Een onderzoek over de fotosensibilisatie van nucleïnezuren

UI f

•- o

^ o

FOTOSENSIBILISATIE VAN

NUCLEÏNEZUREN

P R O E F S C H R I F T

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAPPEN AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL TE DELFT OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS IR. H. J. DE WIJS, HOOGLERAAR IN DE AFDELING DER MIJNBOUW-KUNDE, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE VERDEDIGEN OP WOENSDAG 17 NOVEMBER 1965

DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

door

JOHN SAMUEL SUSSENBACH

scheikundig ingenieur geboren te Amsterdam

1965

DRUKKERIJ PASMANS — 'S-GRAVENHAGE

Hoofdstuk 1 A L G E M E N E I N L E I D I N G 7

1. Inleiding 7 2. Voorbeelden van fotosensibilisatie in vivo 8

3. F o t o s e n s i b i l i s a t i e van virussen

en bacteriofagen 9 4. F o t o s e n s i b i l i s a t i e van eiwitten en kleine

moleculen 11 5. Structuur en functie van nuclei nezuren 12

6. F o t o s e n s i b i l i s a t i e van nuclefnezuren en

nucleTnezuurcomponenten 16 7. Structuur van fotodynamische kleurstoffen 18

8. Aangeslagen toestanden van moleculen 20 9. Desactivering van aangeslagen toestanden 23 10. Mechanismen van de fotodynamische

werking 26 11. Literatuur 29

Hoofdstuk; 2 F O T O D Y N A M I S C H E AFBRAAK VAN

GUANINE EN G U A N I N E D E R I V A T E N 3 2

1. Inleiding 32 2. Keuze van de kleurstof 33

3. Basensamenstelling van bestraald DNA 36

4. Spectrofotoraetrisch onderzoek 38 5. Invloed van de zuurgraad en de temperatuur

op de snelheid van de afbraak 41 6. Gebruik van gemerkte verbindingen 42

7. Peroxydenonderzoek 51 8. Slotopmerkingen 54 9. Experimenteel gedeelte 55 10. Literatuur 62 Hoofdstuk 3 F O T O S E N S I B I L I S A T I E VAN N U C L E Ï N E Z U R E N 6 3 1. Inleiding 63 2. Desoxyribonuclernezuur 64 a. Reactieproducten 64 b. F y s i s c h e eigenschappen van DNA 66

d. Bepaling van het moleculairgewicht 70 e. Thermische denaturatie 79 3. Ribonuclernezuur 82 a. Biologische activiteit 82 b. Gedrag op Sephadex 86 4. Slotopmerkingen 87 5. Experimenteel gedeelte 89 6. Literatuur 92

Hoofdstuk 4 H E T MECHANISME VAN DE

F O T O S E N S I B I L I S A T I E VAN GUANINE 93

1. Inleiding 93 2. Complexvorming 94

3. Aangeslagen toestanden 96 4. Kinetiek van de guanineafbraak 101

5. Meting van de kwantenopbrengst 103

6. Fotoreductie 105 7. Conclusies 106 8. Experimenteel gedeelte 110 9. Literatuur 111 SAMENVATTING 113 SUMMARY 115

HOOFDSTUK I

ALGEMENE INLEIDING

1. Inleiding

Op enige uitzonderingen na, zoals bij de fotosynthese, hebben de meeste onderzoekers der stralingsbiologie zich de l a a t s t e jaren beziggehouden met de relatief energierijke kwanten van de ultra-violette en ioniserende straling. Zichtbaar licht wordt in het algemeen door de celcomponenten niet sterk geabsorbeerd en heeft om deze reden meestal weinig effect. Een groot aantal biologische systemen wordt echter door zichtbaar licht beïnvloed in aanwezigheid van een ge-schikte kleurstof. Dit verschijnsel staat bekend onder de naam foto-dynamische werking en werd door R A A B ' in 1900 ontdekt . RAAB nam waar dat pantoffeldiertjes in aanwezigheid van acridine bij bestralen met zonlicht worden gedood, terwijl acridine in het donker geen in-vloed blijkt te hebben. Bestraling van de pantoffeldiertjes zonder acridine heeft geen enkel effect.

De fotodynamische werking bestrijkt een bepaald gebied van het algemenere verschijnsel fotosensibilisatie. Onder fotosensibilisatie verstaan wij het proces, waarbij, door bestraling met zichtbaar licht in aanwezigheid van een geschikte lichtacceptor, veranderingen in een bepaald systeem worden opgewekt. De sensibiliserende kleurstof absorbeert het licht en draagt de opgevangen energie op een of andere wijze over aan een substraat, dat op zichzelf het licht niet kan absor-beren. Door deze energieoverdracht zijn wijzigingen in het substraat mogelijk geworden.

De naam "fotodynamische werking" i s door T A P P E I N E R ^ gegeven aan het gebied der fotosensibilisatie dat zich speciaal bezighoudt met biologische systemen. Deze systemen kunnen uiteenlopen van zoogdieren tot in de cel voorkomende moleculen. F o t o s e n s i b i l i s a t i e van deze systemen gaat meestal gepaard met zuurstofopneming. Aan-gezien de fotodynamische werking in feite de fotosensibilisatie van biologische systemen beschrijft, zal in dit proefschrift dat s l e c h t s over biologische systemen handelt, geen onderscheid worden gemaakt tussen de benamingen fotodynamische werking en fotosensibilisatie.

* 2

Hoewel MARCCACI in 1888 reeds melding maakt van een fotodynamisch fenomeen Is deze waarneming niet algemeen onderkend.

Na deontdekkingdoorRAAB hebbenTAPPElNER en J O D L B A U E R ^ veel werk verricht over de fotodynamische werking. Een groot aantal kleurstoffen werd op activiteit onderzocht, waarbij werd waargenomen dat fotodynamische activiteit gepaard gaat met het vermogen tot fluoresceren. Vrijwel direct na de ontdekking van de fotodynamische werking heeft TAPPEINER getracht dit verschijnsel toe te passen bij de therapie van huidcarcinomen. In enkele gevallen meende hij een genezing te hebben waargenomen.

In de loop der tijd i s een groot aantal publicaties verschenen over fotosensibilisatie, waarbij zeer uiteenlopende systemen zijn on-derzocht. Aangezien reeds verscheidene goede overzichtsartikelen zijn gepubliceerd'*'^'^''', zullen in dit hoofdstuk slechts verschillende voorbeelden worden beschreven. De te bespreken biologische s y s t e -men worden ingedeeld naar hun complexheid.

2. Voorbeelden van fotosensibilisatie in vivo

De meeste experimenten op multicellulaire objecten zijn uitgevoerd bij zoogdieren, zoals bijvoorbeeld muizen en huisdieren. Indien een muis wordt ingespoten met hematoporfyrine en blootgesteld aan zon-licht treden een aantal karakteristieke symptomen op, welke lijken op het vrijkomen van histamine^'^. Met grote doses licht en kleurstof wordt de muis in enkele minuten gedood. Door langdurige, niet-lethale bestraling treedt een oppervlakkige necrose van de huid op. Overeen-komstige verschijnselen kunnen zich ook voordoen bij koeien, paarden en geiten die aan het zonlicht worden blootgesteld na het eten van planten, welke fotosensibiliserende stoffen bevatten ' . Bij de mens kunnen eveneens verschijnselen van fotosensibilisatie worden waar-genomen o.a. na het gebruik van sommige geneesmiddelen en furocumarin e-derivaten

Sommige insektelarven blijken te worden gedood bij bestraling in aanwezigheid van een geschikte fotosensibilisator^^.

Over de fotosensibilisatie bij planten is relatief weinig bekend. Bladeren en wortels kunnen worden aangetast . Bij bestraling van groene bladeren in afwezigheid van koolzuur kan fotoöxydatie van het celmateriaal o p t r e d e n ' ' ' . Riboflavine blijkt de groei van planten te kunnen remmen in aanwezigheid van licht, wellicht door de afbraak

van plantengroeihormonen'^.

Naast de fotodynamische werking bij multicellulaire systemen i s ook fotosensibilisatie bij eencellige organismen bestudeerd. De s e n s i b i l i s a t i e kan hier verschillende gevolgen hebben o.a. afsterven der cellen, afneming der beweeglijkheid, abnormale celdeling, mutaties

etc.. Sommige gekleurde protozo'én worden bij bestraling gesensibili-seerd door hun eigen intracellulaire kleurstoffen'^. Relatief veel onderzoek is verricht bij erythrocyten van z o o g d i e r e n ^ ' ' ® ' ' ^ . Sensi-b i l i s a t i e leidt hier meestal tot hemolyse.

Cultures van HeLa-, apehart- en rauize'èmbryo-cellen worden gesensibiliseerd door neutraalrood'^. Ook eosine heeft een s e n s i b i l i s e -rende invloed op w e e f s e l c u l t u r e s ' ^ . Volgens WHEELER en HOL-LINSHEAD^'' bevat mensenserum een fotodynamische kleurstof, welke inactivering van HeLa-cellen kan bewerkstelligen. Onderzoek over het fotodynamisch doden van verschillende soorten bacteriën bracht aan het licht dat gram-positieve bacteriën meestal het gevoe-ligst zijn ' ^ ' . Een mutant van Sarcina lutea, welke geen carotenoïden bevatte, bleek gevoeliger voor toluïdineblauw dan een gepigm en teerde mutant^^.

Het is gebleken dat psoraleen-derivaten, in tegenstelling tot de zuurstof-obligate sensibilisatoren, hun werking kunnen uitoefenen in afwezigheid van zuurstof^'^'^'*. MATHEWS^^ maakte aannemelijk dat bestraling van bacteriën in aanwezigheid van 8-methoxypsoraleen tot beschadiging van nucleïnezuren leidt, terwijl in aanwezigheid van

toluïdineblauw het celmembraan wordt aangetast.

De kleurstof thiopyronine vertoont in combinatie met zichtbaar licht naast een dodende werking op bacteriën ook een mutagene in-vloed^^. Bestraling van bacteriën in aanwezigheid van acridine-oranje veroorzaakt o.a. een afneming van de extraheerbaarheid van DNA*uit de cellen^^.

