K
osmos
Numer 3 (236) Strony 451-460PROBLEMY NAUK BIOLOGICZNYCH
_____________ P olsk ie Tow a rzystw o P rzyrod n ik ów im. K op ern ik aMa r c in Gie r d a l s k i, Be a t a Ja b ł o ń s k a
Zakład Neurojizjologii Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Pasteura 3, 02-093 Warszawa
DŁUGOTRWAŁE PODAWANIE SUBSTANCJI CZYNNYCH W NEUROBIOLOGII DOŚWIADCZALNEJ
WSTĘP
Metody długotrwałego podawania środków biologicznie czynnych od dawna znajdują się w polu zainteresowania biologii doświadczalnej. Wiele bowiem spośród badanych procesów fi zjologicznych, ze względu na swą względnie wol ną dynamikę, wymaga długo trwającej ingerencji farmakologicznej. Jednak wielokrotne wstrzyk nięcia, nierzadko stosowane przez ponad mie siąc, są czynnikiem stresotwórczym, mogącym wnosić istotne zakłócenia do modelu badawcze go. Wzrost wymagań bioetycznych prowadzi do ograniczenia użycia procedur wywołujących u zwierzęcia ból czy silny dyskomfort. Potrzebne techniki zaczerpnięto więc z farmacji klinicznej i technologii postaci leku, bowiem lekarze zetk nęli się z podobnymi problemami dużo wcześ niej.
Terapia farmakologiczna niemal wszystkich schorzeń wymaga wielokrotnego podawania środka leczniczego. W ten sposób zapewnia się na tyle długi okres działania leku, by zdołał on zlikwidować czynnik etiologiczny lub utrzymać pożądany stan czynnościowy chorego układu bądź narządu.
Pojedyncza dawka daje w większości przy padków szybki wzrost stężenia substancji czyn nej w przedziałach organizmu. Po zakończeniu wchłaniania zaczynają przeważać mechanizmy biotransformacji (przede wszystkim metabo lizm i wydalanie) i stężenie substancji czynnej maleje wykładniczo. Pozwala to na utrzymanie skutecznego stężenia tylko przez pewien (naj
częściej krótki) okres. Podanie w odpowiednim czasie kolejnej dawki leku zapobiega spadkowi poziomu jego stężenia poniżej wartości skutecz nej i umożliwia utrzymanie go przez dłuższy czas.
W przypadku leków o krótkim półokresie biologicznego rozpadu realizacja odpowiednie go schematu dawkowania staje się kłopotliwa zarówno dla pacjenta, jak i lekarza. Dlatego opracowano postaci leku o przedłużonym dzia łaniu. Umożliwiają one utrzymanie skuteczne go stężenia substancji leczniczej przez okres najczęściej 8-12 godzin, nie dłuższy jednak niż jedna doba. Nie likwiduje to wahania stężeń substancji w ustroju, co w przypadku leków o niskim indeksie terapeutycznym (stosunek da wki toksycznej do dawki skutecznej) wiąże się z ryzykiem wystąpienia działań niepożądanych.
Sytuacja uległa radykalnej zmianie w latach 70-tych, gdy wprowadzono do terapii systemy terapeutyczne czyli postaci leku o kontrolowa nym uwalnianiu. Pozwalają one utrzymać stały poziom środka leczniczego przez długi czas (od kilku dni do kilku miesięcy). Systemy terapeu tyczne są tak zaprojektowane, iż szybkość uwal niania jest zaprogramowana w ich konstrukcji, a nie zależy od warunków istniejących w miej scu podania (np. pH, ciśnienie osmotyczne)
( L a n g e r 1990, J a n ic k i 1987a).
Systemy o kontrolowanym uwalnianiu mają wiele zalet, które stawiają je wyżej niż konwen
SKRÓTY: 2-DG — 2-deoksyglukoza, APV — kwas a-aminofosfonowalerianowy, CPP — kwas 3-[(±)-2-karbo- ksypiperazyn-4-ylo]propylo-1 -fosfonowy, DMSO — dimetylosulfotlenek, H-7 — jeden z inhibitorów kinazy białkowej C, MK-801 — maleinian dizocylpiny, NMDA — A-metylo-D-asparaginian, PBS — buforowany roztwór soli fizjologicznej, TRH — tyreotropina
W czasie przygotowywania artykułu (w roku 1996) Beata Jabłońska była stypendystką Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej.
cjonalne postaci leków o przedłużonym działa niu:
1. Pozwalają na utrzymywanie stałego po ziomu substancji czynnej w ustroju, niwelując wahanie stężenia między wartością toksyczną a nieskuteczną.
2. Umożliwiają nieprzerwane i długotrwałe podawanie substancji łatwo ulegających rozpa dowi lub inaktywacji w ustroju (np. białka).
3. Możliwość miejscowego podawania po zwala na utrzymywanie skutecznego stężenia w wybranym miejscu i zapobiega wystąpieniu nie pożądanych efektów w innych narządach.
Długotrwałe podawanie związków czynnych biologicznie jest ważne w biologii i medycynie doświadczalnej nie mniej niż w klinice. Dobrego przykładu dostarcza historia badań mechani zmów działania leków przeciwdepresyjnych.
Ve t u l a n i i współpracownicy (1 9 7 6 ) odkryli, że jedynie długotrwałe podawanie tych leków po wodowało charakterystyczne zmiany w funkcji receptorów (3-adrenergicznych w mózgu szczu
ra. Obserwacja ta była zgodna z danymi klini cznymi, gdyż przeciwdepresyjne działanie le ków ujawnia się dopiero po kilku tygodniach nieprzerwanej farmakoterapii. Pojedyncze da wki tych leków dają różne — zależnie od grupy terapeutycznej — bezpośrednie skutki neuro- chemiczne. Nie muszą one być wprost związane z właściwym mechanizmem działania leku, gdyż bardziej jednolity zespół efektów obserwo wano po dłuższym czasie.
Także badanie mechanizmów długotrwa łych zjawisk, takich jak zmiany rozwojowe (D e n
v e r 1993, F a c t o r i współaut. 1993), regenera
cja (F r e e m a n i współaut. 1994) lub procesy
uczenia się i pamięci ( M o r r i s i współaut. 1986), może wymagać chronicznego podawania związ ków biologicznie czynnych.
W niniejszym artykule przedstawiono dwa podstawowe systemy kontrolowanego uwalnia nia substancji, mianowicie minipompki osmo- tyczne oraz systemy oparte na polimerach.
O S M O T Y C Z N E S Y S T E M Y T E R A P E U T Y C Z N E
Osmotyczne systemy terapeutyczne działają na zasadzie aktywnego wypychania roztworu substancji czynnej ze zbiornika. Siły napędowej dla tego procesu dostarcza ciśnienie osmotycz ne. Pompki tego typu są produkowane przez kilka firm, lecz najpowszechniej są używane modele Alzet® firm y ALZA Corp. (J a n ic k i
1987a).
