Małgorzata B. Gawlik, Elz˙bieta Twardowska,
Małgorzata Trawa, Maciej Gawlik
WPŁYW KWASU SALICYLOWEGO
NA RO
´
WNOWAGE˛ PRO-/ANTYOKSYDACYJNA˛
W WARUNKACH WYSOKICH STE˛Z
˙
EN
´
GLUKOZY
W KRWINKACH CZERWONYCH CZŁOWIEKA
W BADANIACH IN VITRO
Katedra Toksykologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellon´skiego w Krakowie Kierownik: prof. dr hab. J. Brandys
W przeprowadzonych badaniach ludzkie erytrocyty inkubowano z buforem zawieraja˛-cym glukoze˛ w zakresie ste˛z˙. 72,9 – 354,1 mg %. Po upływie 18 godz. oceniano zmiany ro´wnowagi pro-/antyoksydacyjnej mierza˛c poziom powstałego MDA oraz zmiany w ak-tywnos´ci SOD. Dalsza inkubacja zawiesiny krwinek z kwasem salicylowym powodowała zmiany w aktywnos´ci SOD oraz wzrost protekcji krwinek przed dodatkowym czynnikiem utleniaja˛cym kto´rym w zastosowanym eksperymencie był nadtlenek kumenu. Wysokie ste˛z˙enie glukozy hamowało ten efekt.
Hasła kluczowe: hiperglikemia, cukrzyca, krwinki czerwone człowieka, stres
oksydacyjny, kwas salicylowy.
Key words: hyperglycemia, diabetes, human red blood cells, oxidative stress,
salicylic acid.
Cukrzyca nalez˙y do grupy choro´b metabolicznych powia˛zanych z utrzymuja˛ca˛
sie˛, patologicznie podwyz˙szona˛ hiperglikemia˛, wynikaja˛ca˛ z upos´ledzenia
regula-cyjnego wpływu insuliny. Efektem długotrwałej ekspozycji na hiperglikemie˛ jest
stres oksydacyjny (1, 2, 3, 4). Glukoza reaguje z białkami i lipoproteinami na
drodze nieenzymatycznej glikacji oraz ulega autoksydacji, co prowadzi do
po-wstania wolnych rodniko´w. Działanie wolnych rodniko´w jest neutralizowane przez
naturalny system obrony antyoksydacyjnej. System ten złoz˙ony jest z wielu
czynniko´w o charakterze enzymatycznym i nieenzymatycznym, kto´re hamuja˛
oksydacje˛ cza˛steczek oraz struktur komo´rkowych. Jednym z istotnych czynniko´w
bariery antyoksydacyjnej jest miedzio i cynko zalez˙na dysmutaza ponadtlenkowa
(Cu, ZnSOD).
W prewencji i terapii schorzen´ naczyn´ krwionos´nych, kto´re wyste˛puja˛ jako
powikłania cukrzycy ma zastosowanie kwas acetylosalicylowy (5, 6). Wykazano,
z˙e powstaja˛cy z niego kwas salicylowy ma zdolnos´c´ usuwania wolnych rodniko´w
tlenowych i hydroksylowych oraz powoduje hamowanie zalez˙nej od COX generacji
anionorodnika ponadtlenkowego (7). Wpływa takz˙e na zwie˛kszenie poziomu
katalazy. Anionorodnik ponadtlenkowy spontanicznie utlenia tlenek azotu
wy-twarzany przez s´ro´dbłonek do form nieaktywnych, obniz˙aja˛c naczyniorozkurczowy
potencjał czynnos´ciowy (5, 8, 9).
Jednak wyniki niekto´rych badan´ wskazuja˛ na to, z˙e salicylany nie zmiataja˛,
a biora˛ udział w tworzeniu wolnych rodniko´w (10, 11, 12, 13). Sta˛d w
przed-stawionej pracy podje˛to pro´be˛ oceny własnos´ci pro-/antyoksydacyjnych kwasu
salicylowego w modelu in vitro z zastosowaniem krwinki czerwonej człowieka,
naraz˙onej na działanie ro´z˙nych ste˛z˙en´ glukozy.