3. Fotosensibilisatie van virussen en bacteriofagen

Vooral de l a a t s t e jaren i s veel werk verricht over de fotosensi-b i l i s a t i e van dierlijke virussen^^'^^; over plantevirussen i s in dit verband relatief weinig g e p u b l i c e e r d ^ ° ' ' " . In het algemeen zijn plan-tevirussen minder gevoelig voor fotosensibilisatie dan dierlijke virussen en bacteriofagen. Door OSTER en M C L A R E N ' ^ ^ werd aange-toond dat bestraling van tabaksmozalek-virus in aanwezigheid van acriflavine tot inactivering leidt, hoewel ORLOB''^ dit niet kon be-vestigen. Het infectieuze materiaal van een virus b e s t a a t uit nuclelne-zuur. Dit maakt het aannemelijk dat een fotodynamische inactivering van een virus het gevolg is van een inactivering van het nuclelnezuur. Door CHESSIN^^ werd aangetoond dat het infectieuze RNA uit

ta-*

RNA en DNA zijn afkortingen voor r e s p . ribonuclefnezuur en desoxyribo-nucleïnezuur (zie pag. J6).

baksmozalek-virus door bestraling in aanwezigheid van acridineoranje kan worden geïnactiveerd.

De belangstelling voor fotosensibilisatie van dierlijke virussen vindt hoofdzakelijk zijn oorzaak in de gedachte om met behulp van fotodynamisch geïnactiveerd virus bruikbare vaccins te bereiden. De dierlijke virussen worden in twee groepen ingedeeld naar de aard van hun nucleïnezuur. RNA-virussen, zoals polio- en influenza-virus,

worden niet geïnactiveerd in aanwezigheid van fotodynamische kleur-stoffen''^, doch wel a l s de kleurstoffen aanwezig zijn bij de vorming van de virusdeeltjes in de g a s t h e e r c e l ' ' ^ ' ^ ^ ' ^ ' ' . Dit kan worden ver-klaard door aan te nemen dat de kleurstof niet in staat is door de ei-witmantel van het virus heen te dringen en zodoende het nucleïnezuur niet bereikt. Indien de kleurstoffen aanwezig zijn tijdens de virus-productie, kunnen zij een complex vormen met het virus-RNA in de gastheercel. Na het vrijkomen van het virus is de kleurstof dan reeds in het virusdeeltje aanwezig. Bij DNA -virussen, zoals het vaccinia-virus, is het wel mogelijk de virusdeeltjes in vitro te inactiveren door bestraling in tegenwoordigheid van fotodynamische kleurstoffen .

Het verschil in gedrag tussen RNA- en DNA-virussen meent men te kunnen terugvoeren tot een verschil in permeabiliteit der eiwit-mantels. In 1963 lieten W A L L I S en M E L N I C K ^ ^ echter zien dat polio-virus ook in vitro kan worden gesensibiliseerd, indien de juiste om-standigheden worden gekozen. WALLIS c . s . ' ' ° slaagden erin om met behulp van een door toluïdineblauw geïnactiveerd influenza-virus een bruikbaar vaccin te bereiden.

Mazelen-virus wordt door hoge lichtintensiteiten zonder toevoeging van kleurstoffen geïnactiveerd, waarschijnlijk doordat de virusdeel-tjes zijn verontreinigd met flavine-derivaten'*'. Verschillende soorten bacteriofagen worden gesensibiliseerd door proflavine en methyleen-blauw''^''*^. Bij bacteriofagen i s het niet nodig om de kleurstoffen reeds aan de groeiende fagen toe te voegen, zoals bij de RNA-virus-sen. De bestudering van fotosensibilisatie bij bacteriofagen bracht Y A M A M O T O ' ' " ' tot de conclusie dat bij de inactivering eerst een complex tussen kleurstof en faagdeeltje optreedt. Toevoeging van meer dan één kleurstof leidt tot een verdringing van die kleurstof, welke het minst de neiging tot complexvorming bezit, hetgeen wijst op een vrij l o s s e a s s o c i a t i e . De werkzaamheid van de verschillende kleur-stoffen i s afhankelijk van de bacteriofaag.

Door MUSAJO CS.'*'' werd aangetoond dat virussen van het DNA-type door psoraleen-derivaten kunnen worden gesensibiliseerd in af-wezigheid van zuurstof.

4. Fotosensibilisatie van eiwitten en kleine moleculen

Verschillende eigenschappen van eiwitten kunnen worden veran-derd door behandeling met fotodynamische kleurstoffen. Wijzigingen in oplosbaarheid, viscociteit en enzymactiviteit zijn waargenomen als gevolg van een afbraak van bepaalde aminozuren. Deze veranderin-gen vinden s l e c h t s plaats in aanwezigheid van zuurstof, hetgeen wijst op een fotoöxydatie.

Veel onderzoek is verricht over de fotodynamische veranderingen in bloedeiwitten''^''*^. Veelal treedt een afbraak van aminozuur-zijke-tens op. Histidine'*^ blijkt het gevoeligste aminozuur te zijn, gevolgd door tryptofaan en tyrosine^^. De oxydatie van tryptofaan, tyrosine en histidine leidt tot een verregaande afbraak van deze aminozuren, o.a. wordt een verbreking van de ringstructuur geconstateerd. De fotoöxydatie is zeer afhankelijk van de zuurgraad. Verbreking van peptidebindingen in eiwitten wordt niet waargenomen. Het verschil in gevoeligheid van de zijketens van de aminozuren heeft het mogelijk gemaakt om de rol van deze zijketens bij de enzymatische activiteit van een eiwit nader te onderzoeken. In dit verband i s de fotoöxydatie van ribonuclease''^, lysozym^° en t r y p s i n e ^ ' ^ ' bestudeerd. Bij trypsine i s de werking van methyleenblauw vergeleken met de invloed van ribo-flavine. Het werkingsmechanisme van beide kleurstoffen blijkt ver-schillend te zijn. Riboflavine veroorzaakt een afneming van de hoe-veelheden histidine en aromatische zijketens, terwijl onder invloed van methyleenblauw hoofdzakelijk histidine wordt afgebroken.

Ook de fotodynamische aantasting van betrekkelijk kleine verbin-dingen i s reeds tamelijk uitvoerig onderzocht. Bij de bestraling van indolylazijnzuur'"* of ascorbinezuur^^'^'' in aanwezigheid van ribofla-vine treedt een fotoöxydatie van het substraat op. Riboflaribofla-vine zelf ontleedt onder invloed van licht, waarbij o.a. lumichroom ontstaat. De fotoöxydatie van ascorbinezuur is o.a. van belang bij de bestra-ling van melk. HOPKINS^^ nam waar dat bij de bestrabestra-ling van melk een fotoöxydatie van ascorbinezuur optreedt, hoewel het riboflavine op een zeker moment volledig is omgezet. Dit kan worden verklaard door het feit, dat ook lumichroom fotodynamische activiteit vertoont. In het begin van de bestraling verloopt de oxydatie van

ascorbine-zuur onder invloed van riboflavine en aan het eind onder invloed van lumichroom.

Naast de eiwitten spelen ook nucleïnezuren een grote rol in de cel. Het onderzoek van de fotosensibilisatie van laatstgenoemde verbindingen bevindt zich nog in het beginstadium. Daar het onder-werp van deze d i s s e r t a t i e betrekking heeft op de fotosensibilisatie van nucleïnezuren lijkt het voor een beter begrip wenselijk enige aandacht te besteden aan de bouw en functie van deze verbindingen.

5. Structuur en functie van nuclefnezuren

Evenals eiwitten komen nucleïnezuren voor in alle soorten levende systemen. Nucleïnezuren zijn hoogmolecülaire verbindingen opge-bouwd uit een groot aantal nucleotiden. Een nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suiker, vrijwel steeds met vijf C-atomen, en een purine- of pyrimidine-derivaat. In nucleïnezuren zijn deze nucleotiden met elkaar verbonden via suiker-fosfaatgroepen. De suiker kan D-ribose (I) of 2-D-desoxyD-ribose (II) zijn, hetgeen ertoe leidt dat nucle-ïnezuren kunnen worderl verdeeld in ribose- en desoxyribose-nucle-ïnezuren. H O C H ,

/\v

y

/

^vA/

\

Daar het merendeel van de literatuur over nucleïnezuren afkomstig i s uit a n g e l s a k s i s c h e landen hebben de afkortingen RNA (RiboNucleic Acid) en DNA(DeoxyriboNucleic Acid) een grote populariteit gekregen. Deze afkortingen zullen derhalve ook in dit proefschrift worden ge-bruikt.

De in DNA voorkomende purine- en pyrimidine-derivaten zijn bijna altijd uitsluitend thymine (III), cytosine (IV), adenine (V) en guanine (VI). In RNA komen dezelfde basen voor, met uitzondering van thymine dat door uracil (VII) i s vervangen.

NH-H UT H UT u

m

De structuur van een polynucleotide is hieronder schematisch weergegeven.

N'

Py r i m i d i n e

WATSON en CRICK^^ kwamen op b a s i s van röntgenografische ge-gevens tot een model voor de ruimtelijke structuur van DNA dat nu al-gemeen wordt geaccepteerd. Twee polynucleotide-ketens zijn om elkaar gewonden in een rangschikking welke een dubbele helix wordt genoemd. In deze rangschikking bevinden de fosfaatgroepen zich aan de buitenzijde en de purine- en pyrimidine-derivaten zich aan de binnenzijde van de dubbele helix. De beide ketens zijn complementair, doordat elk nucleotide in de ene keten zijn vaste partner in de andere keten heeft, hetgeen mogelijkheden tot duplicatie biedt. Zo wordt tegenover thymine steeds adenine en tegenover cytosine s t e e d s gua-nine gevonden. Deze basenparen worden ten dele in stand gehouden door middel van waterstofbruggen (fig. 1).

Fosfaat Fosfaat \ C t \

Suiker — Adenine Thymine — Suiker

Suiker — T h y m i n e Suiker — C y t o s i n e -Fosfaat, \ Suiker — Guanine Adenine — S u i k e r Guanine — Suiker Cytosine — S u i k e r r \ / r \ r \ r \ Fosfaat Fosfaat F o s f a a t 1. S c h e m a t i s c h e o p b o u w v a n D N A ,

De paren liggen met hun vlakken bijna loodrecht op de a s van de dubbele helix. Schematisch is de ruimtelijke structuur van DNA in figuur 2 weergegeven.