BUDOWA I ZASADA DZIAŁANIA MINIPOMPKI ALZET
Budowa minipompek osmotycznych będzie omówiona na przykładzie produktów firmy AL ZA. Osmotyczne pompki Alzet są miniaturowy mi systemami, które uwalniają substancję do środowiska w sposób ciągły, z kontrolowaną szybkością. Ilość substancji uwolnionej w jed nostce czasu zależy od jej stężenia w
minipom-pce. Pompki zaprojektowano dla środowiska płynu fizjologicznego o temp. 37°C i osmolarno- ści 310 miliosmoli/1 (ciśn. osmotyczne 7,5 atm). Producent podaje wzory pomocne w obliczeniu szybkości pompowania w zależności od aktual nych wartości temperatury i ciśnienia osmoty- cznego (Technical Information Manuał 1995). Ze względu na różnorodność zwierząt laborato ryjnych (gryzonie, koty, psy) spotykamy obecnie duży wybór rozmiarów minipompek. Pompka Alzet jest zbudowana (ryc. 1. ) z trzech koncen trycznych warstw: zbiornika substancji leczni czej, zbiornika substancji osmotycznie czynnej i elastycznej błony półprzepuszczalnej (J a n ic k i
1987a; Technical Information Manuał 1995). Po zaimplantowaniu systemu do organizmu wo da zawarta w płynie śródtkankowym, przenika jąc przez ścianę pompki, rozpuszcza substancję
Ryc. 1. Schemat budowy minipompki os- motycznej Alzet.
A) napełniona pompka gotowa do implantacji. B) wypychanie roztworu substancji czynnej pod wpływem ciśnienia atmosferycznego.
osmotycznie czynną, wzrasta ciśnienie pomię dzy dwoma wewnętrznymi zbiornikami i nastę puje odkształcenie elastomeru, co powoduje wypchnięcie substancji leczniczej przez kapila- rę. Konstrukcja pompki pozwala na użycie sze rokiej gamy rozpuszczalników (tab. 1). Mini- pompki są powszechnie używane do miejscowe go podawania rozmaitych związków do organi zmu zwierząt. Zestawione w tabeli 2. związki dają częściową orientację w różnorodności sub stancji stosowanych w badaniach.
PRZYGOTOWANIE I IMPLANTACJA MINIPOMPEK ALZET
W celu sprawdzenia prawidłowego działania minipompki, po złożeniu całego zestawu (tj. połączeniu pompki z kaniulą elastycznym wę żykiem) i napełnieniu roztworem substancji aktywnej, można go zanurzyć w naczyniu z buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) i inkubować przez całą noc w temperatu rze ciała zwierzęcia. Baczną uwagę należy zwró cić na wybór miejsca implantacji (badania
włas-Tabela 1. Niektóre rozpuszczalniki używane w mini- pomkach Alzet
woda destylowana
izotoniczny roztwór NaCl (i inne roztwory wodne soli) roztwór Ringera (z lub bez kwasu mlekowego) 5% dekstroza (w wodzie lub NaCl)
etanol (do 10% w wodzie) DMSO (do 50% w wodzie) 2% Tween w wodzie
glikol polietylenowy 300 (czysty lub w wodzie) glikol propylenowy (czysty lub w wodzie) glicerol
rozcieńczone zasady (pH < 1 4 ) rozcieńczone kwasy (pH >1,8)
podłoża hodowlane (zawierające 1% alkoholu benzylo- wego jako bakteriostatyk)________________________________
ne). Pompka nie może utrudniać ruchów ani prowokować zwierzęcia do usunięcia implantu. Istotnym problemem jest również długość i ela styczność wężyka łączącego pompkę z kaniulą
Tabela 2. Przykłady substancji czynnych podawanych w minipompkach Alzet
S u b s t a n c ja M ie js c e p o d a n i a Z w ie r z ę L i t e r a t u r a Ś r o d k i p s y c h o t r o p o w e : p r z e c iw d e p r e s y j n e p o d s k ó r n i e s z c z u r (To d d i w s p ó ł a u t . 1 9 9 5 ) u z a le ż n ia ją c e d o r d z e n io w o s z c z u r (l e v y i w s p ó ł a u t . 1 9 9 4 ) p o d s k ó r n i e s z c z u r (Ma l in i w s p ó ł a u t . 1 9 9 4 , Fa c t o r i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 , Nie l s e n 1 9 8 1 ) d o k o m o r o w o s z c z u r (Ro t h m a n i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) p o d s k ó r n ie p ie s (Yo s h i m u r a i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) r o g ó w k a k o t (COLASANTI 1 9 9 0 ) 2 - t y g . z a r o d e k k u r a d o m o w a (Se r a n i Sp a r b e r 1 9 9 8 ) b e n z o d i a z e p i n y p o d s k ó r n i e m y s z (To r c h in i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) S u b s t a n c je p e p t y d o w e : o p io id y d o k o m o r o w o s z c ż u r (Ro t h m a n i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) c z y n n ik i w z r o s t o w e z a k r ę t z ę b a t y s z c z u r (Ba r o n e, J r . i w s p ó ł a u t . 1 9 9 1 ) e n z y m y i b i a ł k a d o ż y ln ie p ie s (Al b in o Te ix e i r a i w s p ó ł a u t . 1 9 9 0 ) z a k r ę t z ę b a t y s z c z u r (Ba r o n e, J r . i w s p ó ł a u t . 1 9 9 1 ) h o r m o n y d o k o m o r o w o s z c z u r (Ik e g a m i i w s p ó ł a u t . 1 9 9 2 ) p o d s k ó r n ie s z c z u r (McDa n i e l i w s p ó ł a u t . 1 9 8 9 a ,b ) n e u r o m o d u la t o r y d o o t r z e w n o w o s z c z u r (Cr a w l e y i Be in f e l d 1 9 8 3 ) d o k o m o r o w o (Ca t z e f l i s i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) N e u r o p r z e k a ż n ik i i j ą d r o n a d s k r z y ż o w a n io w e s z c z u r (It o w i i w s p ó ł a u t . 1 9 9 8 ) n e u r o m o d u la t o r y c ia ł o m ig d a ł o w a t e s z c z u r (Br a d b u r y i w s p ó ł a u t . 1 9 8 5 ) n is k o c z ą s t e c z k o w e p o d s k ó r n i e s z c z u r (Jo h n s o n i w s p ó ł a u t . 1 9 8 3 ) d o ż y ln ie p ie s (Al b in o Te ix e i r a i w s p ó ł a u t . 1 9 9 0 ) j ą d r o p ó łle ż ą c e m a r m o z e t a (Ba r n e s i w s p ó ł a u t . 1 9 8 7 ) P r e p a r a t y b io l o g i c z n e z a k r ę t z ę b a t y s z c z u r (Ba r o n e, J r . i w s p ó ł a u t . 1 9 9 1 ) T o k s y n y i n e u r o t o k s y n y ś lim a k ś w in k a m o r s k a (Br o w n i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) p o d s k ó r n ie s z c z u r (Be n n e t i Ro s e 1 9 9 2 ) p r ą ż k o w ie s z c z u r (Ba z z e t t i w s p ó ł a u t . 1 9 9 3 ) S t e r o id y p o d s k ó r n ie s z c z u r (VlJAYAN i COTMAN 1 9 8 7 )
umieszczoną wewnątrz lub w pobliżu docelowej struktury lub tkanki. Wężyk powinien być tak dobrany, by podczas ruchu zwierzęcia nie na stąpiło odłączenie od pompki lub wyrwanie ka niuli z miejsca podania.