Krwinki czerwone ze wzgle˛du na budowe˛ błony komo´rkowej zbliz˙ona˛
struktural-nie do błon komo´rek s´ro´dbłonka stanowia˛ dogodny model w badaniach efekto´w
działania wolnych rodniko´w. W błonach krwinek czerwonych wyste˛puja˛ duz˙e
ste˛z˙enia nienasyconych kwaso´w tłuszczowych, kto´re pod wpływem czynniko´w
utleniaja˛cych generuja˛ wiele produkto´w, kto´rych obecnos´c´ s´wiadczy o zaistniałym
stresie oksydacyjnym. Jednym z takich produkto´w jest łatwo mierzalny dialdehyd
malonowy (MDA). Krwinki czerwone biora˛ ro´wniez˙ udział w transporcie
nie-kto´rych leko´w jak np. kwasu salicylowego (8, 14).
W prezentowanych badaniach in vitro oceniono wpływ glukozy i kwasu
salicylowego na potencjał antyoksydacyjny krwinki czerwonej człowieka, kto´rego
miara˛ była aktywnos´c´ SOD oraz poziom MDA. Oceniono takz˙e podatnos´c´ na
peroksydacje˛ badanych krwinek eksponowanych na działanie glukozy i kwasu
salicylowego. Zmiana podatnos´ci krwinek na utlenianie wywoływane przez
utlenia-cze zewne˛trzne, moz˙e byc´ uwaz˙ana za miare˛ włas´ciwos´ci pro-/antyoksydacyjnych
czynniko´w obecnych w układzie, w tym przypadku kwasu salicylowego w
warun-kach eksperymentu. W badaniach zastosowano utleniacz, nadtlenek kumenu,
zwia˛zek efektywnie inicjuja˛cy procesy peroksydacji wielonienasyconych kwaso´w
tłuszczowych błony komo´rkowej, wynikiem czego jest wzrost powstawania MDA
(15). Proces ten moz˙e byc´ zahamowany przez czynniki o charakterze
antyok-sydacyjnym.
CZE˛S
´
C´
DOS´
WIADCZALNAOdczynniki: glukoza, odczynnik Drabkina prod. POCH Gliwice, kwas salicylowy prod. Aldrich, dialdehyd malonowy prod. Merck, kwas tiobarbiturowy, bufor fosforanowy z chlorkiem sodu (PBS) prod. Sigma, epinefryna, prod. ICN.
Aparatura: spektrofotometr Genesis 2PC prod. Spectronic, wiro´wka laboratoryjna MPW-350R prod. MPW Med. Instruments.
B a d a n i e w p ł y w u g l u k o z y i k w a s u s a l i c y l o w e g o n a a k t y w n o s´ c´ S O D i p o z i o m M D A
W badaniach wykorzystano trzykrotnie przemyte sola˛ fizjologiczna˛ ludzkie erytrocyty pochodza˛ce od zdrowych oso´b zebrane w jednorodna˛ pule˛. Przygotowano roztwory glukozy w buforze PBS. Ste˛z˙enie cukru zmierzono z zastosowaniem spektrofotometrycznej metody o-toluidynowej. Otrzymane roztwory glukozy mieszano z erytrocytami uzyskuja˛c serie pro´b o hematokrycie ro´wnym 40%. Ste˛z˙enie heksozy w buforze nad erytrocytami w 4 seriach pro´b wynosiło 72,9; 126,2; 280,1 i 354,1 mg %. Imitowały one kolejno: prawidłowy poziom glukozy w krwi, przekroczona˛ glikemie, oraz poziom wyste˛puja˛cy w cukrzycy (16). Kaz˙da seria składała sie˛ z 15 niezalez˙nych pro´b.
