakcjach ISSR otrzymywano wyższą liczbę produktów, a wyniki analiz były bardziej powtarzalne.
Na podstawie analizy produktów otrzymanych w reakcji ze starterami specyficznymi dla genu SERK i SNAC1 stwierdzono, występowanie nielicznych produktów polimorficznych, który uniemożliwił jednoznaczne zróżnicowanie badanych obiektów żyta stąd zdecydowano o analizie poziomu ekspre-sji w/w genów dla wybranych genotypów.
Przeprowadzona analiza ekspresji genów SERK – genu określanego jako marker embriogenezy somatycznej i genu SNAC1 – odpowiadającego za reakcję na stres abiotyczny wykazała, że najsil-niejsza reakcja w postaci zmiany ekspresji bada-nych genów występuje po traktowaniu kłosów żyta temperaturą 4oC przez 2 i 7 dni w porównaniu z kontrolą. Otrzymane wyniki mogą wskazywać, że optymalnym czasem stosowania stresu termiczne-go jest chłodzenie kłosów żyta przez 2 i 7 dni gdyż wtedy najsilniej zmienia się ekspresja badanych genów.
Temat badawczy 2
Testowanie pożywek o najwyższej zdolności do indukcji androgenezy z dodatkiem nanomolekuł Cu i Zn w kulturze pylników i izolowanych mikrospor żyta.
W pracach dotyczących kultur pylników i
izolowanych mikrospor ryżu i jęczmienia podkre-ślana jest konieczność poszukiwania nowych rozwiązań metodycznych niezbędnych dla prze-łamania braku zdolności regeneracyjnych u tzw. „opornych genotypów” (Silva, 2010; Cistue i in., 1999). W temacie badawczym dotyczącym dosko-nalenia metod haploidyzacji żyta w kulturach pylni-ków przetestowano wpływ traktowania wstępnego kłosów i pylników temperaturą 4oC oraz dodatku jonów Zn i Cu na indukcję androgenezy i regenera-cję roślin haploidalnych żyta.
Stres termiczny wywoływany przez traktowa-nie kłosów żyta temperaturą 4oC jest niezbędny do zmiany rozwoju gametofitycznego mikrospor na sporofityczny. Badania nad androgenezą żyta wskazują, że najczęściej stosowanym czasem trak-towania kłosów temperaturą 4oC jest 14 do 21 dni w chłodni (Immonen i Tenhola-Roininen, 2003; Immonen i Anttila, 1998; Tenhola-Roininen i in., 2005; Ma i in., 2004). Immonen i Tenhola-Roininen (2003) podają, że bardzo oporne genotypy mogą wymagać dłuższego stresu niskiej temperatury, nawet powyżej 28 dni.
Celem tematu badawczego 2 była ocena wpływu zoptymalizowanego traktowania wstępnego kłosów żyta (temperatura 4oC) oraz dodatku do pożywki C17 jonów Zn i Cu na indukcję androgenezy i rege-nerację roślin w kulturach pylników i izolowanych mikrospor żyta.
Wyniki
Kultury pylnikowe zakładano w 2 warian-tach traktowania wstępnego kłosów (14 i 21 dni w temperaturze 4oC), a pylniki żyta wykładano na pożywkę C17 zawierającą mieszaninę auksyn (2,4-D i dikamby w proporcji 1 : 1 – kontrola) oraz pożywkę C17 kontrolną z dodatkiem Zn i Cu.
W trakcie realizacji tematu badawczego 2 wyłożono 43.200 pylników z 480 kłosów z 16 genotypów żyta wyprowadzonych w ramach usług badawczych, z których otrzymano 1372 kalusy mikrosporowe i 10 roślin zielonych. Średnia efek-tywność androgenezy na 100 wyłożonych pylników dla 16 badanych genotypów żyta, wynosiła 3,18%, a efektywność regeneracji roślin 0,03% w stosun-ku do liczby wyłożonych pylników, natomiast odsetek konwersji struktur kalusowych w rośliny zielone wynosił 0,73%. Najwyższą liczbę pylników tworzących struktury androgeniczne zaobserwo-wano dla genotypu PHR5/19 – 153 kalusy mikro-sporowe na pożywce z dodatkiem Zn po 21 dniach chłodzenia kłosów, dlatego wybrano w/w geno-typ do zakładania kultur izolowanych mikrospor. Genotyp PHR5/19 zregenerował także najwyższą liczbę roślin zielonych – 8 (2 rośliny na pożywce Sylwia Mikołajczyk, Agnieszka Tomkowiak, Dorota Weigt...
kontrolnej C17 i po 3 rośliny zielone na pożywce z dodatkiem Zn i Cu).