Pompki osmotyczne mogą być wszczepiane podskórnie, a u większych zwierząt także do- otrzewnowo. Tabela 3 przedstawia główne drogi podawania substancji czynnych.
WADY MINIPOMPEK
Pomimo licznych zalet minipompek można dostrzec również niekorzystne cechy tego syste mu podawania. Wypływ płynu z kaniuli do kory mózgowej powoduje w tkance mózgowej znacz ną nekrozę z utratą licznych neuronów i na- mnażaniem się komórek glejowych ( B e a r i
współaut. 1990, J a b ł o ń s k a i współaut. 1993). Na obrazach autoradiograficznych, które otrzy mano ze skrawków mózgów znakowanych
Tabela 3. Główne drogi podania minipompką Alzet podskórnie
dootrzewnowo
do jam ciała (np. komory mózgu, rdzeń kręgowy, pęcherz moczowy, jelito)
m iejscow a m ikroperfuzja tkanki (np. mózg, płytka nerw ow o-m ięśniow a, n erw y obw odow e, kość, oko, mięśnie, jądra, jajnik, śledziona)_________________________
[14C]deoksyglukozą, obserwowano spadek po bierania 2-DG w promieniu 3 mm wokół kaniu li, co sugerowało spadek aktywności metabo licznej tkanki w tej okolicy.
Poza tym, w przypadku podawania białek, fakt, że długi czas przebywają one w środowisku wodnym, może powodować zmniejszenie ich aktywności biologicznej. W wilgotnym środowi sku i w temperaturze 37°C mogą one denaturo wać lub ulegać agregacji.
DYFUZYJNE SYSTEMY TERAPEUTYCZNE
Jedną z klas systemów dyfuzyjnych są po staci oparte na hydrofobowych, nie ulegających degradacji polimerach. Otrzymywane są one w wyniku inkorporacji substancji czynnej w noś niku opóźniającym uwalnianie (J a n ic k i 1987b).
Spośród licznych podłoży nierozpuszczal nych niektóre mają szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych. Obecnie dość po wszechnie jest używana żywica syntetyczna El- vax® (DuPont Co., Wilmington, Delaware) — kopolimer octanu winylu z etylenem. Fakt uży cia żywicy polimerycznej jako czynnika uwal niającego substancje aktywne, a tym samym wprowadzenie do organizmu dodatkowej sub stancji obcej, skłonił wielu badaczy do dokład nego przeanalizowania biologicznych właściwo ści nośnikowych polimerów. L a n g e r i F o lk m a n
(1976) porównywali pod tym względem rozmaite substancje (poliakrylamid, poliwinylopirolidon, alkohol poliwinylowy, polimeryczny hydro- ksymetakiylan oraz kopolimer etylenu z octa nem winylu). Próbki polimeru wszczepiano w rogówkę królika i obserwowano w ciągu miesią ca ewentualne objawy reakcji zapalnej (obrzęk, naciek leukocytów, tworzenie naczyń). Spośród badanych substancji tylko prawidłowo przygo towany Elvax (patrz niżej) nie powodował takich reakcji.
Sporządzenie syntetycznych macierzy za wierających białka wymaga zmodyfikowania procesów przygotowania w celu zminimalizowa nia możliwości utraty ich aktywności. L a n g e r i
F o lk m a n (1976) pokazali, że wyeliminowanie
wody z procedury przygotowywania implantów umożliwia długotrwałe podawanie substancji białkowych z zachowaniem ich pełnej aktywno ści. Wykazali też, że mimo tak długo trwającego wypłukiwania, białka w warunkach in vitro nie tracą swych biologicznych właściwości zacho wując aktywność nawet przez 100 dni. Także tiofosforanowe analogi oligodeoksynukleoty- dów o długości 15 zasad nie wykazywały śladów degradacji w ciągu 3-tygodniowego uwalniania in vitro ( S z k l a r c z y k A. i KACZM AREk L., dane nie opublikowane).
Przykładem wykorzystania tej klasy syste mów terapeutycznych w medycynie może być preparat Actisite zawierający antybiotyk — chlorowodorek tetracykliny, opracowany do zwalczania chorób okołozębowych. Są to włók na Elvaxu nasycone antybiotykiem. Umieszcze nie ich w kieszonce dziąsłowej przy zębie umo żliwia skuteczną terapię używając ponad 1000- krotnie mniejszej dawki substancji leczniczej niż w metodzie tradycyjnej ( L a n g e r 1990, D o n
l e y i P e a r l s t e i n 1993). W tabeli 4 zestawiono
wszystkie dotychczasowe próby wykorzystania implantów Elvaxu w badaniach funkcjonowa nia układu nerwowego.
PRZYGOTOWANIE ŻYWICY ELVAX
S i l b e r s t e i n i D a n i e l (1982) opracowali do kładną procedurę przygotowania żywicy Elvax. Procedura ta została wkrótce zmodyfikowana przez C l i n e ’a i współpracowników (1987). Od tej
Tabela 4. Substancje czynne podawane w implantach Elvax P o d a w a n a s u b s t a n c ja M ie js c e p o d a n ia Z w ie r z ę L i t e r a t u r a A P V , C P P p o k r y w a w z r o k o w a ż a b a (Sc h e r e r i Ud in 1 9 8 9 ) A P V k o r a s o m a t o s e n s o r y c z n a m y s z (Ja b ł o ń s k a i w s p ó ł a u t . 1 9 9 5 ) A P V , M K - 8 0 1 w z g ó r e k g ó r n y t c h ó r z o f r e t k a (Sc h n u p p i w s p ó ł a u t . 1 9 9 5 ) N M D A , A P V , M K - 8 0 1 p o k r y w a w z r o k o w a k ija n k a , m ł o d a ż a b a ( Cl in e i Co n s t a n t in e Pa t o n 1 9 9 0 a ) j o d e k fo s f o lin y k o r a w z r o k o w a s z c z u r (Lin g i w s p ó ł a u t . 1 9 9 5 ) t e t r o d o t o k s y n a n e r w s ł u c h o w y g e r b il (Pa s ic i Ru b e l 1 9 8 9 ) t io f o s f o r a n o w e a n a lo g i o lig o - d e o k s y n u k le o t y d ó w k o r a c z o ł o w a s z c z u r (Sz k l a r c z y k A . i Ka c z m a r e k L ., d a n e n i e o p u b lik o w a n e ) s f in g o z y n a H - 7 e s t i y fo r b o lu p o k r y w a w z r o k o w a k ija n k a (Cl in e i Co n s t a n t in e Pa t o n 1 9 9 0 b ) la m in ia n e r w k u l s z o w y s z c z u r (Po l it is 1 9 8 9 ) k o la g e n t y p u I V n e r w w z r o k o w y s z c z u r m e lin a a k s o le m m a h o m o g e n a t c a łe g o m ó z g u w y c i ą g z w ą t r o b y w y c i ą g e r y t r o c y t ó w n e r w w z r o k o w y s z c z u r (Po l it is 1 9 8 8 ) e k s t r a k t z s ia t k ó w k i n e r w k u ls z o w y s z c z u r (Po l it is 1 9 8 6 ) h o m o g e n a t z u s z k o d z o n e g o n e r w u n e r w w z r o k o w y s z c z u r (Po l it is i Mil l e r 1 9 8 5 )
pory większość użytkowników tego systemu wy korzystuje ich metodykę.
