Morfologiczne i czynnościowe wykładniki
zatrucia kurcząt ochratoksyną A
PRACA DOKTORSKA
Promotor: prof. dr hab. Marek Houszka
Katedra Patologii
Pracownia Ekologii i Chorób Zwierząt Łownych
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU
Pragnę podziękować mojemu szanownemu promotorowi prof. Markowi Houszce za okazaną pomoc i cierpliwość przy pisaniu pracy doktorskiej oraz pozostałym osobom
SPIS TREŚCI
1. Wykaz skrótów………..4
2. Wstęp………..5
3. Cel pracy………...18
4. Materiał i metody badań……….18
5. Wyniki i omówienie wyników ……….………...20
6. Dyskusja ………...……….58
7. Wnioski………..66
8. Streszczenie………67
9. Summary………...68
WYKAZ SKRÓTÓW OTA : Ochratoksyna A OTB : Ochratoksyna B OTC : Ochratoksyna C OTα : Ochratoksyna α AW : Aktywność wodna
BEN : Bałkańska endemiczna nefropatia MPN : Mykotoksykozowa nefropatia świń
CIN : Przewlekłe śródmiąższowe zapalenie nerek OE-OA: Etylo-amidowa ochratoksyna
d-OA : Fenyloalninowa forma ochratoksyny DC-OA: Zdekarboksylowana ochratoksyna OM-OA : O metylowy ester ochratoksyny M-Oα : Ester metylowy ochratoksyny α
FAO : Światowa Organizacja Dodatków Żywieniowych WHO : Światowa Organizacja Zdrowia
IARC: Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem. MRP-2: Białka oporności wielolekowej
CYP: Białka enzymatyczne. COX: Cyklooksygenazy LOX: Lipooksygenazy
ATP: Adenozyna trójfosforanowa.
PEPCK: Karboksykinazy- fosfoenolopirogronianu. MDA: Malonylo dialdehyd
WSTĘP
Grzyby występują w naturze jako heterotroficzne mikroorganizmy. Wytwarzają one węglowodany, kwas cytrynowy i szereg innych kwasów. Niektóre z nich, jak
Aspergillus, Penicillium i Fuzarium produkują ponadto drugorzędne metabolity zwane
mikotoksynami [1, 4, 87]. Ze względu na znaczne rozpowszechnienie mikotoksyn w paszach i w produktach żywnościowych [8, 45, 79, 80] stanowią one poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Ocenia się, że około 25%, a według niektórych szacunków nawet do 40% ziarna zbóż na świecie skażone jest co najmniej jedną mikotoksyną [16, 17, 36]. Powoduje to ogromne straty ekonomiczne [36, 44, 45, 128]. Mikotoksyny zmniejszają bowiem okres żywotności nasion zbóż, obniżają jakość produktów oraz skracają czas ich przechowywania. Wytwarzanie mikotoksyn przez grzyby pozostaje w
ścisłej zależności od warunków środowiskowych [17]. Te toksyczne metabolity grzybów
znane są od dawna, jednak możliwość ich powstania w paszach i patogennego wpływu na organizm zwierząt nie była brana pod uwagę, aż do czasu wystąpienia ostrego zatrucia u indyków w Anglii w 1960 r. Padło wówczas ponad sto tysięcy ptaków, a przyczyną zatrucia okazało się spożycie paszy skażonej aflatoksyną [17, 64, 82]. Pierwsze przypadki zatrucia ochratoksyną u drobiu zostały opisane w Stanach Zjednoczonych przez Hamiltona i współpracowników w 1982 roku i dotyczyły indyków, kur niosek i kurcząt brojlerów [14, 62, 73]. Stopień skażenia paszy ochratoksyną A w tych przypadkach wahał się od 0,3-16 mg/kg. [28]. Obserwowano zaburzenie wzrostu [28, 30, 42, 73], zmniejszenie produkcji jaj i wysoką śmiertelność [28].
Od tego czasu w wielu laboratoriach na całym świecie podjęło intensywne badania nad mikotoksynami. Aktualnie znanych jest około 400 mikotoksyn [17, 45]. Ze względu na swoją zróżnicowaną budowę chemiczną, mikotoksyny wykazują różne działanie patogenne. Najczęściej działają one nefrotoksycznie [25, 40, 58, 68, 71, 80, 82, 86, 102, 103, 104, 113, 114, 115, 134], hepatotoksycznie [8, 23, 24, 28, 77, 86, 99, 124, 125, 127], cytotoksycznie [2, 10, 11, 12, 23, 50, 65, 118], neurotoksycznie [12, 43, 100, 131] karcinogennie [11, 17, 68, 103, 106], estrogennie [131], immunosupresyjne [4, 5, 20, 22, 28, 29, 47, 57, 67, 69, 84, 85, 94, 110, 116, 117, 119, 123, 130], a także teratogennie [12, 14, 73].
Największe znaczenie z punktu widzenia toksykologicznego mają: aflatoksyna, ochratoksyna A, patulina, citrinina, rubratokstna, fumonizyny (B1, B2, B3), zearalenon oraz trichotheceny grupy A i grupy B.
Ochratoksyna A (OTA) jest bezbarwną substancją krystaliczną o temperaturze topnienia 90oC, która pod wpływem promieni UV barwi się na niebiesko. Jest ona bardzo dobrze rozpuszczalna w polarnych rozpuszczalnikach organicznych oraz wodnych roztworach o odczynie zasadowym. Słabo natomiast rozpuszcza się w wodzie [82]. Obecność grup fenolowych i karboksylowych w cząsteczce OTA decyduje o jej kwasowym i słabo hydrofilowym charakterze [131]. Uznawana jest za związek należący do grupy metabolitów pentaketydowych [17, 91]. Posiada strukturę złożoną z jednej cząsteczki dihydroizokumaryny (7-carboksy-5-chloro 8-hydroksy-3,4dihydro-3 R-methylizokumaryna) związanej wiązaniem peptydowym z L-β-fenyloalaniną (Ryc. 1) [2, 11, 12, 24].
Ryc. 1. Wzór strukturalny ochratoksyny
Jest ona wytwarzana przez jedenaście gatunków grzybów z rodzaju Aspergillus oraz dziesięć gatunków grzybów z rodzaju Penicillium. Do głównych gatunków grzybów produkujących ochratoksynę A należy: Penicillium verrucosum, P.chrysogenum,
P.commune, P.cyclopium, P.politans i P.nordicum, P. purpurescens, P. expansum, P. variabile i P. viridicatum oraz Aspergillus ochraceus, A. alliaceus, A. elegans, A. fresenii, A. melleus, A. ostianus, A.petrakii, A.sclerotiorum, A.sulphureus, A. glaucus [91] i A. carbonarius [1]. Badania mykologiczne wskazują, że w ziarnie zbóż ochratoksyna A jest
najczęściej produkowana przez grzyby z rodzaju Penicillium [49]. Początkowo za głównego producenta ochratoksyny A uznawano Penicillium viridicatum. Jednak w roku 1987 na podstawie parametrów morfologicznych, a także wskaźników wzrostu i produkcji toksyn wykazano, że to P.verrucosum, a nie P.viridicatum jest głównym producentem
ochratoksyny A. Obecnie uważa się, że głównymi gatunkami grzybów wytwarzającymi ochratoksynę A są P.verrucosum, A.ochraceus oraz A.carbonarium.
P.verrucosum rozwija się tylko w umiarkowanych temperaturach poniżej 30 OC oraz przy aktywności wodnej1 poniżej 0,8 P. Dlatego nie występuje on w krajach tropikalnych i subtropikalnych, a najczęściej spotykany jest w krajach strefy umiarkowanej. Z kolei
A.ochraceus rozwija się w ciepłym klimacie w krajach tropikalnych przy aktywności
wodnej 0,8. Podobnie A.carbonarius rozwija się w ciepłym klimacie i charakteryzuje się wysoką opornością na promienie słoneczne. Stanowi on główne źródło ochratoksyny A w winie, winogronach oraz w kawie [1]. Pleśnie są organizmami ubikwitarnymi i ich zdolność skażania zarówno środków spożywczych przeznaczonych do konsumpcji człowieka jak i pasz dla zwierząt jest powszechnie znana [101]. Wzrost tych grzybów nie jest jednak równoznaczny z wytwarzaniem przez nie dużej ilości ochratoksyn, które zależne jest od szeregu czynników wewnętrznych jak aktywność wodna, pH oraz potencjałredox, a także zewnętrznych jak wilgotność względna, temperatura, dostępność
tlenu oraz jakość i skład substratu [17]. Wytwarzanie ochratoksyny przez Aspergillus sp. jest wyższa w substracie składającym się z ziarna arachidowego i soi niż w substracie złożonym z ziarna zbóż i ziarna kukurydzy. Z drugiej strony zboża stanowią lepszy substrat dla produkcji ochratoksyny A przez Penicillium verrucosum. Wykazano także, że produkcja ochratoksyny A jest większa w miejscach naświetlonych niż w ciemnych, a także w obecności jonów żelaza, miedzi i cynku oraz przy pH-5,5. Wzrost pH wpływa zdecydowanie hamująco na syntezę ochratoksyny. Ważnym czynnikiem decydującym o rodzaju produkowanej ochratoksyny, a co za tym idzie stopniu jej toksyczności jest także wiek hodowli grzybów. Najbardziej toksyczne formy ochratoksyny wytwarzane są przez grzybnie po jedenastu dniach wzrostu [45].
