Wyniki i dyskusja

Na podstawie emisyjnych widm fluorescencyjnych niemodyfikowanej (HSA) i glikowanej (gHSAGLC, gHSAFRC, gHSAGAL) albuminy wykreślono krzywe wygaszania fluorescencji makrocząsteczek (zależność F/F0 = f([AH]:[HSA])) o stężeniu 5 x 10^-6 mol/dm³ w obecności acetoheksamidu (AH) o wzrastającym stężeniu, dla obu stosowanych w doświadczeniu długości fali wzbudzającej λex 275 nm (Rys.2a) i λex 295 nm (Rys.2b).

Glikacja ludzkiej albuminy surowicy krwi wpływa na zdolność wygaszania fluorescencji HSA przez acetoheksamid. Dla białka modyfikowanego (gHSAGLC, gHSAFRC, gHSAGAL) następuje silniejsze wygaszenie fluorescencji niż dla HSA niemodyfikowanej (Rys.2). Silniejsze wygaszanie fluorescencji gHSAGLC, gHSAFRC, gHSAGAL świadczy o większej zdolności przejmowania energii przez AH od wzbudzonych fluoroforów albuminy glikowanej niż HSA niemodyfikowanej, co ma związek ze zmniejszeniem odległości między fluoroforem i lekiem wskutek zmian strukturalnych albuminy.

Tab.1. Położenie maksimów emisji fluorescencji λmax oraz ich przesunięcia ∆λmax dla układu AH-HSA, AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC, AH-gHSAGAL, λex 275 nm i λex 295 nm.

(-) oznacza przesunięcie krótkofalowe pasma

We wszystkich badanych układach AH-HSA, AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC i AH-gHSAGAL

w miarę wzrostu stężenia leku nastąpiło przesunięcie pasma emisji fluorescencji (∆λmax) w kierunku krótkofalowym względem maksimum emisji fluorescencji niezwiązanej albuminy. Przesunięcie hipsochromowe większe po wzbudzeniu fluorescencji albuminy długością fali λex 275 nm niż długością λex 295 nm oznacza, że nie tylko wokół Trp-214, ale również wokół reszt tyrozylowych rozmieszczonych w subdomenie IIA (Tyr-263), IB (Tyr-138, Tyr-140, Tyr-148, Tyr-150, Tyr-161), IIB (Tyr-319, Tyr-332, Tyr-334, Tyr-341, Tyr-353, Tyr-370) oraz IIIA (Tyr-401, Tyr-411, Tyr-452, Tyr-497) otoczenie staje się mniej polarne. Silniejsze przesunięcie ∆λmax w kierunku „blue”

powodowane rosnącym stężeniem leku w układzie AH-albumina o 2 nm dla gHSAGLC, 3 nm dla gHSAFRC i 6 nm dla gHSAGAL, w porównaniu do niemodyfikowanej HSA (∆λmax = -7 nm) (Tab.1) świadczyć może o wzroście charakteru hydrofobowego otoczenia reszty tryptofanylowej i/lub reszt tyrozylowych albuminy po glikacji.

Ujemne odchylenie krzywych Sterna-Volmera od prostoliniowej zależności F0/F = f[CAH] dla AH-HSA, AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC i AH-gHSAGAL (danych nie pokazano), wskazuje na złożony mechanizm wygaszania fluorescencji niemodyfikowanej i glikowanej HSA przez acetoheksamid, w którym obok wygaszania kolizyjnego, występuje również wygaszanie statyczne (formowanie się trwałego kompleksu lek-albumina w stanie podstawowym). Zgodnie z teorią Eftinka i Ghirona świadczy to o zajmowaniu przez AH w pierwszej kolejności łatwo dostępnych miejsc wiązania, a dopiero po ich nasyceniu pozostałych miejsc w makrocząsteczce (Eftink i Ghiron 1981;

Grigoryan i Ghazaryan 2013).

Tab.2 Wartości KSV [dm³mol^-1] oraz dostępność fluoroforów (fa) dla układu AH-HSA, AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC i AH-gHSAGAL, λex 275 nm i λex 295 nm.

