Helena Puzanowska-Tarasiewicz, Barbara Starczewska, Ludmiła Kuźmicka
REAKTYWNE FORMY TLENU
Zakład Chemii Ogólnej i Nieorganicznej Instytutu Chemii Uniwersytetu w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. H. Puzanowska-Tarasiewicz
Hasła kluczowe: tlen, reaktywne formy tlenu, antyoksydanty. Key words: oxygen, reactive oxygen species, antioxidants.
Tlen jest składnikiem powietrza (20,95% obj.), wody (89% mas.) i litosfery (47,3% mas.). Jako cząsteczka może występować w stanie singletowym i trypleto-wym. W stanie podstawowym występuje w formie trypletowej, gdyż ma dwa nie-sparowane elektrony. Wykazuje właściwości paramagnetyczne i zachowuje się jak miniaturowy magnes – jest przyciągany przez pole magnetyczne.
Tlen singletowy jest bardziej reaktywny od tlenu w stanie trypletowym. W celu wyjaśnienia dlaczego, należy dokonać analizy rozkładu elektronów na orbitalach molekularnych tlenu (ryc. 1).
Ryc. 1. Rozkład elektronów na orbitalach molekularnych tlenu oraz w anionorodniku ponadtlenkowym (1). a – tlen w stanie podstawowym – trypletowy, określany symbolem 3Σ
g O2; b, c – dwie formy tlenu
single-towego: jedna 1Δ
g O2 i druga 1Σg+ O2; d –anionorodnik ponadtlenkowy O2• . Strzałki symbolizują elektrony,
a ich zwroty spiny elektronów.
Fig. 1. Distribution of electrons on the molecular orbitals of oxygen and superoxide anion radical. a – base state – triplet oxygen 3Σ
g O2; b, c – two forms of singlet oxygen, 1Δg O2 and 1Σg+ O2; d – superoxide
Jak wynika z diagramu, tlen w stanie podstawowym (trypletowy, określany w spektroskopii symbolem 3Σ
g O2) jest birodnikiem, natomiast jedna z form tlenu singletowego 1∆
g O2 nie jest wolnym rodnikiem (ma dwa sparowane elektrony na jednym orbitalu π*2p), druga zaś forma 1Σ
g + O
2 ma po jednym elektronie na każdym z orbitali π*2p.
Aby cząsteczka tlenu w stanie trypletowym utleniła inną cząsteczkę i uległa dwuelektrodowej redukcji, musiałaby przyjąć od utlenianej cząsteczki dwa elektro-ny, przy tym oba te elektrony musiałyby mieć równoległe spiny i być skierowane przeciwnie w stosunku do spinów dwóch niesparowanych elektronów na orbitalach
* p 2 y
π , *2p
z
π . Wymaga to, aby utleniana cząsteczka była również w stanie trypleto-wym – o co nie łatwo, gdyż stan podstawowy większości cząsteczek organicznych jest stanem singletowym. Tlen trypletowy ma więc trudności ze znalezieniem odpo-wiednich partnerów do reakcji dwuelektronowej i dlatego reaguje z wieloma związ-kami jednoelektronowo – przyjmując od nich jeden elektron. Produktem tej reakcji jest anionorodnik ponadtlenkowy O2• − cząsteczka, która jest wolnym rodnikiem (posiada jeden niesparowany elektron) i anionem (ładunek ujemny spowodowany jest posiadaniem dodatkowego elektronu).
Znacznie bardziej reaktywny jest tlen singletowy 1O
2 powstający w wyniku wzbu-dzenia cząsteczek tlenu. Wymaga to dostarczenia energii wystarczającej na takie sparowanie elektronów w cząsteczce tlenu, aby spin wypadkowy cząsteczki wynosił zero (1). Wzbudzenie trypletowej cząsteczki tlenu do stanu singletowego może na-stąpić w wyniku zaabsorbowania kwantu promieniowania nadfi oletowego lub pro-mieniowania o wyższej energii oraz niektórych reakcji chemicznych.
Tlen singletowy oddziałuje z innymi cząsteczkami na dwa sposoby:
• przekazuje energię wzbudzenia cząsteczkom przechodząc w stan trypletowy, jest to tzw. „gaszenie” tlenu singletowego;
• wchodzi w reakcję chemiczną, np. z cholesterolem i tryptofanem.