O

O

2. S c h e m a t i s c h e v o o r s t e l l i n g e n m o l e c u u l m o d e l van DNA (uit R . P . L e v i n e , G e n e t i c s , H o l t , New York 1 9 6 2 . ) .

DNA is tot dusverre vrijwel uitsluitend in de celkern gevonden. Het i s thans een algemeen aanvaarde opvatting dat DNA de drager is van de genetische eigenschappen van de cel. Bij sommige virussen wordt deze rol vervuld door RNA. De genetische eigenschappen van een cel komen in eerste instantie tot uitdrukking in de opbouw van de eiwitten(enzymen). De volgorde van de basen in DNA zou dan in ver-band staan met de aminozuur-volgorde van een eiwit. Vele experimen-ten, o.a. over bacterie-transformatie, hebben de genetische functie van DNA aannemelijk gemaakt.

Bacterie-transformatie is een verschijnsel, waarbij één of meer genetisch vastgelegde eigenschappen van de ene cel aan de andere cel worden overgedragen. In 1944 konden AVERY c . s . ^ aantonen dat de actieve substantie bij transformatie uit hoogmoleculair DNA be-staat. Later i s dit verschijnsel bij verschillende soorten bacteriën waargenomen . Bij transformatie wordt DNA uit een bacterie, welke

V o l g e n s e e n p u b l i c a t i e z o u b a c t e r i e t r a n s f o r m a t i e ook w e l e e n s d o o r RNA k u n n e n g e s c h i e d e n

bijvoorbeeld in staat i s tryptofaan te maken, in contact gebracht met cellen van een mutant, die deze eigenschap mist. Het DNA wordt door de mutant opgenomen, waarna een deel der cellen nu wel faan kan maken. De genetische informatie over de synthese van trypto-faan i s dan via het DNA overgebracht naar de mutant.

Het RNA van de cel komt zowel in de celkern als in het cytoplas-ma voor, doch i s van minder homogeen karakter. De basenparing in RNA is niet zo perfect als bij DNA. Hoewel er soms delen in de moleculen zijn die de hélix-structuur bezitten, zijn andere delen veel onregelmatiger opgebouwd. In de cel kunnen verscheidene RNA-frac-ties worden aangetoond, verschillend in functie, moleculairgewicht en bouw. Alle RN A-fracties zijn echter bij de eiwitsynthese betrokken. Hoewel DNA de informatie over de aminozuur-volgorde van een eiwit. zou bezitten, i s het onwaarschijnlijk dat een eiwit direct op een DNA-matrijs zou worden gevormd, aangezien de eiwitsynthese buiten de celkern plaatsvindt. Men heeft ontdekt dat in bacteriecellen een RNA-fractie voorkomt welke wordt gesynthetiseerd op een DNA-raatrijs en de genetische boodschap vanuit de kern overbrengt naar centra in het cytoplasma waar eiwitten worden opgebouwd. Dit RNA, dat een basenvolgorde bezit, welke overeenkomt met de volgorde in DNA, wordt boodschapper- of messenger-RNA(m-RNA) genoemd. De eigen-lijke plaatsen van de eiwitsynthese zijn de ribosomen, deeltjes in het cytoplasma, welke zijn opgebouwd uit eiwit en ribosomaal RNA(r-RNA). Indien deze deeltjes worden gekoppeld met m-RNA i s eiwitsynthese mogelijk geworden. De voor de eiwitsynthese benodigde aminozuren worden in een geactiveerde vorm naar het m-RNA-ribosoom-complex gebracht. Het i s gebleken dat deze geactiveerde vorm b e s t a a t uit een aminozuur gebonden aan een betrekkelijk laagmoleculair nucleïnezuur (MG ±30.000). Deze aminozuur-transporterende nucleïnezuren noemt men soluble RNA(s-RNA) of transfer RNA(t-RNA). Ieder aminozuur zou tenminste één specifiek soort s-RNA-moleculen ter beschikking heb-ben. Men neemt aan dat ieder s-RNA-molecuul een zekere code bezit in de vorm van een bepaalde korte reeks basen, welke het s-RNA in staat stelt zijn plaats op het m-RNA te vinden door complementaire paarvorming. Op deze wijze wordt een bepaald aminozuur op de juiste plaats aan de groeiende polypeptide-keten toegevoegd. Voordat dit gebeurt moet een enzym ieder der twintig aminozuren aan een geschikt s-RNA koppelen.

Hoewel bovenstaande opvatting van de eiwitsynthese wellicht te simplistisch i s , wordt steeds meer steun verkregen voor de verschil-lende aspecten ervan.

Er zijn de l a a t s t e jaren zoveel overzichtsartikelen over de bouw en functie van nucleïnezuren verschenen, dat met een verwijzing naar

enkele hiervan wordt v o l s t a a n ^ ^ ' ^ ^ ' ^ ^ . Bovenstaande paragraaf dient slechts tot enige algemene oriëntering.

6. Fotosensibilisatie van nucleïnezuren en nucleïnezuur-componenten

Het absorptiespectrum van nucleïnezuren wordt veroorzaakt door de gezamenlijke absorpties van de purine- en pyrimidine-derivaten (fig. 3). Dit spectrum bezit een maximum bij 260 mn en vertoont boven 310 mjz bijna geen absorptie meer. Licht met een golflengte groter dan 310 Tnn zal dan ook geen invloed op nucleïnezuren hebben. Bij bestra-ling in aanwezigheid van fotosensibilisatoren kunnen echter wel ver-anderingen ontstaan. Dit geldt eveneens voor sommige in

nucleïne-zuur voorkomende basen.

2i0 260 Golflengtt ( m^)

2 8 0 3 0 0

3. U.V. absorptiespectrum van nuclel"nezuren.

Zo toonde C A R T E R ^ ° aan dat o.a. guanine fotodynamisch kan worden afgebroken door methyleenblauw onder zuurstofopneming.

In 1955 beschreef S P I E G E L - A D O L F ^ ^ de fotodynamische werking van fluoresceïne op verschillende purines en pyrimidines. Bij be-stralingmet zonlicht blijkt guanine voor 90% te zijn afgebroken, terwijl kleine of geen veranderingen bij thymine, uracil en adenine worden waargenomen.

Volgens ISAKA en K A T O ^ ^ zouden guanine^'', xanthine en urine-zuur worden geoxydeerd bij bestraling in aanwezigheid van

ribofla-vine, terwijl dit volgens U E H A R A ook mogelijk zou zijn voor ade-nin e-derivaten.

Fotodynamische invloeden zijn ook bij nucleïnezuren waargeno-men. In 1951 werd door K O F F L E R en M A H L E R ^ ^ de depolymerisatie van DNA beschreven onder invloed van methyleenblauw en andere

fotosensibilisatoren. Ook F R E I F E L D E R C . S . ^ ^ konden

depolymerisa-tie aantonen bij bestraling van DNA in aanwezigheid van acridine-oranje. Dit bleek uit de daling van de viscositeit én de sedimentatie-coëfficiënt. Fotodynamische inactivering van biologisch actieve nucleïnezuren werd in 1960 zowel door C H E S S I N ^ ' ^ a l s door B E L L I N en O S T E R ® ' ' beschreven. CHESSIN slaagde erin om infectieus RNA van tabaksmozaïek-virus te inactiveren door bestraling in aanwezig-heid van methyleenblauw of acridineoranje. Bestraling van trans-formerend DNA van Dipiococcus pneumoniae in aanwezigheid van verschillende kleurstoffen leidt volgens BELLIN en OSTER tot een inactivering van DNA.

Tijdens het in dit proefschrift beschreven onderzoek slaagden SIMON en VAN VUNAKIS^^'^^ erin om moleculaire veranderingen aan te tonen in DNA, dat in aanwezigheid van methyleenblauw i s be-straald. Zowel in DNA a l s in laagmoleculaire derivaten blijkt guanine

snel te worden afgebroken. Van de andere in DNA voorkomende basen wordt thymine langzaam omgezet; de overige basen blijven intact. De fotodynamische guanineafbraak verloopt sneller bij gedenatureerd DNA dan bij natief DNA. Later toonden zij aan dat de anionische vorm van guanine ongeveer 25 maal reactiever i s dan de neutrale vorm. Verscheidene andere kleurstoffen blijken eveneens de afbraak van guanine te s e n s i b i l i s e r e n . De fotodynamische invloed van methy-leenblauw wordt ook bij andere substraten waargenomen. Zo werd het hoofdproduct van de theophylline-afbraak geïsoleerd en geïdentificeerd a l s 1,3-dimethylallantoïne. Over de afbraakproducten van guanine was nog bijna niets bekend.

WACKER C S . ' ' ' ' onderzochten kleurstoffen welke aan methyleen-blauw verwant zijn en vergeleken hun fotodynamische activiteiten, Indien het centrale stikstofatoom uit methyleenblauw wordt vervangen door een koolstofatoom ontstaat thiopyronine (I). Deze kleurstof blijkt eveneens de guanineafbraak te kunnen s e n s i b i l i s e r e n ' ' ' ' ' ^ ' . Vervang-ing van het zwavelatoom uit thiopyronine door zuurstof (II) heeft

gehele inactivering van de fotodynamische werking tot gevolg. Be-straling van DNA en s-RNA in aanwezigheid van thiopyronine blijkt een afneming van de absorptie bij 260 mij. te bewerkstelligen. De af-braak van guanine gaat gepaard met een zekere denaturatie van het nucleïnezuur. De snelheid van de fotodynamische denaturatie van DNA, afkomstig van verschillende organismen, werd door BELLIN en GROSSMAN'^2 onderzocht. Vergelijking van de smeltcurven leidde tot

de conclusie dat de degradatiesnelheid evenredig is met het percen-tage guanine in DNA. Kleurstoffen, welke niet worden gebonden aan DNA, hebben in het algemeen weinig effect.