*) niepewność pomiarowa

Większe wartości stałej Sterna-Volmera KSV otrzymane dla kompleksu AH-HSA w porównaniu ze stałymi KSV otrzymanymi dla AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC i AH-gHSAGAL (Tab.2) wskazują o lokowaniu się cząsteczek acetoheksamidu bliżej fluoroforów niemodyfikowanej

albuminy niż fluoroforów albuminy glikowanej. Wzbudzając fluorescencję albuminy długością fali λex 275 nm zaobserwowano emisję promieniowania pochodzącego nie tylko od reszty tryptofanu, ale również od reszt tyrozylowych. Gdy fluorescencję białek wzbudzano falą o długości λex 275 nm, otrzymano większe wartości stałych KSV dla wszystkich analizowanych układów, niż po wzbudzeniu promieniowaniem λex 295 nm. Świadczy to o udziale reszt tyrozylowych niemodyfikowanej i glikowanej HSA w oddziaływaniu acetoheksamid-albumina. Subdomena IIA ludzkiej albuminy surowicy krwi zawiera tylko jedną resztę tryptofanylową (Trp-214) i tyrozylową (Tyr-263), co wskazywałoby, iż w wiązaniu acetoheksamidu do albuminy biorą udział również inne subdomeny struktury III-rzędowej białka bogate w reszty Tyr (subdomena IB, IIB i IIIA). Joseph i wsp. dowiedli za pomocą techniki wysokosprawnej chromatografii powinowactwa (HPAC), że acetoheksamid wiąże się do glikowanej ludzkiej albuminy surowicy krwi zarówno w I (subdomena IIA), jak i II (subdomena IIIA) miejscu wiązania ligandów według Sudlowa (Joseph et al. 2010). Jako, że wartości stałej KSV i frakcji fa są odwrotnie proporcjonalne, zmniejszeniu KSV towarzyszy wzrost fa. Zaobserwowano, że glikacja zmniejsza siłę oddziaływania AH z fluoroforami albuminy i równocześnie zwiększa dostępność (fa) AH do reszty tryptofanylowej i reszt tyrozylowych HSA (Tab.2).

Skoro AH wysyca miejsca wiązania niemodyfikowanej i glikowanej HSA, korzystając z równania Scatcharda i izoterm wiązania wyznaczono stałe asocjacji Ka, które określają stabilność utworzonego kompleksu ligand-białko (Tab.3).

Tab.3 Stała asocjacji Ka oraz liczba cząsteczek AH związanych z jedną cząsteczką albuminy (n), wyznaczone z zależności Scatcharda (układ AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC, AH-gHSAGAL) i izoterm wiązania (układ AH-HSA), λex 275 nm i λex 295 nm.

*) niepewność pomiarowa

Model Scatcharda wiązania liganda do cząsteczki białka zakłada skończoną liczbę miejsc wiążących dla liganda, wówczas zależność Scatcharda (r/[Lf] = f(r)) ma przebieg prostoliniowy i przecina oś odciętych układu współrzędnych (oś r). Liniowy przebieg zależności r/[Lf] = f(r) dla układu AH-gHSAGLC, AH-gHSAFRC i AH-gHSAGAL wskazuje istnienie jednej klasy równocennych, niezależnych miejsc wiązania acetoheksamidu w strukturze albuminy (lub jednego miejsca wiązania) charakteryzujących się jednakową stałą asocjacji Ka. Z kolei dla układu AH-HSA zaobserwowano kształtem zbliżoną do hiperboli nieliniową zależność Scatcharda. Zjawisko to może wynikać z istnienia więcej niż jednej klasy miejsc wiążących ligand w HSA (wiązanie heterogeniczne), niespecyficznego charakteru wiązania AH z makromolekułą lub negatywnej kooperatywności. Po założeniu istnienia dwóch klas równocennych, niezależnych miejsc wiązania, parametry wiązaniadla kompleksu AH-HSA wyznaczono metodą nieliniowej regresji w oparciu o algorytm Levenberga-Marquardta. W pierwszej klasie miejsc wiązania, stałe asocjacji Ka wyznaczone dla kompleksu acetoheksamidu z białkiem glikowanym są mniejsze niż dla kompleksu acetoheksamidu z albuminą niemodyfikowaną (HSA > gHSAGAL > gHSAFRC > gHSAGLC) (Tab.3). Zarejestrowana średnia liczba cząsteczek AH związana z jedną cząsteczką albuminy glikowanej (n) jest większa od wartości n uzyskanej dla HSA niemodyfikowanej, co oznacza, że glikacja HSA zmniejsza trwałość (stabilność) wiązania leku przez albuminę, ale jednocześnie zwiększa liczbę cząsteczek AH wiążącą się do jednej cząsteczki białka. Do podobnych wniosków doszli Tsuchiya, Koyama i wsp., gdzie wykorzystując odpowiednio filtrację żelową i technikę wygaszania fluorescencji wykazali zmniejszenie powinowactwa acetoheksamidu do albuminy glikowanej (Tsuchiya, Sakurai et al. 1984; Koyama et

