Lech Rodziewicz
ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ –
SPEKTROMETRII MAS DO OZNACZANIA
POZOSTAŁOS
´
CI METABOLITO
´
W NITROFURANO
´
W
W PRODUKTACH POCHODZENIA ZWIERZE˛CEGO
Pracownia Badan´ Chemicznych S
´
rodko´w Spoz˙ywczych Zakładu Higieny Weterynaryjnej w BiałymstokuKierownik: dr L. Rodziewicz
Hasła kluczowe: metabolity nitrofurano´w, pozostałos´ci, wymagania analityczne,
LC-MS/MS, z˙ywnos´c´.
Key words: nitrofuran metabolites, residue, analytical requirements, LC-MS/MS,
food stuffs.
Furazolidon, nitrofurazon, nitrofurantoina, furaltadon (pochodne 5-nitrofurano´w) sa˛ przeciwbakteryj-nymi lekami, kto´re były stosowane w lecznictwie weterynaryjnym (zakaz˙enie dro´g moczowych, przewodu pokarmowego, sko´ry), a takz˙e jako dodatki konserwuja˛ce do z˙ywnos´ci. Działania bakteriobo´j-cze nitrofurano´w obejmuja˛ szerokie spektrum mikroorganizmo´w (paciorkowce, gronkowce, pałeczki gram ujemne).
Ponadto nitrofurany maja˛ włas´ciwos´ci przeciwpierwotniakowe i grzybobo´jcze. Obok cennego działania farmakologicznego nitrofurany wywołuja˛ liczne efekty niepoz˙a˛dane takie jak: mutagennos´c´, kancerogennos´c´, hepatoksycznos´c´, uszkodzenia płuc oraz mie˛s´nia serowego (1). Nitrofurany w organiz-mie zwierza˛t dos´c´ szybko ulegaja˛ przemianom metabolicznym, dlatego tez˙ do kontroli pozostałos´ci nitrofurano´w wykorzystano ich metabolity jako biomarkery pozostałos´ci ze wzgle˛du na ich długi po´łokres zaniku w organizmie zwierza˛t (1,9 – 3,8 tyg.). Biomarkerem furazolidonu jest metabolit 3-amino-2-oksazolidon (AOZ), nitrofurantoiny 1-aminohydantoina (AHD), nitrofurazonu semikarbazyd (SEM) oraz furaltadonu 3-amino-5-morfolinometylo-2-oksazolidon (AMOZ) (2).
Rozporza˛dzenie Komisji 90/2377/WE z dnia 26 czerwca 1990 r. zakwalifikowało nitrofurantoine˛, nitrofurazon, furaltadon oraz furazolidon w roku 1995 do IV aneksu w 4-stopniowym podziale s´rodko´w farmakologicznych pod wzgle˛dem maksymalnej granicy pozostałos´ci w z˙ywnos´ci pochodzenia zwierze˛-cego (ang. maximum residua limits – MRL). W aneksie tym znalazły sie˛ zwia˛zki aktywne far-makologicznie, dla kto´rych nie moz˙na ustalic´ MRL. Umieszczenie nitrofurano´w w aneksie IV oznacza zakaz ich stosowania u zwierza˛t, kto´rych produkty przeznaczone sa˛ do spoz˙ycia (3). Mimo to istnieja˛ podejrzenia, z˙e nitrofurany moga˛ byc´ nielegalnie wykorzystywane w leczeniu zwierza˛t (4, 5). W krajach nalez˙a˛cych do UE na 1500 przebadanych pro´bek produkto´w pochodzenia zwierze˛cego stwierdzono 12 wyniko´w dodatnich co stanowi 0,8% wszystkich pro´bek. Dyrektywa 96/23/WE z dnia 29 kwietnia 1996 r. nakazuje monitorowanie pozostałos´ci metabolito´w nitrofurano´w w tkankach zwierza˛t i produktach pochodzenia zwierze˛cego (6).