Toksyczne metabolity grzybów Aspergillus mogą występować w wielu produktach spożywczych. Stwierdzano je w orzeszkach ziemnych [20, 82], ziarnie zbóż [1, 36, 45], nasionach bawełny, żyta, przenżyta, jęczmienia, rzepaku, owsa [41], sorgo, kakao [12], ziarnie kawy [12, 24], sianie, chmielu [82], ryżu [20, 114], wędzonym mięsie [45, 82], orzechach brazylijskich [82], ziarnie kukurydzy [1, 20, 41, 71], suszonych rybach [82], nasionach roślin oleistych pochodzących ze strefy tropikalnej i subtropikalnej, trawach, roślinach strączkowych [64], ziarnie grochu [82], mieszankach paszowych dla drobiu
1 aktywność wodna = stosunek ciśnienia pary wodnej danego produktu do ciśniecie pary wody czystej w tej
[82], sokach owocowych, winie, piwie [1], produktach mleczarskich [41, 45] a także w chlebie [45]. Wysokie stężenie ochratoksyny A (50 µg/kg) zostało stwierdzone w przyprawach korzennych i ziołach leczniczych [82]. Występuje ona również w suszonych figach (60-120 µg/kg), winogronach (250 µg/kg) oraz w śliwkach (210-280 µg/kg). Natomiast w sokach owocowych występuje w niewielkich ilościach. W soku grejpfrutowym stwierdzono 1,3 µg ochratoksynyA/litr, w soku pomidorowym 0,032
µg/litr, a w soku z czarnej porzeczki 0,06 µg/litr. Spotykana jest również w warzywach i
owocach. W pomidorach było jej 1,44 µg/kg, w wiśniach 2,71 µg/kg, figach 7,5 µg/kg, a w truskawkach 1,44 µg/kg. Nieoczekiwanie wysokie stężenie ochratoksyny A w rzędu 33000 µg/kg stwierdzono w Tunezji w ziarnie pszenicy i jęczmienia, mielonych zbożach, suchych warzywach i oliwkach [70]. Ale także w krajach Unii Europejskiej około 20% zbieranych zbóż przeznaczonych do produkcji zarówno produktów żywnościowych jak i pasz dla zwierząt skażonych jest mikotoksynami w ilościach wykrywalnych laboratoryjnie [36]. Średnie skażenie pasz ochratoksyną A kształtuje się na poziomie około 100-500 µg/kg, a w przypadku nieprawidłowych warunków przechowywania może osiągać wartości nawet powyżej 5000 µg/kg [15]. W krajach europejskich w zbożach i produktach pochodnych wykryto obecność mikotoksyn w stężeniach: 0,1 – 12,5 – 206 – 442 µ/kg. W Polsce (w latach 1984-85) w 63 na 368 badanych próbek chleba stwierdzono obecność mikotoksyn w średnim stężeniu 1360 µg/kg, a w 48 na 215 badanych próbek mąki stwierdzono obecność mikotoksyn o średnim stężeniu 4370
µg/kg.
Zanieczyszczenie ochratoksyną A (OTA) mięsa i przetworów mięsnych, a także jej znaczna trwałość w trakcie procesów technologicznych produkcji żywności staje się poważnym problemem dla zdrowia ludzi [45]. Jej obecność stwierdzono także we krwi, wątrobie i nerkach zwierząt poddanych ubojowi [108]. Badania przeprowadzone w krajach byłej Jugosławii i w Kanadzie wykazały obecność ochratoksyny A na poziomie 10-229 ng/ml we krwi loch poddanych ubojowi [108].
Na Bałkanach występuje ona powszechnie w produktach żywnościowych oraz w paszach, a w surowicy krwi mieszkających tam ludzi stwierdza się około 50 Nm ochratoksyny [38]. Powoduje ona groźną chorobę zwaną bałkańską endemiczną nefropatią (BEN) [7, 11, 12, 25, 68, 101, 102, 103, 106, 107, 135]. Choroba pojawiła się po raz pierwszy w latach 50 w Jugosławii, Rumunii i Bułgarii i była wiązana ze spożyciem owoców skażonych ochratoksyną A. W początkowej fazie choroby nie obserwuje się wyraźnych objawów patognomicznych, co utrudnia wczesną jej diagnozę. Niedokrwistość
normochromatyczna wyprzedza typowe objawy kliniczne wskazujące na dysfunkcję nerek.Częstotliwość występowania tej choroby w zagrożonych populacjach wynosi około 2-25%, a średni wskaźnik śmiertelności według oficjalnych statystyk w latach 1957-1984 wynosił 3% rocznie [101], przy czym kobiety są bardziej wrażliwe niż mężczyźni [34, 73, 101]. Ostatnie badania wskazują, że na terenach dotkniętych bałkańską endemiczna nefropatią ochratoksyna A obecna jest we krwi 6-18% populacji ludzkiej [34]. Choroba ma charakter przewlekły i rozwija się w ciągu kilku lat z postępującym rozlanym włóknieniem nerek [17, 34]. U jednego na trzech pacjentów umierających na bałkańską endemiczną nefropatię notowano także brodawczaki lub raki miedniczki nerkowej, moczowodów i pęcherza moczowego [73, 103]. Badania mikrobiologiczne wykazały obecność bakterii z rodzaju Enterobacter, Proteus oraz E.coli w moczu i kale [104]. U zwierząt ochratoksyna została uznana za główny czynnik etiologiczny przewlekłej mikotoksykozowej nefropatii świń (MPN) [25, 104, 105, 108]. Po raz pierwszy stwierdzono ją w Danii, a następnie w Bułgarii [108]. Choroba rozwija się w ciągu kilku miesięcy, a jej najbardziej widoczną cechą jest powiększenie nerek. Dlatego w Danii wszystkie świnie wykazujące w rutynowych badaniach poubojowych powiększenie nerek badane są w kierunku obecności ochratoksyny A, a w przypadku stwierdzenia w nerkach ilości przekraczających 10 µg/kg cała tusza podlega konfiskacie. Średnia zawartość ochratoksyny A wywołująca mykotoksykozową nefropatię świń wynosi około 200µg/kg. W surowicy krwi świń pochodzących z tego regionu stwierdzano w 1994 roku średnio 60.9 ng/ml ochratoksyny A, a w tkance nerkowej 42-427 ng/g. Zarówno bałkańska endemiczna nefropatia jak i MPN charakteryzują się zmianami zwyrodnieniowymi komórek nabłonka proksymalnych kanalików nerkowych oraz śródmiąższowym włóknieniem nerek [17, 55, 68, 80]. Kliniczną konsekwencją tych procesów jest poliuria oraz zmiany parametrów biochemicznych i hematologicznych krwi [105]. U drobiu karmionego przez rok paszą skażoną ochratoksyną A w stężeniu 0,3-1 mg/kg rozwija się nefropatia charakteryzująca się zwyrodnieniem nabłonka proksymalnych i distalnych kanalików nerkowych ze znacznym zaburzeniem funkcji nefronu. Dla drobiu ochratoksyna A jest trzykrotnie bardziej toksyczna niż aflatoksyna [50]. Nic więc dziwnego, że zatrucia obserwujemy właśnie w tej grupie zwierząt. Brojlery otrzymujące jednorazowo paszę zawierającą ochratoksynę A w ilości 16 mg/kg wykazują cechy ostrej ochratoksykozy charakteryzującej się apatią, biegunkami, zaburzeniem koordynacji ruchowej, wyczerpaniem oraz śmiercią kurcząt w ciągu 22-25 godz. [53]. Bardzo
1,4 mg/kg powoduje znaczne uszkodzenie nerek, anoreksję, wielomocz, wymioty, podwyższoną temperaturę, odwodnienie, zapalenie spojówek, zapalenie gardła, ogólne osłabienie przechodzące w skrajne wyczerpanie i śmierć zwierząt [115].
Natomiast u przeżuwaczy ochratoksykoza jest rzadko spotykana, ponieważ obecne w
żwaczu mikroorganizmy mają zdolność hydrolizy ochratoksyny A do słabo toksycznej
ochratoksyny α (OTα) i fenyloalaniny [15, 73, 131]. Przewlekłe zatrucie OTA przebiega ze zmniejszeniem spożycia paszy, wzmożonym pragnieniem i zmianami w nerkach [113, 114, 115]. Natomiast przewlekłe zatrucie ochratoksyną A u drobiu charakteryzuje się zaburzeniem wzrostu [59, 60], krzepnięcia krwi, fagocytozy [52, 123], integralności tkanki kostnej [26, 27, 28, 48, 52, 54, 89, 122, 126 129] i nabłonka jelitowego [16]. Zaburzony zostaje ponadto proces glikogenezy, poziom białka całkowitego, albumin, globulin, cholesterolu, trójglicerydów, potasu, kwasu moczowego, kreatyniny oraz γ-glutamylotransferazy [73]. Karmienie niosek przez 4 tygodnie paszą skażoną ochratoksyną A w ilości 2,6 ppm obniżyło nieśności o 38 %, a 5,2 ppm zmniejszyło nieśności o 62% [82].
FAO/WHO ustaliły 112 ng/kg masy ciała jako orientacyjną tolerowaną tygodniową dawkę ochratoksyny, która odpowiada dawce dziennej na poziomie 16 ng/kg masy ciała. Dawka ta została obliczona na podstawie najniższego poziomu ochratoksyny powodującego uszkodzenie nerki świń, które są gatunkiem najbardziej wrażliwym [73]. W krajach Unii Europejskiej maksymalna dopuszczalna dawka ochratoksyny A wynosi 5
µg/kg w zbożach (ryż, jęczmień) 3 µg/kg dla produktów zbożowych i ziarna zbóż
przeznaczonego bezpośrednio dla konsumpcji człowieka oraz 10 µg/kg dla suszonych owoców przeznaczonych do produkcji win [1]. W wielu krajach świata zostały przeprowadzone badania nad obecnością ochratoksyny A w krwi ludzi zdrowych. Jej największą zawartość odnotowano w Danii oraz Tunezji, odpowiednio 1,6 ng/ml, 1,2 ng/ml. W innych krajach średnia ta wynosi dla Słowacji 0,14 ng/ml, Szwecji 0,17 ng/ml, Czech 0,23 ng/ml, Chorwacji 0,39 ng/ml, Włoch 0,53 ng/ml, Hiszpanii 0,71 ng/ml, Niemiec-0,79 ng/ml, Kanady 0,88 ng/ml, Bułgarii 1,0-10,0 ng/ml, Węgier 0.1-1.4 ng/ml, a Francji i Japonii- zaledwie 0,068 ng/ml. W Polsce badania te zostały przeprowadzone przez Golińskiego w latach 1983-1984 oraz 1984-1985 i wykazały średnio 0,21-0,31 ng/ml ochratoksyny A w surowicy ludzi. Międzynarodowa agencja badań nad rakiem (IARC), oceniając wpływ ochratoksyny A na organizm człowieka i zwierząt, uznała jej karcinogenne działanie i zakwalifikowała ją do grupy 2B karcinogenów [1, 17, 33, 69].