Najbardziej podatnymi na uszkodzenie przez tlen singletowy są reszty amino-kwasowe białek – histydyny, tryptofanu, metioniny i cysteiny oraz składniki kwa-sów nukleinowych - reszty purynowe, pirymidynowe i guanina (1). Pomimo, że tlen uszkadza składniki komórek, to bez tlenu nie ma życia.
Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem. Utlenia związki organiczne pobierając od nich elektrony, a sam ulega redukcji. Całkowita, czteroelektronowa redukcja czą-steczki tlenu (O2 + 4 H
+ + 4 e → 2 H
2O) z wytworzeniem wody jest utrudniona. Wiadomo jednak, że większość związków organicznych, z którymi tlen mógłby re-agować w komórkach, to związki w stanie singletowym, tzn. że spiny wszystkich elektronów w atomach tworzących cząsteczki uległy sparowaniu i wypadkowy spin każdej cząsteczki tych związków równy jest zeru. Woda, produkt redukcji tlenu, jest również cząsteczką w stanie singletowym.
Tlen, nie mogąc znaleźć partnerów do reakcji czteroelektronowej, wstępuje na dro-gę reakcji jednoelektronowej, tworząc anionorodnik ponadtlenkowy: O2 + e → O2•
Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego lub dwóch elektronów do cząsteczki tlenu – co jest trudne ale możliwe, powoduje powstanie nadtlenku wodoru: O2• + 2 H
+ + e → H
2O2 ← O2 + 2 H
+ + 2 e . Nadtlenek wodoru jest mniej reaktywny niż większość wolnych rodników, tj. atomów lub cząsteczek
zdol-nych do samodzielnego istnienia, mających jeden lub więcej niesparowazdol-nych elek-tronów. Jest on jednak bardziej reaktywny od tlenu cząsteczkowego O2 . Anionorod-nik ponadtlenkowy, O2• , może w roztworze wodnym przyłączyć proton i utworzyć rodnik wodoronadtlenkowy: O2• + H
+ → HO
2•
Produktem przyłączenia trzech elektronów do cząsteczki tlenu (co zachodzi na szczęście niezbyt łatwo) jest rodnik hydroksylowy •OH – jeden z najbardziej reak-tywnych utleniaczy w układach biologicznych. Do zajścia reakcji anionorodnika ponadtlenkowego, nadtlenku wodoru i rodnika hydroksylowego nie jest istotne, aby partner był w stanie trypletowym.
Wszystkie wymienione produkty redukcji i wzbudzenia tlenu są bardziej reak-tywne niż cząsteczka tlenu w podstawowym stanie trypletowym. Z tego powodu określane są one różnie – jako „aktywne formy tlenu”, „reaktywne formy tlenu”, czy „reaktywne metabolity tlenu”. Niektórzy autorzy proponują używanie zwrotu „wolne rodniki tlenowe”. Zwrot ten uwzględnia jedynie O2• i •OH, podczas gdy ak-tywnymi formami są H2O2 (który nie jest rodnikiem) i tlen singletowy (1).
Obok wymienionych powyżej reaktywnych form tlenu (RFT), będących głów-ną przyczygłów-ną toksyczności tlenu, organizmy żywe mogą zetkgłów-nąć się z pokrewnymi formami tlenu, np. alotropową odmianą tlenu – ozonem O3, czy związkami tworzą-cymi się w reakcjach metabolicznych: NO•, NO2•, HONO2 , HOCl, HOBr, HOBr (2). Reakcje RFT z cząsteczkami organicznymi prowadzą do powstania wolnych rodników substancji organicznych: RO•, ArO•, ROO•. Mogą to być rodniki, w któ-rych niesparowany elektron znajduje się na atomie węgla lub innego pierwiastka, np. azotu.
P o w s t a w a n i e r e a k t y w n y c h f o r m t l e n u
Reaktywne formy tlenu znajdują się w wodzie, powietrzu oraz mogą powstawać w organizmach żywych wskutek działania zewnętrznych czynników fi zycznych, np. promieniowania jonizującego i nadfi oletowego, ultradźwięków. Promieniowanie jo-nizujące powoduje jonizację oraz wzbudzenie cząsteczek wody (radiolizę) z wy-tworzeniem rodników hydroksylowych: H2O→ H2O+ + e; H2O→ H2O* (wzbudzona cząsteczka); H2O*→ H• + •OH; H2O++ H2O → H3O++ •OH. W wyniku oddziaływa-nia pomiędzy produktami radiolizy wody − H• i •OH powstają m.in. cząsteczki wo-doru H2 i nadtlenku wodoru. Odpowiednio dobierając warunki napromieniowania, można stworzyć sytuacje, w których dominować będzie jeden typ RFT (1).