Ook psoraleen-derivaten vertonen fotosensibiliserende eigen-schappen ten opzichte van DNA, hoewel deze van geheel andere aard zijn dan van riboflavine of methyleenblauw. Deze psoraleen-derivaten onderscheiden zich door het feit dat zuurstof hun werking remt. Door MUSAJO C S . werd waargenomen dat- vele psoraleen-derivaten met DNA in oplossing een binding kunnen aangaan, doch dat er geen verband bestaat tussen de fotosensibiliserende eigenschappen en de binding aan DNA. Bestraling van DNA in aanwezigheid van een foto-sensibiliserend psoraleen-derivaat heeft een drastische verandering in het fluorescentie-spectrum van de fotosensibilisator tot gevolg. Experimenten met verschillende basen en nucleosiden brachten aan het licht, dat alleen de bestraling van pyrimidine-nucleosiden in aanwezigheid van deze verbindingen tot spectrale veranderingen leidt. Bij de bestraling van purine-derivaten werden geen veranderingen waargenomen. Chromatografisch kon worden aangetoond dat bestraling van thymidine, cytidine en uridine in aanwezigheid van een psoraleen-derivaat tot een koppelingsproduct leidt, dat fluorescentie vertoont.

Aangezien de psoraleen-derivaten hun werking op DNA uitoefenen door binding aan het substraat, is het in feite niet juist om deze ver-bindingen tot de fotosensibilisatoren te rekenen. Van een fotosensi-bilisator wordt immers verwacht dat deze slechts katalytisch werkt.

7. Structuur van fotodynamische kleurstoffen.

Hoewel methyleenblauw de kleurstof is waarvan de fotodynamische eigenschappen het uitvoerigst zijn bestudeerd, werden ook vele andere typen verbindingen in de loop der tijd onderzocht. Er zijn thans onge-veer driehonderd verbindingen bekend welke fotodynamische activi-teit vertonen. De grote verscheidenheid, wat hun structuur betreft, is hierbij opvallend. Zo worden actieve kleurstoffen gevonden bij de koolwaterstoffen'*^, dibenzopyraan-derivaten (bijvoorbeeld bengaals-r o o d ' ^ ' ® ^ \ phenazines(neutbengaals-raalbengaals-rood^^', acbengaals-ridines (acbengaals-ridineobengaals-ranje ',

phenothiazine-derivaten (methyleenblauw,°°'°^', furocumarines (8-me-thoxypsoraleen^^', flavines (lumichroom^^ en riboflavine'''), porphy-rines (hematoporphyrine'' ' en vele andere groepen. Naast het ver-schil in structuur blijkt er ook een grote variatie in de absorptiespec-tra te bestaan.

Hoewel men tevergeefs naar een gemeenschappelijke structuur zal zoeken, welke het fotodynamisch vermogen van een kleurstof karakteriseert, bezitten vele fotosensibilisatoren een tricyclisch skelet met een structuur welke op anthraceen lijkt. Bij de bestudering van deze sensibilisatoren heeft men geconstateerd, dat vervanging van de meso-atomen of de para-atomen van de centrale ring door hetero-atomen tot toeneming van het fotodynamisch vermogen leidt. YAMAMOTo'*'^ vermeldt de volgende reeks van toenemend fotodyna-misch vermogen van tricyclische verbindingen met een op anthraceen gelijkende structuur, a l s functie van de meso-atomen:

C,C <C,0<N,N < N , 0 < C , N < N , S . Zoals reeds eerder i s vermeld, vinden WACKER c . s . ' ° eveneens een dergelijke reeks voor methyleenblauw en aanverwante verbindingen.

Bij de psoraleen-derivaten is aangetoond dat substitutie van de H-atomen op de 5- en/of 8-pIaats door hydroxylgroepen leidt tot ver-l i e s van de a c t i v i t e i t ' ^ . Invoering van een methoxygroep op de 5-of de 8-plaats geeft echter zeer actieve verbindingen, terwijl bij aan-wezigheid van twee methoxygroepen op de 5- en 8-plaats algehele inactivering optreedt. FOWLKS e s . stelden vast dat de hydrogene-ring van de furaanhydrogene-ring eveneens tot inactieve verbindingen leidt. Enige aanwijzingen over het mechanisme van de fotosensibilisatie door furocumarine-derivaten zijn door PATHAK c s . ' ^ gepubliceerd. Een punt van overeenkomst tussen alle fotosensibilisatoren is reeds door TAPPEINER in het begin van deze eeuw opgemerkt, name-lijk dat fotodynamische verbindingen fluoresceren. Het uitzenden van fluorescentielicht wijst erop, dat een molecuul in staat is de opge-vangen lichtenergie vast te houden, totdat het deze energie in één kwant weer uitzendt als fluorescentie-straling. Dit is in tegenstelling met het gedrag van een niet-fluorescerende verbinding, welke de opgevangen energie in een aantal kleinere kwanten door botsingen aan het oplosmiddel overdraagt. In vergelijking met een niet-fluores-cerende verbinding heeft een fluoresniet-fluores-cerende stof dus een betere kans om de opgevangen lichtenergie aan een substraatmolecuul over te dragen.

Het blijkt echter ook mogelijk te zijn dat, hoewel een verbinding kan fluoresceren, zij toch niet tot s e n s i b i l i s a t i e in staat i s . Door OSTER c s . ' ' ^ is vastgesteld dat alleen die kleurstoffen fotodynamische activiteit vertonen, welke een fotoreductie kunnen ondergaan. Bij de

fotoreductie van een dergelijke kleurstof zou een langlevende meta-stabiele aangeslagen toestand een grote rol spelen. Deze aangeslagen toestand staat bekend onder de naam triplettoestand. Naast deze langlevende triplettoestanden bestaan ook kortlevende aangeslagen toestanden (singlettoestanden). De verschillende soorten aangeslagen toestanden zijn van e s s e n t i e e l belang bij lichtabsorptie en energie-overdracht door fotodynamische kleurstoffen.

8. Aangeslagen toestanden van m o l e c u l e n ' ' ' ' ' ^ ' ' ^ ' ^ °

Bij fotochemische r e a c t i e s worden chemische veranderingen opge-wekt door een bepaald systeem bloot te stellen aan straling. Hoewel vele jaren geleden door G R O T T H U S reeds werd geformuleerd dat een r e a c ü e pas kan optreden indien eerst absorptie van energie plaats-vindt, i s merkwaardigerwijs deze wet niet altijd onderkend,

Energie wordt door moleculen geabsorbeerd in discrete eenheden of kwanten. Volgens E i n s t e i n s fotochemische eguivalentiewet absor-beert elk molecuul, dat tengevolge van bestraling reageert, één stra-lingskwant, Dit betekent evenwel niet dat elke geabsorbeerde kwant tot een reactie leidt,

De energie van het licht is sterk afhankelijk van de golflengte. Door EINSTEIN is de relatie russen de golflengte en de energie ge-formuleerd als E = hv, waarbij E = de energie, h = is de constante van PLANCK en V = de frequentie van het licht. Voor het gebied van 200-800 m/i bedraagt de corresponderende energie 143-36 kcal per grammolecuul.

De eerste stap in elke fotochemische reactie is het opvangen van een discrete stralingskwant door een molecuul, waardoor het molecuul vanuit de grondtoestand op een hoger energieniveau komt. Bij de aan-slag tot de l a a g s t e energieniveaus zijn hoofdzakelijk de n- en rr-elec-tronen van belang. Deze soorten elecrr-elec-tronen zijn gemakkelijk exciteer-baar en spelen een grote rol bij zichtbare en U.V,spectra. In de grond-toestand van een molecuul bezet elk paar 7r-electronen één baan, waarbij de spins van beide electronen tegengesteld zijn. Bij de exci-tatie van een dergelijk electronenpaar gaat één electron vanuit de baan van de grondtoestand over naar een baan met grotere energie-inhoud. Het aangeslagen electron blijft meestal s l e c h t s een korte tijd op dit hogere energieniveau en valt dan terug naar de grondtoestand, waarbij het zijn energie op verschillende wijzen kan verliezen.

Voor een tweeatomig molecuul kan het proces van de aanslag der electronen op de volgende wijze worden weergegeven (fig. 4). De curve A vertegenwoordigt de potenti'èle energie E van het molecuul in de

4 . P o t e n t i a a l c u r v e n v o o r e e n t w e e a t o m i g m o l e c u u l .

grondtoestand als functie van de afstand R tussen de twee kernen van het molecuul. Omdat de energie van het molecuul onderworpen i s aan kwanteuze beperkingen worden de toegestane energieniveaus van de grondtoestand weergegeven door een aantal vibratieniveaus (O, 1, 2, e t c ) . Een aangeslagen toestand van hetzelfde molecuul wordt weergegeven door curve A, Deze curve vertoont een andere waarde voor R op het punt van minimale potentiële energie. Uit figuur 4 volgt dat het electronen-spectrum van een dergelijk molecuul uit een groep lijnen bestaat, welke correspondeert met overgangen van de verschillende vibratieniveaus van de grondtoestand naar de vibratie-niveaus van de aangeslagen toestand, zoals door de verticale lijnen is aangegeven. In werkelijkheid worden banden waargenomen, omdat er invloeden zijn welke buiten beschouwing zijn gebleven. De elec-tronen-overgangen zijn toegestaan als wordt voldaan aan verschillende s e l e c t i e r e g e l s , welke de absorptie van electromagnetische straling bepalen. Er zijn geen beperkingen bij verandering van vibratieni-veau, doch bij kamertemperatuur zullen de meeste overgangen ge-schieden vanuit het l a a g s t e vibratieniveau van de grondtoestand. De verticale overgangen zijn een gevolg van het Franck-Condonprincipe. Volgens dit principe verlopen de electronen-overgangen zo snel dat de afstand tussen de kernen niet verandert tijdens de

electronen-over-gang.

Gedurende de bestaanstijd van de aangeslagen toestand, welke in de orde van 10"^—10"' s e c . ligt, kan het molecuul de overmaat vibra-tie-energie overdragen aan het oplosmiddel. Vervolgens kan het mole-cuul onder uitzending van fluorescentie-licht vanuit het laagste

vi-bratieniveau van de aangeslagen toestand terugvallen n a a r d e grond-toestand, Het fluorescentie-licht heeft in het algemeen een langere golflengte dan het geabsorbeerde licht. Bij de aanslag van het

mole-cuul en het afgeven van het fluorescentie-licht zijn de spins van de betreffende electronen niet veranderd,

Niet alle verbindingen vertonen fluorescentie, omdat de aanslag-energie ook op andere wijzen kan worden afgegeven, bijvoorbeeld als warmte via botsingen met het oplosmiddel.

