Dorota Żabicka | Elżbieta Literacka
Nowoczesne metody wykrywania i identyfikacji
bakterii
Modern methods of bacteria detection and identification
Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie} Dorota Żabicka, Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków, ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa, Tel.: (22) 851 46 70, Fax: (22) 841 29 49, e-mail: dzabicka@cls.edu.pl
Wpłynęło: 6.02.2013 Zaakceptowano: 8.03.2013
Streszczenie: Szybkie wykrycie i identyfikacja drobnoustroju
odpowiedzialnego za zakażenie stanowi główny cel i jednocze-śnie wyzwanie dla klinicznych laboratoriów mikrobiologicznych. W ostatnich latach klasyczne metody mikrobiologiczne, takie jak hodowla i identyfikacja z zastosowaniem fenotypowych testów biochemicznych, uzupełniane są o nowoczesne metody analitycz-ne i molekularanalitycz-ne. W niniejszej pracy zostały omówioanalitycz-ne następują-ce metody: identyfikacja z zastosowaniem systemów automatycz-nych, spektrometria masowa MALDI-TOF, metody hybrydyzacji oraz metody PCR i RT-PCR.
Słowa kluczowe: identyfikacja bakterii | hybrydyzacja |
MALDI--TOF | metody molekularne | PCR | systemy automatyczne
Abstract: Rapid detection and identification of microorganism
re-sponsible for infection is the main goal and in the same time main challenge for clinical microbiology laboratories. Within last years the classical microbiological methods, such as culture and identifi-cation based on phenotypic biochemical test, were supplemented with modern analytical and molecular methods. In this paper was presented the following methods: identification with using auto-matic systems, mass spectrometry MALDI-TOF, hybridization, PCR and RT-PCR.
Key words: automatic systems | bacteria identification |
hybridiza-tion | MALDI-TOF | molecular methods | PCR
oraz łatwe rozprzestrzenianie się patogenów, w tym szcze-pów opornych na leki, zmuszają do doskonalenia starych oraz poszukiwania i rozwoju nowych metod identyfikacji drobnoustrojów.
Historycznie identyfikacja bakterii oparta była na morfo-logii kolonii, barwieniu metodą Grama oraz testach bioche-micznych. Do późnych lat 70. ubiegłego wieku mikrobiolo-dzy w swojej ocenie polegali na wzroście i izolacji bakterii w hodowli płynnej i na podłożu agarowym. Identyfikacja opierała się głównie na biochemicznej i metabolicznej cha-rakterystyce szczepu. Identyfikacja przy wykorzystaniu metod fenotypowych jest procesem długotrwałym, ponie-waż izolacja czynnika chorobotwórczego występującego w próbce klinicznej wymaga około 24–48 godzin inkuba-cji, natomiast identyfikacja to kolejne 24 lub więcej godzin inkubacji. W późnych latach 50. i 60. XX wieku tradycyjne testy biochemiczne uległy miniaturyzacji i pojawiły się jako systemy wielotestowe, co było sporym usprawnieniem dia-gnostyki, lecz nie przyspieszyło uzyskania wyniku. W po-łowie lat 70. zaczęły pojawiać się automatyczne narzędzia do identyfikacji i oznaczania lekowrażliwości, w których skomputeryzowane systemy odczytywały wyniki. Te ciągle doskonalone systemy umożliwiły przyspieszenie uzyskania wyniku badania mikrobiologicznego, ułatwiając identyfika-cję oraz ocenę lekowrażliwości w kilka–kilkanaście godzin. Dalsze przyspieszenie czasu wykrycia i identyfikacji drob-noustrojów było możliwe dzięki wprowadzeniu nowej gene-racji systemów do identyfikacji bakterii, wykorzystujących nowoczesne metody analityczne i biologii molekularnej. Metody te, oparte na wykrywaniu profilu białek lub sekwen-cji kwasów nukleinowych, są wysoce swoiste, czułe i szyb-kie, dostarczają prawidłowe wyniki w ciągu kilku godzin [1]. W pracy omówiono stosowane obecnie w laboratoriach mikrobiologicznych nowoczesne systemy automatyczne do identyfikacji fenotypowej i oznaczania lekowrażliwości bakterii, metodę spektrometrii masowej MALDI-TOF oraz najczęściej stosowane metody biologii molekularnej, takie jak PCR, RT-PCR i metody hybrydyzacji.
Wstęp
Wykrycie i identyfikacja drobnoustroju odpowiedzial-nego za zakażenie jest niezbędnym czynnikiem wdrożenia właściwej terapii. Szybka diagnostyka chorób, umożliwia-jąca wczesne rozpoznanie, stanowi główne wyzwanie dla klinicznych laboratoriów mikrobiologicznych. Zmieniająca się epidemiologia zakażeń, pojawianie się nowych niebez-piecznych patogenów, zmieniający się przebieg klinicz-ny zakażeń wywoływaklinicz-nych przez znane, „stare” patogeklinicz-ny
jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
i oznaczania lekowrażliwości bakterii
Wprowadzenie systemów automatycznych wniosło duży postęp w diagnostyce mikrobiologicznej i od ponad 30 lat są to metody chętnie i powszechnie stosowane w wielu labo-ratoriach, ze względu na usprawnienie i ułatwienie pracy ru-tynowej. Są one ciągle modyfikowane, ulepszane, mają coraz szersze spektrum możliwości diagnostycznych. Najczęściej stosowane są do identyfikacji i oznaczeń lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych z materiału klinicznego, ale były również podejmowane próby ich zastosowania do identyfikacji drobnoustrojów w próbkach pobranych bezpośrednio z dodatniej butelki z posiewem krwi [1, 2].