Wszystkie pro´by inkubowano przez 18 godz. w temp. 37°C bez doste˛pu s´wiatła delikatnie mieszaja˛c. Po tym czasie 5 pro´b z kaz˙dej serii zawieraja˛cej okres´lone ste˛z˙enie glukozy wirowano z przys´pieszeniem 1000× g. W warstwie buforowej oznaczano ste˛z˙enie glukozy, a w erytrocytach oznaczano poziom MDA z wykorzystaniem metody spektrofotometrycznej wg Stocks’a (17) i aktywnos´c´ SOD wg metody opartej na hamowaniu samoutleniania adrenaliny do adrenochromu (18).
Pozostałe 10 pro´b z kaz˙dej serii zawiesin erytrocyto´w wirowano z przys´pieszeniem 500× g i cze˛s´c´ buforu znad krwinek przenoszono do probo´wek, w kto´rych mies´ciła sie˛ sucha pozostałos´c´ kwasu salicylowego, jaka została po odparowaniu metanolu z roztworu o odpowiednim ste˛z˙eniu. Bufor wraz z kwasem salicylowym powto´rnie ła˛czono z krwinkami. W badanych zawiesinach erytrocyto´w ste˛z˙enie kwasu salicylowego wynosiło 30 mg %. Przygotowane zawiesiny krwinek zawieraja˛ce lek inkubowano przez 10 min. (5 pro´b z kaz˙dej serii) i 30 min. (5 pro´b z kaz˙dej serii). Po tych czasach, zawiesiny wirowano (1000× g) i w erytrocytach oznaczano poziom MDA i aktywnos´c´ SOD.
B a d a n i e p o d a t n o s´ c i e r y t r o c y t o´ w p o i n k u b a c j i z g l u k o z a˛ i k w a s e m s a l i c y l o w y m n a p e r o k s y d a c j e˛ l i p i d o´ w i n d u k o w a n a˛ n a d t l e n k i e m k u m e n u
Kolejne, niezalez˙nie przygotowane zawiesiny krwinek w identyczny sposo´b jak opisano powyz˙ej (poddane przez 18 godz. działaniu glukozy w ro´z˙nych ste˛z˙eniach, do kto´rych naste˛pnie dodano kwas salicylowy o ste˛z˙. 30 mg % i inkubowano przez kolejne 10 i 30 min.) wirowano (1000× g), odrzucano bufor i krwinki przemywano trzykrotnie sola˛ fizjologiczna˛. Z uzyskanych erytrocyto´w przygotowywano ich 10% zawiesine˛ w buforze PBS. Do kaz˙dej zawiesiny w celu inicjacji peroksydacji lipido´w błony erytrocyto´w dodawano 25μl nadtlenek kumenu (66 mM) i inkubowano przez 1 godz. w temp. 25°C. W zawiesinie erytrocyto´w oznaczano poziom MDA przed i po ekspozycji na zastosowany utleniacz.
O c e n a s t a t y s t y c z n a w y n i k o´ w
Poro´wnania pomie˛dzy badanymi pro´bami wykonano z zastosowaniem testu t odpowiednio dla pro´b zalez˙nych i niezalez˙nych z wykorzystaniem programu komputerowego STATISTICA.
WYNIKI I ICH OMO
´
WIENIEHiperglikemia to stan, w kto´rym ste˛z˙enie glukozy ulega podwyz˙szeniu gło´wnie wskutek upos´ledzenia regulacyjnego wpływu insuliny. Przekroczenie ste˛z˙enia glukozy w osoczu na czczo powyz˙ej 6,1 mmol/dm3
(110 mg/dl) az˙ do osia˛gnie˛cia wartos´ci 7,0 mmol/dm3
(126 mg/dl) okres´lany jest mianem hiperglikemii. W przedstawionym badaniu krwinki poddane były działaniu glukozy o ste˛z˙eniu prawidłowym (72,9 mg %) o ste˛z˙eniu imituja˛cym przekroczona˛ glikemie˛ (126,2 mg %) i o znacznym przekroczeniu imituja˛cym poziom wyste˛puja˛cy w cukrzycy (280,1 i 354,1 mg %).
Po 18 godz. inkubacji krwinek w roztworach glukozy obserwowano hemolize˛ (mierzona˛ poziomem hemoglobiny metoda˛ Drabkina w buforze nad krwinkami) nie przekraczaja˛ca˛ 5%. Nie stwierdzono istotnych statystycznie ro´z˙nic w poziomie hemolizy pomie˛dzy badanymi seriami.