Naast de fluorescentie en stralingsloze desactivering bestaat een ander mechanisme volgens welke het aangeslagen molecuul zijn energie kan verliezen. Vele organische verbindingen met dubbele bindingen bezitten een tweede energieniveau met een eigen set vi-bratieniveaus, welke een lagere energie bezit dan de eerder besproken aangeslagen toestand. Overgangen naar deze toestand gaan gepaard met omkering van de spin van het aangeslagen electron, zodat dit electron niet meer gepaard i s met het electron waarmee het in de grondtoestand geassocieerd was. Door de spinomkering heeft deze aangeslagen toestand een pararaagnetisch karakter. De eerder beschreven aangeslagen toestand, waarbij geen spinomkering heeft p l a a t s -gevonden, i s diamagnetisch en staat bekend als de eerste aangeslagen

singlettoestand (S.), Ook de grondtoestand (S.) is een diamagnetische toestand (fig. 5). De paramagnetische toestand staat bekend als

S i ( 1 * aongeslogen s i n g l e ! ) J Ol Q . O i n J 3 O 1 m m c Ol 3 > / *

- 7 v

5. Meest voorkomende electronen-overgangen in een molecuul tussen singlet-en tripletniveaus. De niet-onderbroksinglet-en pijlsinglet-en stellsinglet-en stralingsovergangsinglet-en voor, de onderbroken pijlen stralingsloze overgangen. In de rechthoeken geven de pijltjes de spinrichting van de betrokken electronen aan. Voor de overzichtelijkheid is van elk energieniveau s l e c h t s één vibratieni-veau aangegeven.

triplet ( T , ) . De namen singlet en triplet hangen samen met de multi-pliciteit van het spectrum indien het molecuul zich in een magnetisch veld bevindt.

Volgens de regel van Hund moet de triplet een lagere energie be-zitten dan de aangeslagen singlet. Deze regel zegt, dat als een groep gedegenereerde énergieniveaus s l e c h t s gedeeltelijk bezet i s de meest stabiele configuratie wordt verkregen, indien elke baan wordt gevuld met één electron, waarbij alle electronen parallele spins hebben. Eerst nadat alle banen één electron bezitten zal paring van electro-nen optreden, als er nog electroelectro-nen over zijn,

Een selectieregel welke overgangen tussen toestanden met ver-schillende multipliciteit verbiedt, maakt een directe aanslag van de grondtoestand naar de triplettoestand zeer onwaarschijnlijk, tenzij zware atomen of paramagnetische verbindingen aanwezig zijn, welke een electronen-overgang voldoende beïnvloeden om een spinomkering mogelijk te maken. De triplettoestand wordt meestal verkregen door een stralingsloze overgang vanuit de aangeslagen singlettoestand, Dit proces concurreert met fluorescentie en botsingsdesactivering. Een triplet kan zijn energie weer verliezen door een overgang naar de aangeslagen singlettoestand onder opneming van thermische energie of door een overgang naar de grondtoestand. Deze l a a t s t e overgang kan gepaard gaan met lichtemissie (fosforescentie) of stra-lingsloos geschieden. Dezelfde multipliciteitsregel welke triplet-singlet emissie (fosforescentie) verbiedt, is er de oorzaak van dat de triplettoestand een relatief lange levensduur heeft, vari'érend van 10'^ tot enkele seconden; deze waarden kunnen worden vergeleken met de 10"^—10'^ s e c . voor een aangeslagen singlettoestand. Gezien de lange levensduur van de triplet heeft deze aangeslagen toestand een grote kans om zijn energie aan een ander molecuul over te dra-gen.

9. Desactivering van aangeslagen toestanden.

Eén van de karakteristieke eigenschappen van de triplettbestand i s zijn relatief lange levensduur. De bestaanstijd van deze toestand kan o.a. worden verkort door de aanwezigheid van paramagnetische stoffen. Zelfs lage concentraties (10"^M) van paramagnetische ionen zoals Cu^"*", Ni^"*", etc. en paramagnetische moleculen zoals O, hebben een zeer grote invloed^ ^. Men spreekt hier van paramagnetische doving of " q u e n c h i n g " . Hoewel men de paramagnetische quenching eerst meende te kunnen verklaren met een toegenomen spin-baan-koppeling in het aangeslagen molecuul door het inhomogene veld van de

quen-c h e r ^ , komt men de l a a t s t e tijd tot de overtuiging dat er een ander mechanisme in het spel i s . Het blijkt namelijk dat sommige sterk paramagnetische ionen (bijvoorbeeld Gd'''^) geen quenchende werking vertonen, terwijl sommige diamagnetische verbindingen, wat quenching betreft, te vergelijken zijn met zuurstef^'''^''. Men neemt tegenwoordig de vorming van een charge-transfer-complex aan tussen de triplet en de quencher^^. Door middel van het charge-transfer-complex zijn triplet-singlet-overgangen waarschijnlijker geworden. Ook de aanwe-zigheid van zware atomen zoals broom en jodium kunnen deze over-gangen bevorderen,

Een ander soort quenching treedt op bij toevoeging van bepaalde anionen aan oplossingen met aangeslagen moleculen, In aanwezigheid van resp, F", Cl", Br' en J~ wordt de fluorescentie van een aantal kleurstoffen in toenemende mate gedoofd. De fluorescentie van een andere groep kleurstoffen wordt gedoofd door anionen zoals J O " , NO" en S Og". In beide gevallen treedt een beïnvloeding van aangeslagen singlettoestanden op,

Bij de fluorescentie-doving onder invloed van halogeniden neemt men aan dat een zgn, reducerende doving optreedt, terwijl de andere groep quenchers via een oxyderende doving zou inwerken op aan-geslagen moleculen. Volgens F Ö R S T E R kan men de reducerende en oxyderende doving a l s volgt verklaren (fig. 6).

Indien de grondtoestand van een kleurstof A energetisch lager ligt dan de grondtoestand van quencher L treedt reducerende quenching op (fig. 6a), De e e r s t e stap bij deze fluorescentie-doving i s een elec-tronen-overgang van de quencher naar het aangeslagen kleurstofmole-cuul A , hetgeen de vorming van twee raonoradicalen A en L"*" tot gevolg heeft. Het is begrijpelijk dat de som van de energie van A' en L'^ kleiner i s dan die van A en L doch groter dan de som van beide grondtoestanden A en L . De moleculen trachten derhalve de toestan-den A en L weer te bereiken en dit geschiedt door gang van A" naar L^, De plaatsgevonden hebbende electronen-over-gangen van L naar A en van A" naar L"*" geschieden stralingsloos; de energie wordt aan het oplosmiddel overgedragen.

In andere gevallen zullen de energieniveaus van de electronen van A hoger liggen dan die van de quencher L en dan zou zogenaamde oxyderende doving kunnen optreden (fig. 6b). Allereerst gaat een electron van A naar een baan overeenkomend met de eerste aange-slagen toestand van L, waarbij de deeltjes A"*" en L" ontstaan. De totale energie van laatstgenoemde deeltjes i s thans kleiner dan die van A plus L doch groter dan van A plus L. De vorming van de beide grondtoestanden komt tot stand door een electronen-overgang van L naar A"*". De beide electronen-overgangen zouden ook in dit geval

stralingsloos g e s c h i e d e n .

Volgens bovenstaand schema leiden de electronen-overgangen tot dezelfde producten, onafhankelijk van het feit of de aangeslagen toestand een singlet of een triplet is .

A - » L

A •• L

_^-6. Mechanismen van de fluorescentie-quenching volgens FÖRSTER. De re-ducerende en oxyderende quenching (resp. a en b) zijn voorgesteld in

s c h e m a ' s , welke de electronen-overgangen tussen de deelnemende mole-culen aangeven. De enkelvoudige lijnen stellen niveaus voor welke s l e c h t s door één electron zijn bezet, de dubbele lijnen geven een niveau aan dat een gepaard electronenpaar bezit. Onbezette banen zijn gestippeld g e -tekend. In de rechthoeken geven de pijlen de spinrichting van de betrok-ken electronen a a n .

10. Mechanismen van de fotodynamische werking

In dit gedeelte zal alleen de fotosensibilisatie onder zuurstof-opneming worden behandeld. Een groot aantal theorieën over de foto-dynamische werking zijn in de loop der tijd opgesteld. De belang-rijkste voorgestelde mechanismen kunnen in vijf groepen worden ver-deeld. In de volgende vijf schema's zijn: D = sensibilisator, A en AH, = substraat, DH, = gereduceerde sensibilisator, DO = complex van sensibilisator en zuurstof. Het teken * duidt op een aangeslagen toestand van het molecuul of complex. Het cijfer linksboven een notatie geeft de multipliciteit van de toestand aan (l=singlet en 3 = triplet).

L ^D ^^^ 'D*^'D* 3 D * + ^Og ^ ^D + ^0* 'Og + A -. Producten

Dit schema i s door K A U T S K Y C . S . ^ ' ^ ' ^ ^ ' ^ ^ ' ^ ° ' ^ ^ opgesteld en ver-onderstelt intermediair de vorming van aangeslagen zuurstof. Het mechanisme i s gebaseerd op de waarneming, dat de levensduur van de aangeslagen kleurstof 10"^ —10'^ s e c . bedraagt in afwezigheid van zuurstof, doch afneemt in aanwezigheid van zuurstof. K A U T S K Y C . S . '^^'^^ bestraalden trypaflavine en leuco-malachietgroen, welke op af-zonderlijke silicagel-korrels waren geadsorbeerd en namen waar dat bij lage zuurstofdruk een fotodynamische reactie optrad. Volgens K A U T S K Y is dit mogelijk doordat een reactief aangeslagen zuurstof-molecuul ontstaat. Hiervoor zouden de ^2 "*" en A toestand van

g g

zuurstof in aanmerking komen welke r e s p . bij 762 en 1260 m^ emissie vertonen, K A U T S K Y nam aan dat bij zijn schema de ^'^^ toestand van belang was. Belangrijke argumenten tegen het door KAUTSKY voorge-stelde mechanisme zijn door G A F F R O N ^ ^ gepubliceerd, die vond dat een fotoöxydatie kan optreden met licht dat een langere golflengte heeft dan 820 m/i, indien bacterio-phaeophytine als sensibilisator wordt gebruikt. Volgens G A F F R O N sluit dit het door KAUTSKY voor-gestelde mechanisme uit daar licht van 820 m/x onvoldoende energie zou bezitten om de bedoelde aangeslagen toestand, aangeduid als ^S"*", te doen ontstaan. KAUTSKY heeft erop gewezen dat in elk ge-val de met ' A aangegeven aangeslagen toestand van zuurstof nog