Automatyczne systemy do identyfikacji i oznaczania lekowrażliwości bakterii są najczęściej oparte na tych sa-mych zasadach co testy konwencjonalne, ponieważ wyko-rzystują zminiaturyzowane wersje tych testów [1]. Jednakże w porównaniu z tradycyjnymi metodami diagnostycznymi wykazują więcej zalet. Jedną z głównych zalet systemów automatycznych jest dostarczanie wyników w krótkim cza-sie, nawet w ciągu 2–4 godzin. Poza znacznym skróceniem czasu identyfikacji drobnoustroju, niewątpliwą zaletą tych systemów jest możliwość jednoczesnego wykonania ozna-czeń identyfikacji i/lub lekowrażliwości dla wielu szczepów bakterii (lub drożdży); w niektórych aparatach nawet ponad 100 drobnoustrojów jednocześnie. Zastosowane w apara-tach czułe systemy detekcji wykrywają nawet najmniejsze, subtelne zmiany we wzroście drobnoustrojów, co zapewnia precyzję wyników odczytywanych automatycznie. Ogrom-nym walorem są także zastosowane w nowoczesnych syste-mach automatycznych tzw. systemy eksperckie, które uła-twiają interpretację otrzymanych wyników. Zaawansowane oprogramowanie, w które wyposażone są nowoczesne sys-temy automatyczne, umożliwia różne sposoby generowania, opracowywania, gromadzenia i przesyłania wyników [1, 3–6].
Obecnie w Polsce, podobnie jak na całym świecie, najczę-ściej stosowane są następujące aparaty: VITEK®2 i VITEK®2 Compact (bioMérieux), BD Phoenix™ (BD Diagnostics), MicroScan® WalkAway (Siemens) oraz SensiTitre® (Fischer Diagnostics) [1–9].
Wszystkie te systemy zapewniają zarówno szybką iden-tyfikację drobnoustrojów, jak i oznaczenie lekowrażliwości. Producenci posiadają w swojej ofercie różnego rodzaju pa-nele, umożliwiające badania różnych grup drobnoustrojów: bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, pałeczek nie-fermentujących, bakterii trudno rosnących o wysokich wy-maganiach wzrostowych, bakterii beztlenowych i drożdży. Panele przeznaczone do oznaczania lekowrażliwości, do-starczają wyniki albo w postaci rzeczywistej wartości MIC, albo w zakresie wartości granicznych, wraz z określeniem kategorii S (wrażliwy), I (średniowrażliwy), R (oporny),
in-CAST. Systemy automatyczne umożliwiają nie tylko ozna-czenie lekowrażliwości, ale także wskazują prawdopodobny mechanizm oporności na antybiotyki, np. beta-laktamazy ESBL i KPC u pałeczek Enterobacteriaceae, metycylinoność u gronkowców, opormetycylinoność na glikopeptydy lub opor-ność wysokiego stopnia na aminoglikozydy u enterokoków. W niektórych systemach (MicroScan® WalkAway i Pho-enix™ BD) dostępne są tzw. panele combo, które umożliwiają jednoczesną identyfikację i oznaczenie lekowrażliwości ba-danego drobnoustroju [1, 3–7]. Poniżej krótko przedstawio-no podstawowe cechy systemów automatycznych.
MicroScan® WalkAway (Siemens) – system ten może
inkubować i analizować od 40 do 96 paneli. W czasie in-kubacji, w celu określenia intensywności wzrostu, dokony-wany jest okresowo ich odczyt przy użyciu fotometru albo fluorometru. System umożliwia identyfikację tlenowych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz pacior-kowców. Panele do oznaczania lekowrażliwości bakterii Gram-ujemnych, zawierające substraty fluorogenne, mogą być odczytane w czasie od 3,5 do 7 godzin. W przypadku paneli przeznaczonych do odczytu turbidymetrycznego wy-niki uzyskiwane są po 4,5–18 godzinach inkubacji [1, 4–5].
BD Phoenix™ Automated Microbiology System
(BD Diagnostics) – system może jednocześnie analizować 99 paneli badanych. Aparat monitoruje każdy panel co 20 minut, określając wzrost drobnoustrojów turbidymetrycz-nie i kolorymetryczturbidymetrycz-nie. Dostępne są panele do badania bakterii Gram-ujemnych, Gram-dodatnich, S. pneumoniae, paciorkowców β-hemolizujących i należących do grupy
vi-ridans. Wyniki otrzymywane są najczęściej po 8–12
godzi-nach inkubacji [1, 3, 5–7].
VITEK®2 (bioMérieux) – system ten stosuje
koloryme-tryczny monitoring wzrostu bakterii w czasie inkubacji. Przy użyciu aparatów VITEK®2 Compact, w zależności od modelu, możliwe jest jednoczesne badanie 30 lub 60 drobnoustrojów, natomiast model VITEK®2 umożliwia jed-noczesne badanie 60 lub 120 drobnoustrojów. System moż-na konfigurować i przystosować do jednoczesnego badania od 30 do 240 mikroorganizmów. Możliwa jest identyfika-cja tlenowych bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, paciorkowców, Neisseria sp. Haemophilus sp.,
Corynebacte-rium sp., bakterii beztlenowych i grzybów
drożdżopodob-nych. Karty do oznaczania lekowrażliwości umożliwiają otrzymanie wyniku dla typowych szybko rosnących bakterii tlenowych Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz S.
pneu-moniae w czasie od 4 do 10 godzin [3, 4–5, 8].
SensiTitre® (Fischer Diagnostics) – jest systemem
opar-tym o metodę mikrorozcieńczeń, w którym do odczytu zastosowano technologię fluorescencyjną. Umożliwia jed-noczesne badanie 64 paneli. Panele są standardowymi, za-wierającymi 96 studzienek płytkami mikrotitracyjnymi. Wzrost oceniany jest przez pomiar fluorescencji po 18–24 h
datnich i Gram-ujemnych, S. pneumoniae, Haemophilus sp. oraz Gram-ujemnych pałeczek niefermentujących. System umożliwia zarówno odczyt manualny, półautomatyczny, jak i w pełni automatyczny [5, 9].