Metodom potwierdzaja˛cym stosowanym w analizie stawia sie˛ wysokie wymagania analityczne. Metody musza˛ spełniac´ wymagania, kto´re sa˛ okres´lone w decyzjach komisji 2002/657/WE z dnia 14 sierpnia 2002 r. (7) oraz 2003/181/WE z dnia 13 marca 2003 r. (8).
Wyz˙ej wymieniona decyzja (7) zakwalifikowała nitrofurany do grupy A, do kto´rej nalez˙a˛ substancje wykazuja˛ce działanie anaboliczne oraz substancje na kto´rych stosowanie nie ma urze˛dowego ze-zwolenia. Wprowadza ona dla ilos´ciowych metod potwierdzaja˛cych grupy A parametry wykonawcze
takie jak: specyficznos´c´, selektywnos´c´, liniowos´c´, powtarzalnos´c´, odtwarzalnos´c´ wewna˛trzlaboratoryj-na, odpornos´c´ na niewielkie zmiany, limit decyzyjny wartos´ci granicznej, zdolnos´ci wykrywania oraz rodzaje technik pomiaro´w (układy) jakie moz˙na stosowac´.
Decyzja (7) wprowadza dwa nowe parametry wykonawcze jakie musi spełniac´ metoda potwier-dzaja˛ca. Jest to decyzyjna wartos´c´ graniczna (CCα) oraz zdolnos´c´ wykrywani (CCβ). CCα oznacza wartos´c´ graniczna˛, na poziomie kto´rej i powyz˙ej kto´rej moz˙na wnioskowac´ z prawdopodobien´stwem błe˛du α, z˙e pro´bka jest niezgodna (fałszywie dodatnia) i wynosi ona dla metabolito´w nitrofurano´w (grupa A) 1%. CCβ jest to najniz˙sze ste˛z˙enie analitu, kto´re moz˙e byc´ wykryte, zidentyfikowane i oznaczone w pro´bce z prawdopodobien´stwem 1 –β. Bła˛d β jest to prawdopodobien´stwo uznania pro´bki za fałszywie ujemna˛ i wynosi on dla metabolito´w nitrofurano´w 5%. Oba te parametry słuz˙a˛ do jednoznacznej interpretacji wyniko´w analiz pozostałos´ci chemicznych w z˙ywnos´ci pochodzenia zwie-rze˛cego.
Wartos´ci CCα i CCβ rozstrzygaja˛ ze znanym prawdopodobien´stwem czy w pro´bce znajduja˛ sie˛ oznaczane metabolity nitofurano´w, czy tez˙ nie lub czy jego wartos´c´ przekracza wartos´c´ graniczna˛. Dla potwierdzaja˛cej metody ilos´ciowej oznaczania metabolito´w nitrofurano´w wyniki sa˛ zgodne jez˙eli sa˛ poniz˙ej wartos´ci CCα wyznaczonej dla poszczego´lnych matryc. Parametry CCα i CCβ moz˙na wyznaczyc´ dwoma sposobami na podstawie analizy 20 pro´bek s´lepych (7) oraz na podstawie krzywej kalibracji sporza˛dzonej zgodnie z PN-ISO 11843-2 (9).
Decyzja (8) wprowadziła MRPL dla metabolito´w nirofurano´w dla produkto´w pochodzenia zwierze˛ce-go, kto´ry wynosi 1,0 ng/g. MRPL (ang. minimum required performance limit) jest to najmniejsza zawartos´c´ analitu jaka moz˙e byc´ wykryta, zidentyfikowana i potwierdzona za pomoca˛ metody analitycznej (8).