Biorąc pod uwagę jej potencjalne działanie rakotwórcze określono dzienną dawkę ochratoksyny wynoszącą 5 ng/kg masy ciała jako całkowicie bezpieczną [73].
Poszczególne gatunki zwierząt wykazują więc różną wrażliwość na ochratoksynę A, co obrazuje Tab. 1.
Tab. 1. Dawka DL50 ochratoksyny dla różnych gatunków zwierząt
Zwierzę DL50 (mg/kg masy ciała) Droga podania
Mysz (samiec) 51÷68 Doustnie
Mysz (samica) 22 Dootrzewnowo
Szczur (samiec/ samica) 12,6/ 14,3 Dootrzewnowo
Brojler 3,3 Doustnie
Indyk 5,9 Doustnie
Świnia 1 Doustnie
Pies 0,2 Doustnie
Świnka morska (samiec/samica) 9,1/8,1 Doustnie Faucet-Margquis V. [33].
Metabolizm i kinetyka
Mikotoksyny wnikają do organizmu najczęściej drogą pokarmową. Mogą one jednak wnikać również drogą oddechową, przez skórę bądź przez spojówki. Do płodu przenikają przez łożysko [12, 15], a także z mlekiem matki [131]. Niewielka ilość ochratoksyny A jest wchłaniana przez błonę śluzową żołądka w postaci niezjonizowanej na zasadzie dyfuzji biernej [33, 73]. Głównym miejscem wchłaniania mikotoksyn, a w szczególności ochratoksyny A jest jednak jelito cienkie, zwłaszcza proksymalna część jelita czczego [33, 44, 111, 112]. Ochratoksyna A wchłaniania jest w 66% w jelitach świń, w 56% w jelitach królików i w 40% u brojlerów [33, 37]. Wchłanianie następuje na zasadzie dyfuzji biernej. Proces wchłaniania jest jednak ograniczony przez pompę aktywnego transportu anionów organicznych MPR-2 na szczytowej powierzchni enterocytów. Po wchłonięciu z krwią żyły wrotnej dostaje się do wątroby i dalszych narządów. W 99% zostaje ona związana z białkami surowicy krwi i tylko niewielka ilość pozostaje we krwi (w postaci wolnej) [17]. W szczególności łączy się z albuminami surowicy oraz z niezidentyfikowaną makrocząsteczką o masie molekularnej 20 KDa [17, 33, 37, 38, 73, 80]. Mechanizm, poprzez który ochratoksyna A łączy się z albuminami nie jest dokładnie
wyjaśniony. Według jednych doniesień łączy się ona w postaci di-anionów z podjednostkami IIA i IIB albumin surowiczych [33]. Może to opóźniać transport ochratoksyny A do narządów wewnętrznych i wydłużać jej okres półtrwania, prowadząc w konsekwencji do przewlekłych efektów toksycznych [73, 80]. Połączenia te mogą być jednak konkurencyjnie zastępowane innymi ligandami anionowymi, takimi jak aminotransferazy, fenyloalanina oraz niektóre niesterydowe leki przeciwzapalne. Okres półtrwania OTA jest najdłuższy u ludzi i wynosi 30 dni, u małp wynosi on 21 dni, u świń 75-120 godz., a u szczurów 55-230 godz. Stężenie ochratoksyny A i jej metabolitów w surowicy zależy od takich parametrów jak wysokość dawki, czas ekspozycji, droga podania, okres półtrwania, od tego czy jest ona podana naturalnie w paszy czy w postaci czystej oraz od stopnia wiązania z białkami surowicy [33]. U świń, ptaków i szczurów najwyższe stężenia ochratoksyny A w organizmie stwierdza się w nerkach, mięśniach, wątrobie i tkance tłuszczowej [78].
Transport
Jak już wspomniano, ochratoksyna absorbowana jest głównie w odcinku bliższym jelita czczego. Wnika ona do komórek zarówno za pośrednictwem aktywnego transportu jak i drogą biernej dyfuzji. Wnikanie to jest jednak redukowane przez aktywność pomp zlokalizowanych w błonie szczytowego obszaru enterocytów. Są to transportery anionów organicznych zwane białkami oporności wielolekowej MRP-2 (Multidrug Resistance Protein-2) [33]. Gekle i współpracownicy wykazali, że w komórkach nabłonka proksymalnych kanalików nerkowych wymiana zachodząca na szczytowej powierzchni błony komórkowej jest inna niż ta na poziomie powierzchni przypodstawnej i bocznej komórki [39]. Na poziomie szczytowej powierzchni nabłonka kanalików nerkowych aktywny transport ochratoksyny A odbywa się poprzez transportery fenyloalaniny, H+/dipeptydów oraz anionów organicznych. Natomiast na powierzchni przypodstawnej i bocznej komórki tylko za pośrednictwem transporterów anionów organicznych [33].
Ekskrecja i eliminacja
Ochratoksyna A jest eliminowana z organizmu z moczem, żółcią oraz z kałem [33, 112, 131]. Część wydalana z żółcią może być ponownie absorbowana w obrębie jelit. Jednak około 30-40% ochratoksyny A jest wydalane drogą moczową. W nerkach jest ona filtrowana w kłębkach nerkowych i z moczem pierwotnym dostaje się do światła proksymalnych kanalików krętych, skąd może być częściowo reabsorbowana i ponownie
wraca do krwi. Eliminacja poszczególnych ochratoksyn jest zróżnicowana (Tab. 2). Badania przeprowadzone przez Li i wsp. wykazały, że u szczurów czas półtrwania ochratoksyny A jest najdłuższy i wynosi 103 godziny. Czas półtrwania metabolitów OTA wynosi: dla Op-OTA 50 godz., dla OT α 9,6 godz., dla 4-OH-OTA 6 godz., dla OTB 4,2 godz., a dla OTC 0,6 godz. [33].Ochratoksyna A, ochratoksyna B oraz ochratoksyna α są eliminowane głównie drogą moczową (48%). Natomiast 4-OH-OTA jest eliminowana głównie drogą żółciową (41%) [33].
Tab. 2. Ochratoksyna i jej metabolity
NAZWA R1 R2
Ochratoksyna A (OTA) H Cl
Ochratoksyna B (OTB) H H
Ochratoksyna C (OTC) CH2CH3 Cl
Ochratoksyna A ester metylowy
(metylowy ester fenyloalaniny) H Cl Ochratoksyna B ester metylowy
(metylowy ester fenyloalaniny) H H Ochratoksyna B ester etylowy
(ester etylowy fenyloalaniny) H H Rouvier. M., Toulouse 2002 [93] (R1, R2 - patrz Ryc. 1) Metabolizm
In vitro ochratoksyna A jest hydrolizowana przy udziale enzymów trawiennych, tj. α chymotrypsyny i karboksypeptydazy do ochratoksyny α [61] i fenyloalaniny [15, 131]. Inkubacja ochratoksyny A z mikrosomami komórek wątrobowych szczura, świni i człowieka, a także w hodowli komórkowej nerki małp i nabłonka oskrzelowego człowieka prowadzi do powstania dwóch epimerów hydroksylowanych, tj. 4-R-hydroksyochratoksyny A (4R-OHOA) i 4-S-4-R-hydroksyochratoksyny A [24, 33, 109]. Natomiast inkubacja ochratoksyny A z mikrosomami komórek wątrobowych królika lub nerki świni prowadzi do powstania 10-hydroksyochratoksyny A (10-OHOA) [33, 109]. Wszystkie te transformacje są zależne od systemu mikrosomalnego mono-oksygenazy cytochromowej i CYP P-450 oraz peroksydazy [93]. Niektórzy autorzy sugerują, że ochratoksyna A jest słabo metabolizowana przez białka enzymatyczne P-450, a jej toksyczne oddziaływanie wynika bardziej ze stresu oksydatywnego [2, 33, 39]. Dlatego dodawane do paszy witaminy A, C i E - mające właściwości przeciwutleniające - zmniejszają jej patogenne działanie. Witaminy A i E modulują ponadto aktywność enzymów kaskady kwasu arachidonowego w szczególności cyklooksygenazy (COX) i
Mechanizm działania
Ochratoksyna A wykazuje różnorodne działania patogenne, ale przede wszystkim działa nefrotoksycznie [6, 19, 25, 66, 68, 80, 81, 82, 113, 114, 115, 120, 121, 133, 134]. Jest ona uznana za jeden z głównych czynników etiologicznych wielu chorób nerek o przebiegu ostrym i przewlekłym. U świń typowe objawy kliniczne występują już po skarmianiu ich paszą zawierającą 1400 µg/kg paszy [73]. W wysokich dawkach powoduje także uszkodzenie strukturalne jelit i wątroby [113]. U szczurów karmionych przez 8-12 tygodni dietą skażoną ochratoksyną A w stężeniu 2 mg/kg następuje zmniejszenie aktywności dehydrogenazy mleczanowej, fosfatazy alkalicznej, leucyno-aminopeptydazy, gamma-glutamylo-transferazy oraz N-acetylo-β-D-glukozo-amidazy we krwi [33]. Działanie nefrotoksyczne polega na uszkodzeniu mechanizmu odpowiedzialnego za transport anionów organicznych w rąbku szczoteczkowym komórek nabłonka proksymalnych kanalików nerkowych [95]. Zaburzenia funkcji nerki, a w szczególności kanalików nerkowych prowadzą do zwiększenia objętości moczu (poliuria), zawartości glukozy (glikozuria) i białka (białkomocz) oraz przenikania do moczu gamma-glutamylo-transferazy, fosfatazy alkalicznej oraz leucyno-aminopeptydazy (enzymuria). Zarówno glikozuria jak i proteinuria powstają na skutek zaburzenia reabsorpcji w proksymalnych kanalikach nerkowych [104]. Dożylne podanie szczurom ochratoksyny A w dawce 3 nmol/kg masy ciała spowodowało wzrost pH w kanalikach krętych i kanalikach zbiorczych oraz we wstępujących i zstępujących naczyniach prostych, a także wzrost stężenia jonów wodorowęglanowych w kanalikach nerkowych. Zaburzenie pH w tkance
śródmiąższowej okolicy brodawki nerkowej może spowodować zaburzenie w procesie
zakwaszanie moczu i prowadzić do jego alkalizacji. Z tego powodu wielu autorów sugeruje, że zaburzenie homeostazy pH może w znaczący sposób naruszyć równowagę kwasowo-zasadową ustroju oraz wzmagać nefrotoksyczne działanie OTA [63].