Wszystkie wymienione wyżej systemy automatyczne po-siadają zaawansowane oprogramowania komputerowe, tzw. systemy eksperckie (expert systems), które zawierają informa-cje istotne dla interpretacji otrzymywanych wyników identy-fikacji i lekowrażliwości drobnoustrojów [5, 10]. Sprawdzają one poprawność uzyskanych wyników przed wydaniem osta-tecznego raportu, podają interpretację wykrytych mechani-zmów oporności, informują o konieczności wykonania do-datkowych testów. Stanowią bazę danych opartą o najnowsze doniesienia literaturowe i obowiązujące kryteria interpretacji. Sformułowane reguły eksperckie zapewniają spójną inter-pretację, oszczędzają czas, eliminują wiele błędów i pomyłek ludzkich. Przykładem tego typu oprogramowania jest tzw. Zaawansowany System Ekspertowy (ang. Advanced Expert System, AES) zastosowany w systemach VITEK®2. AES jest bazą danych zawierającą około 20 000 rozkładów wartości MIC dla około 100 gatunków drobnoustrojów, opracowanych na podstawie doniesień literaturowych i zasobów własnych firmy, umożliwiającą identyfikację ponad 2300 fenotypów lekowrażliwości [8, 10]. Dla każdego oznaczonego fenoty-pu system sprawdza czy otrzymane wartości MIC są zgodne z identyfikacją gatunkową badanego drobnoustroju. System dopuszcza tylko jedną niezgodność w wartościach MIC oznaczonych dla danego gatunku drobnoustroju; w przypad-ku stwierdzenia kilw przypad-ku niezgodności sugeruje ponowne wy-konanie badania. Ponadto, określony dla każdego badanego izolatu fenotyp lekowrażliwości zostaje porównywany z fe-notypami znajdującymi się w bazie danych. Jeśli odczytane dla badanego izolatu wartości MIC odpowiadają fenotypowi znajdującemu się w bazie danych, wynik jest akceptowany. System podaje interpretację oznaczenia w oparciu o reko-mendacje CLSI i EUCAST, uwzględnia także oporność na-turalną, gatunkowo specyficzną. W niektórych przypadkach aparat może podawać wskazówki terapeutyczne. Wszystkie systemy ekspertowe podlegają częstym aktualizacjom tak, by na bieżąco uwzględniać najnowsze dane i zapewnić jak najbardziej wiarygodną i aktualną interpretację uzyskanych wyników. Nowoczesne oprogramowanie systemów auto-matycznych, poprzez laboratoryjne systemy informatyczne, umożliwia szybką dystrybucję uzyskanych wyników i pomoc w ustaleniu właściwej terapii [10].
Pomimo niewątpliwych zalet, jakie posiadają systemy automatyczne, ich wadą jest i niższa czułość i specyficzność identyfikacji w odniesieniu do bakterii wolno rosnących lub bardziej wymagających. Stwierdzane są również problemy w prawidłowej interpretacji wyników oznaczania wrażliwo-ści na antybiotyki w przypadku niektórych grup drobno-ustrojów [7, 8, 9, 11–14].
Narzędziem najnowszej generacji wykorzystywanym w mikrobiologii klinicznej do identyfikacji mikroorga-nizmów jest spektrometria mas, tzw. MALDI-TOF MS (ang. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry). Jest to analityczna metoda do szybkiego i precyzyjnego oszacowania masy cząsteczek w zakresie od 100 Da do 100 kDa. Jednym z jej etapów jest jonizacja próbki techniką MALDI (ang. Matrix Assisted La-ser Desorption and Ionisation) – laLa-serowa desorpcja próbki oraz jej jonizacja wspomagana matrycą. Energia wiązki la-sera jest tak dobrana, aby nie doprowadzać do fragmenta-cji cząsteczek (łagodna metoda jonizado fragmenta-cji), lecz tylko do ich „wybijania” ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca dostarcza dużej ilości jonów (protonów) potrzebnych do jo-nizacji badanej substancji, przez co ułatwia jonizację próbki, absorbuje energię lasera, po czym przekazuje ją do anali-zowanych cząsteczek. Zastosowana w spektrofotometrach technika TOF (ang. Time of Flight) jest techniką pomiaru czasu przelotu jonów, wykorzystującą fakt, iż jony o różnej masie poruszają się z różną prędkością i po przebyciu pew-nej drogi w przestrzeni docierają do detektora z opóźnie-niem zależnym od tej prędkości [15].
Obecnie na świecie w diagnostyce mikrobiologicznej wy-korzystywane są dwa systemy MALDI-TOF MS;, są to Bio-typer® firmy Bruker oraz system Vitek® MS firmy bioMérieux. Umożliwiają one identyfikację setek różnych gatunków bak-terii i wielu klinicznie istotnych grzybów [15–17]. Główną zaletą techniki MALDI-TOF MS jest bardzo szybki czas uzyskania identyfikacji skróconej do kilku minut (nie li-cząc czasu na wyhodowanie drobnoustroju), w porównaniu z 24–48-godzinnym czasem potrzebnym do identyfikacji drobnoustroju metodami konwencjonalnymi. Zastosowa-nie metody skraca proces diagnostyczny o około 24 godziny. Właściwości drobnoustrojów analizowane metodą spektro-metrii masowej to unikatowy profil białkowy drobnoustroju, czyli jego molekularny białkowy „odcisk palca”. Wykazano, iż MALDI-TOF MS silnie różnicuje poszczególne gatunki drobnoustrojów, gdyż główny profil masowy uzyskany przez ten system jest profilem białek rybosomalnych, na podsta-wie których odbywa się współczesna klasyfikacja taksono-miczna drobnoustrojów [18]. System dokonuje klasyfika-cji i identyfikaklasyfika-cji mikroorganizmów przez automatyczną analizę ich profilu białkowego i porównanie ze spektrofo-tometrycznymi wzorami referencyjnymi zgromadzonymi w bazie danych. Aktualne bazy danych zawierają kilkaset lub nawet tysiące spektrów referencyjnych, umożliwiając szybką, precyzyjną i wiarygodną identyfikację drobnoustro-jów [19, 20]. W praktyce wykonanie oznaczenia tą metodą jest bardzo proste, wystarczy niewiele, około 105–106 świe-żych komórek wyrosłych na podłożu mikrobiologicznym. Na specjalną płytkę nanosi się komórki bakterii i dodaje
automatycznie dokonuje oznaczenia i generuje wyniki [18]. Zastosowanie MS w obszarze mikrobiologii klinicznej rozwija się bardzo dynamicznie. Obecnie dostępne systemy MALDI-TOF MS są skoncentrowane głównie na identyfi-kacji gatunku bakterii poprzez analizę i wizualizację profili białek, które są znacznie łatwiej jonizowane niż np. silnie hydrofilowe cząsteczki oligo- czy polisacharydów. Pomimo niewątpliwych zalet, MALDI-TOF MS nie jest systemem pozbawionym pewnych ograniczeń. Te, które są najczęściej wymieniane to:
t konieczność wcześniejszej hodowli drobnoustroju w celu otrzymania czystej, świeżej hodowli;
t wstępna klasyfikacja drobnoustroju na podstawie barwienia metodą Grama;
t problemy przy identyfikacji drobnoustrojów w mie-szanej hodowli;
t prawidłowa identyfikacja gatunków blisko spokrew-nionych [15, 20].