Absorpcja promieniowania nadfi oletowego przez cząsteczki prowadzi do wzbu-dzenia, jonizacji lub rozpadu cząsteczek. Podobnie wysoka temperatura i wyłado-wania atmosferyczne powodują rozpad cząsteczek tlenu na atomy, które reagując z innymi cząsteczkami tlenu, tworzą ozon O3: O2 → O + O; O + O2 → O3. Ozon atmosferyczny, pojawiający się często jako składnik smogu spowijającego miasta, jest również reaktywną formą tlenu (bardziej reaktywny niż tlen trypletowy). W roztwo-rach wodnych rozpada się, tworząc rodniki •OH i HO2• oraz H2O2. Wdychanie ozonu niszcząco wpływa na nasze płuca i inne tkanki (m.in. serca, wątroby, mózgu) (3).
Szereg związków określanych jako fotosensybilizatory (światłouczulacze) po za-absorbowaniu kwantu światła może przechodzić w stan wzbudzony, tj. ze stanu sin-gletowego w stan trypletowy i reagować z tlenem trypletowym. W wyniku reakcji wytwarza się anionorodnik ponadtlenkowy, np. w fotoredukcji rybofl awiny (1).
Nie tylko fotoredukcja prowadzi do wytwarzania anionorodnika ponadtlenkowe-go, ale także obecność zredukowanych form niskocząsteczkowych (RH2) składni-ków komórek, np. zredukowana rybofl awina, cukry o właściwościach redukujących (glukoza), związki tiolowe (cysteina, glutation): RH2 + O2 → RH + H
+ + O 2• (1). Działanie na roztwory wodne ultradźwiękami, czyli tzw. sonikacja roztworów, prowadzi do powstawania w tych roztworach RFT. I tak w wyniku sonikacji, czyli sonolizy wody tworzą się atomy wodoru i rodniki •OH. Rekombinacja rodników
•OH prowadzi do powstawania H
2O2. W roztworach wodnych, zawierających tlen, atomy wodoru reagują z O2 tworząc HO2• . Sonikacja napowietrzonych roztworów wodnych prowadzi do powstawania NO• (1, 4).
Jednoelektronowemu utlenianiu mogą ulegać substancje obce dla organizmu (ksenobiotyki), które znajdują się w organizmie jako leki lub składniki pożywienia. Podobnie, jak w przypadku fotosensybilizatorów, ksenobiotyki ulegają w komór-kach cyklicznej redukcji i cyklicznie reagują z tlenem (cykle redoks „napędzane” są jednak nie przez światło, lecz przez metabolizm komórki) (1). Ten ostatni problem nabiera znaczenia, jeśli weźmiemy pod uwagę trucizny stosowane do zwalczania szkodników, np.fungicydy, herbicydy, insektycydy. Mechanizm toksyczności wielu z tych związków polega na wytwarzaniu RFT.
W organizmach żywych przebiegają również procesy utleniania białek oddecho-wych, tj. hemoglobiny i mioglobiny. Zarówno hemoglobina – obecna w czerwo-nych krwinkach, jak i mioglobina występująca w mięśniach zawierają jako grupę prostetyczną – hem. W grupach hemowych obecne są jony żelaza Fe2+, które pod wpływem tlenu mogą się łatwo utleniać do jonów żelaza Fe3+ : hem-Fe2+ + O
2 →
hem-Fe3+ + O
2• . W przypadku hemoglobiny i mioglobiny jon Fe2+ jest silnie zwią-zany z hemem białek oddechowych, dlatego jest mniej podatny na utlenianie, jed-nak może temu procesowi ulec. W krwinkach czerwonych człowieka w ciągu doby ok. 3% hemoglobiny ulega utlenieniu do methemoglobiny – formy niezdolnej do przenoszenia O2. Reakcja ta jest głównym źródłem O2• . Krwinki zawierają jednak enzym reduktazę methemoglobinową, który redukuje methemoglobinę do hemo-globiny (5). Źródłem O2• w mięśniach jest utlenianie białka oddechowego mięśni - mioglobiny.
