PRZEGL EPIDEMIOL 2002;56:425-33
Sławomir A Pancewicz 1 , Elżbieta Skrzydlewska 2 , Teresa Hermanowska-Szpakowicz 1, An-na Stankiewicz 2, Maciej Kondrusik 1
OCENA POTENCJAŁU OKSYDOREDUKCYJNEGO U CHORYCH Z NEUROBORELIOZĄ
1 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji AM w Białymstoku Kierownik: T. Hermanowska-Szpakowicz
2 Zakład Chemii Analitycznej AM w Białymstoku Kierownik: E. Skrzydlewska
Badaniami objęto 25 chorych z rozpoznaniem neuroboreliozy pod postacią zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, wykazując w płynie mózgowo-rdzeniowym zaburzenia równowagi oksydoredukcyjnej wyra-zające się wzrostem aktywność dysmutazy nadtlenkowej (SOD) oraz obniżeniem aktywności peroksydazy glutationowej (GSH-Px), reduktazy glutationowej (GSSG-R), a wzrostem stężenia grup -SH i aldehydu ma-lonowego (MDA). W surowicy wykazano wzrost aktywności enzymów SOD, GSH-Px i GSSG-R oraz stężenia grup -SH i MDA.
Słowa kluczowe: neuroborelioza, reaktywne formy tlenu, antyoksydanty Key words: neuroborreliosis, reactive oxygen species, antioxidants
WSTĘP
Neuroborelioza - zapalna choroba obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego - wywołana jest przez krętki Borrelia burgdorferi sensu lato. Najwcześniejszą postacią boreliozy układu nerwowego jest zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, rozwijające się często jeszcze przed ustąpieniem rumienia wędrującego. Rzadko, jedynie u ok. 0,1% zakażonych, neuroborelioza przebiega jako ciężkie zapalenie mózgu i rdzenia kręgo wego objawiające się zaburzeniami świadomości, ogniskowym uszkodzeniem ośrodko wego układu nerwowego o różnej lokalizacji i niedowładami związanymi z zajęciem rdzenia kręgowego (1). Rozpoznanie choroby jest trudne, gdyż większość jej objawów klinicznych nie jest specyficzna i występuje w przebiegu wielu innych chorób. Diagno styka choroby polega na wykazaniu zmian zapalnych w płynie mózgowo-rdzeniowym (pmr) i obecności swoistych przeciwciał przeciw B. burgdorferi w pmr. Wyhodowanie krętka B. burgdorferi z pmr jest trudne i rzadko wykonywane ze względu na niski A Zieliński, MP Czarkowski. Skuteczność szczepień przeciw krztuścowi w czasie epidemii 1997-1998 w Polsce. Przegl Epidemiol 2001;55:207-15.
426
S A Pancewicz i inni
Nr 3
odsetek dodatnich wyników; wg Karlsson i wsp. odsetek ten wynosi poniżej 10% (2).
Także identyfikowanie DNA krętka w pmr metodą PCR nie jest powszechnie wyko
nywane. Ujemny wynik badania PCR wg Pachner i Delaney nie wyklucza
neurobore-liozy, gdyż jego przyczyną może być nieobecność, niska liczba krętków lub krętkowego
DNA w pmr (3).
Celem pracy była ocena zachowania się parametrów układu oksydoredukcyjnego
surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego u chorych z neuroboreliozą przebiegającą pod
postacią zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.
MATERIAŁ I METODY
Badaniami objęto 25 chorych w wieku od 21 do 64 lat (x = 42,3) hospitalizowanych
w Klinice Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji AM w Białymstoku z rozpoznaniem
neu-roboreliozy pod postacią zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Rozpoznanie choroby
ustalono na podstawie wywiadu epidemiologicznego, obrazu klinicznego, wyników
badań laboratoryjnych - zwłaszcza pmr - i wyników badań serologicznych: wykrycia
w pmr i w surowicy przeciwciał przeciwko B. burgdorferi w klasie IgM i/lub dynamiki
mian przeciwciał w klasie IgG testem immunoenzymatycznym ELISA przy użyciu
zestawu firmy Biomedica IgM i IgG (Austria).