Krwinki czerwone zawieszone w buforze zawieraja˛cym glukoze˛ w zakresie ste˛z˙en´ od 72,9 do 354,1 mg % w okresie 18 godz. inkubacji zuz˙ywały cukier, kto´rego poziom w tym czasie obniz˙ył sie˛ o ok. 50% (ryc. 1).
Ryc. 1. Ste˛z˙enie glukozy w buforze przed i po 18-godzinnej inkubacji z krwinkami. Fig. 1. The level of glucose in the buffer before and after 18-h incubation with erythrocytes.
Przedstawione poniz˙ej wyniki z oznaczen´ ste˛z˙enia MDA i aktywnos´ci SOD przypisano do odpowied-nich wyjs´ciowych ste˛z˙en´ glukozy jakie były w buforze przed rozpocze˛ciem inkubacji.
Pod wpływem 18 godz. oddziaływania glukozy, takz˙e na poziomie prawidłowej glikemii, w krwin-kach czerwonych stwierdzono podwyz˙szony poziom peroksydacji lipido´w, czego wynikiem jest istotny wzrost poziomu MDA, w poro´wnaniu do oznaczanego w chwili rozpocze˛cia inkubacji. Poziom tego markera jest podobny, niezalez˙ny od ste˛z˙enia glukozy w badanych zawiesinach (ryc. 2).
Ryc. 2. Wpływ glukozy i kwasu salicylowego na powstawanie MDA w zawiesinie krwinek. Fig. 2. Effect of glucose and salicylic acid on MDA formation in the red blood cells suspension.
Kwas salicylowy, gło´wny metabolit kwasu acetylosalicylowego powstaja˛cy na drodze jego hydrolizy, wia˛z˙e sie˛ z albuminami osocza i działa w obre˛bie tkanek do kto´rych zostanie przetransportowany. Wyniki badan´ in vitro wskazuja˛, z˙e substancja ta szybko przenika do krwinek czerwonych i stan ro´wnowagi osia˛gany jest w czasie 1 – 5 min. (14). W s´rodowisku buforu, po osia˛gnie˛ciu stanu ro´wnowagi kwas salicylowy mniej wie˛cej ro´wnomiernie rozmieszcza sie˛ pomie˛dzy bufor i krwinki.
Dodanie kwasu salicylowego w ste˛z˙eniu terapeutycznym do zawiesiny krwinek poddanych 18 godz. działaniu glukozy o normalnym i wysokim ste˛z˙eniu glukozy nie wpłyne˛ło znacza˛co na poziom MDA przez kolejne 10 i 30 min. inkubacji (ryc. 2).
Zwie˛kszenie aktywnos´ci SOD jest jednym z mechanizmo´w przeciwutleniaja˛cego działania kwasu salicylowego i jego pochodnych (5, 6). Uzyskane wyniki w przedstawionych badaniach własnych dotycza˛ce aktywnos´ci SOD w krwinkach poddanych działaniu glukozy moga˛ s´wiadczyc´, z˙e enzym ten odgrywa istotna˛ role˛ w ochronie erytrocyto´w poddanych działaniu glukozy (4, 19). Aktywnos´c´ tego enzymu istotnie zmniejszyła sie˛ w zawiesinach krwinek zawieraja˛cych glukoze˛ w zakresie ste˛z˙. od 126,2 do 280,1 mg % w poro´wnaniu zaro´wno do aktywnos´ci enzymu w tej samej zawiesinie krwinek przed rozpocze˛ciem inkubacji jak i w stosunku do zawiesiny z prawidłowym ste˛z˙eniem glukozy. Najwyz˙sze badane ste˛z˙enie glukozy 354,1 mg % spowodowało istotny spadek aktywnos´ci SOD w poro´wnaniu do aktywnos´ci enzymu w tej samej zawiesinie krwinek, ale w przeciwien´stwie do pozostałych grup z podwyz˙szonym ste˛z˙eniem glukozy spowodowało wzrost w stosunku do zawiesiny z prawidłowym ste˛z˙eniem glukozy (ryc. 3).