W obecności donorów elektronów (D), np. azotanów(III), aminofenoli może prze-biegać dwuelektronowa redukcja O2 związanego z hemoglobiną i powstawać H2O2: hem−Fe2+−O 2 + D ⎯⎯ →⎯ + H 2 hem−Fe3+ + H 2O2 + Dutl. (2).
Źródłem O2• i H2O2 w komórkach są niektóre reakcje enzymatyczne, przebiega-jące np. z udziałem oksydazy ksantynowej. Enzym ten może redukować cząsteczkę tlenu zarówno jedno-, jak i dwuelektronowo w zależności od stężenia O2 i pH roz-tworu. W komórkach możliwa jest także czteroelektronowa redukcja tlenu przebie-gająca w mitochondriach – w głównym miejscu komórki, w którym zużywany jest tlen. W zachodzącym w mitochondriach cyklu Krebsa dwuwęglowe reszty zwią-zane z koenzymem A (tj. acetylokoenzym A) utleniane są do CO2 i H2O. Energia uwalniana podczas tego procesu wykorzystywana jest do syntezy ATP (6).
Powstające RFT rozpadają się lub wchodzą w reakcje ze składnikami komórek (uszkadzają główne klasy składników komórek – związki niskocząsteczkowe, biał-ka, lipidy i kwasy nukleinowe) (1). W komórkach istnieje równowaga pomiędzy szybkością tworzenia RFT a szybkością ich zaniku.
Z rozważań wynika, że O2• i H2O2 są nieuniknionymi produktami ubocznymi wie-lu reakcji przebiegających w komórkach aerobowych. Znacznie bardziej reaktywny niż O2• i H2O2 jest rodnik hydroksylowy •OH. Początkowo zakładano, że powstaje on w reakcji Habera-Weissa: O2• + H2O2 → •OH + OH
− + O
2 (7). Stwierdzono jed-nak, że w/w reakcja w warunkach zbliżonych do fi zjologicznych nie ma praktycz-nego znaczenia. Obecnie przyjęta koncepcja zakłada istnienie cyklu dwóch reakcji: jedna z nich to reakcja Fentona (utlenianie Fe2+ za pomocą H
2O2), druga – reakcja regeneracji jonu Fe2+ (2). Fe2+ + H 2O2 → •OH + OH − + Fe3+ ; O 2• + Fe 3+ → O 2 + Fe 2+
Sumując oba równania otrzymujemy reakcję Habera-Weissa katalizowaną przez jony żelaza (7):
O2• + H2O2 •OH + OH− + O2
Krótkie przypomnienie: rodnik hydroksylowy •OH to zupełnie co innego niż anion wodorotlenkowy OH− (OH− to anion tworzący się w reakcji dysocjacji elek-trolitycznej).
Obecność jonów żelaza (Fe2+/Fe3+) w bardzo małych stężeniach lub jonów miedzi (Cu+/Cu2+) głównie związanych z białkami, a także innych metali przejściowych (manganu, chromu, kobaltu, niklu) jeszcze w niższych stężeniach niż jonów żelaza i miedzi może katalizować w/w reakcję (1). Jony metali przejściowych mają niespa-rowane elektrony w powłokach walencyjnych i dlatego można je uznać za wolne rodniki, np.:
Fe3+... 3d5 Cu2+... 3d9
Niektóre jony metali przejściowych, jako niezbędne składniki komórek żywych, mogą występować na różnych stopniach utlenienia. Oznacza to możliwość ich utle-niania w reakcji z tlenem lub H2O2 i redukcji przez inne substancje, a tym samym katalizowania przez te jony reakcji prowadzących do powstania RFT.
W podsumowaniu można stwierdzić, że część RFT to wolne rodniki, które cha-rakteryzuje na ogół wysoka reaktywność. Dążąc do sparowania elektronów – po-zbycia się nadmiarowego elektronu lub przyłączenia elektronu do innej cząsteczki, zazwyczaj szybko wchodzą w reakcje z wieloma cząsteczkami.