Systemy te są jednak ciągle ulepszane, ich czułość będzie zapewne wzrastać z każdą następną generacją, umacniając pozycję MS w laboratoriach klinicznych [15, 21].
Obecnie w literaturze prezentowane są liczne doniesienia o nowych zastosowaniach MALDI-TOF MS [15, 22–26]. Prowadzone są badania dotyczące zastosowania MS do bez-pośredniego wykrywania drobnoustrojów w materiale klinicznym, takim jak krew czy mocz, chociaż nie opraco-wano jeszcze wystandaryzowanych procedur. Wykazano, że MALDI-TOF MS może w szybki (2 godziny) i dokład-ny sposób dokonać identyfikacji patogenów występujących w pozytywnych podłożach hodowlanych krwi. Problem sta-nowią jednak próbki zawierające mieszaną florę bakteryjną, paciorkowce hemolizujące, czy beztlenowce [23–26]. Roz-waża się również wykorzystanie MS w typowaniu mikro-biologicznym drobnoustrojów. Wykazano bowiem wysoką zgodność wyników typowania bakterii uzyskanych przy użyciu MALDI–TOF MS oraz MLST, uznawanej obecnie za złoty standard w typowaniu wielu gatunków bakterii [15]. Podejmowane są także próby wykorzystania MS w ozna-czaniu lekowrażliwości drobnoustrojów. Zaobserwowano, iż produkty, które powstają w wyniku hydrolizy (np. beta-laktamów przez enzymy bakteryjne – β-laktamazy) różnią się masą cząsteczkową od natywnych cząsteczek antybio-tyków. Wynik tego oznaczenia uzyskiwany jest w czasie od 1 do 2,5 godziny. Wykazano wysoką czułość i swoistość tego oznaczenia, wynoszące odpowiednio 97% i 98%. Są tak-że badania, które wskazują ogromny potencjał tej metody w rutynowym wykrywaniu niebezpiecznych mechanizmów oporności, np. karbapenemaz typu KPC, MBL i OXA-48 [15, 19, 22].
Uważa się, że spektrometria masowa będzie miała szereg innych zastosowań, np.: do oznaczania toksynotwórczości szczepu, wykrywania i identyfikacji sygnałów
„quorum-sen-ników wiązania mikroorganizmów w organizmie gospoda-rza (np. przeciwciał, kompleksów antygen-przeciwciało), badania otoczek i LPS bakterii. Przypuszcza się, iż szybkie wykrycie tych struktur komórkowych metodą spektrometrii może mieć ważne znaczenie kliniczne we wczesnym wykry-waniu, np. bakteriemii i sepsy. Są także badania zmierzające do wykorzystania MS do identyfikacji wirusów [15, 22].
Metody molekularne
Postęp w dziedzinie metod biologii molekularnej zre-wolucjonizował sposób identyfikacji i klasyfikacji drobno-ustrojów oraz umożliwił zastosowanie metod genetycznych w diagnostyce wielu chorób zakaźnych. Metody moleku-larne pozwalają na szybką identyfikację wielu gatunków drobnoustrojów: bakterii, wirusów i grzybów. Znalazły miejsce szczególnie w wykrywaniu i identyfikacji drob-noustrojów sprawiających trudności w hodowli lub długo rosnących na podłożach mikrobiologicznych i tym samym sprawiających trudności w identyfikacji metodami kon-wencjonalnymi. Rozwój testów molekularnych był możliwy dzięki poznaniu sekwencji genomów wielu gatunków drob-noustrojów i opisaniu genów, które stanowią istotny cel, wy-korzystywany w identyfikacji drobnoustrojów. Upowszech-nienie stosowania tych testów jest wynikiem standaryzacji i pojawienia się automatycznych zestawów do amplifikacji czy też automatycznych systemów do ekstrakcji kwasów nu-kleinowych. Wadą testów jest ich cena, jednak wraz z upły-wem czasu będą one tańsze i szerzej dostępne. W badaniach próbek klinicznych znalazły zastosowanie zarówno testy do badań przesiewowych, jak i testy potwierdzające. Wy-korzystują one głównie metody hybrydyzacji, amplifikacji specyficznych dla gatunku produktów PCR lub też sekwen-cjonowanie DNA [19, 27–30].
Hybrydyzacja
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych jest techniką, któ-ra została opisana po któ-raz pierwszy w 1961 roku. Metoda ta polega na tworzeniu wiązań wodorowych pomiędzy nu-kleotydami komplementarnych do siebie jednoniciowych cząsteczek DNA lub RNA. W wyniku hybrydyzacji powsta-ją dwuniciowe cząsteczki (hybrydy), w których jedna nić jest cząsteczką DNA lub RNA badanego mikroorganizmu (ang. target), a druga wyznakowaną chemicznie, radioak-tywnie lub barwnikiem fluorescencyjnym sondą. Jako son-dy stosowane są cząstki DNA, RNA lub analogów kwasów nukleinowych, np. PNA, czyli kwasu peptydonukleinowe-go (ang. Peptide Nucleic Acid). W diagnostyce mikrobio-logicznej stosowane są metody hybrydyzacji na podłożu stałym oraz hybrydyzacji w podłożu płynnym. Przykładami
blot (wykrywanie kwasu DNA) i Northern blot (wykrywa-nie kwasu RNA). Jednym z typów hybrydyzacji jest FISH (ang. Fluorescent In Situ Hybridisation), która umożliwia wykrywanie określonej sekwencji DNA w badanej próbce przy wykorzystaniu sondy molekularnej znakowanej fluore-scencyjnie. FISH jest techniką, która łączy w sobie zalety za-równo histopatologii, jak i metody molekularnej, stosowana jest do wykrywania i identyfikacji bakterii w ich naturalnym środowisku [19, 29–30].