W pmr i surowicy tych samych chorych oznaczano aktywności: dysmutazy
nadtlen-kowej (Cu,Zn-SOD EC 1.15.1.1) wg Sykesa (4,5), reduktazy glutationowej (GSSG-R
EC.1.6.4.2) wg Mitze i Langdon (6), peroksydazy glutationowej (GSH-Px EC.1.11.1.6.)
wg Paglia i Valentine (7) oraz stężenie grup sulhydrylowych (~SH) wg Ellmana (8)
i aldehydu malonowego (MDA) przy użyciu zestawu Bioxytech LPO-586 kit. Grupę
kontrolną stanowiło 10 pacjentów z rozpoznaniem dyskopatii, u których pmr nie wy
kazywał odchyleń od normy. Badania przeprowadzono dwukrotnie: przed leczeniem
(badanie 1) i średnio po 4 tygodniach antybiotykoterapii (badanie 2). Wyniki badań
poddano analizie statystycznej przy pomocy programu Statistica 5,0 PL.
WYNIKI
W pmr w grupie kontrolnej średnie wartości badanych parametrów układu oksydo
redukcyjnego wynosiły: SOD x = 15,951 j/mg białka, GSH-Px x = 688,189 mj/mg białka,
GSSG-R x = 19,547 mj/mg białka, -SH x = 0,961 μmol/g i MDA x= 0,177 nmol/mg
białka. Natomiast w surowicy wynosiły one: SOD x= 3,021 j/mg białka, GSH-Px
x= 141,707 mj/mg białka, GSSG-R x = 24,87 mj/mg białka, -SH x= 198,832 μmol/g
i MDA x= 4,757 nmol/mg
białka.
Badanie pmr wykonane przed leczeniem wykazało zmiany o charakterze zapalnym:
pleocytoza wahała się od 38 do 80 komórek w 1 mm
3(x = 56,33), stężenie białka od
32,0 do 91,00 mg/dl (x = 62,67 mg/dl). W badaniu 2 w pmr stwierdzono: cytozę średnio
x = 12,0 komórek w 1 mm
3(od 8 do 17 komórek w 1 mm
3), stężenie białka x = 24,33
mg/dl (od 15,0 do 37,0 mg/dl).
W surowicy chorych aktywność SOD w badaniu 1 była 16-krotnie wyższa porównaniu
do grupy kontrolnej. Po antybiotykoterapii, mimo prawie 2-krotnego obniżenia, nadal
była 9-krotnie wyższa w porównaniu z grupą kontrolną. Aktywność GSSG-R w suro
wicy 25-krotnie wyższa przed leczeniem, uległa 3,7-krotnemu obniżeniu po leczeniu,
jednak nadal prawie 7-krotnie przewyższała aktywność w grupie kontrolnej. W
suro-Nr 3 Borelioza i potencjał oksydored. 427 wicy w badaniu 1 stwierdzono 7,6-krotny wzrost aktywności GSH-Px. Po leczeniu jej
aktywność obniżyła się ale była nadal 2,7-krotnie wyższa niż w grupie kontrolnej. Stężenie wolnych grup -SH w surowicy w badaniu 1 było 1,6-krotnie wyższe w po równaniu z grupą kontrolną. Po zakończeniu leczenia spadło ono 2-krotnie; uzyskując wartości niższe niż w grupie kontrolnej. Natomiast stężenie MD A przed leczeniem było aż 8,5-krotnie wyższe niż w grupie kontrolnej i mimo, iż po leczeniu uległo 3-krotnemu obniżeniu to nadal było 2,7-krotnie wyższe niż u osób zdrowych. Wszystkie wymienione różnice były statystycznie istotne (tab. I).
Aktywność SOD w pmr przed leczeniem chorych wynosiła 44,42 j/ml i była prawie 3-krotnie wyższa niż w grupie kontrolnej. Po leczeniu obniżyła się znamiennie, ale nadal była znacząco 1,2-krotnie wyższa. Aktywność GSSG-R w pmr była przed lecze niem niższa niż w grupie kontrolnej, ale po leczeniu uległa dalszemu 2,6-krotnemu obniżeniu. Także aktywność GSH-Px w pmr w badaniu 1 prawie 10-krotnie niższa w porównaniu z grupą kontrolną, po antybiotykoterapii, podobnie jak aktywność GSSG-R, która mimo prawidłowego już obrazu pmr, uległa znacznemu, dalszemu obniżeniu, uzyskując wartość 35,8 j/ml, tj. 19-krotnie niższą niż w grupie kontrolnej. Stężenie wolnych grup -SH w pmr przed antybiotykoterapią było ponad 100-krotnie wyższe niż w pmr osób z grupy kontrolnej. Po leczeniu, mimo normalizacji parametrów pmr, uległo obniżeniu, jednak nadal przewyższało prawie 35-krotnie ich stężenie w prawidłowym pmr. Również stężenie MDA w pmr przed leczeniem 3-krotnie wyższe, w badaniu 2 uległo obniżeniu do wartości uzyskanych w grupie kontrolnej. Wszystkie wyżej wymienione różnice były statystycznie istotne (tab. I).