Ochratoksyna A powoduje zmiany regresywne układu limfatycznego drobiu [21, 22, 29, 57, 85], wpływając na zmniejszenie liczby limfocytów [14, 21, 42, 47, 57, 102] oraz wywiera niekorzystny wpływ na odpowiedź immunologiczną typu komórkowego [21, 31], a w niektórych przypadkach osłabia także odpowiedź typu humoralnego [73, 103, 104]. Sam mechanizm immunosupresyjnego działania mikotoksyn, a w szczególności ochratoksyny A nie jest do końca wyjaśniony, ale wielu autorów sugeruje, że hamowanie syntezy białek [2, 9, 10, 11, 12, 25, 47, 55, 68, 76, 94] wpływa negatywnie na podział mitotyczny szybko dzielących się komórek układu immunologicznego [47, 102]. Ostatnie badania ptaków karmionych paszą skażoną ochratoksyną A w stężeniu 2-4
mg/kg w okresie 21 dni wykazały spadek białka całkowitego surowicy krwi, liczby limfocytów oraz zmniejszenie masy narządów limfatycznych jak grasica, torba Fabrycjusza oraz śledziona [28, 57]. Ponadto zmniejsza ona aktywność dopełniacza oraz osłabia aktywność makrofagów spełniających istotną rolę w nieswoistej odpowiedzi immunologicznej. Działanie immunosupresyjne ochratoksyny A silnie zaznacza się u kurcząt i indyków natomiast w znacznie mniejszym stopniu u przepiórek i kaczek [130]. Ptaki narażone są najczęściej na pobieranie paszy zawierającej niskie dawki mikotoksyn. Prowadzi to do ogólnego osłabienia odporności organizmu, co zwiększa wrażliwość ptaków na różne choroby [103, 107, 128] bakteryjne jak salmonelloza [31, 35, 104], kolibakterioza [62, 104], wirusowe jak choroba Gumboro, choroba Mareka oraz pasożytnicze jak kokcydioza [56]. U indyków, a także u brojlerów w przebiegu zatrucia ochratoksyną często notowane są zapalenia worków powietrznych [28, 29, 62, 73].
Ochratoksyna A powoduje zaburzenia oddychania mitochondrialnego [33, 38, 40, 46, 73, 102, 105] w wyniku dysfunkcji transporterów fosforu w błonie mitochondrialnej oraz zaburzeniem aktywności ATP-azy w wewnętrznej błonie mitochondrialnej [73]. Ponadto konkurencyjnie hamuje ona aktywność dehydrogenazy bursztynianowej i oksydazy cytochromowej C, a także hamuje aktywność enzymów cyklu Krebsa powodując obniżenie produkcji ATP, który jako źródło energii niezbędny jest do produkcji cholesterolu. Peroksydacja nienasyconych kwasów tłuszczowych [2, 11, 12, 40, 68, 80, 96] tworzących struktury błon komórkowych jest ważnym kierunkiem działania wielu ksenobiotyków, w tym również ochratoksyny, prowadząc do zaburzenia homeostazy wapniowej komórki ze wzrostem poziomu wolnego wapnia w cytoplazmie, a w następstwie uszkodzenia komórek i tkanek. Wzmożona peroksydacja tłuszczów błonowych w przebiegu ochratoksykozy może prowadzić do uszkodzenia i martwicy komórek kanalików nerkowych.
Hepatotoksyczność
Klinicznym wyrazem hepatotoksycznego działania ochratoksyny A jest zmniejszenie poziomu białka całkowitego, albumin, cholesterolu [81, 107], trójglicerydów oraz zmniejszenie aktywności gamma-glutamylo-transferazy i cholinesterazy w surowicy krwi [52]. W procesie detoksyfikacji ochratoksyny A w wątrobie powstają jej metabolity jak 4-hydroksy-ochratoksyna A [131]. W procesie tym istotną rolę odgrywa białko enzymatyczne cytochrom CYP P- 450 znajdujące się w mikrosomach komórek
A (OH-OTA) [131]. Ponadto wykazano, że ochratoksyna A zaburza metabolizm węglowodanów [11, 12, 38, 131] u szczurów. Po jednorazowej doustnej dawce 15 mg/kg masy ciała następowało obniżenie stężenia glikogenu w wątrobie oraz wzrost stężenia glikogenu w sercu i glukozy w surowicy.
Ochratoksyna A konkurencyjnie hamuje mitochondrialne białka transportowe wątroby szczura, co może być przyczyną zmniejszenia produkcji energii niezbędnej do syntezy cholesterolu i prowadzić do obniżenia jego stężenia w surowicy [107]. Zaburzenie syntezy cholesterolu może także być następstwem zmniejszenia syntezy białek będących nośnikami steroli [73, 105]. Ochratoksyna A posiada zdolności wiązania z albuminami [11, 12, 15, 17, 38, 39, 41, 46, 79, 80], co utrudnia jej przenikanie z krwiobiegu do komórek wątrobowych oraz nerkowych, a w konsekwencji jej eliminację z organizmu [73, 80, 131]. W celu utrzymania ochratoksyny A we krwi, organizm może okresowo zwiększyć wytwarzanie albumin, co minimalizuje uszkodzenie narządów [81]. OTA może hamować metabolizm zarówno glukozy, jak i insuliny, powodując gromadzenie glikogenu w wątrobie. Następuje zmniejszenie aktywności karboksykinazy-fosfoenolopirogronianu (PEPCK)ze znaczną redukcją procesu neoglukogenezy nerkowej [16, 73, 131].
Cytotoksyczność
Ochratoksyna A pierwotnie uszkadza enzymy związane z metabolizmem fenyloalaniny. Hamuje ona enzymy zaangażowane w syntezę kompleksu fenyloalanina- t-RNA. Może również współreagować z innymi enzymami, które używają fenyloalaniny jako substratu, np. hydroksylazą fenyloalaninową, która katalizuje nieodwracalną hydroksylację fenyloalaniny do tyrozyny [73]. Zajmuje ona miejsce fenyloalaniny i powoduje zaburzenie biosyntezy białek, głównie glikoprotein i lipoprotein, budujących struktury błon komórkowych. Jako inhibitor biosyntezy białek powoduje destabilizację struktur błon plazmatycznych plemników [13]. Podawana dzikom w paszy w dawce 0,08 mg/kg powoduje w ciągu 24 godz. zmniejszenie objętości ejakulatu, żywotności oraz ruchliwości plemników [13].
Zatrucie mikotoksynami powoduje powstawanie rodników nadtlenkowych [2, 11, 80, 40], które uszkadzają błony plazmatyczne i DNA [14, 23, 24, 25, 88, 106], RNA [14, 25, 46, 106] oraz mitochondria [38, 40, 46, 73, 94, 96, 107]. Powstawanie rodników nadtlenkowych odgrywa kluczową rolę w patogenezie wielu chorób, w tym również wywołanych ochratoksyną A [2, 96]. W następstwie rozpadu makromolekuł dochodzi do
wzrostu malonylo-di-aldehydu (MDA) [38], który stanowi końcowy produkt peroksydacji tłuszczów i uznawany jest za biomarker stresu oksydatywnego i uszkodzenia komórki [38].
Teratogenność
Ochratoksyna A wykazuje działanie teratogenne powodując różne anomalie morfologiczne u szczurów oraz u embrionów kurzych. Poprzez łożysko trafia do płodu, gdzie ulega kumulacji [12, 17, 38]. Powoduje zarówno u szczurów, jak i u myszy destabilizację wielu parametrów związanych ze wzrostem oraz różnicowaniem komórek, co tłumaczy jej patogenne działanie na rozwój płodów [17]. Karcinogenne działanie ochratoksyny A na zwierzęta i ludzi nie jest dokładnie wyjaśnione. Prawdopodobnie jest ono związane ze zmniejszeniu aktywności fagocytarnej makrofagów [69, 73, 102, 104, 131]. Poprzez specyficzne hamowanie aktywności endogennego interferonu [104] osłabiona zostaje także funkcja komórek NK odpowiedzialnych za niszczenie komórek nowotworowych [73, 106, 131].
CEL PRACY
Celem pracy było określenie wpływu skarmiania kurcząt brojlerów paszą zawierającą ochratoksynę A na strukturę mikroskopową narządów i tkanek oraz wpływ tych zmian na parametry kliniczne ptaków. Obszarem szczególnego zainteresowania były zmiany zachodzące w obrębie układu pokarmowego, układu immunologicznego, kości i nerek.