Acetoheksamid tworzy wiązania wodorowe w obrębie subdomeny IB, IIA, IIIA (Rys.3) makrocząsteczki z następującymi resztami aminokwasów: Asn-405, Arg-117, Arg-218, Arg-521, Tyr-138, Tyr-161, Tyr-401, Lys-195, Lys-199, Lys-525, Lys-402, Asp-351, Asp-549 oraz Cys-448, jak wskazuje teoretyczny model wiązania acetoheksamid do albuminy natywnej (HSA), skompleksowanej z glukozą (GLC-HSA) i fruktozą (FRC-HSA). Ponieważ energia wiązania kompleksu AH-albumina jest największa stwierdza się, że subdomena IIB makrocząsteczek nie wykazuje właściwości wiążących AH, co może także oznaczać, że kompleks jest najmniej stabilny (Tab.4).

Rys.3 Acetoheksamid (AH) w miejscu wiązania subdomeny IIIA albuminy surowicy krwi a) HSA, b) GLC-HSA, c) FRC-HSA, z zaznaczonymi wiązaniami wodorowymi (----) i resztami aminokwasów biorących udział w oddziaływaniu.

Struktura acetoheksamidu oraz rząd wielkości stałej asocjacji Ka, która charakteryzuje siłę wiązania leku do cząsteczki albuminy może świadczyć, że pomiędzy pierścieniami aromatycznymi AH, a aromatycznymi grupami aminokwasowymi niemodyfikowanej i glikowanej HSA dochodzi do interakcji typu π-π. Babu stwierdził, że oddziaływania tego typu polegają na tworzeniu tzw. struktur kanapkowych (struktura typu „sandwich”) między pierścieniami tryptofanu lub/i tyrozyn a lekiem

(Babu 2003). Oprócz wiązań wodorowych stabilizujących strukturę III-rzędową HSA, to oddziaływania π-π wspomagają utrzymywanie konformacji nowopowstałego kompleksu lek-albumina.

Tab.4 Energia wiązania kompleksu AH-HSA, AH-(GLC-HSA), AH-(FRC-HSA) otrzymana w CLC Drug Discovery Workbench ver. 1.0.2.

4. Wnioski

a) Acetoheksamid (AH) w badanym zakresie stężeń tworzy kompleks zarówno z albuminą niemodyfikowaną (HSA), jak i glikowaną (gHSAGLC, gHSAFRC, gHSAGAL) w specyficznych dla niego miejscach wiążących oraz niespecyficznie oddziałuje z hydrofobowymi fragmentami powierzchni makrocząsteczek.

b) Glikacja zmniejsza powinowactwo AH do jego miejsc wiązania w strukturze albuminy, bądź tak zmienia strukturę HSA, że wiązanie AH do zmienionej konformacji albuminy staje się trudniejsze.

c) Jak wskazuje teoretyczny model wiązania acetoheksamidu do albuminy natywnej (HSA), skompleksowanej z glukozą (GLC-HSA) i fruktozą (FRC-HSA), acetoheksamid tworzy wiązania wodorowe w obrębie subdomeny IB, IIA, IIIA makrocząsteczki. Aminokwasy subdomeny IIB nie biorą udziału w tworzenie kompleksu HSA, (GLC-HSA) i AH-(FRC-HSA).