Z uwagi na to, że granulki surowej żywicy zawierają substancje obce (np. przeciwutle- niacz butylohydroksytoluen), istotne jest na wstępie dokładne wypłukanie żywicy polimeru w wodzie i alkoholu absolutnym. Mycie zapo biega wystąpieniu reakcji zapalnej w miejscu implantacji (La n g e r i Fo l k m a n 1976).
Przygotowanie właściwych implantów skła da się z dwu etapów — mieszania i suszenia. Sposób przeprowadzenia obu z nich ma podsta wowe znaczenie dla fizykochemicznych i farma- kokinetycznych właściwości preparatu.
Wyjściowym surowcem jest 10% roztwór El- vaxu w chlorku metylenu. Substancję inkor- porowaną dodaje się do niego bądź w formie stężonego roztworu (w wodzie lub DMSO)
(Sm it h i współaut. 1995) bądź w postaci suche
go proszku (np. białka) (Rh in e i współaut. 1980)
otrzymując roztwór przygotowawczy. Następnie za pomocą wytrząsarki wytwarza się emulsję (lub odpowiednio — zawiesinę), którą natych miast wylewa się na płytkę szklaną lub na dno małego naczynka w temperaturze suchego lo du. Zapobiega to rozwarstwianiu faz i sedymen tacji zawieszonych cząstek. Taka preparatyka dawała także większą powtarzalność parame trów uwalniania in vitro.
S u s z e n ie p r z e p r o w a d z a s ię r ó w n ie ż w n i sk ie j te m p e r a tu r z e — p r e p a r a t m u s i p o z o s t a w a ć p r z e z 2 d n i w te m p e r a t u r z e - 7 0 ° C (Sm it h i
współaut. 1995) lub -20°C (Rh in e i współaut.
1980). Następnie liofilizuje się go lub suszy w niskiej próżni w celu usunięcia resztek rozpu szczalników. W ten sposób otrzymuje się zesta lony materiał zawierający rozproszone w poli merze ziarna substancji.
Gotowy produkt można następnie ciąć na mniejsze cząstki, a nawet na cienkie skrawki w kriostatowym mikrotomie, chłodząc dodatkowo polimer suchym lodem (badania własne).
KINETYKA UWALNIANIA SUBSTANCJI CZYNNEJ
Mimo dużej liczby publikacji opisujących wykorzystanie implantów z żywicy Elvax, tylko kilka prac dotyczy fizykochemicznej i farma- kokinetycznej strony zagadnienia. Na przełomie lat 70-tych i 80-tych zespół Langera zajmował się uwalnianiem białek (La n g e r i Fo l k m a n
1976, Rh in e i współaut. 1980). Kilkanaście lat
później uwalnianie związków niskocząsteczko- wych opisali szczegółowo Sm it h i współautorzy
(1995).
Przebieg czasowy uwalniania makrocząste czek z macierzy Elvax ma charakterystyczny profil (Rh in ei współaut. 1980) i można wyróżnić
w nim 3 fazy (ryc. 2. ):
I — okres początkowy (gwałtowne uwalnia nie);
II — okres pośredni (uwalnianie ze względ nie stałą szybkością);
Ryc. 2. Przebieg uwalniania substancji z żywicy Elvax. I — faza gwałtownego uwalniania, II — faza ustalonego wypłukiwania, III — faza zanikowa procesu.
Kinetyka uwalniania jest silnie uzależniona od postępowania na wszystkich etapach prepa ratyki. Wzrost stężenia wyjściowego roztworu Elvaxu w znaczny sposób obniża prędkość uwalniania się białka (którym był inhibitor try- psyny z soi o masie cząsteczkowej 21 kDa;
L a n g e r i F o lk m a n 1976). Również rodzaj roz
puszczalnika stosowanego do zawieszania związków niskocząsteczkowych modyfikuje profil czasowy uwalniania (ryc. 3.; S m ith i
współaut. 1995). Użycie DMSO w preparatyce powoduje, iż profil uwalniania ma w przybliże niu charakter wykładniczego spadku, zaś za stosowanie roztworu wodnego daje początkowy silny wyrzut (ok. 2 dni) po czym, w ciągu jedne go tygodnia, poziom uwalniania ustala się i trwa nie zmieniony przez 2 miesiące.
Wielkość zawieszonych ziaren białka i względna ich zawartość w roztworze przygoto wawczym mają duży wpływ na uwalnianie. Wzrost względnej zawartości białka istotnie wzmaga szybkość uwalniania, jak również jego sprawność (tj. procent substancji uwolnionej
czas
Ryc. 3. Wpływ rodzaju rozpuszczalnika użytego pod czas preparatyki na przebieg procesu uwalniania sub stancji z macierzy Elvax.względem zawartości początkowej). Także im większe rozmiary ziaren substancji zawieszo nej, tym silniejsze jej uwalnianie. Zależność ta jest najsilniej wyrażona w zakresie zawartości 25-37,5% (R h in e i współaut. 1980). Podobne obserwacje poczyniono dla związków niskoczą steczkowych, aczkolwiek zależność nie była tak znaczna (S m ith i współaut. 1995), przy czym
silniej zaznaczona w przypadku macierzy su szonej w niskiej próżni.
Sposób dosuszania to kolejny punkt mający duże znaczenie dla stabilności i powtarzalności parametrów uwalniania. Macierz suszona w ni skiej próżni uwalnia inkorporowaną substancję szybciej niż bardziej obkurczona macierz liofili zowana. Początkowy wyrzut substancji jest bar dzo obfity i w tym okresie macierz traci wię kszość zawartej w niej substancji. Z kolei uwal nianie z liofilizowanych skrawków w małym stopniu zależy od grubości skrawków (S m ith i
współaut. 1995).
Pokrycie polimeru zawierającego substancję czynną przez warstwę czystej żywicy znacznie opóźniało proces uwalniania. Należy pamiętać, że szybkość uwalniania zależy silnie od rozpu szczalności substancji w płynie śródtkanko-
wym (S m ith i współaut. 1995).