Nie wykazano korelacji pomiędzy badanymi parametrami antyoksydacyjnymi i stęże niami produktów peroksydacji zawartymi w pmr i w surowicy poza istotną zależnością aktywności SOD w badaniu 2 (tab. II).
DYSKUSJA
Spośród komórek układu odpornościowego uczestniczących w odpowiedzi zapalnej najważniejszą rolę odgrywają granulocyty obojętnochłonne. Fagocytujący granulocyt obojętnochłonny zwiększa konsumpcję tlenu i uwalnia do przestrzeni pozakomórkowej reaktywne formy tlenu (RFT). Zjawisko to - nazwane wybuchem tlenowym - jest istotne dla zabijania wielu gatunków bakterii (9). Georgilis i wsp. i Suhonen i wsp. wykazali, że wszystkie szczepy B. burgdorferi chociaż miały różną zdolność poddawania się eliminacji przez fagocytozę powodowały indukcję wybuchu tlenowego (10, 11). Ma i wsp. wykazali, iż lipoproteiny OspA i OspB B. burgdorferi stymulują produkcję tlenku azotu (NO) przez makrofagi szpiku kostnego, a Modolel i wsp. stwierdzili, iż interakcja B. burgdorferi z mysimi makrofagami szpiku kostnego prowadzi do fagocytozy krętków, generacji NO i anionorodnika ponadtlenkowego (12, 13). Cinco i wsp. wykazali, że fagocytoza i aktywność metaboliczna komórek fagocytujących B. burgdorferi wzra stała jako funkcja stężenia krętków, wzmagała ją opsonizacja krętków, jednak ich intensywność była mniejsza niż dla S. aureus (14).
Zwraca się uwagę na udział SOD w aktywności bakteriobójczej fagocytów. Jonhston i wsp. wykazali, że zabijanie S. aureus było hamowane gdy opłaszczona lateksem SOD była fagocytowana razem z bakteriami, a Hampton i wsp. stwierdzili, że przymocowa nie SOD do powierzchni S. aureus zmniejszało wskaźnik zabijania o 30% (15, 16). Rola
Tabe 1 a I. Porównanie aktywności parametrów antyoksydacyjnych i produktów peroksydacji (MDA) u pacjentów z neuroboreliozą w su rowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym przed i po leczeniu oraz z grupą kontrolną
Ta b 1 e I. Comparison of cerebrospinal fluid and serum antioxidation parameters and peroxidation products (MDA) of patients before and after treatment with parameters of in healthy controls
Badane
parametry Wartość Badanie 1 od - do X = SD Badanie 2 Wartość od - do X = SD Badanie 1 a 2 p = Gr. kontrolna a badanie 1 p = Gr. kontrolna a badanie 2 p = S u r o w i c a SOD j/mg białka GSH-Px j/mg białka GSSG-R mj/mg białka MDA nmol/mg białka -SH μmol/g tkanki 27,35-81,77 438,26-1706,0 244,88-1288,14 13,0-89,5 172,04-469,56 47,97 1073,05 620,27 40,26 315,57 14,77 269,42 283,73 22,43 57,38 13,0-50,8 115,15-876,53 103,45-508,59 4,0-20,2 27,35-372,84 26,99 391,00 168,40 13,02 169,55 13,0 152,04 87,14 3,96 80,76 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,00001* 0,1405 P ł y n m ó z g o w o - r d z e n i o w y SOD j/mg białka GSH-Px j/mg białka GSSG-R mj/mg białka MDA nmol/mg białka -SH μmol/g tkanki 8,7-85,18 10,3-426,42 1,36-27,33 0,03-1,49 1,02-293,26 44,42 70,77 7,97 0,54 100,02 18,80 88,60 6,88 0,47 74,75 6,25-46,22 4,15-143,1 1,0-16,39 0,03-0,962 0,98-89,70 20,56 35,8 7,57 0,18 33,29 11,97 47,01 4,6 0,23 14,96 0,00001* 0,00001* 0,7570 0,00001* 0,00001* 0,0001* 0,00001* 0,0001* 0,0017 0,00001* 0,6533 0,00001* 0,000001* 0,2865 0,00001* t • - istotność statystyczna (p<0,05) - wzrost - obniżenie
Tabela I I . Porównanie zależności badanych parametrów antyoksydacyjnych i produktów peroksydacji (MDA) w płynie
mózgowo-rdzeniowym i surowicy u chorych z neuroboreliozą