D z i a ł a n i e R F T w ż y w y c h o r g a n i z m a c h
Reaktywne formy tlenu znane są z dwojakiego działania w żywych organizmach. Z jednej strony są one potrzebne do prawidłowego funkcjonowania komórek, m.in. do regulacji procesów naprawczych w komórkach, ekspresji genów, regulacji me-tabolizmu, przekazywania sygnału mutagennego (8), ale mogą być również bardzo szkodliwe (2). Coraz więcej wyników badań świadczy o tym, że szlaki przewod-nictwa wewnątrzkomórkowego są aktywowane przez zmiany równowagi redoks z udziałem RFT, np. ozonu, H2O2. Wiadomo także, że działanie podwyższonych stę-żeń RFT jest przyczyną wielu chorób cywilizacyjnych, tak jak cukrzyca, miażdżyca uszkodzenie mięśnia sercowego lub mózgu (2). Przekroczenie określonych stężeń RFT w komórkach powoduje groźne dla organizmu konsekwencje i określane jest mianem stresu oksydacyjnego (9), który odpowiada za powstawanie wielu chorób.
Najczęściej badanym procesem, związanym ze skutkami zachodzenia w organi-zmie reakcji z RFT, jest peroksydacja lipidów. Przez peroksydację lipidów rozu-miemy wolnorodnikowy proces utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, w którym powstają nadtlenki tych związków (z ang. nadtlenek to peroxide). Peroksydacja lipidów, jak każdy proces wolnorodnikowy, składa się z trzech etapów: inicjacji, propagacji (prolongacji), terminacji.
Inicjacja peroksydacji lipidów polega na oderwaniu atomu wodoru od cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub reszty takiego kwasu wchodzącego w skład fosfolipidu. Reakcja inicjacji przekształca cząsteczkę kwasu tłuszczowego w wolny rodnik alkilowy L•, gdyż przy atomie węgla, który stracił atom wodoru, pozostaje niesparowany elektron. Do czynników odrywających wodór od wielo-nienasyconego kwasu tłuszczowego (L), inicjującego peroksydację lipidów należy zaliczyć rodnik hydroksylowy •OH oraz rodniki: nadtlenkowy LOO•, alkoksylowy LO•, bądź alkilowy L• substancji obecnych w komórce. Peroksydację lipidów mogą też inicjować: ozon, NO, NO2, SO2 oraz kationorodniki – ferrylowy bądź nadferry-lowy oraz kompleks Fe2+-O
2-Fe3+ (1).
Należy zaznaczyć, że naturalnie występujące kwasy tłuszczowe nie zawierają sprzężonych wiązań podwójnych. Pojawienie się tych wiązań jest możliwe podczas procesu peroksydacji. Do wiązań podwójnych może przyłączać się ozon bądź tlen singletowy. In vivo procesowi peroksydacji ulegają przede wszystkim reszty wielo-nienasyconych kwasów tłuszczowych wchodzące w skład fosfolipidów, gdyż fosfo-lipidy są głównym składnikiem budulcowym błon komórkowych, a wolne kwasy tłuszczowe występują w błonach w bardzo małych ilościach.
Przebieg procesu peroksydacji lipidów można przedstawić w trzech etapach (10): – inicjacja: LH + O2 → L• + HOO• ; 2 LH + O2 → 2 L• + H2O2
– propagacja: L• + O2 → LOO• ; LOO• + LH → LOOH + L• ; LOOH → LO• + •OH – terminacja: L• + L• → L−L ; L• + LOO • → LOOL ; LOO• + LOO• → LOOL + O2
Wolne rodniki powstające w procesach peroksydacji lipidów mogą reagować z białkami. W rezultacie powstają wolne rodniki białek, które mogą uczestniczyć w reakcjach terminacji, tworząc mieszane połączenia białkowo-lipidowe.
W procesie peroksydacji lipidów może wystąpić zjawisko reinicjacji polegające na tym, że nadtlenki lipidów (nierodnikowe produkty peroksydacji) mogą ulegać rozkła-dowi i prowadzić do ponownego powstania wolnych rodników. Rozpad taki inicjowa-ny może być przez joinicjowa-ny metali przejściowych, głównie joinicjowa-ny żelaza i miedzi (1):
LOOH + Fe2+ → LO• + OH− + Fe3+ ; LOOH + Fe3+ → LOO• + H+ + Fe2+ Dalsze przemiany produktów peroksydacji, zachodzące w wyniku reakcji β-eli-minacji, prowadzą do rozpadu reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i powstania aldehydów (np. dialdehydu malonowego), hydroksyaldehydów i węglo-wodorów (np. etanu, pentanu). Im więcej wiązań podwójnych zawiera reszta kwasu tłuszczowego, tym łatwiej ulega ona peroksydacji. Optymalne parcjalne ciśnienie tlenu w tym procesie waha się w granicach 1–10 mm Hg. Wcale nie jest więc tak, że im więcej tlenu, tym szybsza peroksydacja lipidów (1).