Przy oznaczaniu metabolito´w nitrofurano´w w produktach pochodzenia zwierze˛cego sa˛ stosowane metody, w kto´rych maja˛ zastosowanie układy LC-UV, LC-MS i LC-MS/MS. Układ LC-UV nie spełnia warunku MRPL, gdyz˙ granice wykrywalnos´ci podawane przez ro´z˙nych autoro´w sa˛ wyz˙sze od wymaganych (10). Przy zastosowaniu tego układu moz˙na oznaczyc´ metabolity nitrofurano´w wa˛trobie na poziomie 5,0 – 10 ng/g (10). Ponadto zgodnie z decyzja˛ (8) metody potwierdzaja˛c musza˛ przekazywac´ informacje˛ na temat struktury analitycznej. Dlatego tez˙ metody oparte wyła˛cznie na analizie chromato-graficznej bez zastosowania spektrometrii mas nie sa˛ odpowiednie jako metody potwierdzaja˛ce w grupie A. Zgodnie z decyzja˛ (8) układ LC-MS moz˙e byc´ stosowany w metodach potwierdzaja˛cych grupy A. Układ ten nie spełnia jednak warunku MRPL (10, 11, 12). Przy zastosowaniu układu LC-MS moz˙na oznaczyc´ metabolity w tkance mie˛s´niowej na poziomie 0,25 – 5,0 ng/g (11), zas´ w jajach 1,0 – 3,0 ng/g (12) przy MPRL wynosza˛cym 1,0 ng/g .
Warunek MRPL spełniaja˛ metody, w kto´rych sa˛ stosowane układ LC-MS/MS. Zastosowanie tego układu pozwoliło na zwie˛kszenie czułos´ci 20 – 100 razy wzgle˛dem LC-MS, co pozwoliło na identyfika-cje i oznaczanie poniz˙ej MPRL (13).
P r z y g o t o w a n i e p r o´ b e k d o a n a l i z y. Analiza metabolito´w nitrofurano´w w produktach pochodzenia zwierze˛cego przy uz˙yciu LC-MS/MS dziela˛ sie˛ zasadniczo na naste˛puja˛ce etapy: przygotowanie pro´bki do badan´, hydroliza i derywatyzacja, neutralizacja, oczyszczanie i zate˛z˙anie otrzymanego ekstraktu oraz analiza LC-MS/MS.
Analize˛ pro´bek metabolito´w nitrofurano´w prowadzono w obecnos´ci standardu wewne˛trznego dodane-go bezpos´rednio do pro´bki przed homogenizacja˛ w roztworze wodnym kwasu solnedodane-go. Jako standard wewne˛trzny (IS) stosowano przewaz˙nie wzorce deuterowe (AOZ-d4, AMOZ-d5) lub znaczone izotopem we˛gla (13C
3-AHD,13C15N2-SEM).
Najwaz˙niejszym etapem analizy jest hydroliza metabolito´w nitrofurano´w powia˛zanych z białkami i derywatyzacja, kto´re przeprowadzano jednoczes´nie traktuja˛c jako jeden etap. Powoduje to, z˙e oznaczano sume˛ całkowita zwia˛zanych i wolnych metabolito´w bez rozro´z˙niania na wolne lub zwia˛zane. Prze-prowadzenie hydrolizy i derywatyzcji jest konieczne, w celu uzyskania zwia˛zko´w o bardziej korzystnych włas´ciwos´ciach dla analizy technika˛ MS. Metabolity nitrofurano´w maja małe masy atomowe pomie˛dzy 75 a 202 g/mmol. Z punku widzenia analizy MS zakres mas poniz˙ej m/z 150 przy technice jonizacji ESI rozpylania w polu elektrycznym, czyli elektrosprej (ang. electrospray ionisation – ESI) powoduje zmniejszenie czułos´c´ MS oraz interferencje ze strony rozpuszczalniko´w i innych zwia˛zko´w stosowanych w analizie. Dlatego tez˙ w celu uzyskania zwia˛zko´w o bardziej korzystnych włas´ciwos´ciach dla MS przeprowadzono hydrolize˛ metabolito´w nitrofurano´w roztworem kwasy solnego i derywatyzacje˛ wolnej grupy aminowej danego metabolitu przy zastosowaniu 2-nitrobenzaldehyd (NBA). Spowodowało to wzrost masy atomowej poszczego´lnych metabolito´w 208 – 334 g/mol, kto´ra jest bardziej tolerowana przez