* *

kan o n t s t a a n ^ ' . Na de experimenten van GAFFRON^-^'^^'^'* en de critiek van T E R E N I N ^ ^ is lange tijd weinig aandacht besteed aan dit schema, hoewel ROSENBERG c.s.^^ ook verschijnselen waarnemen welke op de vorming van aangeslagen zuurstof wijzen. De l a a t s t e tijd is echter dit mechanisme, waarbij intermediar aangeslagen zuurstof bij fotoöxydaties wordt aangenomen, weer in de belangstelling geko-men omdat er aanwijzingen zijn dat het toch wel een rol kan spelen, De bovengenoemde aangeslagen toestanden blijken te worden gevormd bij de reactie van waterstofperoxyde en hypochloriet ' '^ en zij ontstaan eveneens bij electrische ontladingen in een zuurstofstroom, De met ' l ] '*' en A aangeduide toestanden zijn beide aangeslagen

g g

singlets van zuurstof. Aangezien de grondtoestand van zuurstof een triplet i s , gaat de overgang naar de singlets 2g*" of A met spinom-kering gepaard. Daar volgens het Pauli-principe twee in hetzelfde energieniveau voorkomende electronen tegengestelde spins moeten bezitten i s de terugkeer van het aangeslagen electron uit de singlet-toestand naar het grondniveau alleen mogelijk onder spinomkering. Deze spinomkering is een betrekkelijk onwaarschijnlijk fysisch ge-beuren en dientengevolge i s de levensduur van de singlet-zuurstof relatief lang.

Door F O O T E en W E X L E R ^ ° ° ' ^ ° ^ is waargenomen dat de oxydatie van bepaalde olefinen door singlet-zuurstof (gevormd bij de reactie tussen waterstofperoxyde en hypochloriet) tot dezelfde reactiepro-ducten leidt als de gesensibiliseerde fotoöxydatie van deze verbin-dingen,

Indien singlet-zuurstof, opgewekt met electrische ontladingen, door oplossingen van anthraceen-derivaten wordt geleid, ontstaan endo-peroxyden, welke eveneens worden gevormd bij de gesensibiliseerde f o t o ö x y d a t i e ^ ^ . Deze endo-peroxyden zijn niet gevormd door de in-werking van ozon of atomaire zuurstof op de anthraceen-derivaten, aangezien met deze actieve zuurstofvormen andere producten ont-staan. Hoewel de experimenten met aangeslagen zuurstof nog in het beginstadium verkeren, kan dit mechanisme van groot belang zijn bij andere gesensibiliseerde fotoöxydaties.

II. 1 D ^^ ' D * ^ 3 D *

3 D * + ^ A ^ 1 D + 3 A * 3 A * + ^ o ^ ^ Producten

Volgens G A F F R O N ^ ^ ' ^ 3 , 9 4 y^jQ^jt- j g aanslag-energie van de kleurstof overgedragen op het substraat. Argumenten voor dit schema zijn door

hem verzameld uit experimenten over de fotoöxydatie van rubreen. Hierbij nam G A F F R O N waar dat de reactie relatief onafhankelijk is van de zuurstof-concentratie en concludeerde dat dus het substraat moet worden geactiveerd.

III. 'D ^r ^D* . 3 D *

3 D * + AHg ^ A + DH2 D H ^ + ^ O ^ ^ ' D + H ^ O ,

Het H.O kan eventueel met A reageren. Volgens dit schema treedt een reductie van de kleurstof en de vorming van H O op ^3^ Deze opvatting wordt gesteund door experimenten van G A L S T O N ' ' ' , W E I L en M A H E R ^ ° ' ' en polarografische studies van B E R G ' ° ^ . Dit mecha-nisme zou een rol spelen bij de oxydaties van nicotine onder invloed van methyleenblauw^ '', indolylazijnzuur o.i.v. riboflavine''^ en glycerol o,i,v, anthrachinon-2-sulfonzuur"'^'"'®. Bij de meeste foto-dynamische reacties is daarentegen nooit waterstofperoxyde-vorming aangetoond^ ° ' " " ' .

IV. ' D + ' A -. ' D A

'DA 'T 'DA* - 3DA*

3 D A * + 3O2 -* Producten

Het schema, dat o.a. door F I A L A " ' 3 wordt voorgesteld, i s gebaseerd op polarografische waarnemingen bij de inwerking van licht op een complex substraat-kleurstof dat reeds in het donker i s gevormd . De door F I A L A gebruikte substraten waren voornamelijk eiwitten. Bij de l a a t s t e stap van dit schema zou volgens S A N T A M A R I A ' ^ een zogenaamd " o x y r a d i c a a l " ontstaan: " D A O O " . Volgens F R E I F E L D E R c s . ^ ^ zou dit schema bij de sensibilisatie van DNA door acridine-oranje optreden. BELLIN en GROSSMAN^^ namen waar dat in het algemeen complexvormende kleurstoffen DNA beter sensibiliseren dan niet-complexvormende verbindingen.

V. ' D ^^ ' D * ^ 3 D *

3 D * + ' O 2 - D O 2

Voor dit schema i s de l a a t s t e jaren veel indirect bewijs geleverd. In 1943 dacht T E R E N I N ^ ^ reeds aan de vorming van een kleurstof-peroxyde-radicaal dat met het substraat zou reageren. Van verschil-lende zijden heeft men steun verkregen voor dit mechanisme, voor-namelijk van L I V I N G S T O N en O W E N S ' ° ^ , O S T E R C S . ' ^ ^ en S C H E N C K C S . ^ ^ ' ' " ^ ' " " ' " ' . Het complex tussen aangeslagen kleurstof en zuurstof wordt wel aangeduid als moloxyde, fotoperoxyde, biradicaal of oxyradicaal. Door O S T E R ^ ^ i s de fotodynamische werking van pro-flavine op p-tolueendiamine bestudeerd. Dit substraat wordt gemak-kelijk geoxydeerd in aanwezigheid van allerlei soorten sensibilisa-toren. De voornaamste conclusies uit Osters werk zijn de postulering van een fotoperoxyde en het bewijs dat een langlevende triplettoe-stand een rol speelt. Kleurstoffen welke een fotoöxydatie van p-to-lueendiamine sensibiliseren zijn ook tot inactivering van transfor-merend DNA en tumorcellen in s t a a t . Deze sensibiliserende eigen-schappen gingen tevens gepaard met het vermogen een fotoreductie te kunnen ondergaan.

Een direct bewijs van de vorming van een fotoperoxyde is echter nog steeds niet geleverd. De vorming van een fotoperoxyde als inter-mediair bij de fotoöxydatie van anthraceen i s niet erg waarschijn-l i j k ' ° ' .

Om voor de fotodynamische werking één algemeen geldend me-chanisme op te stellen lijkt tot dusverre weinig zinvol. Welke van bovenstaande schema's optreedt, zal waarschijnlijk afhankelijk zijn van de sensibilisator en het substraat.

11. Literatuur 1. O . R a a b , Z . B i o l . 39 (1900) 5 2 4 . 2. A . M a r c c a c i , A r c h . I t a l . B i o l . 9 (1888) 2. 3 . H . V. T a p p e l n e r , A. J o d l b a u e r , D i e s e n s i b i l i s i e r e n d e Wirkung f l u o r e s -c l e r e n d e r S u b s t a n z e n , F . C . W . V o g e l , L e i p z i g 1 9 0 7 . 4. N . T . C l a r e in R a d i a t i o n B i o l o g y III (A. H o l l a e n d e r , e d . ) M c G r a w - H i l l , New York 1 9 5 6 . 5. W.L. F o w l k s , J . I n v e s t . D e r m a t o l . 32 (1959) 2 3 3 . 6. J . D . S p i k e s , C . A . G h i r o n in P h y s i c a l p r o c e s s e s in R a d i a t i o n B i o l o g y (L. A u g e n s t e l n c . s . , e d . ) A c a d e m i c P r e s s , New York 1964. 7. H . F . B l u m , P h o t o d y n a m i c a c t i o n and d i s e a s e s c a u s e d by l i g h t . R e i n -hold, New York, l e u i t g a v e 1 9 4 1 , 2^ u i t g a v e 1964.

8. W. H a u s m a n n , S t r a h l e n t h e r a p l e VII, Urban und S c h w a r t z e n b e r g , B e r l i n 1923. 9. V . J . M c G o v e r n , A r c h . D e r m a t o l . 83 (1961) 4 0 . 10. R . L . B a e r , L . C . H a r b e r , A r c h . D e r m a t o l . 83 (1961) 7. 1 1 . L . M u s a j o , G. R o d i g h i e r o , E x p e r i e n t i a 18 (1962) 1 5 3 . 12. A. M a t o l s t y , G. F a b i a n , N a t u r e 158 (1946) 8 7 7 . 13. J. F r a n c k , C . S . F r e n c h , J. G e n . P h y s i o l . 25 (1941) 3 0 9 . 14. A.W. G a l s t o n , S c i e n c e 111 (1950) 6 1 9 . 15. A . C . G l e s e , E . Z e u t h e n , J . G e n . P h y s i o l . 32 (1949) 5 2 5 . 16. H . F . B l u m , E . F . K a u z r a a n n , J . G e n . P h y s i o l . 37 (1954) 3 0 1 .