W hybrydyzacji na podłożu stałym (technika zwana blot-ting), kwas nukleinowy stanowiący target jest unierucho-miony na membranie. W klinicznych laboratoriach mikro-biologicznych stosowana jest głównie metoda Southern blot. Metoda ta ma zastosowanie nie tylko do wykrywania i iden-tyfikacji drobnoustrojów, lecz także do wykrywania mutacji czy typu szczepu w badaniach epidemiologicznych. W ru-tynowej diagnostyce znalazły zastosowanie testy, w których sondy wykrywają specyficzne sekwencje genomowego lub plazmidowego DNA. Przykładami takich testów są testy BD Affirm VPIII, zawierające sondy wyznakowane chemilumi-nescencyjnie, umożliwiające wykrycie drobnoustrojów wy-wołujących stany zapalne pochwy: Candida sp., Gardnerella
vaginalis i Trichomonas vaginalis [19, 27].
Obecnie w laboratoriach mikrobiologicznych najczęściej stosowana jest technika hybrydyzacji w roztworze. W syste-mach komercyjnych znakowane sondy są wykorzystywane do wykrycia i do szybkiej identyfikacji drobnoustroju wy-wołującego zakażenie, przy czym detekcja drobnoustrojów oparta jest na chemiluminescencji lub fluorescencji. Swo-istość i czułość tych testów wynosi niemal 100% i większość można wykonać w czasie jednej godziny. Przykładami wy-korzystania metody hybrydyzacji w diagnostyce mikrobio-logicznej są testy z rodziny AccuProbe firmy Gen-Prob Inc. oraz testy QuickFISH i PNA FISH firmy AdvanDx. W te-stach obu firm sonda wykrywa rybosomalny RNA bada-nego drobnoustroju, wyhodowabada-nego wcześniej na podłożu stałym lub płynnym, a testy QuickFISH również w podłożu pobranym z dodatniej butelki z posiewem krwi. Dostępne są również testy zawierające wyznakowane sondy, umożli-wiające wykrycie drobnoustrojów bezpośrednio w próbkach klinicznych, np. Gen-Prob Inc. oferuje kilka systemów z ro-dziny PACE do wykrywania Chlamydia trachomatis
i Neisse-ria gonorrhoeae w próbkach klinicznych. Wymienione testy
różnią się przygotowaniem próbki do badania i sposobem odczytu. W testach AccuProbe i PACE sonda jest wyznako-wana chemiluminescencyjnie, reakcja zachodzi w roztwo-rze w probówkach, a wynik odczytywany jest przy pomocy luminometru. Dostępne testy AccuProbe umożliwiają iden-tyfikację Mycobacterium tuberculosis i kilku gatunków prąt-ków szybko rosnących, Campylobacter sp., Enterococcus sp.,
Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, N. gonorr-hoeae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae,
Strep-dimorficznych Blastomyces dermatitidis, Coccidioides
immi-tis i Histoplasma capsulatum. Testy QuickFISH i PNA FISH
pozwalają na identyfikację drobnoustrojów w rozmazie na szkiełku mikroskopowym. Odczytu wyniku dokonuje się w mikroskopie fluorescencyjnym, a widoczne w preparacie drobnoustroje zachowują swój kształt, dzięki czemu obraz przypomina widok preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama. Z informacji na stronie internetowej produ-centa testu wynika, że obecnie metoda ta pozwala na iden-tyfikację S. auerus i gronkowców koagulazo-ujemnych,
En-terococcus faecalis i grupy EnEn-terococcus faecium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aueruginosa, Can-dida albicans, CanCan-dida glabrata, CanCan-dida tropicalis, CanCan-dida parapsilosis i Candida krusei [27–28].
Opisano również zatasowanie metody FISH do rozpo-znania czynnika etiologicznego infekcyjnego zapalenia wsierdzia. Metoda ta pozwoliła na wykrycie w preparatach histologicznych zastawek serca nie tylko bakterii typowych, łatwych w hodowli, ale także mikroorganizmów wymaga-jących, trudnych w hodowli na podłożach mikrobiologicz-nych, lub takich, których nie udaje się hodować w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej [31].
Metoda PCR
Wprowadzenie reakcji łańcuchowej polimerazy, w skró-cie PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), było jednym z największych, jeśli nie największym przełomem w naukach biologicznych i chemicznych. Metoda ta w obecnej postaci została opracowana przez Mullis i wsp. na początku lat 80. ubiegłego wieku. Metoda PCR polega na powielaniu (am-plifikacji) łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania prób-ki, z wykorzystaniem polimerazy odpornej na temperaturę oraz starterów, czyli krótkich łańcuchów DNA o sekwencji komplementarnej do poszukiwanego genu. Produkt reakcji jest następnie poddawany elektroforezie w celu uwidocznie-nia cząsteczki DNA o spodziewanej wielkości. Metoda PCR może być wykorzystywana do szybkiego wykrywania i na-mnożenia materiału genetycznego drobnoustroju występu-jącego w próbce klinicznej w niewielkiej liczbie kopii, przez co wykazuje większą czułość niż testy hybrydyzacji. Pomi-mo rozwoju różnych metod Pomi-molekularnych, PCR pozostaje najszerzej wykorzystywaną metodą, zarówno w badaniach eksperymentalnych, jak i w laboratoriach klinicznych. Wie-le gotowych testów amplifikacji łączy w sobie szybki czas detekcji z wysoką czułością i swoistością. Niektóre tech-niki mogą być także wykorzystywane do oceny ilościowej kwasów nukleinowych w próbkach klinicznych i dzięki temu znalazły zastosowanie w monitorowaniu progresji choroby. Wadami metody PCR są głównie koszty sprzętu, konieczność wydzielenia przestrzeni laboratoryjnej w celu
trzeba zatrudnienia wykwalifikowanego personelu. W nie-których przypadkach wadą PCR jest także bardzo duża czułość, pozwalająca na wykrycie tak małych ilości DNA, że wykrywany jest drobnoustrój, który nie jest przyczyną zakażenia [19, 29].