MECHANIZMY UWALNIANIA SUBSTANCJI Z ŻYWICY ELVAX — HIPOTEZY
Mechanizm uwalniania substancji z żywicy nie jest dostatecznie wyjaśniony. Istnieją przy puszczenia, że substancja uwalnia się na dro dze dyfuzji. Wniknięcie cieczy (płynu śródtkan- kowego) do macierzy jest niezbędnym warun kiem procesu prawidłowego uwalniania sub stancji. Efekt początkowego wyrzutu substancji wynika prawdopodobnie z rozpuszczania się cząstek zagnieżdżonych na powierzchni skraw ków. Trudno wyjaśnić kontrowersje co do wiel kości rzędu kinetyki uwalniania w fazie pośred niej. Ten sam zespół badaczy podaje dla białek albo rząd 0 ( L a n g e r i F o lk m a n 1976) albo rząd
1/2 (R h in e i współaut. 1980). Makrocząsteczki
są zbyt duże, by mogły przenikać bezpośrednio przez błonę czystego polimeru ( L a n g e r i F o l k
m an 1976), jest możliwe zatem, iż stałe uwalnia
nie zachodzi na drodze dyfuzji przez kanały w macierzy. Kanały te powstają prawdopodobnie podczas preparatyki i początkowo są wypełnio ne zawieszoną substancją tworzącą kręte łań cuchy stykających się ziaren (ryc. 4. ). Po roz puszczeniu ziaren znajdujących się na powierz chni następuje stopniowe rozpuszczanie ziaren tworzących owe łańcuchy i dyfuzja cząsteczek substancji na zewnątrz kanału. Teraz szybkość dyfuzji ustala się na pewnym
charakterystycz-nym poziomie. Substancja uwalnia się aż do wyczerpania. Z powodu znikomej przepuszczal ności polimeru dla wody ziarna tkwiące samo tnie w macierzy nie ulegają rozpuszczaniu.
Istotną rolę przypisuje się także zjawiskom kapilarnym oraz ciśnieniu osmotycznemu wypychającemu osadzone wewnątrz macierzy cząsteczki, ze względu na nikłą lecz istniejącą przepuszczalność dla wody ( L a n g e r i F o lk m a n
1976).
Wzrost szybkości uwalniania substancji wraz ze wzrostem wielkości cząstek tłumaczy się większą średnicą kanałów oraz porów po wstałych w macierzy polimeru. Podobnie wię ksza zawartość zawieszanych cząstek prowadzi do wytworzenia większej liczby mniej krętych kanałów, a zatem większej porowatości macie rzy, co poprawia migrację wody do wnętrza
ZASTOSOWANIE W
Opisane wyżej systemy kontrolowanego uwalniania zaczęto stosować w neurobiologii doświadczalnej na przełomie lat 70-tych i 80- tych. Jako pierwsze do użytku weszły mini- pompki osmotyczne, które zastosowano w ba daniach nad uzależnieniem od psychostymu- lantów ( N i e l s e n 1981) oraz działaniem tych substancji na układ dopaminergiczny w zależ ności od fazy aktywności dobowej ( B u r g e r i
M a r t i n I v e r s o n 1993). Zagadnienia związane z
uzależnieniem, tolerancją i odstawieniem ana
lizowano także później w odniesieniu do opia-
tów (S e r a n i S p a r b e r 1988, Y o s h im u r a i współ
aut. 1993, R o t h m a n i współaut. 1993, W e l i n i
współaut. 1994) oraz nikotyny (Y a n g i współaut.
1992, F u n g i L a u 1992, M a l i n i współaut. 1993,
M a l i n i współaut. 1994). Badano także mecha
nizmy układu nagrody, który przypuszczalnie
Uwalnia się ona jedynie z zia ren p ow ierzchniow ych oraz łańcuchów mających kontakt z powierzchnią skrawka. Ziarna i łańcuchy ziaren zamknięte całkowicie w macierzy polime ru nie ulegają rozpuszczaniu przez płyn śródtkankowy.
macierzy i dyfuzję rozpuszczonych cząsteczek na zewnątrz.
Powlekanie macierzy warstwą czystego poli meru zmniejsza liczbę cząstek eksponowanych na powierzchni skrawka oraz zmniejsza dostę pność porów.
Różnice w szybkości uwalniania substancji, zależne od metody dosuszania, tłumaczy się zróżnicowaną zwartością macierzy, która ściś nięta podczas liofilizacji dostatecznie izoluje ziarna inkorporowanej substancji od rozpusz czalnika (S m ith i współaut. 1995). Dzięki temu uwalnianie nieznacznie zależy od grubości skrawka. W przypadku suszenia w niskiej próż ni luźniejsza macierz umożliwia względnie swo bodną penetrację wodnego rozpuszczalnika i szybsze wymywanie substancji.
NEUROBIOLOGII
jest związany ze zjawiskiem uzależnienia ( B a r
n e s i współaut. 1987). W celu określenia wpły
wu środków uzależniających na płód, na przy kład kokainy na rozwój neurochemiczny jąder szwu ( F a c t o r i współaut. 1993) oraz metadonu na rozwój układu bólowego ( E n t e r s i współaut. 1991), pompki implantowano u ciężarnych sa mic szczurów. Inne zagadnienia neuro- i psy- chofarmakologii również wymagają tego sposo bu podawania substancji czynnych. Po długo trwałym podawaniu substancji leczniczych za
pomocą minipompek
badano zmiany wpo
szczególnych układach neuroprzekaźnikowych
( B a r b e r i współaut. 1989, Cox i współaut.
1991, P a e t s c h i G r e e n s h a w 1993, T o d d i współaut. 1995) oraz lateralizację funkcji ukła du dopaminergicznego w ciele migdałowatym
( B r a d b u r y i współaut. 1985). Minipompki
po-Ryc. 4. Powstawanie łańcu chów złożonych z ziaren in korporowanej substancji.
służyły jako dogodne narzędzie do przeanalizo wania rozwoju tolerancji na przeciwdrgawkowe działania benzodiazepin ( T o r c h i n i współaut. 1993). Przy okazji stwierdzono, iż najlepszym do tego rodzaju badań nośnikiem jest tetragli- kol, w przeciwieństwie do innych substancji nośnikowych (PEG400, glikol propylenowy, Tween, DMSO, sól fizjologiczna, Molecusol i metyloceluloza), które wykazują działanie pro- konwulsyjne. W neuroendokrynologii doświad czalnej pompki używano w badaniach wpływu TRH i jego metabolitów na funkcję układu dopa- minergicznego w podwzgórzu (Ik e g a m i i współ aut. 1992, J i k i h a r a i współaut. 1993), a także
wpływu naltreksonu na unerwienie pośrednie go płata przysadki nerwowej (S a la n d i współ
aut. 1990).
Długotrwałe podawanie substancji czyn nych tą metodą stosowano w badaniach nad wpływem blokowania wychwytu zwrotnego mo- noamin na dobową rytmikę aktywności u roz wijających się szczurów ( B a r b e r i współaut.
1989) oraz w badaniach nad fizjologią zacho wań pokarmowych (H o s k in s i Ho 1986, S c h i c k
i współaut. 1988, I t o w i i współaut. 1988, E c k e l
i O s s e n k o p p 1993, C a t z e f l i s i współaut. 1993,
V a n d e r M e e r i współaut. 1995) i seksualnych
(Y o n e z a w a i współaut. 1992).