17. H . F . B l u m , H.W. G i l b e r t , J. C e l l u l a r C o m p . P h y s i o l . 15 ( 1 9 4 0 ) 8 5 . 18. A . I . H o l t z , P r o c . S o c . E x p t l . B i o l . Med. 110 (d962) 6 0 5 . 19. R . P . B o l a n d e , L . Wurz, A r c h . P a t o l . 75 (1963) 1 1 5 . 2 0 . W.B. W h e e l e r , A . C . H o l l i n s h e a d , S c i e n c e 141 (1963) 1 2 7 9 . 2 1 . T . T ' u n g , S.H. Z i a , P r o c . S o c . E x p t l . B i o l . Med. 36 (1937) 3 2 6 . 22. M.M. M a t h e w s , W.R. S i s t o m , A r c h . M l k r o b i o l . 35 (1960) 139. 2 3 . E . L . O g i n s k y , G . S . G r e e n , D . G . Griffith, W.L. F o w l k s , J . B a c t e r i o l . 78 (1959) 8 2 1 . 2 4 . W.L. F o w l k s , D . G . Griffith, E . L . O g i n s k y , N a t u r e 181 (1958) 5 7 1 . 2 5 . M.M. M a t h e w s , J . B a c t e r i o l . 85 (1963) 3 2 2 . 2 6 . H. B ö h m e , A. W a c k e r , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 12 (1963) 137. 2 7 . K . C . Smith, B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 8 (1962) 157. 2 8 . C. W a l l i s , J . L . M e l n i c k , V i r o l o g y 23 (1964) 5 2 0 . 2 9 . C. W a l l i s , J . L . M e l n i c k , P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 4 ( 1 9 6 5 ) 159. 3 0 . G . B . O r l o b , V i r o l o g y 21 (1963) 2 9 1 . 3 1 . J.M. B l r k e l a n d , S c i e n c e 80 (1934) 3 5 7 . 3 2 . G. O s t e r , A . D . M c L a r e n , J . G e n . P h y s i o l . 33 (1950) 2 1 5 . 3 3 . M. C h e s s l n , S c i e n c e 132 (1960:t 1 8 4 0 . 3 4 . K. H e r z b e r g , K. R e u s s , R. D a h n . N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 50 (1963) 3 7 6 . 3 5 . D. C r o w t h e r , J . L . M e l n i c k , V i r o l o g y 14 <1961) 1 1 . 3 6 . F . L . S c h a f f e r , V i r o l o g y 18 (1962) 4 1 2 . 3 7 . A . J . H a c k e t t , P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 (-1962) 147. 3 8 . C.W. H i a t t , T r a n s . N . Y. A c a d . S c i . 23 (1960) 6 6 . 3 9 . C. W a l l i s , J . L . M e l n i c k , V i r o l o g y 21 (1963) 3 3 2 . 4 0 . C. W a l l i s , N . S a k u r a d a , J . L . M e l n i c k , J . I m m u n o l . 9 i /(1963) 6 7 7 . 4 1 . E . G . C u t c h i n s , T . R . Dayhuff, V i r o l o g y 17 (1962) 4 2 0 . 4 2 . J . N . W e l s h , M.H. A d a m s , J . B a c t e r i o l . 68 (1954) 122. 4 3 . N. Y a m a m o t o , V i r u s ( O s a k a ) 6 (1956) 5 1 0 . 4 4 . L . M u s a j o , G. R o d i g h i e r o , G. C o l o m b o , V. T o r l o n e , F . D a l l ' A c q u a , E x p e r i e n t i a 21 (1965) 2 2 . 4 5 . Z . V o d r a z k a , J. C e j k a , J . S a l a k , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 2 ( 1 9 6 1 ) 3 4 2 . 4 6 . L . S a n t a m a r i a , B u l l . S o c . C h i m . B e l g . 71 ( 1 9 6 2 ) 8 8 9 . 4 7 . A. L u k t o n , R . W e i s b r o d , J. S c h l e s i n g e r , P h o t o c h e m , P h o t o b i o l . 4 (1965) 2 7 7 . 4 8 . L . Weil,, W.G. G o r d o n , A . R . B u c h e r t , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 33 (195 1) 90. 4 9 . L . Weil, T . S . S e l b l e s , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 54 (1955) 3 6 8 . 5 0 . L. Weil, A . R . B u c h e r t , J . Maher, A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 40 (1952) 2 4 5 . 5 1 . C . A . G h i r o n , J . D . S p i k e s , P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 4 (1965) 1 3 . 5 2 . S.K. K o n , M . B . W a t s o n , B i o c h e m . J. 30 ( 1 9 3 6 ) 2 2 7 3 . 5 3 . F . G . H o p k i n s , C o m p . R e n d . T r a v . L a b . C a r l s b e r g , S e r . C h i m . 22 (1938) 2 2 6 . 5 4 . J . D . W a t s o n , F . H . C . C r i c k , N a t u r e 171 (1953) 7 3 7 . 5 5 . O . T . A v e r y , C M . M c L e o d , M. M c C a r t h y , J. E x p t l . Med. 79 (1944) 137. 5 6 . Shen San C h u l n , Hong Mang-Mlng, Gal R u i - C h u , C h e n Wal-Chu, C h a n g

W e n - L i n , S c i e n t l a S i n i c a 11 (1962) 2 3 3 . 5 7 . E . Chargaff en J . N . D a v i d s o n , T h e N u c l e i c A c i d s , A c a d e m i c P r e s s , New York 1 9 5 5 . 5 8 . E . H a r b e r s , D i e N u c l e i n s a U r e n , T h l e m e V e r l a g , S t u t t g a r t 1 9 6 4 . 5 9 . J . N . D a v i d s o n , W . E . C o h n , P r o g r e s s in n u c l e i c a c i d r e s e a r c h . A c a d e m i c P r e s s , New York 1 9 6 3 - . 6 0 . C.W. C a r t e r , B i o c h e m . J . 22 (1928) 5 7 5 . 6 1 . M. S p i e g e l - A d o l f , F e d . P r o c . 14 (1955) 2 8 5 . 6 2 . S. I s a k a , J. K a t e , J . C o l l . A r t s . S c i . C h i b a U n i v . 1 (1962) 4 3 , z l e ook ref. 6. p a g . 3 1 6 . 6 3 . W.R. F r i s e l l , C.W. C h u n g , C . G . M a c k e n z i e , J. B i o l . C h e m . 234 (1959) 1297. 6 4 . K. U e h a r a , T . M l z o g u c h l , Y. O k a d a , J . B i o c h e m . ( T o k y o ) 55 (1964) 6 8 5 . 6 5 . H. Koffler, I . L . M a r k e r t , P r o c . S o c . E x p t l . B i o l . Med. 76 (1951) 90. 6 6 . D. F r e i f e l d e r , P . F . D a v i s o n , E . P . G e i d u s c h e k , B i o p h y s . J . 1 (1961) 3 8 9 . 6 7 . J . S . B e l l i n , G. O s t e r , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 42 (1960) 5 3 3 . 6 8 . M.I. Simon, H. V a n V u n a k i s , J . Mol. B i o l . 4 (1962) 4 8 8 .

6 9 . M.I. Simon, H. V a n V u n a k i s , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 105 (1964) 197. 70. A. W a c k e r , G, TUrck, A. G e r s t e n b e r g e r , N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 50 (1963) 3 7 7 . 7 1 . E . R . L o c h m a n n , W. S t e i n , N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 51 (1964) 5 9 . 7 2 . J . S . B e l l i n , L . I . G r o s s m a n , P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 4 (1965) 4 5 . 7 3 . L . M u s a j o , G. R o d i g h i e r o , F . D a l l ' A c q u a , E x p e r i e n t i a 21 (1965) 2 4 . 7 4 . G. O s t e r , J . S . B e l l i n , B . H o l m s t r ö m , E x p e r i e n t i a 18 (1962) 2 4 9 . 7 5 . M.A. P a t h a k , B . A l l e n , D . J . E . I n g r a m , J . H . F e l l m a n , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 54 (1961) 5 0 6 . 76. G. O s t e r , J . S . B e l l i n , R.W. K i m b a l l , M.E. S c h r a d e r , J . A m . C h e m . S o c . 81 (1959) 5 0 9 5 . 7 7 . G . H . B e a v e n , E . A . J o h n s o n , H . A . W i l l i s , R . G . J . M i l l e r , M o l e c u l a r S p e c t r o s c o p y , H e y w o o d & C o , L o n d o n 1 9 6 1 . 7 8 . T . F ö r s t e r , F l u o r e s z e n z O r g a n i s c h e r V e r b i n d u n g e n , V a n d e n b r o e c k e n R u p r e c h t , G ö t t i n g e n 1 9 5 1 . 7 9 . C . R e i d , E x c i t e d s t a t e s in c h e m i s t r y and b i o l o g y , B u t t e r w o r t h s S c i e n -t i f i c P u b l i c a -t i o n s , L o n d o n 1 9 5 7 . 8 0 . E . J . B o w e n , F . W o k e s , F l u o r e s c e n c e of s o l u t i o n s , L o n g m a n s , G r e e n a n d C o . , L o n d o n 1 9 5 3 . 8 1 . V . K a s c h e , L . L l n d q v i s t , J . P h y s . C h e m . 68 (1964) 8 1 7 . 8 2 . D . F . E v a n s , J . C h e m . S o c . (1957) 1 3 5 1 , 3 8 8 5 . 8 3 . H . L i n s c h i t z , L . P e k k a r i n e n , J . A m . C h e m . S o c . 82 (1960) 2 4 1 1 . 8 4 . F . F u j i m o r i , R . L i v i n g s t o n , N a t u r e 180 (1957) 1 0 3 6 . 8 5 . H . T s u b o m u r a , R . S . M u l l i k e n , J . Am. C h e m . S o c . 82 (1960) 5 9 6 6 . 8 6 . G . O . S c h e n c k , A n g e w . C h e m . 69 ( 1 9 5 7 ) 5 7 9 . 8 7 . H. K a u t s k y , H. d e B r u y n , N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 19 (1931) 1 0 4 3 . 8 8 . H. K a u t s k y , H. d e B r u y n , R . N e u w i r t h , W. B a u m e i s t e r , B e r . 66 (1933) 1588 8 9 . H. K a u t s k y , A. H i r s c h , W. F l e s c h , B e r . 68 (1935) 152. 9 0 . H. K a u t s k y , G.W. Muller, Z . N a t u r f o r s c h . P t a . 2 (1947) 1 6 7 . 9 1 . H. K a u t s k y , Biocherri. Z . 291 (1937) 2 7 1 . 9 2 . H . Gaffron, B i o c h e m . Z . 287 (1936) 130. 9 3 . H . Gaffron, B i o c h e m . Z . 264 (1933) 2 5 1 . 9 4 . H. Gaffron, B e r . 68 (1935) 1 4 0 9 . 9 6 . A. T e r e n i n , A c t a P h y s i c o c h i m . U S S R . 18 (1943) 2 1 0 . 9 7 . J . L . R o s e n b e r g , D . J . S h o m b e r t , J . Am. C h e m . S o c . 82 (1960) 3 2 5 7 . 9 8 . A . U . K h a n , M . K a s h a , J. C h e m . P h y s . 39 ( 1 9 6 3 ) 2 1 0 5 . 9 9 . A . U . K h a n , M . K a s h a , N a t u r e 204 (1964) 2 4 1 . 1 0 0 . R . J . B r o w n e , E . A . O g r y z l o , P r o c . C h e m . S o c . (1964) 117. 1 0 1 . C . S . F o o t e , S. Wexler, J . Am. C h e m . S o c . 86 (1964) 3 8 7 9 . 102. C . S . F o o t e , S. Wexler, J . Am. C h e m . S o c . 86 (1964) 3 8 8 0 . 1 0 3 . E . J . C o r e y , W.C. T a y l o r , J . Am. C h e m . S o c . 86 (1964) 3 8 8 1 . 104. S. F l a l a , B i o c h e m . Z . 320 (1949) 10. 105. L . Weil, J . Maher, A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 29 (1950) 2 4 1 . 106. H. B e r g , H . E . J a c o b , P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 4 (1965) 5 5 . 107. H. B e r g , H . H e i n e c k e , H . E . J a c o b , N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 51 (1964) 4 4 4 . 1 0 8 . K. Meyer, J . B i o l . C h e m . 103 (1933) 5 9 7 . 109. R . L i v i n g s t o n , K . E . O w e n s , J . Am. C h e m . S o c . 78 (1956) 3301 110. G . O . S c h e n c k , N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 35 ( 1 9 4 8 ) 2 8 . G . O . S c h e n c k , K. G o U n i c k , O b e r d i e s c h n e l l e n T e i l p r o z e s s e p h o t o s e n -s i b l l i -s i e r t e r S u b -s t r a t o b e r t r a g u n g e n , W e -s t d e u t -s c h e r V e r l a g , K ö l n und 1 1 1 . O p l a d e n 1 9 6 3 . G . O . S c h e n c k , E . K o c h , Z . E l e k t r o c h e m . 64 (1960) 170.