MATERIAŁ I METODY
Biosyntezę ochratoksyny A przyprowadzono stosując jako podłoże ziarno pszenicy inokulowane szczepem KA-10 Aspergillus ochraceus i inkubowane w temperaturze 28 ºC przez 192 godz. Końcowe stężenie ochratoksyny w kulturze wynosiło 102,4 mg/kg. Badania przeprowadzono na 30 sztukach 14 dniowych kurcząt brojlerów krzyżówki COB-500 odchowanych w warunkach fermowych. Ptaki zostały podzielone na cztery grupy, w tym dwie grupy kontrolne (K-0/25) i (K-0/35) oraz dwie grupy doświadczalne (K-1) i (K-2). Grupy kontrolne K-0 otrzymywały standardową paszę wolną od ochratoksyny. Była to dobrze zbilansowana pasza charakteryzująca się wysokim poziomem białka, aminokwasów, energii, witamin i związków mineralnych. Kurczęta doświadczalne karmiono tą samą paszą z dodatkiem ochratoksyny A. Pasza wraz ochratoksyną była mieszana w mieszalniku bębnowym przez cztery godziny. Po zakończeniu mieszania pobrano pięć próbek paszy w celu oznaczenia stężenia ochratoksyny. Oznaczenie wykonano metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). HPLC- FLD według procedury badawczej PB 09/CH- metodą akredytowaną przez Polskie Centrum Akredytacji. ( NR. Akredytacji AB 584). Po pierwszym oznaczeniu dodawano kulturę A.ochraceus z ochratoksyną aż do uzyskania wymaganego stężenia 6 mg/kg. Ptaki doświadczalne otrzymywały tak przygotowaną paszę przez okres 10 dni (grupa K-1) i 20 dni (grupa K-2). Badanie wykonano w wiwarium Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu za zgodą II Lokalnej Komisji Etycznej we Wrocławiu nr 57/2009 z dnia 20.04.2009. W jednym pomieszczeniu zostały umieszczone kurczęta kontrolne, a w drugim kurczęta doświadczalne. Wszystkie ptaki miały wolny dostęp do paszy i wody. Przez cały okres trwania doświadczenia wszystkie grupy były obserwowane cztery razy dziennie: o godz. 7.30, 11.00, 14.00 oraz o godz. 20.00. Kurczęta zostały zważone w dniu rozpoczęcia doświadczenia, trzeciego, dziesiątego oraz dwudziestego dnia doświadczenia. Codziennie oceniano stan kliniczny ptaków. Po zakończeniu doświadczenia obliczono ilość paszy zjedzonej przez ptaki kontrolne i doświadczalne. W 10 i 20 dniu doświadczenia od pięciu kurcząt z każdej
grupy kontrolnej i dziesięciu kurcząt z grupy doświadczalnej pobrano 5 ml krwi z żyły skrzydłowej celem określenia parametrów biochemicznych aparatem MAXMAT PL. Oznaczano:
- Fosfatazę alkaliczną IFCC/AMP.
- Albuminy metodą kolorymetryczną BCG. - Kwas moczowy metodą enzymatyczną DST. - Kreatyninę metodą kinetyczną Jaffe.
Następnie kurczęta zostały poddane eutanazji poprzez przerwanie ciągłości kręgów szyjnych i wykonano badanie sekcyjne. W trakcie sekcji pobierano wycinki narządów wewnętrznych: żołądka gruczołowego, nerki, torby Fabrycjusza, śledziony, wątroby, jelita czczego, jelita biodrowego, mózgowia oraz kości piszczelowej do badań histopatologicznych. Torba Fabrycjusza i śledziona zostały uprzednio zważone. Z pobranych wycinków wykonano skrawki parafinowe grubości 5 µm barwione hematoksyliną i eozyną [18]. Wycinki tkanki kostnej zostały uprzednio poddane 10 dniowej kąpieli w mieszaninie odwapniającej 10% wersenianu sodu, a przez następne 10 dni w mieszaninie kwasu mrówkowego i cytrynianu sodu [18]. Preparaty oceniano w mikroskopie świetlnym. Ponadto wykonano badania morfometryczne długości kosmków i głębokości krypt jelita czczego i biodrowego oraz wielkości grudek chłonnych torby Fabrycjusza, wykorzystując system komputerowo wspomaganej analizy obrazu Multi- Scan BaseV.8 pracującego w środowisku Windows i sprzężony z mikroskopem Axiophot firmy Zeiss. W każdym preparacie jelita mierzono dziesięć wzdłużnie przeciętych kosmków, a w torbie Fabrycjusza najdłuższą i najkrótsza oś grudek chłonnych obliczając pole powierzchni (P) według wzoru:
π
⋅ ⋅ = 2 b a P gdzie: a - najdłuższa oś b – najkrótsza oś.Natomiast pomiary grubości ściany, wielkości jamy szpikowej oraz stopnia porowatości kości piszczelowej wykonano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse 80i z oprogramowaniem Nis Elements Ar. W pomiarach tych wyznaczono ilość tkanki kostnej w obrębie trzonu kości piszczelowej w stosunku do badanej powierzchni w 10 kolejnych
polach widzenia dla jednej próbki. Następnie wyniki uśredniano i wyznaczano stopień porowatości kości. Z kości piszczelowej pobrano także materiał do badań w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), aby określić jej skład pierwiastkowy. Materiał ten został odwodniony w szeregu acetonowym i wysuszony w punkcie krytycznym. Preparaty badano w SEM firmy EVO LS 15 Zeiss wyposażonym w mikrosondę rentgenowską. Badania wykonano przy napięciu przyspieszającym 20000 eV, przy powiększeniu 500x. Badaniom punktowym poddano obszary od strony okostnej i
śródkostnej.
W trakcie badania sekcyjnego pobierano także drugą kość piszczelową, którą po oczyszczeniu z tkanek miękkich i zważeniu poddano badaniom biomechanicznym w aparacie MTS Mini Bionix 858 przy prędkości obciążenia próbek 5 N/s. Na podstawie uzyskanych pomiarów wyznaczono moment maksymalnej siły. Pozwoliło to porównać właściwości mechaniczne kości piszczelowych kurcząt w zakresie zdolności do przenoszenia maksymalnych obciążeń.
Obliczenia statystyczne
Na danych liczbowych uzyskanych w doświadczeniach, wykonywano obliczenia statystyczne. Wyniki obliczeń przedstawiono w tabelach. Przy porównaniu średnich uzyskanych z grup doświadczalnych ze średnimi z grup kontrolnych zastosowano test t Studenta. W tabelach, średnie doświadczalne oznaczano jedną lub dwoma gwiazdkami. Jeżeli średnie różniły się od siebie istotnie na poziomie ufności α=0,05 stawiano jedną gwiazdkę *, a jeżeli różniły się na poziomie ufności α=0,01 stawiano dwie gwiazdki **.
Dla lepszej przejrzystości, wyniki obliczeń przedstawiono również na wykresach (Ryc. 3, 4, 5, 6, 7), gdzie zaznaczono średnie i błędy standardowe średnich, zaznaczając u góry dla jakiego poziomu ufności te błędy były wyliczone.
WYNIKI Objawy kliniczne
Począwszy od czwartego dnia doświadczenia w grupie ptaków doświadczalnych zauważono na ściółce ślady wodnistej, ciemno brązowej biegunki, która się stopniowo nasilała obejmując wszystkie ptaki grupy K-1 i K-2. Chore ptaki stały lub siedziały skulone z przymkniętymi oczami i nastroszonymi piórami nie wykazując chęci do ruchu. Obniżyło się także spożycie paszy i wody w porównaniu do ptaków kontrolnych. Powłoki skórne, grzebień i dzwonki oraz łuski śródstopia były wyraźnie blade (Ryc. 2). Średnia
masa ptaków w grupach doświadczalnych różniła się statystycznie w sposób istotny, od
średniej masy w odpowiednich grupach kontrolnych.
W przeprowadzonym doświadczeniu waga ptaków doświadczalnych z grupy K-1 w wieku 25 dni (czyli 10 dni po rozpoczęciu doświadczenie) była o 47% mniejsza niż kurcząt kontrolnych. W grupie K-2 tj. po 20 dniach doświadczenia waga ptaków była o 51% mniejsza niż kurcząt kontrolnych (Ryc. 3, Tab. 3).
Tab. 3. Średnia masa ptaków w trakcie doświadczenia
K0 (25 dni) K1 K0 (35 dni) K2 Średnia 1307 696,6** 1895,8 923,9** Błąd Standardowy (SD) 61,676 28,581 52,736 27,116 Odchylenie(SEM) Standardowe 137,913 90,383 117,922 85,750 Liczebnik (N) 5 10 5 10
A
B
B
B
Ryc. 2. Wygląd kurcząt doświadczalnych (B) i kontrolnych (A) w 20 dniu doświadczenia.
Ryc 3. Masa kurcząt w 10 i 20 dniu doświadczenia
Badania biochemiczne krwi wykazały, że stężenie albumin w surowicy kurcząt doświadczalnych grupy K-1 uległo zmniejszeniu o 31, 89% w porównaniu do kurcząt kontrolnych K-0/25. Natomiast stężenie kreatyniny w surowicy kurcząt grupy K-1 uległo wzrostowi o 24,2% , a stężenie kwasu moczowego o 82,30% w porównaniu do kurcząt kontrolnych. Również aktywność fosfatazy alkalicznej w surowicy kurcząt grupy K-1 uległa zmniejszeniu o 58,3% w porównaniu do grupy kurcząt kontrolnych (Tab. 4 oraz Ryc. 4, 5, 6, 7).
U kurcząt grupy K-2 poziom albumin uległ zmniejszeniu o 21% w porównaniu do kurcząt kontrolnych. Natomiast poziom kwasu moczowego uległ wzrostowi o 277%, a poziom kreatyniny o 49,4% w porównaniu do kurcząt kontrolnych. Poziom fosfatazy zasadowej kurcząt grupy K-2 uległ wzrostowi o 93,9% w porównaniu do kurcząt kontrolnych.