Pierwsze zastosowania implantów opartych na żywicy Elvax pojawiły się w neurobiologii w połowie lat 80-tych, początkowo w badaniach nad regeneracją w ośrodkowym ( P o l i t i s 1986, 1989) i obwodowym ( P o l i t i s i M i l l e r 1985,
P o l i t i s 1988, 1989) układzie nerwowym. W ba
daniach tych stosowano w dalszym ciągu rów nież minipompki osmotyczne ( B o r z e i x i współ aut. 1988). Doświadczenia dotyczące szeroko rozumianej plastyczności układu nerwowego wymagają często długotrwałych podań. Zasto sowanie implantów Elvaxu (J a b ł o ń s k a i współ
aut. 1995, S c h n u p p i współaut. 1995) oraz
mi-nipompek ( B r o w n i współaut. 1993) opisano w
pracach związanych z badaniem zmian plasty cznych korowych map czuciowych i słucho wych, plastyczności rozwojowej drogi wzroko wej u żab ( S c h e r e r i U d in 1989, C l i n e i C o n s t a n t i n e P a t o n 1990a, b) i szczurów (L in g i współaut. 1995), jak również przy badaniu skutków długotrwałego zablokowania aferenta- cji słuchowej w jądrze ślimakowym (P a s ic i
R u b e l 1989) (oba z użyciem Elvaxu). Należą tu
również zagadnienia pamięci i uczenia, w któ rych wykorzystano minipompki ( M c D a n i e l i współaut. 1989a, b, B a r o n e , Jr. i współaut.
1991, B e n n e t t i R o s e 1992). Omawiane syste
my są używane również w badaniach funkcjo nowania obwodowego układu nerwowego, na przykład kontroli akcji serca (J o h n s o n i współ
aut. 1983, A l b i n o T e i x e i r a i współaut. 1990).
Podsumowując, systemy długotrwałego kontrolowanego podawania można stosować wszędzie tam, gdzie są badane skutki długo trwałego podawania substancji, między innymi w farmakoterapii doświadczalnej (patrz wyżej, oraz np. M c C a l l u m i współaut. 1986, C o l a s a n t i
1990) oraz tam, gdzie bada się mechanizmy zjawisk o wolnej dynamice przebiegu, na przy kład rozwój lub plastyczność (patrz wyżej). Sy stemy te stosuje się również w celu stworzenia doświadczalnych modeli pewnych stanów pato logicznych, na przykład choroby Huntingtona
(R ie k e i współaut. 1989, B a z z e t t i współaut.
1993), wewnątrzmózgowego odczynu zapalnego
( S a la n d i współaut. 1984) oraz uzależnienia
lekowego ( N i e l s e n 1981, M a l i n i współaut.
1994, W e l i n i współaut. 1994).
Autorzy dziękują. Profesor Jolancie Skan- giel-Kramskiej i Profesor Małgorzacie Kossut za cenne uwagi podczas przygotowywania artyku łu.
METHODS OF SUSTAINED DRUG DELIVERY IN EXPERIMENTAL BIOLOGY S u m m a ry
This review is an attempt to summarize the sustained delivery of drugs into animal tissues and organs. Two controlled release systems commonly used in experimental biology are discribed and discussed with respect to their
usefulness: the osmotic Alzet minipumps used so far, and new, implantable sustained-release polymer-based sys tems.
LITERATURA
Al b in o Te i x e ir aA., Az e v e d oI., Br a n c oD., Os s w a l dW., 1990.
Purine agonists prevent trophic changes caused by sym pathetic denervation. Eur. J. Pharmacol. 179, 141-149.
Ba r b e rN. I., Te ic h e rM. H., Ba l d e s s a r in iR. J., 1989. Effects
o f selective monoaminergic reuptake blockade on activ ity rythms in developing rats. Psychopharmacology
Berl. 97, 343-348.
Ba r n e s N . J . , Co s t a l lB ., Do m e n e y A . M ., Na y l o r R . J . , 1987.
Behavioural consequences o f the infusion o f dopamine into the nucleus accumbens o f the common marmoset (Callithrix jacchus). Neuropharmacology 26, 1327-
1335.
Ba r o n eS., Jr., Ta n d o nP., McGin t yJ. F., Til s o nH. A., 1991.
learning after intradentate administration o f colchicine.
Exp. Neurol. 114, 351-363.
Ba z z e t t T . J ., Be c k e r J . B ., Ka a t z K . W ., Al b in R . L „ 1993.
Chronic intrastriatal dialytic administration o f quinolinic acid produces selective neural degeneration. Exp. Neu
rol. 120, 177-185.
Be a r M. F., Kl e in s c h m i d t A., Gu Q. A., Si n g e rW., 1990.
Disruption o f experience-dependent synaptic modifica tions in striate cortex by infusion o f an NMDA receptor antagonist J. Neurosci. 10, 909-925.
Be n n e t t M. C., Ro s e G. M., 1992. Chronic sodium azide
treatment impairs learning o f the Morris water maze task. Behav. Neural Biol. 58, 72-75.
Bo r z e ix M. G., Ca h n R., Ca h n J ., 1988. Effects o f new
chemically and metabolically stable prostacyclin anal ogues (iloprost and ZK 96480) on early consequences o f a transient cerebral oligemia, in the rat. Prostaglandins
35, 653-664.
Br a d b u r y A. J., Co s t a l l B., Do m e n e yA. M., Na y l o r R. J.,
1985. Laterality o f dopamine function and neuroleptic
action in the amygdala in the rat. Neuropharmacology
24, 1163-1170.
Br o w n J . N ., Mil l e r J . M ., Al t s c h u l e r R . A ., Nu t t a l l A . L .,
1993. Osmotic pump implant fo r chronic infusion o f
drugs into the inner ear. H e a r . R e s . 70, 167-172.
Bu r g e r L. Y. i Ma r t i n Iv e r s o n M. T., 1993. Day/night
differences in D l but notD 2 DA receptor protection from EEDQ denaturation in rats treated with continuous co caine. Synapse 13, 20-29.
Ca t z e f l is C., Pie r r o zD. D., Ro h n e r Je a n e r e n a u d F., Rtvie r
J. E., Siz o n e n k oP. C., Au b e r tM . L., 1993. Neuropeptide
Y administered chronically into the lateral ventricle pro foundly inhibits both the gonadotropic and the somato tropic axis in intact adult fem ale rats. Endocrinology
132, 224-234.
Cl in e H. T., Dę b s k i E. A., Co n s t a n t in e Pa t o n M., 1987.
N-methyl-D-aspartate receptor antagonist desegregates eye-specific stripes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,
4342-4345.
Cl in e H. T., Co n s t a n t in e Pa t o n M., 1990a. NMDA receptor
agonist and antagonists alter retinal ganglion cell arbor structure in the developing frog retinotectal projection. J.
Neurosci. 10, 1197-1216.
Cl in e H . T ., Co n s t a n t in e Pa t o n M ., 1990b. The differential
influence o f protein kinase inhibitors on retinal arbor morphology and eye-specific stripes in the frog retinotec tal system. Neuron 4, 899-908.