MS. Wada˛ zastosowania NBA do derywatyzacji metabolito´w jest długi czas reakcji ponad 15 godz. w temp. 37°C. Zwie˛kszenie czasu derywatyzacji nie wpłyne˛ło w zasadniczy sposo´b na wzrostu czułos´ci metody. W celu ominie˛cia czasochłonnej derywatyzacji testowano wiele innych aldehydo´w aromatycz-nych w celu skro´cenia czasu reakcji oraz zwie˛kszenia czułos´ci. Z
˙
aden z testowanych zwia˛zko´w nie dał znacza˛cej poprawy (4). Neutralizacje˛ pro´bki prowadzono przewaz˙nie fosforanem tro´jsodowym lub kwas´nym fosforanem potasu, doprowadzaja˛c do pH = 7 wodorotlenkiem sodu.Naste˛pnym etapem analizy jest oczyszczanie i zate˛z˙anie otrzymanych ekstrakto´w, kto´re prowadzono przewaz˙nie metoda˛ ekstrakcji ciecz-ciecz (5, 14, 15) lub ciecz-ciecz w poła˛czeniu z SPE. Do ekstrakcji stosowano octan etylu. Przy zastosowaniu metody SPE stosowano kolumienki polimerycznych typu LiChlorut EN (4, 16) ( firmy Merck), Oasis MAX, Oasis HLB (firmy Waters) (17, 18).
Wypełnienia te charakteryzuja˛ sie˛ wysoka˛ powierzchnia aktywnos´ci, duz˙a˛ pojemnos´cia˛ i stabilnos´cia˛ w szerokim zakresie pH. Przy zastosowaniu octanu etylu do ekstrakcji z tkanki mie˛s´niowej drobiu przy wzmocnieniu na poziomie 1,0 μg/kg otrzymano odzysk dla AHD, AOZ, SEM odpowiednio 104, 34 i 28%, zas´ w jajach przy tym samym wzmocnieniu 34, 19 i 20% ze wzgle˛dnym odchyleniem standardowym poniz˙ej 10% (14). Przy zastosowaniu do ekstrakcji otanu etylu i kolumienek Oasis w wa˛trobie trzody przy wzmocnieniu 5 – 25μg/kg otrzymano odzysk powyz˙ej 50% dla AMOZ, AHD, zas´ dla AOZ, SEM powyz˙ej 90% (5). Kolumienki LiChlorut EN znalazły zastosowanie w oznaczaniu metabolito´w nitrofurano´w w tkankach zwierza˛t (4, 16), Oasis MCX i Oasis HLB w tkankach zwierza˛t (17) i Oasis HLB w miodzie (18).
A n a l i z a L C - M S / M S. Do analizy stosowano kro´tkie kolumny chromatograficzne standardowe o s´rednicy 2 – 3 mm wypełnione przewaz˙nie faza˛ chemicznie odwro´cona˛ C-18. Jako faze˛ ruchoma˛ stosowano wode˛, wodne roztwory kwasu octowego oraz buforowy roztwo´r octanu amonowego w poła˛czeniu z polarnymi rozpuszczalnikami acetonitrylem lub metanolem. Stosowano układ faz z zastosowaniem elucji gradientowej. W celu uzyskania najlepszego rozdziału metabolito´w nitrofurano´w testowano ro´z˙ne kolumny oraz skład fazy ruchomej. Najlepszy rozdział uzyskano stosuja˛c kolumne˛ C-18 Luna (5μm, 150 × 3 mm, Phenomenex) oraz faze˛ ruchoma˛ A – o ste˛z˙. 0,5 mmol/dm3octan amonu
i B – metanol (13).