Ta b 1 e I I . Comparison of antioxidation parameters and peroxidation products (MDA) in cerebrospinal fluid and serum in patients with
neuroborreliosis
S u r 0 w i c a B a d a n i e 1 B a d a n i e 2 SOD GSH-Px GSSG-R MDA -SH SOD GSH-Px GSSG-R MDA -SH Płyn mózgowo-rdzeniowy Badanie 1 SOD p=0,682 GSH-Px p=0,348 GSSG-R p=0,545 MDA p=0,235 -SH p=0,359 Badanie 2 SOD p=0,008* GSH-Px p=0,208 GSSG-R p=0,833 MDA p=0,296 -SH p=0,714• - istotność statystyczna (p<0,05)
430
S A Pancewicz i inni Nr 3 SOD w hamowaniu zabijania sfagocytowanych bakterii może być wyjaśniona poprzez hamowanie produkcji rodników wodorotlenowych. Wykazano, że Mycobacterium tuber-culosis, Nocardia asteroides oraz Helicobacter pylori wydzielają SOD, co być może jest przyczyną zmniejszenia ich zabijania (17,18,19). Nichols i wsp. zidentyfikowali pojedyn czy gen SOD w krętkach B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii i B. afzelii (20).W neuroboreliozie układu nerwowego wykazano zapalenie nerwów ze zmianą struk tury aksonu i demielinizacją, obecnością okołonaczyniowych nacieków zapalnych skła dających się z makrofagów i limfocytów B, uszkodzenie komórek Schwanna i obecność B. burgdorferi lub jej antygenów wewnątrz makrofagów (21). Garcia-Monco i wsp. wykazali, że podanie żywych B. burgdorferi powodowało wzrost przepuszczalności bariery krew - mózg zależny od dawki podanych krętków, natomiast neurologiczne uszkodzenia były spowodowane bezpośrednim działaniem krętków i ich produktów na komórki neuronalne, komórki Schwanna i glejowe i generacją tlenku azotu (NO) (21). Mechanizmy odpowiedzialne za neurotoksyczne działanie NO nie są do końca wyjaś nione. Przypuszcza się, że NO może wywierać swoje działanie przez generację anionów ponadtlenkowych (9).
Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych charakteryzuje się intensywną reakcją zapalną w przestrzeni podpajęczynówkowej i w oponach mózgowych, uszko dzeniem bariery krew-mózg, obrzękiem mózgu oraz zapaleniem naczyń. Produkcji RTF w komórkach śródbłonka naczyń i odpowiedzi zapalnej okołonaczyniowego mikrogleju towarzyszy stres oksydacyjny prowadzący do wzrostu przepuszczalności bariery krew-mózg, oksydacyjnego uszkodzenia neuronów i peroksydacji lipidów w neuronach (22). Leib i wsp. w paciorkowcowym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych wykazali ge nerację RTF w komórkach w zapaleniu komór i podpajęczynówki oraz naczyń mózgo wych; stwierdzili, że stosowanie antyoksydantów w sposób istotny zmniejsza uszkodze nie tkanki mózgowej (22,23). Jain i wsp. wykazali wzrost stężenia anionorodnika ponadtlenkowego (od 0,67 do 8,8 μmol/min/dl), nadtlenku wodoru (od 342,1 do 2067 μg/h/dl) i aktywności SOD (od 11,3 do 42,8 j/ml) w pmr u chorych z bakteryjnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. Wskaźniki generacji anionu ponadtlenkowe go, stężenia MDA i aktywności SOD były zdecydowanie wyższe u dzieci wyleczonych lub zmarłych z powodu bakteryjnego zapalenia opon niż u dzieci wyleczonych lub zmarłych z powodu zapalenia gruźliczego. Wg autorów wzrost stężenia MDA odzwier ciedla stopień uszkodzenia tkanki mózgowej w przebiegu zapalenia opon (24, 25). Yoshida i wsp. obserwowali wzrost aktywności Cu/Zn SOD i Mn SOD pmr w bakte ryjnych zapaleniach opon mózgowo-rdzeniowych i chorobach naczyniowych mózgu następujący nie tylko w wyniku przechodzenia enzymu z uszkodzonej tkanki nerwowej, ale także na skutek indukowania jego produkcji w miejscu uszkodzenia (26).