W erytrocytach poddanych 18 godz. działaniu glukozy w zakresie ste˛z˙en´ od 72,9 do 126,2 mg % oraz kwasu salicylowego o ste˛z˙. 30 mg % przez kolejne 10 min. doszło do znamiennego wzrostu aktywnos´ci SOD w stosunku do erytrocyto´w, na kto´re oddziaływała tylko glukoza. Dłuz˙sza 30 min. inkubacja
Ryc. 3. Wpływ glukozy i kwasu salicylowego na aktywnos´c´ SOD w krwinkach czerwonych. Fig. 3. Effect of glucose and salicylic acid on SOD activity in red blood cells.
krwinek z kwasem salicylowym spowodowała, z˙e aktywnos´c´ SOD istotnie zmalała w poro´wnaniu do oznaczanej po 10 min. inkubacji.
W zawiesinie erytrocyto´w naraz˙onych na 18 godz. oddziaływanie glukozy w ste˛z˙eniu pocza˛tkowym 280,1 mg % i poddanej przez kolejne 10 i 30 min. inkubacji z kwasem salicylowym stwierdzono istotny wzrost aktywnos´ci SOD w poro´wnaniu do zawiesiny naraz˙onej tylko na działanie glukozy. Inkubacja z kwasem salicylowym krwinek naraz˙onych na wysokie ste˛z˙enie glukozy 354,1 mg % nie spowodowała znacza˛cych zmian w aktywnos´ci SOD w stosunku do krwinek naraz˙onych tylko na działanie glukozy. Obserwowane zmiany w aktywnos´ci SOD moga˛ s´wiadczyc´ o tym, z˙e kwas salicylowy wpływa na bariere˛ antyoksydacyjna komo´rki w zakresie zmian potencjału enzymatycznego w zalez˙nos´ci od ste˛z˙enia glukozy. Wzrost aktywnos´ci SOD w stosunku do erytrocyto´w naraz˙onych na niz˙sze ste˛z˙enia glukozy wskazuje na wyraz´na˛ poprawe˛ potencjału obronnego komo´rki pod wpływem kwasu salicylowego. W warunkach eksperymentu zmiana ta nie miała charakteru trwałego. Po dłuz˙szym czasie inkubacji zanotowano spadek aktywnos´ci enzymu. Wyz˙sze ste˛z˙enia glukozy moga˛ tłumic´ ochronny efekt działania SOD.
W zastosowanym ste˛z˙eniu i rez˙imie czasowym ekspozycji, kwas salicylowy nie podwyz˙szył znamiennie poziomu MDA w stosunku do zawiesin krwinek z glukoza˛ bez wzgle˛du na jej ste˛z˙enie. S
´
wiadczy to, z˙e nie wykazuje on w zaistniałych warunkach włas´ciwos´ci prooksydacyjnych. Biora˛c pod uwage˛ stosunkowo kro´tki czas oddziaływania leku na erytrocyty trudno odnies´c´ te wynik do badan´ wskazuja˛cych na brak działania antyoksydacyjnego albo wre˛cz prooksydacyjnego kwasu (10).Interesuja˛cy jest wynik badan´, kto´ry moz˙e potwierdzac´, z˙e funkcjonowanie w erytrocytach mechaniz-mo´w antyoksydacyjnych uaktywnionych przez działanie glukozy i kwasu salicylowego po usunie˛ciu tych czynniko´w ze s´rodowiska krwinek, zostawia s´lad w postaci zwie˛kszonej odpornos´ci komo´rek na działanie dodatkowego czynnika utleniaja˛cego jakim był nadtlenek kumenu (ryc. 4). Punkt odniesienia
w tych badaniach stanowił układ składaja˛cy sie˛ z zawiesiny erytrocyto´w w buforze z fizjologicznym ste˛z˙eniem glukozy poddany działaniu nadtlenku kumenu. Ilos´c´ powstaja˛cego w tym układzie MDA przyje˛to za wartos´c´ 1. Ste˛z˙enie glukozy 126,2 i 280,1 mg % nie spowodowało zwie˛kszenia podatnos´ci na oksydowalnos´c´ błon erytrocyto´w w poro´wnaniu do erytrocyto´w poddanych działaniu glukozy o ste˛z˙eniu 72,9 mg %. Dopiero ste˛z˙enie glukozy o wartos´ci 354,1 mg % istotnie zmniejszyło odpornos´c´ na działanie nadtlenku kumenu.