Pro´bki analizowano stosuja˛c układ LC-MS/MS. Najcze˛s´ciej stosowana˛ metoda˛ jonizacji jest roz-pylanie cieczy zawieraja˛cej badana˛ substancje w polu elektrycznym (ang. electrospray ionisation – ESI). Jest to łagodna jonizacja nie powoduja˛ca fragmentacji badanych cza˛stek. W celu wywołania wto´rnej fragmentacji w drugim MS stosowano przewaz˙nie metode˛ wzbudzania jono´w przez kolizje˛ (ang. collisiom induced dissociation – CID). Rozdzielenie wia˛zki jono´w wg wartos´ci stosunku m/z prowadzo-no z zastosowaniem analizatora kwadrupolowego. Układ pracował w trybie joprowadzo-no´w dodatnich. Iden-tyfikacje i oznaczanie ilos´ciowe metabolito´w prowadzono przewaz˙nie w systemie monitorowania wybranych reakcji tworzenia jono´w metastabilnych MRM (ang. metastable reaction monitoring). W celu uzyskania wykresu kalibracyjnego mierzono odpowiedzi spektrometru mas na ro´z˙ne ilos´ci metabolito´w nitrofurano´w wzgle˛dem odpowiedzi na stała˛ ilos´c´ IS.
Na ryc. 1 przedstawiono chromatogramy metabolito´w nitrofurano´w pro´bki mie˛s´ni bydła wzmocnionej na poziomie 1,0 μg/kg, uzyskane przy zastosowaniu układu LC-ESI-MS/MS-CID. Pro´bki do badan´ przygotowano wg procedury własnej. Zastosowano chromatograf cieczowy firmy Agilent 1100, spektrometr masowy API 3000 LC-MS/MS przy wysokim napie˛ciu fragmentacji 5500 V, kto´ra jest optymalna dla czterech metabolito´w. Do wste˛pnego rozdziału metabolito´w nitrofurano´w zastosowano kolumne˛ chromatograficzna˛ Luna C18 o wymiarach 150× 2 mm, wielkos´c´ ziarna 3 μm firmy Phenomenex oraz faze˛ ruchoma˛ A – metanol do LC-MS, B – 20:80 (V1+ V2) metanol do LC-MS i 0,5
mM octan amonu. Analize˛ pro´bek prowadzono w obecnos´ci dwo´ch IS AOZ-d4 i AMOZ-d5, kto´rych sygnały lez˙a˛ blisko oznaczanych analito´w. AOZ-d4 jest IS dla AOZ, AHD, SEM, zas´ AMOZ-d5 dla AMOZ. Identyfikacje i oznaczanie ilos´ciowe metabolito´w nitrofurano´w prowadzono w systemie monitorowania wybranych reakcji (ang. metastable reaction monitoring – MRM). W celu identyfikacji uwzgle˛dniono podstawowe przejs´cia m/z dla AHD 249→ 134 (15), 249 → 178 (28), AOZ 236 → 134 (19), 236→ 192 (19), SEM 209 → 166 (15), 209 → 192 (25), AMOZ 335 → 291 (18), 335 → 262 (24), zas´ przy oznaczaniu ilos´ciowym AHD 249→ 134, AOZ 236 → 134, SEM209 → 166, AMOZ 335 → 291 oraz dla IS AOZ-d4 240→ 142 (19), AMOZ-d5 340 → 296 (18). W nawiasie podano wartos´c´ energii kolizyjnej w MeV.
Spełnia to wymagania decyzji (7), kto´ra wymaga dla metod potwierdzaja˛cych przy wykorzystaniu zbierania danych w systemie MRM co najmniej czterech punkto´w identyfikacyjne. W naszym przypadku jon macierzysty kaz˙dego z metabolito´w nitrofurano´w daje po dwa jony potomne. Jon
Ryc. 1. Chromatogram LC-ESI-MS/MS-CID z ekstraktu mie˛s´ni bydła, tryb pracy MRM, wzmocnienie matrycy 1 ng/g.
Fig. 1. LC-ESI-MS/MS-CID chromatograms of cattle muscle extract, MRM mode, spiked matrix meat tissue nitrofuran metabolites 1 ng/g.
macierzysty daje 1 punkt identyfikacjny, zas´ jony potomne po 1,5 punktu kaz˙dy z osobna, co w sumie wynosi 4 punkty identyfikacyjne.