Badania przeprowadzone w niniejszej pracy sugerują potrzebę opracowania indywidualnego planu dawkowania leków (zwłaszcza o niskim wskaźniku terapeutycznym) u osób, u których istnieje podejrzenie występowania albuminy o zaburzonej strukturze i zdolności wiążącej, obarczonych schorzeniami przewlekłymi np. cukrzycą. Ponieważ lek w formie związanej do albuminy nie wykazuje aktywności farmakologicznej, a jedynie frakcja wolna może wywołać oczekiwany efekt terapeutyczny bądź toksyczny, znajomość aktywności wiążącej białek pozwoli uzyskać satysfakcjonujące rezultaty wybranej terapii.

Praca zrealizowana ze środków finansowych umowy realizowanej przez Młodego Naukowca nr:

KNW-2-O18/N/8/N i KNW-2-O14/N/9/K oraz umowy statutowej KNW-1-033/N/9/O.

5. Literatura

Ahmed N, Thornalley PJ (2007) Advanced glycation endproducts: what is their relevance to diabetic complications? Diabetes Obes Metab 9: 233–245.

Artali R, Bombieri G, Calabi L et al. (2005) A molecular dynamics study of human serum albumin binding sites. II Farmaco 60(6): 485–495.

Babu MM (2003) NCI: a server to identify non-canonical interactions in protein structures. Nucleic Acids Res 31(13): 3345–3348.

Broderson R, Sjodin T, Sjoholm I (1977) Independent binding of ligands to human serum albumin.

J Biol Chem 252: 5067–5072.

Carter DC, He XM (1990) Structure of serum albumin. Science 249: 302–303.

Eftink MR, Ghiron CA (1981) Fluorescence quenching studies with proteins. Anal Biochem 114:

199–227.

Grigoryan KR, Ghazaryan AG (2013) Quenching mechanism of human serum albumin fluorescence by Gangleron. Chem Biol 2: 6–10.

Hiratsuka T (1990) Conformational changes in the 23-kilodalton NH2-terminal peptide segment of myosin ATPase associated with ATP hydrolysis. J Biol Chem 265(31): 18786–18790.

Joseph KS, Anguizola J, Jackson AJ et al. (2010) Chromatographic analysis of acetohexamide binding to glycated human serum albumin. J Chromatogr B 878(28): 2775–2781.

Koyama H, Sugioka N, Uno A et al. (1997) Effects of glycosylation of hypoglycaemic drug binding to serum albumin. Biopharm Drug Dispos 18: 791–801.

Lakowicz JR (2006) Principles of Fluorescence Spectroscopy. New York: Springer.

Nawale RB, Mourya VK, Bhise SB (2006) Non-enzymatic glycation of proteins: a cause for complication in diabetes. Indian Biochem Biophys 43: 337–344.

Rondeau P, Bourdon E (2011) The glycation of albumin: structural and functional impacts.

Biochimie 93: 645–658.

Szkudlarek A, Pożycka J, Maciążek-Jurczyk M (2019) Influence of piracetam on gliclazide-glycated human serum albumin interaction. A spectrofluorometric study. Molecules 24(1): 111.

Taira Z, Terada H (1985) Specific and non-specific ligand binding to serum albumin. Biochem Pharm 34(11): 1999–2005.

Tsuchiya S, Sakurai T, Sekiguchi SI (1984) Nonenzymatic glucosylation of human serum albumin and its influence on binding capacity of sulfonylureas. Biochem Pharmacol 33: 2967–2971.

Zhang Q, Ames JM, Smith RD et al. (2009) A perspective on the Maillard reaction and the analysis of protein glycation by mass spectrometry: probing the pathogenesis of chronic disease. J Proteome Res 8(2): 754–769.

Zuwała-Jagiełło J (2009) Terapia chorób z udziałem końcowych produktów zaawansowanej glikacji w ich patogenezie. Pol Merk Lek XXVII: 152–158.