We własnych badaniach pmr w początkowej fazie neuroboreliozy zaobserwowano -podobnie jak w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych - istotny, wielo rotny wzrost aktywności SOD i stężenia MDA. Po antybiotykoterapii mimo cofnięcia się zmian zapalnych w pmr aktywność SOD obniżała się, jednak nadal była 1,2-krotnie wyższa w porównaniu z grupą kontrolną. Także stężenie MDA trzykrotnie wyższe przed leczeniem, uległo znamiennemu obniżeniu do wartości uzyskanych w grupie kontrolnej.
Nr 3 Borelioza i potencjał oksydored. 431 W poprzednich własnych badaniach chorych z erythema migrans - wczesnej postaci
boreliozy z Lyme - w badaniu wstępnym stwierdzono obniżenie aktywności SOD i GSH-Px w surowicy i jej dalsze obniżanie się, mimo całkowitego cofnięcia się zmian skórnych. Natomiast aktywność GSSG-R przed leczeniem była wyższa niż w grupie kontrolnej i po antybiotykoterapii ulegała dalszemu podwyższeniu. Natomiast przed leczeniem stężenie MDA było znamiennie wyższe, a po leczeniu - mimo obniżenia się-nadal było 3-krotnie wyższe w porównaniu do osób zdrowych. Stężenie grup -SH przed leczeniem wynosiło 76,7% wartości uzyskanych w grupie kontrolnej, po antybio tykoterapii uległo podwyższeniu, nie osiągając jednak stężenia w grupie kontrolnej (27).
W obecnych badaniach u chorych z neuroboreliozą, w przeciwieństwie do chorych z rumieniem wędrującym, zwraca uwagę wielokrotny wzrost aktywności wszystkich enzymów antyoksydacyjnych w surowicy, obniżający się po antybiotykoterapii. Jednak mimo ustąpienia zmian chorobowych aktywność tych enzymów nadal znacznie, istotnie przewyższała wartości uzyskane w grupie kontrolnej. Również stężenie MDA i grup -SH, mimo obniżenia po leczeniu, nadal było istotnie wyższe niż w grupie kontrolnej.
Uzyskane wyniki wskazują, że w neuroboreliozie pod postacią zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych dochodzi do zaburzeń równowagi oksydoredukcyjnej zarówno w pmr jak i w surowicy. Badania wykazały, że w pmr wzrasta aktywność SOD i obniża aktywność GSH-Px, GSSG-R. Konsekwencją tych zmian jest wzrost stężenia wolnych grup -SH i produktów peroksydacji lipidów mierzonych jako MDA. Również w suro wicy zaobserwowano zarówno zaburzenia enzymatycznych jak i nieenzymatycznych parametrów obrony antyoksydacyjnej, charakteryzujące się wzrostem aktywności en zymów SOD, GSH-Px i GSSG-R oraz stężenia grup - SH i MDA.
S A Pancewicz, E Skrzydlewska, T Herman owska-Szpakowicz, A Stankiewicz, M Kondrusik EVALUATION OF OXIDOREDUCTIVE POTENTIAL OF PATIENTS W I T H
NEUROBORRELIOSIS SUMMARY
Aim: The purpose of the study was to evaluate parameters of oxidoreductive system in serum and cerebrospinal fluid (CSF) of patients with neuroborreliosis.
Material and methods: The cases were 25 patients aged 21 to 64 (x=42,3) hospitalized with diagnosis of neuroborreliosis. Activity of superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD), glutathione reductase (GSSG-R), glutathione peroxidase (GSH-Px) and concentration of sulphydryl groups ( -SH) and malondialdehyde ( MDA) in serum and CSF were tested. The control group consisted of 10 patients with diagnosis of discopathy. An examination was performed twice: before and after treatment.
Results: Results of the study showed lack of stability in an oxidoreductive system during neuroborreliosis both in serum and in CSF. In CSF activity of SOD was increased while activity of GSH-Px and GSSG-R were decreased. Also concentration of -SH and lipid peroxidation products measured as MDA were increased. The increase of SOD, GSH-Px, GSSG-R activity and concentration of -SH and MDA in serum were detected.
Conclusions: Disorders of an oxidoreductive system in CSF and serum during neuroborre liosis were observed. These changes persisted despite treatment and normalization of inflam-matory CSF markers.