Ryc. 4. Stężenie kwasu moczowego w surowicy (µmol/l)
Ryc. 5. Stężenie albumin w surowicy krwi (g/l)
p<0,05
Ryc. 6. Stężenie kreatyniny w surowicy (µmol/l)
Ryc. 7. Aktywność fosfatazy zasadowej w surowicy (U/l) p<0,05
Tab. 4. Wskaźniki statystyczne parametrów biochemicznych krwi
Kwas moczowy Albuminy
K0/25 K1 K0/35 K2 K0/25 K1 K0/35 K2 Średnia 342,2 624* 213,6 806,9** 13,8 9,4** 14,0 11,1 Błąd ( SD) Standardowy 39,65 68,053 37,993 95,904 0,374 0,707 0,305 0,887 Odchylenie Standardowe 88,65 215,203 84,954 302,329 0,837 0,966 1,581 2,806 Liczebność (N) 5 10 10 10 5 10 5 10
Kreatynina Fosfataza zasadowa
K0/25 K1 K0/35 K2 K0/25 K1 K0/35 K2 Średnia 37,6 49,6** 34,2 51,1* 8688 3643** 1876 3638 Błąd ( SD) Standardowy 1,288 1,790 2,764 3,998 1060,62 468,000 202,62 708,773 Odchylenie Standardowe 2,88 5,66 6,181 12,644 2372,029 1479,94 453,078 2241,338 Liczebność (N) 5 10 5 10 5 10 5 10
Zmiany sekcyjne
Kurczęta brojlery grup kontrolnych w badaniu sekcyjnym nie wykazywały widocznych odchyleń od stanu prawidłowego. Wielkość oraz ułożenie narządów wewnętrznych prawidłowe. Stan utrzymania i odżywiania dobry. Waga ptaków w stosunku do wieku prawidłowa.
U kurcząt doświadczalnych grupy K-1 stwierdzono silne zmniejszenie torby Fabrycjusza oraz śledziony. Nerki były powiększone i blade. Również wątroba była blada, kruchej konsystencji. Błona śluzowa jelit na całej długości blada, pokryta drobnymi wynaczynieniami. W jelicie grubym stwierdzono znaczną ilość papkowatej treści. Kości
śródstopia tych kurcząt były mniejsze w porównaniu do kurcząt kontrolnych.
U ptaków grupy K-2 zmiany patologiczne były bardziej nasilone niż u kurcząt grupy K-1. Nerki wszystkich kurcząt były silne powiększone i blade (Ryc. 8).
Ryc. 8. Silne powiększenie i bladości nerek (A) kurcząt doświadczalnych (K-2).
Podobnie wątroba była krucha i blada. Pomniejszenie torby Fabrycjusza i śledziony było bardziej widoczne niż w grupie K-1. Żołądek mięśniowy był prawie pusty. Żołądek gruczołowy w obu grupach doświadczalnych nie wykazywał odchyleń od stanu prawidłowego. Błona śluzowa jelit na całej długości blada, miejscami przekrwiona, pokryta zielonkawą śluzowatą treścią. Kości śródstopia były wyraźnie mniejsze zarówno
A
A
w porównaniu do kurcząt grupy K-0/35 jak i K-1. Obliczenia statystyczne wykazały, że zarówno średnie masy torby Fabrycjusza jak i śledziony w grupach K-1, K-2 różniły się istotnie od odpowiednich mas w grupie kontrolnej K-0/25 i K-0/35. W omawianym doświadczeniu masa torby Fabrycjusza ptaków doświadczalnych grupy K-1 tj. 10 dni po rozpoczęciu doświadczenia była o 30 % mniejsza niż u kurcząt kontrolnych. Natomiast u kurcząt doświadczalnych grupy K-2 masa torby Fabrycjusza uległa zmniejszeniu o 53 % w porównaniu do kurcząt kontrolnych. Masa śledziony kurcząt doświadczalnych grupy K-1 była o 53% mniejsza, a kurcząt grupy K-2 o 52% mniejsza niż kurcząt kontrolnych (Tab. 5, 6, i Ryc. 9 i 10).
Ryc. 9. Średnia masa torby Fabrycjusza.
Ryc. 10 Średnia masy śledziony
Tab. 5. Masa torby Fabrycjusza
K0 /25 K1 K0/35 K2 Średnia 2,178 1,677 3,362 1,579** Błąd (SD) Standardowy 0,156 0,173 0,324 0,226 Odchylenie Standardowe (SEM) 0,349 0,549 0,725 0,7157 Liczebnik (N) 5 10 5 10
Tab. 6. Masa śledziony
K0/25 K1 K0/ 35 K2 Średnia 1,532 0,711** 1,958 0,935** Błąd (SD) Standardowy 0,131 0,031 0,140 0,082 Odchylenie Standardowe (SEM) 0,293 0,101 0,313 0,262 Liczebnik (N) 5 10 5 10
W badaniu morfometrycznym kości oceniano:
1. Średnicę zewnętrzną kości piszczelowej mierzoną w części środkowej
wyznaczanej na podstawie odległości do końca bliższego i dalszego. p<0,05
2. Średnicę wewnętrzną, mierzoną w tym samym miejscu, wyznaczającą grubość
jamy szpikowej
3. Stopień porowatości kości, będący informacją dotyczącą ilości wolnych
przestrzeni pomiędzy beleczkami pierwotnej tkanki kostnej od strony okostnej i sródkostnej
4. Objętość kości
Wyniki badań morfometrycznych zostały przedstawione w tabeli 7 oraz na rycinach 11-13.
Tablica 7. Wyniki analizy morfometrycznej kości badanych zwierząt średnica zewnątrz SD średnica wewnątrz SD grubość ściany SD masa kości (g) SD stopień porowatości - okostna % SD stopień porowatości -sródkostna % SD K0/25 6,593 0,29 2,776 0,73 3,817 0,48 11,2291 0,521 23,980 2,03 0 K1 5,004 0,16 3,354 0,29 1,650 0,29 4,3303 0,647 59,600 3,5 0 K0/35 7,048 0,31 3,471 0,56 3,577 0,4 11,8157 0,916 27,880 3,55 37,380 2,65 K2 5,723 0,24 3,174 0,34 2,549 0,37 7,1210 0,971 61,320 4,36 68,480 3,51
Ryc. 12. Masa kości piszczelowej kurcząt (w gramach). (p < 0,05).
Wyniki pomiarów średnicy kości piszczelowej oraz stopnia jej porowatości wskazują na wyraźne zatrzymanie syntezy tkanki kostnej w grupie eksperymentalnej po 10 dniach podawania ochratoksyny. W kolejnych dniach synteza kości uległa wznowieniu, ale przy wzrastającej masie kostnej dochodzi do pozornego wzrostu gęstości kości, co przejawia się mniejszym stopniem porowatości. Współczynnik ten ulega obniżeniu w grupie eksperymentalnej co oznacza, że pomimo wznowienia syntezy tkanki kostnej, nie jest ona na tyle silna aby utrzymać ciężar ptaka. Konsekwencją jest odkształcanie się kości oraz zmniejszenie objętości jamy szpikowej. W badaniu biomechanicznym wykazano, że kości ptaków grupy eksperymentalnej są mniej sztywne, czyli łatwiej ulegają odkształceniom. Jest to spowodowane zróżnicowaną masą kości jak i różnym stopniem jej mineralizacji (Ryc. 14 i 15).
Ryc. 14. Średnie wartości siły przenoszonej przez kości piszczelowej (p < 0,05)
Ryc. 15. Średnie wartości ugięcia kości piszczelowej (p<0,05)
Ugięcie wraz ze spadkiem zdolności do przenoszenia obciążeń wskazuje na utratę lub brak właściwej struktury tkanki kostnej oraz wciąż niedostateczny stopień jej mineralizacji. Maksymalne wartości przenoszenia siły dla ptaków grupy kontrolnej w 25 i 35 dniu życia tj. w 10 i 20 dniu doświadczenia wynoszą odpowiednio 188,02 N i 281,12 N natomiast dla ptaków grupy eksperymentalnej 81,26 N i 64,84 N. Oznacza to, że zdolność do przenoszenia obciążeń przez kości piszczelowe ulega znacznemu obniżeniu po podaniu ochratoksyny. W związku z osłabionym procesem osteogenezy, zaburzoną mikroarchitekturą kości oraz słabą mineralizacją dochodzi do wyraźnego zwiększenia elastyczności kości u ptaków z grupy eksperymentalnej. Uzyskane wstępne wartości są charakterystyczne dla kości pierwotnej, która w obu grupach ulega resorpcji (Ryc. 39, 41). Brak lub osłabienie osteogenezy odokostnowej w grupach eksperymentalnych doprowadza do istotnych zmian we właściwościach mechanicznych kości. Porównując zdolność do odkształcenia pod wpływem obciążenia wartości te są wyższe dla grup kontrolnych (2,92 mm i 2,64 mm). Wyznaczony przez nie kierunek spadkowy oznacza wzrost sztywności kości ptaków grupy kontrolnej. Grupy eksperymentalne nie tylko słabiej przenoszą obciążenia ale również wykazują tendencje odwrotne w zakresie ugięcia (2,2 mm i 2,34 mm) (Ryc. 16).
Krzywa w odniesieniu do siły jest płaska dla kości elastycznych, natomiast dla kości sztywnych jest pionowa.
Na wykresach tych uwzględniono moment maksymalnej siły działającej na kość, powyżej której dochodzi do odkształceń plastycznych. Często w takim przypadku, dochodzi do złamania elastycznego, gdzie po przejściu przez punkt maksimum, kości ulegają powolnemu odkształceniu pod wpływem mniejszych sił. Oznacza to stopniowe, wielokrotne „pękania” z których każde pęknięcie osłabia kość. Stąd wartości niezbędne do dalszego przełamywania kości są coraz mniejsze.