Ryc. 4. Podatnos´c´ na peroksydacje˛ lipido´w pod wpływem nadtlenku kumenu krwinek czerwonych naraz˙onych uprzednio na działanie glukozy i kwasu salicylowego.
Fig. 4. Susceptibility of glucose- and salicylic acid-preexposed erythocytes to cumene peroxide-induced lipid peroxidation.
Działanie utleniaja˛ce nadtlenku kumenu w stosunku do badanych erytrocyto´w poddanych 18 godz. działaniu glukozy w zakresie ste˛z˙. 72,9 – 280,1 mg % zostało istotnie obniz˙one, jez˙eli na krwinki dodatkowo oddziaływał kwas salicylowy w ste˛z˙. 30 mg % przez okres 30 min. Kro´tsza 10 min. inkubacja z kwasem salicylowym wpłyne˛ła protekcyjnie na krwinki znajduja˛ce sie˛ w otoczeniu glukozy w ste˛z˙. 126,2 i 280,1 mg %, a nie zadziałała protekcyjnie na zawiesine˛ z prawidłowym ste˛z˙eniem glukozy.
Działanie antyoksydacyjne kwasu salicylowego w stosunku do erytrocyto´w naraz˙onych na działanie utleniaja˛ce nadtlenku kumenu nie miało znaczenia w przypadku erytrocyto´w naraz˙onych na glukoze˛ o ste˛z˙. 354,1 mg %.
W pewnym przybliz˙eniu moz˙emy stwierdzic´, z˙e zawiesiny krwinek z glukoza˛, kto´re wykazały zwie˛kszenie aktywnos´ci SOD pod wpływem kwasu salicylowego sa˛ ro´wniez˙ mniej podatne na inicjacje˛ peroksydacji za pos´rednictwem nadtlenku kumenu.
Wobec istnienia ro´z˙nic w obserwowanych efektach, zaro´wno dla ro´z˙nych ste˛z˙en´ glukozy jak i czasu naraz˙enia na kwas salicylowy, wydaje sie˛ interesuja˛ce zbadanie kinetyki zmian markero´w stresu oksydacyjnego, co moz˙e miec´ znaczenie praktyczne w leczeniu oso´b z cukrzyca˛.
M.B. G a w l i k
THE IN VITRO EFFECTS OF SALICYLIC ACID ON PRO-/ANTIOXIDATIVE BALANCE IN HUMAN RED BLOOD CELLS AT HIGH GLUCOSE CONCENTRATIONS
S u m m a r y
In vitro effects of glucose and salicylic acid on the antioxidant system in human red blood cells were studied. The suspensions of erythrocytes in phosphate-buffered saline containing glucose at 72.9; 126.2; 280.1 and 354.1 mg % were incubated at 37°C for 18 hours. After that, 30 mg% salicylic acid was added to each sample and then the samples were incubated for a further 10 and 30 min. The levels of MDA and the activity of SOD were measured before and after the incubation. Samples of erythrocytes after incubation with glucose and salicylic acid prepared as described above were oxidized with cumene hydroperoxide for 1 hour. Erythrocyte susceptibility to peroxidation was assessed by the determination of MDA level and SOD activity. The results suggest that salicylic acid does not change the level of MDA in erythrocyte suspensions exposed to glucose within the studied concentration range. The activity of SOD in these suspensions depended on the concentration of glucose and the time of incubation with salicylic acid. Susceptibility to lipid peroxidation of red blood cells exposed to glucose dropped under the influence of salicylic acid within the glucose concentration range of 126.2-280.1 mg%.