Co l a s a n t iB . K., 1990. A comparison o f the ocular and central
effects o f delta 9-tetrahydrocarmabinol and cannabige- rol. J. Ocul. Pharmacol. 6, 259-269.
Cox M., Ga r r ic kN., Re it eM., Ge n n a r oM., 1991. Minipump
clorgyline administration and CSF amine metabolites in unrestrained monkeys. Pharmacol. Biochem. Behav.
38, 677-679.
Cr a w l e yJ. N., Be in f e l d M. C., 1983. Rapid development o f
tolerance to the behavioural actions o f cholecystokinin.
Nature 302, 703-706.
De n v e rR. J., 1993. Acceleration ofanuran amphibian meta
morphosis by corticotropin-releasing hormone-like pep tides. Gen. Comp. Endocrinol. 91, 38-51.
Do n l e y T. G., Pe a r l s t e in M. E., 1993. Intrapocket tetracy
cline release in periodontal therapy. Gen. Dent. 41,
61-65.
Ec k e lL. A., Os s e n k o p pK. P., 1993. Nouel diet consumption
and body weight gain are reduced in rats chronically infused with lithium chloride: Mediation by the chemosen- sitive area postrema. Brain Res. Bull. 31, 613-619.
En t e r sE. K., Gu oH. Z., Pa n d e yU., KoD. J., Ro b in s o nS. E.,
1991. The effect o f prenatal methadone exposure on
development and nociception during the early postnatal period o f the rat. Neurotoxicol. Teratol. 13, 161-166.
Fa c t o rE. M., Ha r tR. P., Jo n a k a itG. M., 1993. Neurochemi
cal development o f the raphe after continuous prenatal cocaine exposure. Brain Res. Bull. 31, 49-56.
Fr e e m a n K., Lu d in g t o nJ. R., Jr., Sv e c T. A., Pin e r o G. J., Ho o v e rJ., 1994. Continuously infused calcium hydrox
ide: its influence on hard tissue repair. J. Endod. 20,
272-275.
Fu n g Y . K., La u Y . S., 1992. Chronic effects o f nicotine on
mesolimbic dopaminergic system in rats. Pharmacol.
Biochem. Behav. 41, 57-63.
Ho s k in s B., Ho I. K., 1986. Lack o f effect o f dynorphin on
consummatory behaviors in obese and normal rats. Life
Sci. 39, 589-593.
Ik e g a m i H„ Jik ih a r a H., Ko ik e K., Mo r is h ig e K., Ku r a c h i H., Ya m a m o t o N., Hir o t a K., Miy a k e A., Ta n iz a w a O., 1992.
Intraventricular administration o f thyrotrophin-releasing hormone (TRH) suppresses prolactin secretion and syn thesis: A possible involvement o f dopamine release by TRH from rat hypothalamus. J. Endocrinol. 133, 59-66.
It o w i N., Na g a i K ., Na k a g a w a H., Wa t a n a b eT., Wa d aH ., 19 8 8.
Changes in the feeding behavior o f rats elicited by histamine infusion. Physiol. Behav. 44, 221-226.
Ja b ł o ń s k aB., Gi e r d a l s k iM., Ku b l i kA ., Sk a n g ie l Kr a m s k aJ., Ko s s u tM ., 1993. Effects o f implantation o f Alzet 1007D
osmotic minipumps upon 2-deoxyglucose uptake in the cerebral cortex o f mice. Acta Neurobiol. Exp. 53, 577-
580.
Ja b ł o ń s k aB., Gie r d a l s k iM., Siu c iń s k aE., Sk a n g ie l Kr a m s k a
J., Ko s s u tM., 1995. Partial blocking o f NMDA receptors
restricts plastic changes in adult mouse barrel cortex.
Behav. Brain Res. 66, 207-216.
Ja n ic k i S., 1987a. Systemy terapeutyczne. [W:] Fie b ig A.
(red.) Farmacja stosowana. PZWL Warszawa, 194-195. Janicki S., 1987b. Tabletki [W :] F ie b ig A . (red.) Farmacja
stosowana. P Z W L Warszawa, 164-166.
Ji k ih a r a H., Ik e g a m i H., Ko ik e K., Wa d a K., Mo r is h ig e K., Ku r a c h i H., Hir o t a K., Miy a k e A., Ta n iz a w a O., 1993.
Intraventricular administration o f histidyl-proline-di- ketopiperazine [Cyclo(His-Pro)j suppresses prolactin se cretion and synthesis: a possible role o f Cyclo(His-Pro) as dopamine uptake blocker in rat hypothalamus. En
docrinology 132, 953-958.
Jo h n s o nM. D., Sm it hP. G., Mil l sE., Sc h a n b e r gS. M., 1983.
Paradoxical elevation o f sympathetic activity during catecholamine infusion in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther.
227, 254-259.
La n g e r R., 1990. New methods o f drug delivery. Science
249, 1527-1533.
La n g e r R., Fo l k m a n J., 1976. Polymers f o r the sustained
release o f proteins and other macromolecules. Nature
263, 797-800.
Le v yR ., Le i p h a r tJ ., Di l l sC ., 1994 Analgesic action o f acute
and chronic intraspinally administered opiate and alpha 2-adrenergic agonists in chronic neuropathic pain.
Stereotact. Funct. Neurosurg. 62, 279-289.
Lin gJ. J., Y u J., Ro b e r t s o n R . T., 1995. Sustained inhibition
o f acetylcholinesterase activity does not disrupt early geniculocortical ingrowth to developing rat visual cortex.
Brain Res. Dev. Brain Res. 86, 354-358.
Ma l in D. H., La k e J. R., Ca r t e r V. A., Cu n n in g h a m J. S., Wil s o n O. B., 1993. Naloxone precipitates nicotine ab
stinence syndrome in the rat. Psychopharmacology
Beri. 112, 339-342.
Ma l in D. H., La k e J. R., Ca r t e r V. A., Cu n n in g h a m J. S., He b e r tK. M., Co n r a d D. L., Wil s o n O. B., 1994. The
nicotinic antagonist mecamylamine precipitates nicotine abstinence syndrome in the rat. Psychopharmacology
Berl. 115, 180-184.
McCa l l u m K. N., Sh a r m aA. K., Bl a n c h a r d D. S., St r ib l in g
D., Mir r l e e sD. J., Du g u idI. G., Th o m a sP. K., 1986. The
effect o f continuous subcutaneous insulin infusion ther apy on morphological and biochemical abnormalities o f
peripheral nerves in experimental diabetes. J. Neurol.
Sci. 74, 55-67.
McDa n i e lW. F., Da v a l l E. J., Wa l k e r P. E., 1989a. ACTH
4-9 analog can retard spatial alternation learning in brain damaged and normal rats. Behav. Neural Biol.
52, 271-278.
McDa n i e lW. F., Wa t e r sP. E., Da v a l lE. J., 1989b. Arginine
vasopressin 4-9 retards spatial alternation learning.
Neuropeptides 14, 219-224.