Inni autorzy metod oznaczania metabolito´w nitrofurano´w monitorowali inne przejs´cia m/z. W tab. I przedstawiono najcze˛s´ciej stosowane jony diagnostyczne metabolito´w nitrofurano´w, IS do identyfikacji i oznaczania ilos´ciowego.
T a b e l a I
Jony diagnostyczne uz˙ywane dla metabolito´w nitrofurano´w T a b l e I
Diagnostic ions used for nitrofuran metabolites
Zwia˛zek Jon podstawowy
Jony uz˙ywane w analizie jakos´ciowej (m/z) Jony uz˙ywane w analizie ilos´ciowej (m/z) AOZ 236 134, 101, 149, 192 134 AHD 249 134, 104, 178, 108 134 SEM 209 166, 134, 192, 196 166 AMOZ 335 291, 128, 262, 266 291 AOZ-d4 (IS) 240 134 AMOZ-d5 (IS) 340 296 SEM-d4 (IS) 213 170 AHD-d4 (IS) 253 138 jon podstawowy
Układ LC-ESI-MS/MS-CID oraz ww. przejs´cia stosowano do oznaczania metabolito´w nitrofurano´w w tkance mie˛s´niowej zwierza˛t (4, 10, 14, 17), krewetkach (15), jajach (14) i miodzie (18). Zgodnie z decyzja˛ (7) przy oznaczaniu metabolito´w wyznaczano wartos´c´ CCα i CCβ. W tkance mie˛s´niowej kurcza˛t przy zastosowaniu do oczyszczania ekstrakto´w poprzez ekstrakcje˛ octanem etylu i za-stosowaniem kolumienek Lichlorut EN CCαi CCβmies´ciło sie˛ w zakresie 0,11 – 0,21 i 0,19 – 0,36 ng/g przy MRPL wynosza˛cym 1,0 ng/g, zas´ odzysk w granicach 85 – 122%. Najmniejsze wartos´c´ CCαi CCβ stwierdzono dla AMOZ 0,12, 0,2 ng/g, najwie˛ksze zas´ dla AHD 0,21 i 0,36 ng/g (16). W miodzie przy zastosowaniu do oczyszczania kolumienek polimerycznych CCαmies´ciło sie˛ w zakresie 0,07 – 0,46, a CCβ0,12 – 0,56 ng/g (18). CCαi CCβobliczono na podstawie krzywej kalibracji.
Niekto´rzy autorzy metod oczyszczaja˛c ekstrakt octanem etylu wyznaczali granice˛ wykrywalnos´ci (LOD) dla S/N = 3 (stosunek sygnału do szumu) oraz granice˛ oznaczonos´ci (LOQ) S/N = 6 w tkance mie˛s´niowej trzody. Granice wyznaczono na postawie wyniko´w uzyskanych w trzech laboratoriach. Wyznaczona wartos´ci LOD mies´ciła sie˛ w granicach 0,03 – 0,09, zas´ LOQ 0,05 – 0,49 ng/g. Najmniejsze wartos´c´ LOQ stwierdzono dla AMOZ 0,04 – 0,07, najwie˛ksze zas´ dla AHD 0,37 – 0,49 ng/g. Odzyski przy fortyfikacji na poziomie 0,5 ng/g uzyskane w trzech laboratoriach sa˛ podobne i wynosiły dla AOZ 45 – 48, AHD 24 – 29, SEM 12 – 15 i AMOZ 46 – 49% (5)
PODSUMOWANIE
Metody oznaczania metabolito´w nitrofurano´w, w kto´rych stosowano układ
LC-MS wg decyzji komisji 2003/181/WE nie spełniaja˛ warunku MRPL (1,0 ng/g),
gdyz˙ ich granice wykrywalnos´ci sa˛ wyz˙sze od wymaganych. Warunek MRPL
spełniaja˛ metody, w kto´rych stosowano układ LC- MS/MS. Zastosowanie tego
układu pozwoliło na zwie˛kszenie czułos´ci 20 – 100 razy wzgle˛dem LC-MS, co
pozwoliło na identyfikacje i oznaczanie poniz˙ej MPRL. Przedstawione metody
oznaczania metabolito´w w kto´rych stosowano układ LC-MS/MS oraz wyznaczono
wartos´c´ CC
α
i CC
β
spełniaja˛ wymagania decyzji komisji 2002/657/WE.