PIS
´
MIENNICTWO1. Baynes J.W., Thorpe S.R.: Role of oxidative stress in diabetic complications. Diabetes, 1999; 48: 1-9. – 2. Tohoku J.: Lipid peroxidation and resistance to oxidation in patients with type 2 Diabetes Mellitus. J. Exp. Med., 2004; 203: 211-8. – 3. Piconi L., Quagliaro L., Ceriello A.: Oxidative stress in diabetes. Clin. Chem. Lab. Med., 2003; 41: 1144-49. – 4. Sushil K.J.: Hyperglycemia can cause membrane lipid peroxidation and osmotic fragility in human red blood cells. J. Biol. Chem., 1989; 264: 21340-43. – 5. American Diabetas Association. Aspirin therapy in diabetes. Diabetes Care 2003; 26: 87-88. – 6. Czyz˙ M., Watała C.: Aspiryna-molekularne mechanizmy działania kwasu acetylosalicylowe-go w organizmie. Poste˛py Hig. Med. Dos´w., 2005; 59: 105-13. – 7. Ghiseli A., Laurenti O., De Mattia
G., Maiani G., Ferro-Luzzi A.: Salicylate hydroxylation as an early marker of in vivo oxidative stress in
diabetic patients, Free Radic. Biol. Med., 1992; 13: 621-626. – 8. Awtry E.H., Loscalzo J.: Aspirin. Circulation, 2000; 101: 1206-18. – 9. Blatter-Garin M.C., Kalix B., De Pree S., James R.W.: Aspirin use is associated with higher serum concentrations of the anti-oxidant enzyme, paraoxonase-1. Diabetologia, 2003; 46: 593-594. – 10. Durak I., Karaayvaz M., Çimen M.Y.B., Avci A., Çimen Ö.B., Büyükloçak S.,
O˝ztürk H.S., Özbek H., Kaçmaz M.: Aspirin impairs antioxidant system and causes peroxidation in
human erythrocytes and guinea pig myocardial tissue. Hum. Exp. Toxico,. 2001; 20: 34-37. 11. Kirkova M., Ivancheva E., Russanov E.: In vitro effects of aspirin on malondialdehyde formation and on activity of antioxidant and some metal-containg enzymes. Comp. Biochem. Physiol. Pharmacol. Toxicol., 1994; 108: 145-52. – 12. Pihan G., Regillo C., Szabo S.: Free radicals and lipid peroxidation in ethanol or aspirin induced gastric mucosal injury. Dig. Dis. Sci., 1987; 32: 1395-401. – 13. Orhan H.,
Sahin G.: In vitro effects of NSAIDS and paracetamol on oxidative stress-related parameters of human
erythrocytes. Exp. Toxicol. Pathol., 2001; 53: 133-40. – 14. Ohsako M., Matsumoto Y., Goto S.: Transport of aspirin and its metabolites through human erythrocyte membrane. Biol. Pharm. Bull., 1993; 16: 154-57. – 15. van den Berg J.J.M., Op den Kamp J.A.F., Lubin B.H., Roelofsen B., Kuypers F.A.: Kinetics and site specifity of hydroperoxide- induced oxidative damage in red blood cells, Free Radical Biol. Med., 1992; 12: 487-498. – 16. American Diabetas Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 2005; 28: 37-42. – 17. Stocks J., Offerman E.C., Modell C.B., Dormand
T.L.: The susceptibility to autoxidation of human red cell lipids in health and disease. Br. J. Haemat.,
1972; 23: 713-25. – 18. Misra H.P., Fridovich I.: The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J. Biol. Chem., 1972; 247: 3170-75. – 19.
Kotake M., Shinohara R., Kato K., Hayakawa N., Hayashi R., Uchimura K., Makino M., Nagata M., Kakizawa H., Nakagawa H., Nagasaka A., Itoh M.: Reduction of activity, but no decrease in
concentration of erythrocyte Cu,Zn-superoxide dismutase by hyperglycaemia in diabetic patients. Diab. Med., 1998; 15: 668-71.