K0/25 K0/35
K1 K2
d[mm]
Ryc. 16. Wykres odkształceń badanych kości piszczelowych w odniesieniu do siły w grupie kontrolnej i eksperymentalnej w 10 i 20 dniu eksperymentu.
Badania histopatologiczne
W preparatach histologicznych jelita czczego kurcząt kontrolnych kosmki jelitowe były smukłe, regularnego palczastego kształtu (Ryc. 17). W prawidłowym cylindrycznym nabłonku kosmków obecne były nieliczne komórki kubkowe oraz średnio liczne migrujące limfocyty. Średnia wysokość kosmków u ptaków grupy KO/25 i KO/35 wynosiła odpowiednio 1,27 i 1,19 mm, a głębokość krypt 0,347 i 0,23 mm (Tab. 8). U ptaków otrzymujących przez 10 dni ochratoksynę A (K-1) zarówno kosmki jak i krypty uległy niewielkiemu skróceniu. Kosmki miały 1,12 mm, a krypty 0,26 mm długości (Ryc. 18, Tab. 8). Kosmki pozostawały wciąż smukłego kształtu jednak na ich powierzchni widoczne były wrębiaste wgłębienia. Wzmożona była także liczba komórek kubkowych. Natomiast zrąb kosmków podobnie jak liczba intraepitelialnych limfocytów utrzymywała się na poziomie grupy kontrolnej. U ptaków otrzymujących ochratoksynę przez 20 dni (K-2) kosmki były wyraźnie skrócone (1,03mm) i poszerzone, miejscami zlewając się ze sobą w mało foremne struktury o nierównej wrębiastej powierzchni (Ryc. 19). W nabłonku kosmków liczne były komórki kubkowe. Nieznacznie wzmożona była także liczba śródnabłonkowych limfocytów. Skróceniu uległy krypty jelitowe (0,18 mm). U części ptaków obserwowano nacieki zapalne szczególnie w przypodstawnych obszarach błony śluzowej z formowaniem torbielowatych struktur w kryptach (Tab. 9 i 10, Ryc. 20, 22).
Tab. 8. Pomiary kosmków i krypt jelita czczego i biodrowego
Średnia długość kosmków jelita czczego Średnia długość kosmków jelita biodrowego Średnia długość krypty jelitowej jelita czczego Średnia długość krypty jelitowej jelita biodrowego Grupa kurcząt [mm] K0/25 1,27 0,736 0,347 0,25 K1 1,129 0,73 0,26 0,19 K0/35 1,19 0,817 0,23 0,20 K2 1,038 0,63 0,18 0,13
Ryc. 17. Kosmki jelita czczego kurcząt kontrolnych (K-0). Prawidłowo ukształtowane, smukłe, palczaste kosmki. H&E. Pow. x100
Ryc. 18. Kosmki jelita czczego kurcząt doświadczalnych (K-1).
Ryc. 19. Błona śluzowa jelita czczego kurcząt doświadczalnych (K2). Znaczne skrócenie i deformacja kosmków. H&E. pow. x 100
Ryc. 20. Błona śluzowa jelita czczego kurcząt doświadczalnych (K2). Torbielowate poszerzenie krypt wypełnionych detrytus oraz masywne nacieki zapalne w zrębie mezenchymalnym. H&E. pow. x 200
Ryc 21. Średnia długość kosmków jelita czczego kurcząt
Tab. 9. Średnia długości kosmków jelita czczego K0/25 K1 K0/35 K2 Średnia 1,27 0,624** 1,19 0,612** Błąd standardowy 0,056 0,035 0,117 0,047 Odchylenie Standardowe 0,126 0,113 0,262 0,142 Liczebność 5 10 5 9 p < 0,05
Ryc. 22 Średnia długość krypt jelita czczego kurcząt.
Tab. 10. Średnia długość krypt jelita czczego K-0/25 K-1 K-0/35 K-2 Średnia 0,347 0,141** 0,23 0,117** Błąd Standardowy 0,05 0,009 0,018 0,014 Odchylenie Standardowe 0,114 0,028 0,04 0,042 Liczebność 5 10 5 9
Z obliczeń statystycznych wynika, że średnia długości kosmków jelita czczego: - w grupie K1 nie różniła się istotnie od średniej grupy K0,
- w grupie K2 różniła się istotnie na poziomie α=0,05.
W jelicie biodrowym kosmki są fizjologiczne krótsze niż w jelicie czczym. W grupie ptaków kontrolnych średnia długość kosmków wynosiła 0,78 mm przy czym nie miały one tak smukłego wyglądu jak w jelicie czczym. W nabłonku liczne były komórki kubkowe oraz średnio liczne migrujące limfocyty (Ryc. 21, 23). Krypty drobne głębokości 0,22 mm (Ryc. 22), a zrąb mezenchymalny prawidłowo wykształcony.
U ptaków grupy doświadczalnej K-1 kosmki były nieznacznie tylko skrócone (0,73 mm) i uzyskiwały bardziej liściasty kształt wynikający z ich pogrubienia i nierównej wrębiastej powierzchni. Wzmożona była także liczba komórek zrębu mezenchymalnego. W
nabłonku kosmków bardzo liczne komórki kubkowe i średnio liczne migrujące przez nabłonek limfocyty. Nieznacznie skrócone były także krypty jelitowe (0,19 mm). Ptaki doświadczalne K-2 przedstawiały podobny obraz jelita biodrowego jak w grupie K1 jednak nieco bardziej nasilone było skrócenie kosmków (0,63 mm) i krypt (0,13 mm) (Ryc. 24, 25, 26, Tab. 8, 9). Z obliczeń statystycznych wynika, że średnie długości kosmków w jelicie biodrowym nie różniły się istotnie między sobą w grupach K-0, K-1, K-2. Podobnie średnie długości krypt jelita biodrowego nie różniły się między sobą istotnie.
Ryc. 23. Błona śluzowa jelita biodrowego kurcząt doświadczalnych (K-1). Znaczne skrócenie i deformacja i kosmków oraz nacieki zapalne zrębu mezenchymalnego. H-E, pow. x 100
Ryc. 25. Średnia długość kosmków jelita biodrowego.
p<0,05
Ryc. 24. Błona śluzowa jelita biodrowego kurcząt doświadczalnych (K-2). Skrócenie kosmków i znaczne wzmożenie liczby komórek kubkowych. H-E. Pow. x100
Tab. 11. Średnia długość kosmków jelita biodrowego. K-0/25 K-1 K-0/35 K-2 Średnia 0,736 0,379** 0,817 0,412** Błąd standardowy 0,039 0,016 0,045 0,031 Odchylenie Standardowe 0,087 0,051 0,101 0,098 Liczebność 5 10 5 10
Ryc 26 Średnia długość krypt jelita biodrowego.
Tab. 12. Średnia długość krypt jelita biodrowego. K-0/25 K-1 K-0/35 K-2 Średnia 0,255 0,092** 0,20 0,091** Błąd Standardowy 0,028 0,0051 0,024 0,0056 Odchylenie Standardowe 0,063 0,016 0,054 0,017 Liczebność 5 10 5 10
Obraz mikroskopowy torby Fabrycjusza kurcząt grupy kontrolnej (K-0) przedstawiał prawidłową budowę histologiczną. Grudki chłonne odpowiedniej wielkości i kształtu zbudowane z gęsto ułożonych limfocytów. Poszczególne grudki oddzielone są wąskimi pasemkami śródmiąższowej tkanki łącznej. Fałdy torby Fabrycjusza pokrywa regularny, dobrze zachowany nabłonek pryzmatyczny (Ryc. 27).
U kurcząt doświadczalnych grupy K-1 stwierdzono w centralnych obszarach zanik limfocytów z tendencją do rozszerzania w kierunku obwodowym. Tkanka łączna pomiędzy grudkami przedstawiała cechy umiarkowanego obrzęku. (Ryc. 28).
Ryc. 27. Torba Fabrycjusza kurcząt grupy K-0 przedstawia prawidłową strukturę histologiczną. H-E. Pow. x 200
Grudki chłonne torby Fabrycjusza kurcząt doświadczalnych grupy K-1 były mniejsze niż u zwierząt kontrolnych. Znacznemu zmniejszenie uległa również liczba znajdujących się w nich limfocytów. Na obwodzie grudek chłonnych pojawiają się niewielkie nacieki zapalne ze znacznym odsetkiem heterofilów (Ryc. 28). U kurcząt doświadczalnych (grupy K-2) w centrum grudek zaznacza się silny zanik utkania limfatycznego obejmujący stopniowo także obszary obwodowe. W centrum grudek u 1/3 badanych ptaków formowały się torbielowate struktury wypełnione kwaśnymi mukopolisacharydami (Ryc.30). U kurcząt (grupy K-2) utkanie limfatyczne grudek chłonnych wykazywało silniejszy stopień zaniku niż w grupie K-1 (Tab. 13) (Ryc. 29). Również tkanka łączna otaczająca grudki chłonne jest bardziej obrzękła (Ryc. 30).
Ryc. 28. Torba Fabrycjusza kurcząt grupy K-1. Wyraźnie widoczna deplecja limfocytów w centrum grudek chłonnych. H-E. Pow. X 200.
A
A
A
Ryc. 29. Torba Fabrycjusza kurcząt grupy K-2. W centrum grudek chłonnych widoczna nasilona apoptoza limfocytów. H-E. Pow. X 200.
Ryc. 30. Torba Fabrycjusza kurcząt grupy K-2.W grudkach widoczne torbielowate struktury (A) wypełnione kwaśnymi mukopolisacharydami. Pow. x 200.