L. R o d z i e w i c z
THE APPLICATION OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY TO DETERMINE NITROFURAN METABOLITE RESIDUES
IN ANIMAL PRODUCTS
PIS
´
MIENNICTWO1. Szczypka M.: Włas´ciwos´ci genotoksyczne zwia˛zko´w 5-nitrofuranowych. Roczn. PZH, 1995; 4: 390-395. – 2. Cooper K., Kennedy G.: Nitrofuran antibiotic metabolites detected at parts per million concentrations in retina of pigs-a new matrix for enhanced monitoring of nitrofuran abuse. Analyst. 2005; 130: 446-448. – 3. Rozporza˛dzenie Komisji 90/2377/WE z dnia 26 czerwca 1990 r. okres´laja˛ca procedury wspo´lnoty dla ustalenia najwyz˙szych dopuszczalnych pozostałos´ci weterynaryjnych produk-to´w medycznych w z˙ywnos´ci. – 4. Leitner A., Zollner P., Lindner W.: Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2001; 939: 49-58. – 5. O’Keeffe M., Conneely A., Cooper K.: Nitrofuran antibiotic residues in pork The FoodBRAND retail survey. Anal. Chim. Acta 2004; 520: 125-131. – 6. Dyrektywa 96/23/WE z dnia 29 kwietnia 1996 r. o s´rodkach przyje˛tych do dla monitorowania pewnych substancji i ich pozostałos´ci u zwierza˛t z˙ywych i w produktach pochodzenia zwierze˛cego. – 7. Decyzja Komisji z dnia 14 sierpnia 2002 r. 2002/657/WE wykonuja˛ca dyrektywe˛ Rady 96/23 dotycza˛ca˛ wyniko´w metod analitycznych i ich interpretacji. – 8. Decyzja Komisji z dnia 13 marca 2003 r. 2003/181/WE zmieniaja˛ca decyzje˛ 2002/657/WE w odniesieniu do ustalenia minimalnych wymaganych wartos´ci granicznych wydajnos´ci (MPRL) dla niekto´rych pozostałos´ci w z˙ywnos´ci pochodzenia zwierze˛cego. – 9. PN-ISO 11843-2: Zdolnos´c´ wykrywania – Cz. 2: Metrologia w przypadku kalibracji liniowej. PKN, lipiec 2003; 19:1-13. – 10. Horne E., Cadogan A., O’Keeffe.: Analysis of protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry. Analyst. 1996; 121: 1463-1468.
11. Stolker A., Brinkman U.: Analatical strategie sof residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals- a review. J. Chromatogr. A 2005; 1067: 15-53. – 12. Corcia A., Nazzari M.: Liquid chromatographic-mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacterial agents in animal ford products. J. Chromatogr. A, 2002; 974: 53-89. – 13. Hartig L., Czapiewski K.: Detecting nitrofuran metabolitrs in animal products using LC/MS/MS. Article 2005; 17: 21-23. – 14. Finzi J.K., Donato J.L., Sucupira M., De Nucci G.: Determination of nitrofuran metabolites in poultry muscle and eggs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2005; 842: 30-35. – 15. Scope A.: Detection of nitrofran metabolites in shrimp. FDA 2004; 1: 1-7. – 16. Mottier P., Khong S., Gremaud E.: Quantitative determination of nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray onization-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2005; 842: 30-35. – 17. Conneely A., Nugent A., Okeeffe M.: Isolrtion of bound residues of nitrofuran drugs from tissue by solid-phase extraction with determination by liquid chromatography with UV and tandem mass spectrometric detection. Anal. Chim. Acta 2003; 483: 91-98. – 18. Khong S., Gremaud E., Richoz J.: Analysis of matrix-bound nitrofuran in worldwide originated honeys by isotope dilution high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2004; 25: 5309-5315.