Metody PCR opisano niemal dla wszystkich możliwych drobnoustrojów. Wiele laboratoriów, w tym laboratoriów referencyjnych, wykorzystuje metody PCR w diagnostyce zakażeń bakteryjnych, wirusowych, grzybiczych i pasożyt-niczych. Na rynku dostępne są zestawy odczynników pro-dukowane przez różne firmy, zwane ASRs (ang. Analyte Specific Reagents), które są podstawą testów PCR typu „in-house”, czyli wykonywanych zgodnie z procedura przyjętą w danym laboratorium. Poza standardową procedurą PCR, stosowaną w większości laboratoriów, zastosowanie znala-zły także metody multipleks PCR i nested-PCR. W meto-dzie multipleks PCR możliwe jest jednoczesne wykrywanie dwóch lub więcej sekwencji docelowych w jednej probówce. Metoda ta jest często wykorzystywana do jednoczesnego wy-krywania w jednej probówce zarówno DNA stanowiącego kontrolę pozytywną reakcji PCR, jak i badanego DNA, lub też dwóch różnych sekwencji docelowych w badanym DNA. Przykładem może być jednoczesne (w jednej probówce) wy-krywanie genu oporności na meticylinę i potwierdzenie ga-tunku S. aureus. W przypadku multipleks PCR należy bar-dzo dokładnie sprecyzować warunki PCR oraz wykluczyć wzajemną interferencję primerów. Metoda nested-PCR jest bardzo czułą i swoistą techniką, na którą składają się dwie kolejne reakcje PCR. Startery reakcji są dobrane tak, że para starterów wykorzystana w drugiej reakcji PCR jest komple-mentarna do wewnętrznego regionu amplikonu otrzyma-nego w pierwszej reakcji. Metoda nested -PCR jest szcze-gólnie przydatna, gdy w badanej próbce jest bardzo mała ilość kwasu nukleinowego, bowiem pierwszy PCR umożli-wia namnożenie DNA, które jest następnie amplifikowane w wykrywalnej ilości w drugim PCR. Jako przykład można podać wykrywanie ludzkiego wirusa Herpes w próbce bada-nej. Pierwszy PCR może być wykorzystany do ustalenia czy występuje DNA wirusa i jeśli wynik reakcji jest pozytywny, wówczas drugi PCR umożliwia określenie przynależności wirusa do typu 1 lub 2. Główną wadą nested -PCR jest to, że reakcja nie zachodzi w systemie zamkniętym. Koniecz-ność otwarcia probówki w czasie przygotowania drugie-go PCR może przyczynić się do zanieczyszczenia próbki i otrzymania fałszywych wyników [19, 29].
Oprócz klasycznych reakcji PCR stosowane są również inne metody amplifikacji kwasów nukleinowych, takie jak NASBA (ang. Nucleic Acid Sequence Based Amplification). Jest to metoda umożliwiająca amplifikację RNA, mająca zastosowanie m.in. w diagnostyce zakażeń wirusem HIV czy też TMA (ang. Transcription-Mediated Amplification), technika amplifikacji w warunkach niezmiennej
tempera-DNA, używana m.in. w testach z rodziny APTIMA firmy Gene-Probe Inc. do diagnostyki zakażeń Neisseria
gonor-rhoeae i Chlamydia trachomatis [27]. W laboratoriach
mi-krobiologicznych stosowane są również systemy wyko-rzystujące metodę PCR, które umożliwiają automatyczny odczyt wyniku testu. Przykładem tego typu systemów jest test COBAS AMPLICOR CT/NG firmy Roche, łączący PCR i hybrydyzację. Umożliwia on wykrywanie C. trachomatis oraz N. gonorrhoeae w moczu, wymazach z szyjki macicy lub wymazach z cewki moczowej [27].
Real-time PCR
Technika Real-time PCR (RT-PCR), czyli PCR z odczy-tem w czasie rzeczywistym, stanowi największy przełom w detekcji produktów PCR. Metoda ta została rozwinięta na początku lat 90. ubiegłego wieku przez Higuchi i wsp. W odróżnieniu od klasycznego PCR, gdzie amplikony wy-krywane są na końcu całej procedury PCR, w aparatach RT-PCR możliwe jest śledzenie powstawania amplikonów w czasie rzeczywistym, po każdym cyklu reakcji amplifika-cji, dzięki czemu wynik pozytywny może być obserwowany szybko, jeszcze w czasie trwania testu. Detekcja produktu PCR w systemach RT-PCR możliwa jest dzięki zastosowaniu pomiaru fluorescencji próbki uwolnionej z różnego rodzaju fluorescencyjnych znaczników, proporcjonalnej do ilości powstałego produktu reakcji. Kolejną zaletą jest to, że reak-cja przebiega w zamkniętych probówkach, bez konieczności otwierania, co ma duże znaczenie w ochronie próbki przed kontaminacją. Real-time PCR jest także stosowany w ilo-ściowym oznaczeniu kwasów nukleinowych, co jest wy-korzystywane w monitorowaniu progresji różnych chorób, takich jak HIV, WZW, czy zakażenie cytomegalowirusem. Real-time PCR jest metodą bardzo szybką w porównaniu z typowym PCR. Wiele wyników uzyskuje się w ciągu 30–40 minut, co jest nieporównywalne z 4–5 godzinami potrzeb-nymi do wykonania standardowej metody PCR [29].