Przedstawiony powyżej opis peroksydacji lipidów to proces nieenzymatyczny. Powstawanie wielu ważnych biologicznie związków, np.prostaglandyn,
trombok-sanów czy leukotrienów z kwasu arachidonowego inicjowana jest przez reakcje peroksydacji. Reakcje te katalizowane są przez cykloksygenazę i lipoksygenazy – enzymy katalizujące wbudowanie cząsteczki tlenu w określoną pozycję cząstecz-ki kwasu tłuszczowego, w wyniku czego powstają nadtlencząstecz-ki kwasów tłuszczowych (1). Produkty końcowe procesu peroksydacji lipidów, zwłaszcza aldehydy, są mniej reaktywne niż wolne rodniki. Reagują jednak z grupami tiolowymi białek oraz z resztami aminokwasów, np. lizylowymi, histydylowymi, arginylowymi, tyrozylo-wymi. Mogą zmieniać właściwości antygenowe białek, z którymi się łączą i hamo-wać aktywność szeregu enzymów, co prowadzi m.in. do hamowania replikacji DNA (11). Produkty peroksydacji lipidów modyfi kują także właściwości fi zyczne błon komórkowych, osłabiają zależność pomiędzy transportem elektronów przez łańcuch oddechowy a syntezą ATP w mitochondriach.
Reakcje reaktywnych form tlenu z białkami prowadzą do modyfi kacji reszt ami-nokwasowych, modyfi kacji grup prostetycznych (czyli nieaminokwasowych skład-ników białek złożonych) oraz agregacji lub fragmentacji cząsteczek białkowych (1). Reakcja rodnika hydroksylowego •OH z białkami (B) powoduje oderwanie atomu wodoru od cząsteczki białkowej. Niesparowany elektron zlokalizowany początko-wo na atomie, od którego oderwany został początko-wodór (B−H + •OH → B• + H2O) może ulegać przemieszczeniu w cząsteczce białka i umiejscowić się na jednej z reszt aminokwasowych, np. na resztach cysteiny (białko1−Cys−S• + •S−Cys−białko2 → białko1−Cys−S−S−Cys−białko2. Rekombinacja wolnych rodników białkowych pro-wadzi do powstania dimerów białkowych (1). Działanie promieniowania jonizu-jącego na roztwory białek w warunkach tlenowych prowadzi z kolei do fragmen-tacji cząsteczek białkowych, napromieniowanie zaś w warunkach beztlenowych – do agregacji. Szczególnie wrażliwe na uszkodzenia oksydacyjne są oprócz reszt cysteiny – reszty metioniny, tyrozyny, argininy, tryptofanu, lizyny, proliny, histy-dyny, fenyloalaniny (np. utlenianie reszt metioniny niektórych białek prowadzi do utraty funkcji biologicznej białka) (11). Reakcje RFT z białkami powodują nie tyl-ko utlenianie białek, ale także powstanie w białkach grup redukujących, zdolnych do redukcji cytochromu C i jonów metali. Reakcje z RFT mogą prowadzić do po-wstawania nadtlenków aminokwasów i białek oraz uszkodzeń zasad nukleinowych i kwasów nukleinowych.
Kwasy nukleinowe są związkami bardziej stabilnymi niż białka i lipidy, odpo-wiadają bowiem za powielanie, przechowywanie i przekazywanie informacji ge-netycznej. Nadtlenek wodoru H2O2 i anionorodnik ponadtlenkowy O2• nie powo-dują uszkodzeń składników kwasów nukleinowych. Natomiast rodnik hydroksy-lowy •OH może uszkodzić zasady nukleinowe, reszty cukrowe (np. deoksyrybozę w DNA, rybozę w RNA) lub rozerwać wiązania fosfodiestrowe łączące nukleotydy. Uszkodzenia te stara się organizm „naprawić”, gdyż DNA jest zbyt ważny, aby jego uszkodzenia pozostawić. Uszkodzone zasady są „wycinane” z DNA i w znacznej mierze nie metabolizowane dalej, lecz wydalane z komórek organizmu. Oceniono, że liczba uszkodzeń DNA przez endogenne RTF w przeciętnej komórce człowieka jest rzędu 104 na dobę (1).