Mo r r is R. G., An d e r s o n E., Ly n c h G. S., Ba u d r y M., 1986.
Selective impairment o f learning and blockade o f long term potentiation by an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP5. Nature 319, 774-776.
Nie l s e n E . B., 1 9 8 1 Rapid decline o f stereotyped behavior in rats during constant one week administration o f amphe tamine via implanted A LZET osmotic minipwnps. Phar
macol. Biochem. Behav. 15, 1 6 1 - 1 6 5 .
Pa e t s c h P. R., Gr e e n s h a w A. J., 1993. Down-regulation o f
beta-adrenergic and dopaminergic receptors induced by 2-phenylethylamine. Cell Mol. Neurobiol. 13, 203-215.
Pa s ic T. R., Ru b e l E. W., 1989. Rapid changes in cochlear
nucleus cell size follow ing blockade o f auditory nerve electrical activity in gerbils. J. Comp. Neurol. 283,
474-480.
Po l it isM. J., 1986. Retina-derived growth-promoting extract
supports axonal regeneration in vivo. Brain Res. 364,
369-371.
Po l it is M. J., 1988. Inhibition o f reactive gliosis in vivo by
exogenous axolemma and myelin fractions. Exp. Neu
rol. 100, 288-296.
Po l it isM. J., 1989. Exogenous laminin induces regenerative
changes in traumatized sciatic and optic nerve. Plast.
Reconstr. Surg. 83, 228-235.
Po l it is M . J., Mil l e rJ. E ., 1985. The roles o f reactive gliosis
and mitosis on tropic fa ctor production in traumatized nervous system tissue. Brain Res. 346, 186-189.
Rh in e W. D., Hs ie h D. S., La n g e r R., 1980. Polymers fo r
sustained macromolecule release: procedures to fa b ri cate reproducible delivery systems and control release kinetics. J. Pharm. Sci. 69, 265-270.
Rie k eG. K., Sm it hJ., Id u s u y iO. B., Se m e n y aJ., Ho w a r dR., Wil l ia m s S ., 1989. Chronic intrastriatal L-pyrogluta-
mate: neuropathology and neuron sparing like Hunting ton’s disease. Exp. Neurol. 104, 147-154.
Ro t h m a n R . B ., Br a d y L . S ., X u H ., Lo n g J . B ., 1 9 9 3 . Chronic intracerebroventricular infusion o f the antiopioid pep tide, Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2 (NPFF), downregulates mu opioid binding sites in rat brain.
P e p t id e s 14, 1 2 7 1 - 1 2 7 7 .
Sa l a n d L. C., Ortiz E., Sa m o r aA., 1984. Chronic infusion o f
opiate peptides to rat cerebrospinal f u id with osmotic minipumps. Anat. Rec. 210, 115-123.
Sa l a n d L. C., Re y e s E., Sa m o r a A., Gu t ie r r e z L., 1990.
Chronic naltrexone infusion: effects on innervation o f rat neurointermediate lobe. Brain Res. Bull. 24, 779-786.
Sc h e r e r W. J. i Ud in S. B., 1989. N-methyl-D-aspartate
antagonists prevent interaction o f binocular maps in Xenopus tectum. J. Neurosci. 9, 3837-3843.
Sc h ic k R. R., St e v e n s C. W., Ya k s h T. L., Go V. L., 1988.
Chronic intraventricular administration o f
cholecysto-kinin octapeptide (CCK-8) suppresses feeding in rats.
Brain Res. 4 4 8 , 2 9 4 - 2 9 8 .
Sc h n u p pJ. W., Kin gA. J., Sm it hA. L., Th o m p s o nI. D., 1995.
NMDA-receptor antagonists disrupt the form ation o f the auditory space map in the mammalian superior collicu lus. J. Neurosci. 15, 1516-1531.
Se r a nG. F., Sp a r b e rS. B., 1988. Metabolism o f methadone
by chicken embryos prevents induction o f chronic opioid- type dependence after a single injection: use o f osmotic pumps f o r continuous infusion. Pharmacol. Biochem.
Behav. 30, 357-363.
Si l b e r s t e in G. B., Da n i e lC. W., 1982. Elvax 40P implants:
sustained, local release o f bioactive molecules influenc ing mammary ductal development. Dev. Biol. 93, 272-
278.
Sm it hA. L., Co r d e r yP. M. .Th o m p s o n I. D., 1995. Manufac
ture and release characteristics o f Elvax polymers con taining glutamate receptor antagonists. J. Neurosci.
Methods 60, 211-217.
Technical Information Manual. ALZA Corp. (1995)
To d d K. G., McMa n u s D. J., Ba k e r G. B., 1995. Chronic
administration o f the antidepressants phenelzine, desi- pramine, clomipramine, or maprotiline decreases bind
ing to 5 -h yd roxytrypta m in e2 A receptors w ithout affecting benzodiazepine binding sites in rat brain. Cell
Mol. Neurobiol. 15, 361-370.
To r c h in C. D., Ka p e t a n o v ic I. M., Ku p e r b e r g H. J., 1993. A
system fo r testing the development and reversal o f anticonvulsant tolerance to benzodiazepines in mice.
Epilepsy Res. 16, 27-35.
Van der Me e rM. J., Sw e e pC. G., Pe s m a nG. J., Bo r mG. F., He r m u sA. R., 1995. Synergism between IL-1 beta and
TNF-alpha on the activity o f the pituitary-adrenal axis and on food intake o f rats. Am. J. Physiol. 268, E551-
E557.
Ve t u l a n iJ., St a w a r zR. J., Di n g e l lJ. V., Su l s e rF., 1976. A
possible common mechanism o f action o f antidepressant treatments: Reduction in the sensitivity o f the nora drenergic cyclic AM P gererating system in the rat limbic forebrain. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol.
293, 109-114.
Vij a y a nV. K., Co t m a n C. W., 1987. Hydrocortisone adminis
tration alters glial reaction to entorhinal lesion in the rat dentate gyrus. Exp. Neurol. 96, 307-320.
We l inM., Ha r r oJ., Yu k h a n a n o v R., Ny b e r g F., Or e l a n d L.,
1994. Cholecystokinin receptor binding in morphine an
algesia: tolerance, withdrawal and abstinence. Neuro
peptides 26, 379-383.
Ya n g C . Y ., Wu W . H ., Zb u z e k V . K ., 1 9 9 2 . Antinociceptive effect o f chronic nicotine and nociceptive effect o f its withdrawal measured by hot-plate and tail-flick in rats.
Psychopharmacology Berl. 1 0 6 , 4 1 7 - 4 2 0 .
Yo n e z a w aA., Ka w a m u r a S., An d o R., Ta d a n o T., Kis a r a K., Kim u r a Y ., 1992. Chronic clonidine treatment and its
termination: effects on penile erection and ejaculation in the dog. Life Sci. 51, 1999-2007.
Yo s h im u r aK., Ho r iu c h iM., Ko n is h iM „ Ya m a m o t oK., 1993.
Physical dependence on morphine induced in dogs via the use o f miniosmotic pumps. J. Pharmacol. Toxicol.