Wnioski
Traktowanie ściętych kłosów żyta temperaturą 4oC przez 21 dni było najefektywniejsze dla induk-cji androgenezy w kulturze pylników na pożywce C17 z dodatkiem Zn.
Na podstawie oceny efektywności indukcji androgenezy i regeneracji roślin w kulturach pylni-ków 16 genotypów żyta stwierdzono, że traktowanie pylników temperaturą 4oC przez 21 dni wpłynęło pozytywnie na analizowane parametry androgene-zy dla badanych 16 genotypów żyta, które tworandrogene-zyły struktury androgeniczne z wyższą efektywnością na 3 kombinacjach pożywki C17 (kontrola, dodatek Zn i Cu).
Literatura
Cistué, L., A. Ramos & A. M. Castillo (1999). Influence of anther pretreatment and culture medium composition on the production of barley doubled haploids from model and low responding cultivars. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 55: 159– 166.
Hecht, V., Vielle-Calzada, J.-P., Hartog m.V., Schmidt, E.D.L., Boutilie, K., Grossniklaus, U., de Vries, S.C. (2001). The Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENRSIS
RECEP-TOR KINASE 1 gene is expressed in developing ovules
and embryos and enhances embryogenic competence in culture. Plant Physiology 127: 803– 816.
Immonen, S., Anttila A. (1998). Impact of microspore
developmental stage on induction and plant regeneration in rye anther culture. Plant Sci., 139: 213– 222.
Immonen, S., Tenhola-Roininen, T. (2003). Protocol for rye anther culture. M. Maluszynski et al. (eds.), Doubled Haploid Production in Crop Plants, 141– 149.
Ma R., Y.-D. Guo & S. Pulli (2004). Comparison of anther and microspore culture in the embryogenesis and regeneration of rye (Secale cereale). Plant Cell Tiss. Org. Cult., 76: 147– 157.
Naruzzaman, M., Sharoni, A. M., Kikuchi, S. (2013). Roles of
NAC transcription factors in the regulation of biotic and
abiotic stress responses in plants. Frontiers in Microbio-logy 4: 248.
Santos, M. O., Aragão, F. J. L. (2009). Role SERK genes in plant environmental response. Plant Signaling & Beha-vior 4: 1111– 1113.
Silva, T. D. (2010). Indica rice anther culture: Can the impasse be surpassed? Plant Cell Tiss Organ Cult, 100 (1): 1– 11. Somleva, M. N., Schmidt, E.D.L., de Vries, S.C. (2000).
Embryogenic cells in Dactylis glomerata L. (Poaceae) explants identified by cell tracking and by SERC expres-sion. Plant Cell Reports 19: 718– 726.
Takasaki, H., Maruyama, K., Takahashi, F., Fujita, M., Yoshi-da, T., Nakashima k., Myouga, F., Toyooka, K., Yamagu-chi-Shinozaki k., Shinozaki, K. (2015). SNAC-As, stress responsive NAC transcription factors, mediate ABA-indu-cible leaf senescence. The Plant Journal 84: 1114– 1123. Tenhola-Roininen, T., Tanhuanpää, P., Immonen, S. (2005).
The effect of cold and heat treatment on the anther culture responce of diverse rye genotypes. Euphytica 145: 1– 9.
Komunikat
Short communication
BIULETYN INSTYTUTU HODOWLI I AKLIMATYZACJI ROŚLIN Nr 291 (1) / 2020: 71–72 E-ISSN: 2657–8913