HOOFDSTUK 2

FOTODYNAMISCHE AFBRAAK VAN GUANINE EN GUANINE-DERIVATEN

1. Inleiding

De kennis van de fotosensibilisatie van nucleïnezuren beperkte zich bij de aanvang van ons onderzoek tot de door B E L L I N en OSTER' aangetoonde inactivering van biologisch actieve nucleïnezuren onder invloed van zichtbaar licht in aanwezigheid van o.a, methyleenblauw. In verband met de belangstelling voor fotochemie en fotobiologie in het Laboratorium voor Biochemie en Biofysica van de Technische Hogeschool te Delft werd aan de schrijver van dit proefschrift een

nadere bestudering van bovengenoemd verschijnsel opgedragen. Het lag voor de hand te veronderstellen dat bij de fotodynamische aantasting van nucleïnezuren een oxydatieve afbraak optreedt, daar BELLIN en OSTER steeds de aanwezigheid van zuurstof van essen-tieel belang vonden voor de werking van fotodynamische kleurstoffen. Daar in bovengenoemd laboratorium reeds verscheidene onderzoekingen zijn verricht over gefotosensibiliseerde reacties waarbij lumichroom de lichtacceptor is, werd deze stof uitgekozen voor een nadere be-studering van de fotosensibilisatie van nucleïnezuren. Het is vanzelf-sprekend dat de gebruikte kleurstof als zodanig geen effect op cellen of nucleïnezuren mag vertonen, terwijl deze eveneens stabiel ten op-zichte van licht behoort te zijn, daar anders gevormde bestralingspro-ducten misschien een storende invloed zouden kunnen uitoefenen. Lumichroom voldoet aan de juist genoemde eisen.

Het i s te verwachten dat de fotodynamische inactivering van nucleïnezuren berust op chemische veranderingen in deze polymeren. Nucleïnezuren zijn echter enigszins ongeschikte verbindingen voor de bestudering van zulk een veronderstelde chemische aantasting omdat het immers voor naspeuring van eventueel teweeggebrachte ver-anderingen noodzakelijk i s , alvorens een analyse te verrichten, een hydrolyse uit te voeren. Hierbij kan een aangebrachte beschadiging worden uitgebreid of misschien juist worden opgeheven. Bovendien i s het uiteraard mogelijk dat de fotodynamische inactivering van nucleïnezuren leidt tot chemische omzettingen in een relatief zeer gering aantal groepen, zodat een opsporing hiervan in een stof met moleculairgewichten in de orde van miljoenen wel zeer moeilijk moet

worden geacht. Teneinde deze bezwaren te vermijden werd derhalve een groot deel van het onderzoek verricht met de nucleotiden, nucleo-siden en basen, welke in DNA voorkomen. De bij deze verbindingen waargenomen verschijnselen zijn in dit hoofdstuk beschreven. Aan-wijzigingen dat overeenkomstige chemische veranderingen eveneens in nucleïnezuren optreden worden in het daaropvolgende hoofdstuk behandeld.

2. Keuze van de kleurstof

Daar transformerend DNA een zeer specifieke en goed meetbare biologische activiteit bezit kan met behulp hiervan op betrekkelijk eenvoudige wijze worden nagegaan welke kleurstoffen fotodynamische activiteit vertonen. Als transformerend DNA werd gekozen de nucleï-nezuur-fractie uit een natuurlijke stam van B. subtilis welke in staat is een stam van hetzelfde micro-organisme, die het vermogen tot synthese van tryptofaan heeft verloren, deze eigenschap weer terug te geven. Alvorens over te gaan tot lumichroom als fotosensibilisator werden enige kleurstoffen op hun effect onderzocht. Hiertoe werd transformerend DNA bestraald in aanwezigheid van resp. methyleen-blauw, neutraalrood, fluoresceïne en berberinesulfaat. De te bestralen oplossing, welke per 4 ml 320 /xg DNA en 2.10'^ gmol kleurstof in 0,07 M NaCl bevatte, werd in een cuvet op 20 cm van twee hoge druk kwiklampen gedurende 45 minuten bestraald. De biologische activiteit van onbestraald DNA werd op lOO?^ gesteld en de activiteit van be-straald en onbebe-straald DNA in aanwezigheid van een kleurstof hier-mee vergeleken. De resultaten zijn weergegeven in tabel 1.

Wij moeten op grond van deze resultaten aannemen dat berberine een sterk toxische invloed op bacteriën heeft. Het is op deze wijze dus niet mogelijk berberine op fotodynamische activiteit te onderzoeken. Neutraalrood en fluoresceïne blijken goede fotosensibilisatoren te zijn, terwijl methyleenblauw s l e c h t s een geringe invloed vertoont. Geen der kleurstoffen had veel invloed in het donker.

In de experimenten van B E L L I N en O S T E R ' bleken methyleen-blauw en neutraalrood fotosensibilisatoren te zijn van ongeveer ge-lijke sterkte, terwijl in onze experimenten alleen neutraalrood actief i s . De oorzaak van dit verschil moet worden gezocht bij de gebruikte lichtbron. De door ons gebruikte lamp (Philips HP 125) heeft zeer weinig emissielijnen in het absorptiegebied van methyleenblauw, dit in tegenstelling met de door BELLIN en O S T E R toegepaste wolfraam-lamp, welke voldoende licht van deze golflengten uitzendt.

Hoewel neutraalrood en fluoresceïne onder onze omstandigheden goede fotodynamische activiteit vertoonden, waren zij voor ons doel

TABEL 1

Fotodynamische inactivering van transformerend DNA

Kleurstof Geen idem Neutraalrood idem Methyleenblauw idem Fluoresceïne idem Berberine idem (B)estraald of (O)nbestraald 0 B 0 B 0 B 0 B 0 B Activiteit in % 100 100 110 50 97 90 110 65 0 0

toch minder geschikt, omdat beide verbindingen vrij snel ontleden bij bestraling. Hierdoor wordt een spectrofotometrisch onderzoek bemoeilijkt, terwijl het bovendien dan onmogelijk is lange bestra-lingstijden te gebruiken.

BELLIN en OSTER hadden gevonden dat ook riboflavine (I) foto-dynamische activiteit bezit, maar deze kleurstof is evenmin stabiel bij bestralen. In het Laboratorium voor Biochemie en Biofysica der Technische Hogeschool te Delft zijn verschillende eigenschappen van het structureel sterk met riboflavine overeenkomende lumichroom (II) door POSTHUMA^ onderzocht. Deze kleurstof is wel stabiel bij

bestraling, zodat het aantrekkelijk leek deze verbinding met behulp van het transformatie-systeem op fotodynamische activiteit te testen. Lumichroom is een gele kleurstof, welke slecht in water oplost (bij 22 C ± 3 [ig/ml), doch gemakkelijk oververzadigde oplossingen

geeft. De oplosbaarheid is veel groter in alkalisch milieu. In bijna al onze experimenten is lumichroom gebruikt bij pH 7. Bij deze zuur-graad vertoont lumichroom het onderstaande spectrum (fig. 7). In het

300 Golflengte [ mu)

7. Absorptiespectrum van lumichroom in water.

pH-gebied van 2-8 verandert dit spectrum niet. Boven pH 8 wordt de gele kleur van de oplossing veel intensiever en treden ook in het spectrum geringe veranderingen op. De stabiliteit van lumichroom bij bestralen is onderzocht over het pH-traject 2-7. Bij een pH lager dan 3,5 blijkt lumichroom onder invloed van licht vrij snel te ontleden. Voor een onderzoek naar de fotodynamische activiteit van deze kleurstof werd 4 ml oplossing (320 /tg transformerend DNA en 40 (ig lumichroom in 0,07 M NaCl) in een cuvet bestraald gedurende 4, 8 en 12 minuten. Tevens werd dit DNA in afwezigheid van lumichroom ge-durende dezelfde tijden bestraald om te onderzoeken of kortgolvig U.V. licht uit de lampen de cuvet bereikte. De resultaten zijn in fi-guur 8 weergegeven.

Uit deze resultaten blijkt duidelijk dat lumichroom een goede fotosensibilisator van DNA i s , welke in het donker geen invloed heeft. Lumichroom bezit absorptiemaxima bij o.a. 355 en 370 m^. De ge-bruikte lamp heeft o.a. emissielijnen bij 313, 366 en 405 m/x,