Obecnie na rynku dostępne są systemy RT-PCR różnych producentów, umożliwiające wykrycie drobnoustrojów bezpośrednio w próbce badanej (krew, surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, plwocina, popłuczyny oskrzelo-we, próbki płynnego stolca, wymazy z szyjki macicy, cewki moczowej, odbytu, ran operacyjnych, nosa) lub stwierdza-nie obecności genów kodujących toksyny lub mechanizmy oporności na antybiotyki u wyhodowanych bakterii [19, 27– 29]. Przykładami tego typu testów są: BD ProbeTec – służące do wykrywania obecności C. trachomatis i N. gonorrhoheae w wymazach z szyjki macicy i cewki moczowej, NucliSENS EasyQ (Gen-Probe Inc., bioMérieux) – umożliwiające wy-krywanie S. aureus opornych na metycylinę (MRSA) w wy-mazach z nosa, BD GenOhm – umożliwiające wykrycie MRSA w wymazach z nosa, Dx CT/NG/MG firmy BioRad
heae i Mycoplasma genitalum w próbkach od pacjentów.
Systemem łączącym PCR i sekwencjonowanie DNA jest Li-ghtCycler Septifast firmy Roche, umożliwiający szybką dia-gnostykę w przypadku sepsy i infekcyjnego zapalenia wsier-dzia, poprzez wykrywanie i identyfikację szeregu istotnych klinicznie gatunków bakterii i grzybów drożdżopodobnych we krwi pełnej lub wycinkach zakażonych zastawek.
Oprócz testów, które muszą być wykonane w laborato-rium przez wykwalifikowany personel, pojawiły się również systemy umożliwiające wykonanie oznaczenia przez perso-nel medyczny na oddziale szpitalnym lub w Izbie Przyjęć. Ten typ testów, stosowanych głównie w kontroli zakażeń szpitalnych, reprezentuje cała rodzina testów GeneXpert firmy Cepheid, umożliwiających wykrywanie m.in. MRSA w wymazach z nosa, dodatnich próbkach z butelki z posie-wem krwi oraz z wymazów z ran, enterokoków opornych na wankomycynę (VRE) w wymazach z odbytu, czy
Clostri-dium difficile w próbkach płynnego kału [32].
Podsumowanie
Mikrobiologiczne laboratoria diagnostyczne coraz chęt-niej sięgają po nowoczesne metody diagnostyczne. Planując wprowadzenie nowych testów diagnostycznych, należy jed-nak pamiętać, że wszystkie nowe metody i testy stosowane w rutynowej diagnostyce powinny spełniać odpowiednie, obecnie obowiązujące wymagania prawne, takie jak „Ustawa z dnia 15 kwietnia 2011 r. o działalności leczniczej” (Dz. U. z 2011 r. Nr 112, poz. 654, Nr 149, poz. 887, Nr 174, poz. 1039, Nr 185, poz. 1092, Dz. U. z 2012 r. poz. 742) oraz „Ustawa o zawodzie lekarza” (Dz. U. z 2011 r. nr 277, poz. 1634), zobo-wiązujące świadczeniodawców do wykonywania diagnostyki laboratoryjnej jedynie z użyciem wyrobów odpowiadających wymaganiom „Ustawy z dnia 20 maja 2010 r. o wyrobach me-dycznych” (Dz. U. z 2010 r. Nr 107, poz. 679, Nr 102, poz. 86, Dz. U. z 2011 r. Nr 113, poz. 657). Ustawa o wyrobach medycznych reguluje wymagania dotyczące testów do dia-gnostyki in vitro, zarówno wprowadzanych do obrotu przez producentów i dystrybutorów w Polsce, jak i testów opra-cowanych w laboratorium diagnostycznym. Testy komer-cyjne spełniające wymogi ustawowe posiadają odpowiednie oznakowanie symbolem CE-IVD. Należy również pamiętać, że stosowanie komercyjnych metod diagnostycznych wyma-ga od użytkownika spełnienia określonych wymogów jako-ściowych. Wiarygodne wyniki można otrzymać jedynie wte-dy, gdy testy wykonywane są zgodnie z instrukcją producenta oraz z zastosowaniem odpowiednich wzorców odniesienia i materiałów kontrolnych, a używana aparatura podlega okre-sowej konserwacji i fachowemu nadzorowi.
Pomimo wprowadzenia do diagnostyki nowoczesnych metod analitycznych, takich jak spektrometria masowa
gnostyki mikrobiologicznej nadal stanowi hodowla drob-noustrojów na odpowiednich podłożach mikrobiologicz-nych i uzyskanie tzw. czystej kultury, czyli etap, który nawet w przypadku drobnoustrojów szybko rosnących wymaga wielogodzinnej inkubacji. Niniejsze opracowanie omawia jedynie obecnie najczęściej stosowane nowe metody wykry-wania i identyfikacji drobnoustrojów chorobotwórczych. W piśmiennictwie pojawia się szereg doniesień o możliwo-ści wykorzystania innych metod, takich jak sekwencjonowa-nie kwasów nukleinowych, mikromacierze DNA, wykrywa-nie drobnoustrojów z użyciem bakteriofagów, są to jednak metody znajdujące się w fazie eksperymentalnej, stosowane w badaniach naukowych [19]. Trudno obecnie przewidzieć, które z tych metod znajdą szersze zastosowanie w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej.
Konflikt interesów: nie zgłoszono.
Piśmiennictwo
1. O’Hara CM. Manual and automated instrumentation for identification of
Enterobacteriaceae and other aerobic gram-negative bacilli. Clin
Micro-biol Rev 2005;18(1):147–62.
2. Beuving J, van der Donk CF, Linssen CF, Wolffs PF, Verbon A. Evaluation of direct inoculation of the BD PHOENIX system from positive BACTEC blo-od cultures for both Gram-positive cocci and Gram-negative rblo-ods. BMC Microbiol 2011;11:156.
3. Dallas SD, Avery AL, Pekarek PM et al. Comparison of BD Phoenix to Bio-merieux Vitek for the identification and susceptibility testing of common bacterial isolates. 105th General Meeting of the American Society for
Microbiology, Atlanta, Georgia, June 5–9, 2005; http://www.bd.com/ds/ technicalCenter/whitepapers/lr905.pdf
4. Sellenriek P, Holmes J, Ferrett R, Drury R, Storch GA. Comparison of Mi-croScan Walk-Away®, Phoenix™ and VITEK-TWO® microbiology systems used in the identification and susceptibility testing of bacteria. 105th
General Meeting of the American Society for Microbiology, Atlanta, Geo-rgia, June 5–9, 2005; http://www.bd.com/ds/technicalCenter/whitepa-pers/lr900.pdf
5. Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: a re-view of general principles and contemporary practices. Clin Infect Dis 2009;49(11):1749–1755.