Tabela 13. Średnie wymiary grudek chłonnych kurcząt grup K-0, K-1 oraz K-2 średnie długości grudek chłonnych średnie szerokości grudek chłonnych średnia powierzchnia grudek chłonnych2 K-0/25 K-0/35 K-1 K-2 K-0/25 K-0/35 K-1 K-2 K-0/25 K-0/35 K-1 K-2 1- K-0/25 0,752 0,688 0,57 0,33 0,26 0,22 2 0,81 0,725 0,7 0,35 0,35 0,3 3 0,915 0,77 0,67 0,3 0,32 0,42 4 0,887 0,77 0,52 0,32 0,34 0,23 5 0,915 0,76 0,52 0,37 0,22 0,28 6-K-0/35 1,1 0,79 0,67 0,36 0,4 0,3 7 1,13 0,626 0,55 0,37 0,29 0,32 8 1,12 0,62 0,78 0,43 0,26 0,31 9 1 0,67 0,71 0,44 0,31 0,31 10 0,8 0,6 0,8 0,36 0,27 0,35 Średnia 0,8558 1,0108 0,702** 0,649** 0,334 0,388 0,302* 0,304* 0,224 0,269 0,166 0,155 Odchylenie Standardowe 0,125 0,137 0,07 0,1035 0,0442 0,0387 0,0528 0,0568
Ryc. 31. Średnia wielkość grudek chłonnych torby Fabrycjusza ptaków (mm2)
U ptaków kontrolnych struktura śledziony wykazuje prawidłową budową histopatologiczna. Zarówno ilość jak i wielkość grudek chłonnych śledzionowych jest zachowana.
U kurcząt doświadczalnych grupy K-1 nie zauważono wyraźnych zmian histopatologicznych. Natomiast u kurcząt doświadczalnych grupy K-2 widoczny był umiarkowany zanik komórek limfocytarnych na obwodzie grudek chłonnych postępujący w kierunku centrum grudki. Grudki chłonne uzyskują często nieregularny kształt. Miejscami obserwuje się rozrzedzenie i zanik utkania limfatycznego.
W nerkach kurcząt obu grup kontrolnych nie stwierdzono zmian histopatologicznych. Struktura histologiczna kanalików nerkowych zachowana (Ryc. 32). U kur doświadczalnych grupy K-1 nabłonki kanalików nerkowych były obrzmiałe powodując zmniejszenie światła kanalików. W świetle kanalików nerkowych miejscami stwierdzono obecności wałeczków białkowych lub złuszczonych nabłonków (Ryc. 33). W tkance
śródmiąższowej obserwuje się nacieki komórek zapalnych złożone z limfocytów i
histiocytów (Ryc. 33, 34).
W grupie kurcząt doświadczalnych K-2 zmiany histopatologiczne nerek są bardziej nasilone niż w grupie K-1. Nabłonki kanalików nerkowych są obrzmiałe powodując znaczne zwężenie światła kanalika, a ziarnista cytoplazma ogranicza widoczność jądra komórkowego. Pojedyncze komórki nabłonkowe ulegają rozpadowi. Naczynia krwionośne są rozszerzone wypełnione erytrocytami (Ryc. 33, 34). Ponadto w tkance łącznej śródmiąższowej obecne są obfite nacieki zapalne (Ryc. 34).
A
B
B
A
B
B
Ryc. 33. Nerka kurcząt grupy K-1. Widoczne obrzmienie komórek nabłonka kanalików nerkowych (A) oraz obecność złuszczonych nabłonków w świetle kanalików (B). H-E. Pow. x 400.
Ryc. 34. Nerka kurcząt grupy K-2. Widoczne obrzmienie i rozpad komórek nabłonka (B) oraz masywne nacieki zapalne w tkance śródmiąższowej (A). H-E. Pow. x 400.
Wątroba kurcząt kontrolnych nie wykazywała zmian histopatologicznych. Hepatocyty są kształtu i wielkości prawidłowej z dobrze widocznymi jądrami. Wokół większych naczyń obecne są niewielkie nacieki limfocytarne. Struktura układu naczyniowego wątroby zachowana. W świetle naczyń obecne liczne erytrocyty (Ryc. 35) . U kurcząt doświadczalnych zarówno grupy K-1 jak i K-2 komórki wątrobowe były obrzękłe, a ich cytoplazma zawierała liczne ziarnistości ograniczające widoczność jądra. Miejscami widoczne były niewielkie nacieki komórek zapalnych złożone główne z limfocytów, histiocytów i heterofilów (Ryc. 36, 37).
A
Ryc. 35. Wątroba kurcząt kontrolnych. Prawidłowa struktura histologiczna. Widoczne niewielkie nacieki okołonaczyniowe (A). H&E. Pow. x 100.
B
A
A
B
Ryc. 36. Wątroba kurcząt grupy K-1.
Przyćmienie miąższowe hepatocytów (B) oraz drobne nacieki zapalne (A). H-E. Pow. x 100
Ryc. 37. Wątroba kurcząt grupy K-2.
Przyćmienie miąższowe hepatocytów (B) oraz infiltracja komórek zapalnych (A). H-E. Pow x 100.
Badania histopatologiczne kości piszczelowej wykazały, że u 25 dniowego zdrowego kurczęcia od strony okostnej zaznacza się wysoka aktywność komórek osteogennych (Ryc. 38). Okostna w tym miejscu jest zgrubiała, zbudowana z kilku warstw wyraźnie odstających od kości. Pomiędzy włóknami kolagenowymi okostnej obserwuje się liczne osteoblasty formujące nowe beleczki tkanki kostnej. Pomiędzy beleczkami widoczne są naczynia krwionośne wypełnione krwią.
W części centralnej ściany kości na powierzchni zatok resorpcyjnych widoczne są liczne osteoblasty „zabudowujące” wcześniej zresorbowane fragmenty (Ryc. 42). Za proliferującymi osteoblastami postępują angioblasty, tworząc pęczek naczyniowy, z którego rozwiną się naczynia krwionośne osteonu. Nowe blaszki kostne wyraźnie odgraniczają nowopowstałą kość od starej. Osteoblasty w tych miejscach ułożone są w taki sposób, że przypominają nabłonek płaski lub sześcienny. U ptaków, niezwykle rzadko komórki te układają się w kilka rzędów, co teoretycznie umożliwia powstawanie kilku blaszek w jednakowym czasie jak ma to miejsce np. u psów czy owiec. Konsekwencją tak postępujących procesów jest w 35 dniu (K0/35) dobrze rozwinięta tkanka kostna nabudowana przez apozycję od strony okostnej. Powstałe tutaj beleczki kostne ulegają zarastaniu. Procesom kościotwórczym towarzyszy silna angiogeneza, co prowadzi do powstania nowych generacji osteonów. Ich przebieg w odróżnieniu od kości pierwotnej jest zazwyczaj okrężny w stosunku do osi długiej (Ryc. 40). Od strony jamy szpikowej w wyniku działania komórek linii osteoklastycznej dochodzi do powolnego poszerzania jamy szpikowej (Ryc. 43, 44).
Liczba miejsc w których zachodzi resorpcja kości jest mniejsza niż w 25 dniu. W części centralnej ściany kości piszczelowej, na powierzchni beleczek kostnych obecne są komórki powierzchni kości co świadczy o zaprzestaniu w tym miejscu procesów kościotworzenia. W grupie eksperymentalnej (K-1), w 25 dniu życia po 10 dniach podawania ochratoksyny A zaznacza się drastyczny spadek liczby komórek kościotwórczych zarówno od strony okostnej jak i wewnątrz kości (Ryc. 39). Resorpcja od strony jamy szpikowej utrzymuje się na podobnym poziomie jak u ptaków zdrowych. Konsekwencją tych zmian jest zahamowanie kościotworzenia od strony okostnej. Po 20 dniach podawania ochratoksyny (grupa K2) dochodzi do istotnych zaburzeń w strukturze kości. W wyniku utrzymującej się stałej osteoresorpcji i słabemu kościotworzeniu nie obserwuje się odokostnowego odtworzenia kości. Tkanka kostna zachowuje swój pierwotny układ. Nie tworzą się osteony o przebiegu okrężnym. Od strony nadal silnie
spłaszczonej okostnej obserwuje się osteoblasty wypełniające puste przestrzenie powstałe w wyniku pierwotnego formowania kości (Ryc. 41).
Natomiast szpik kostny ptaków grup doświadczalnych wykazuje tylko nieznaczne zaburzenia. Liczba koloni krwiotwórczych jest mniejsza niż w kontroli zarówno w 10 jak i 20 dniu eksperymentu. W obrazie histologicznym przedstawia się to jako „przerzedzenia” w szpiku kostnym, dzięki którym widać komórki zrębu oraz komórki tłuszczowe (Ryc. 45).
O
BK
Ryc. 38. Kość ptaka grupy kontrolnej (K-0/25) od strony okostnej (O). Widoczne są przykryte okostną nowopowstałe beleczki kostne (BK), na powierzchni których licznie występują osteoblasty. H-E Pow. 200x
O
O
KP
Ryc. 39. Kość ptaków doświadczalnych grupy K-1. Widoczna jest, silnie spłaszczona okostna (O) i kość pierwotna (KP). Brak proliferacji osteoblastów. H-E pow x 200
Ryc. 40. Przekrój przez kość ptaków grupy kontrolnej (K-0/35) od strony okostnej. Widoczna okostna (O) zbudowana z dwóch warstw oraz kość powstała w wyniku odokostnowego kościotworzenia (KO). Pomiędzy wytworzonymi beleczkami kostnymi liczne osteoblasty (strzałka) H-E pow x
KP
O
Ryc. 41. Kość ptaków grupy doświadczalnej K-2. Widoczna silnie spłaszczona okostna zbudowana z tkanki łącznej (O). Od niej, w głąb kości wnikają osteoblasty które zabudowują przestrzenie pomiędzy beleczkami kości pierwotnej (strzałka). H-E pow. x 200
Ryc. 42. Kość ptaka grupy kontrolnej (K-0/35). Osteoblasty (strzałka) zabudowują przestrzenie pomiędzy beleczkami kości pierwotnej (KP). H-E pow. x 400