Reaktywne formy tlenu mogą uszkodzić cukrowce lub reszty sacharydowe bia-łek, np. mukopolisacharyd – kwas hialuronowy (istotny składnik mazi stawowej). Stwierdzono, że działanie RFT na roztwory kwasu hialuronowego powoduje
rozry-wanie wiązań glikozydowych pomiędzy monomerami, czyli depolimeryzację wie-locukru, co prowadzi do zmniejszenia lepkości roztworów kwasu (nie pozostaje to bez znaczenia dla właściwego funkcjonowania stawów) (12).
O b r o n a k o m ó r e k p r z e d RFT
Organizmy żywe zawierają specjalne enzymy katalizujące rozkład anionorodnika ponadtlenkowego O2• lub H2O2. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) jest enzymem katalizującym reakcję dysmutacji (dysproporcjonowania) anionorodnika ponad-tlenkowego: (O2• + O2• + 2 H
+⎯⎯ →SOD⎯ H
2O2 + O2), natomiast peroksydaza gluta-tionowa katalizuje reakcję pomiędzy glutationem (GSH) a H2O2, w wyniku której powstaje utleniona forma glutationu, czyli disulfi d glutationu (GSSG): 2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O (1). Enzym ten redukuje nie tylko H2O2, ale także nadtlen-ki organiczne oraz znajdujące się w błonach komórkowych nadtlennadtlen-ki fosfolipidów. Peroksydaza glutationowa współdziała z reduktazą glutationową – enzymem od-twarzającym zredukowaną formę glutationu. Podobnie S-transferazy glutationowe, które w odróżnieniu od peroksydazy glutationowej nie zawierają selenu, katalizują reakcje redukcji nadtlenków lipidów przez glutation (1). Reakcję dysproporcjono-wania nadtlenku wodoru katalizuje enzym katalaza, natomiast metalotioneiny (biał-ka) wiążą i detoksykują jony metali ciężkich, np. kadm, rtęć oraz magazynują takie metale niezbędne dla organizmu, jak cynk i miedź (12).
W krwinkach zdrowego człowieka w ciągu doby około 3 % hemoglobiny ulega utlenieniu do methemoglobiny, nie mogącej przenosić tlenu. Reakcja ta jest głów-nym źródłem O2• w tych komórkach (8). Gdyby nie enzym –reduktaza methemo-globinowa, która redukuje methemoglobinę do hemoglobiny, po kilkunastu dniach większość hemoglobiny w krwinkach przeszłaby w niezdolną do przenoszenia O2 methemoglobinę. Również białka hemowe mogą w pewnych warunkach i we współ-działaniu z niskocząsteczkowymi oksydantami bronić się przed RFT. Przykładowo hemoglobina i mioglobina hamują tworzenie rodnika •OH w układzie zawierającym askorbinian, a to dzięki swej aktywności peroksydazowej. Reagują one z H2O2 wy-korzystując askorbinian w reakcji: askorbinian + H2O2 → dehydroaskorbinian + O2 (1). Szereg białek enzymatycznych także chroni przed RFT. Katalizują one reakcje nie wytwarzające RFT, np. ceruloplazmina (białko zawierające miedź) zapobiega powstawaniu anionorodnika ponadtlenkowego O2• ) (13).
Poza enzymami rozkładającymi RFT w organizmie, szereg innych związków ni-skocząsteczkowych wykazuje właściwości antyoksydacyjne, np. kwas moczowy, cysteina, kreatynina. Również melaniny i melatoniny zdolne są do reakcji z wolny-mi rodnikawolny-mi (1). Przykładowo melatonina, rozpuszczalna w roztworach wodnych i lipidach, może pełnić funkcję antyoksydanta hydrofi lowego, który chroni środowi-sko wodne komórki, jak i antyoksydanta hydrofobowego chroniącego wnętrze błon komórkowych.