6. O’Hara CM. Evaluation of the Phoenix 100 ID/AST system and NID panel for identification of Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, and commonly isolated nonenteric gram-negative bacilli. J Clin Microbiol 2006;44(3):928–933. 7. Stefaniuk E, Baraniak A, Gniadkowski M, Hryniewicz W. Evaluation of the
BD Phoenix automated identification and susceptibility testing system in clinical microbiology laboratory practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003;22(8):479–485.
8. Nakasone I, Kinjo T, Yamane N, Kisanuki K, Shiohira CM. Laboratory-based evaluation of the colorimetric VITEK-2 Compact system for spe-cies identification and of the Advanced Expert System for detection of antimicrobial resistances: VITEK-2 Compact system identification and antimicrobial susceptibility testing. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;58(2):191–198.
9. Chapin KC, Musgnug MC. Evaluation of Sensititre automated reading and incubation system for automated reading of Sensititre broth micro-dilution susceptibility plates. J Clin Microbiol 2004;42(2):909–911. 10. Winstanley T, Courvalin P. Expert systems in clinical microbiology. Clin
Microbiol Rev 2011;24(3):515–556.
11. Kulah C, Aktas E, Comert F, Ozlu N, Akyar I, Ankarali H. Detecting imipe-nem resistance in Acinetobacter baumannii by automated systems (BD Phoenix, Microscan WalkAway, Vitek 2); high error rates with Microscan WalkAway. BMC Infect Dis 2009;9:30.
trum Beta-lactamase detection with different panels for automated susceptibility testing and with a chromogenic medium. J Clin Microbiol 2008;46(11):3721–3727.
13. Abele-Horn M, Stoy K, Frosch M, Reinert RR. Comparative evaluation of a new Vitek 2 system for identification and antimicrobial susceptibi-lity testing of Streptococcus pneumoniae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2006;25(1):55–57.
14. Chatzigeorgiou KS, Sergentanis TN, Tsiodras S, Hamodrakas SJ, Bagos PG. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J Clin Microbiol 2011;49(9):3284–3291.
15. van Belkum A, Welker M, Erhard M, Chatellier S. Biomedical mass spec-trometry in today’s and tomorrow’s clinical microbiology laboratories. J Clin Microbiol 2012;50(5):1513–1517.
16. Cassagne C, Ranque S, Normand AC et al. Mould routine identification in the clinical laboratory by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PLoS One 2011; 6(12):e28425. 17. Bille E, Dauphin B, Leto J et al. MALDI-TOF MS Andromas strategy for the
routine identification of bacteria, mycobacteria, yeasts, Aspergillus spp. and positive blood cultures. Clin Microbiol Infect 2012;18(11):1117– 1125.
18. Intelicato-Young J., Fox A. Mass spectrometry and tandem mass spectrometry characterization of protein patterns, protein markers and whole proteomes for pathogenic bacteria. J Microbiol Methods 2013;92(3):381–386..
19. van Belkum A, Durand G, Peyret M et al. Rapid clinical bacteriology and its future impact. Ann Lab Med 2013;33(1):14–27.
20. Risch M, Radjenovic D, Han JN, Wydler M, Nydegger U, Risch U. Compa-rison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med Wkly 2010;140:w13095.
21. Dubois D, Grare M, Prere MF, Segonds C, Marty N, Oswald E. Performan-ces of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. J Clin Microbiol 2012;50(8):2568–2576. 22. Hrabák J, Chudácková E, Walková R. Matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight (maldi-tof ) mass spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to routine diagnosis. Clin Microbiol Rev 2013;26(1):103–114.
teria in blood culture broths using matrix-assisted laser desorption-ionization Sepsityper™ and time of flight mass spectrometry. PLoS One 2011;6(8):e23285.
24. Buchan BW, Riebe KM, Ledeboer NA. Comparison of the MALDI Biotyper system using Sepsityper specimen processing to routine microbiological methods for identification of bacteria from positive blood culture bot-tles. J Clin Microbiol 2012;50(2):346–352.
25. Wimmer JL, Long SW, Cernoch P et al. Strategy for rapid identification and antibiotic susceptibility testing of gram-negative bacteria directly recovered from positive blood cultures using the Bruker MALDI Biotyper and the BD Phoenix system. J Clin Microbiol 2012;50(7):2452–2454. 26. Ferreira L, Sánchez-Juanes F, González-Avila M et al. Direct identification
of urinary tract pathogens from urine samples by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2010;48(6):2110–2115.
27. Emmadi R, Boonyaratanakornkit JB, Selvarangan R et al. Molecular me-thods and platforms for infectious diseases testing a review of FDA-ap-proved and cleared assays. J Mol Diagn 2011;13(6):583–604.
28. Ieven M, Finch R, van Belkum A. European quality clearance of new mi-crobiological diagnostics. Clin Microbiol Infect 2013;19(1):29–38. 29. Sibley CD, Peirano G, Church DL. Molecular methods for pathogen
and microbial community detection and characterization: current and potential application in diagnostic microbiology. Infect Genet Evol 2012;12(3):505–521.
30. Wagner M, Haider S. New trends in fluorescence in situ hybridization for identification and functional analyses of microbes. Curr Opin Biotechnol 2012;23(1):96–102.
31. Mallmann C, Siemoneit S, Schmiedel D et al. Fluorescence in situ hybridi-zation to improve the diagnosis of endocarditis: a pilot study. Clin Micro-biol Infect 2010;16(6):767–773.
32. Żabicka D, Strzelecki J, Wozniak A et al. Efficiency of the Cepheid Xpert vanA/vanB assay for screening of colonization with vancomycin-resi-stant enterococci during hospital outbreak. Antonie Van Leeuwenhoek 2012;101(3):671–675.