Peroksydację lipidów hamują z kolei składniki błon komórkowych, jak chole-sterol, prowitamina D3, witamina D3, witamina D2 (1). Również grupa tiolowa glu-tationu (GSH) – powszechnego składnika bardzo różnych komórek naszego ciała – łatwo reaguje z wolnymi rodnikami, najszybciej z rodnikiem hydroksylowym •OH, wolniej z rodnikami organicznymi, w tym wolnymi rodnikami białek i in-nych makrocząsteczek (białko• + GSH → białko-H + GS•) (1). Za najistotniejszy
antyoksydant płynów komórkowych w organizmie uważa się kwas askorbinowy, czyli witaminę C. Jest on reaktywny wobec O2• , H2O2 , •OH, tlenu singletowego i rodników nadtlenkowych (1). Fizjologicznym antyoksydantem hydrofobowym, chroniącym błony komórkowe jest witamina E, czyli α-tokoferol (14) oraz karo-tenoidy (zwłaszcza β-karoten), oksykaroteinoidy, bilirubina i produkt jej utlenienia – biliwerdyna oraz koenzym Q (9). I tak np. β-karoten (K) jest efektywnym „wy-gaszaczem” tlenu singletowego oraz reaguje z wolnymi rodnikami organicznymi powstającymi w procesie peroksydacji lipidów: LOO• + K → LOO-K• ; LOOK• +
LOO• → LOO-K-OOL. Właściwości antyoksydacyjne wykazują żeńskie hormony
płciowe – pochodne estronu i estradiolu oraz niektóre jony metali, np. selen, cynk (ten ostatni wypiera jony Fe2+ i Cu2+ z centrów wiążących w błonach komórkowych i DNA). Aktywność enzymów antyoksydacyjnych w krwinkach czerwonych i oso-czu omówiono w pracy Winterbourna (5) oraz w monografi i Bartosza (15).
Podsumowując rozważania można stwierdzić, że wszystkie antyoksydanty zapo-biegają niekontrolowanym, zwłaszcza wolnorodnikowym reakcjom utleniania prze-biegającym w organizmie.
H. P u z a n o w s k a-T a r a s i e w i c z, B. S t a r c z e w s k a, L. K u ź m i c k a REACTIVE OXYGEN SPECIES
PIŚMIENNICTWO
1. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wyd. Naukowe, PWN, Warszawa 2003. – 2. Halliwell B., Gutteridge J.M.: Free radicals in biology and medicine. Oxford University, Press Oxford, New York , 1999. – 3. Mud-way I.S., Kelly F.J.: Ozone and the lungs a sensitive issue. Mol. Aspets Med. 2000; 21: 1-48. – 4. Mark G., Schuchmann H.P., Sonntag C.: Formation of peroxynitrite by sonication of aerated water. J. Am. Chem. Soc., 2000; 122: 3781-3782. – 5. Winterbourn C.C.: Oxidative reactions of hemoglobin. Methods Enzy-mol., 1990; 186; 265-272. – 6. Cadenas E., Davies K.: Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med., 2000; 29: 222-230. – 7. Kehrer J.P.: The Haber – Weiss reac-tion and mechanisms of toxicity. Toxicology, 2000; 14: 43-50. – 8. Dębski B., Milner J.A.: Molekularne mechanizmy przeciwnowotworowego działania czosnku; rola reaktywnych form tlenu. Bromat. Chem. Toksykol., 2007; 40: 223-228. – 9. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M., Mazur M.: Free radi-cals, metals and antioxidants in oxidative stress – induced cancer. Chem. Biol. Interact., 2006; 160: 1-40. – 10. Gibka J.: Antyutleniacze w kosmetykach. Rynek Chem., 2001; 2: 42-45.
11. Stadman E.R., Levine R.L.: Protein oxidation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2000; 899: 191-208. – 12. Miles A.T., Hawksworth G.M., Beattie J.H., Rodilla V.: Induction, regulation, degradation, and biologi-cal signifi cance of mammalian metallothioneins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 2000: 35: 35-70. – 13. Floris G., Medda R., Padiglia A., Musci G.: The physiopathological signifi cance of ceruloplasmin. Bio-chem. Pharmacol. 2000; 60: 1735-1741. – 14. Van Acker S.A., Koymans L.M., Bast A.: Molecular phar-macology of vitamin E: structural aspects of antioxidant activity. Free Radic. Biol. Med., 1993; 15: 311-328.- 15. Bartosz G.: Erytrocyty, W. Fizjologia krwi, red. Z. Dąbrowski, t. 2. 2000; Wyd. Naukowe PWN, Warszawa.
