Praca oryginalna Original paper
Bakterie z gatunku Clostridium perfringens stano-wi¹ czynnik etiologiczny wielu chorób cz³owieka i zwierz¹t (6, 18, 24). Zró¿nicowanie objawów choro-bowych wywo³ywanych przez te drobnoustroje zwi¹-zane jest z aktywnoci¹ wytwarzanych przez nie tok-syn. Zdolnoæ wytwarzania czterech tzw. g³ównych toksyn letalnych o symbolach á, â, å, é umo¿liwia roz-ró¿nienie w obrêbie gatunku Cl. perfringens piêciu typów toksynogennych, oznaczanych jako A, B, C, D, E (27, 28). Poza wymienionymi toksynami drobno-ustroje omawianego gatunku posiadaj¹ zdolnoæ wy-twarzania kilkunastu innych. Mog¹ one odgrywaæ istot-n¹ rolê w patogenezie zaka¿eñ wywo³ywanych przez Cl. perfringens, choæ nie maj¹ znaczenia przy typo-waniu tych drobnoustrojów. Najczêciej wymieniany-mi sporód wspomnianej grupy toksyn s¹: enterotok-syna (CPE) oraz odkryta niedawno tokenterotok-syna â2 (CPB2) (12, 28).
Znaczenie poszczególnych typów toksynogennych Cl. perfringens w etiologii zaka¿eñ wywo³ywanych u ludzi i ró¿nych gatunków zwierz¹t jest niejedna-kowe. U wiñ najczêciej opisywane s¹ zaka¿enia wywo³ywane przez Cl. perfringens typu C i typu A (27, 28).
Pierwszy z wymienionych jest czynnikiem etiolo-gicznym zakanego martwicowego zapalenia jelit pro-si¹t, nazywanego równie¿ zakan¹ enterotoksemi¹ prosi¹t (enterotoxaemia infectiosa porcellorum) (6, 22, 27, 28). Objawy kliniczne choroby stwierdza siê u pro-si¹t zwykle w pierwszym tygodniu ¿ycia (najczêciej w ci¹gu pierwszych 3 dni po urodzeniu). Zale¿nie od postaci choroby u prosi¹t obserwuje siê krwawe bie-gunki o ró¿nym nasileniu. Ich konsekwencj¹ jest od-wodnienie i wyniszczenie zwierz¹t, prowadz¹ce nie-rzadko do zejæ miertelnych w ci¹gu 1-3 dni. Spoty-kane s¹ równie¿ przypadki poprzedzonych zapaci¹ nag³ych padniêæ.
Zapalenia jelit wywo³ane przez Cl. perfringens typu A mog¹ wystêpowaæ u prosi¹t w pierwszym tygodniu ¿ycia, jak te¿ u starszych osobników, równie¿ po od-sadzeniu. Maj¹ one zwykle przebieg ³agodniejszy od wywo³ywanych przez szczepy Cl. perfringens typu C (5, 27, 28). Rozpoznanie metodami laboratoryjnymi Cl. perfringens typu A jako czynnika etiologicznego w konkretnych przypadkach zw³aszcza u starszych zwierz¹t jest utrudnione z powodu wystêpowania tych drobnoustrojów w sk³adzie normalnej flory jelitowej wiñ. Jako wskazanie do podejrzeñ w tym kierunku wymienia siê np. stwierdzenie w posiewach
intensyw-Cechy fenotypowe i genotypowe szczepów
Clostridium perfringens izolowanych
od prosi¹t ss¹cych*
)
BERNARD WASIÑSKI, ZYGMUNT PEJSAK
Zak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Wasiñski B., Pejsak Z.
Evaluation of phenotypic and genotypic features of Clostridium perfringens strains isolated from suckling piglets
Summary
The aim of present study was to determine á and â toxin expression as well as the prevalence of á, â, å, é, â2 toxin genes and the enterotoxin gene of Clostridium perfringens strains isolated from suckling piglets with diarrhea. Rectal swabs, feces samples and intestine sections originating from 15 farms were examined during the study. All isolated through ELISA Cl. peringen strains demonstrated á toxin expression and none of them demonstrated â toxin. All isolates were positive for the á and negative for the â, å, é and enterotoxin gene, implying that only non-enterotoxigenic type A strains were detected. Over 41% of the isolates demonstrated â2 toxin gene. The â2 positive strains were isolated from samples originating from 9 farms. The lack of type C strains among isolates collected during the study was also noted, as well as the different intensity of patho-logical changes in the intestines of piglets from which â2 positive strains were isolated.
Keywords: Clostridium perfringens, diarrhea, pig
nego wzrostu szczepów typu A i wykazanie u nich do-datkowo zdolnoci wytwarzania CPB2 (28).
Diagnostyka laboratoryjna zaka¿eñ wywo³ywanych przez Cl. perfringens oprócz potwierdzenia przyna-le¿noci gatunkowej wyizolowanych szczepów, maga okrelenia ich typu toksycznego i zdolnoci wy-twarzania poszczególnych toksyn.
U¿ywany przy standardowych sposobach typowa-nia Cl. perfringens odczyn seroneutralizacji toksyn jest, mimo swoich zalet, metod¹ uci¹¿liw¹ i d³ugotrwa³¹. Wymaga znacznych iloci toksyny, swoistych surowic, a tak¿e wykorzystania zwierz¹t laboratoryjnych, co przy obecnych uwarunkowaniach prawnych mo¿e stwarzaæ dla niektórych laboratoriów dodatkowe utrud-nienia. Jako metoda alternatywna w ostatnich latach coraz czêciej proponowana jest reakcja polimeryzacji ³añcuchowej (PCR) (2, 3, 7, 19, 21). W odniesieniu do Cl. perfringens wykorzystywana jest ona zwykle do wykrywania genów poszczególnych toksyn u wy-izolowanych szczepów.
Wród metod umo¿liwiaj¹cych stwierdzenie ekspre-sji wybranych genów koduj¹cych toksyny omawianych drobnoustrojów coraz czêciej wykorzystywany jest enzymatyczny odczyn immunoadsorpcyjny (ELISA). Dostêpne na rynku zestawy ELISA pozwalaj¹ na wy-krywanie, miêdzy innymi, obecnoci toksyn á, â i en-terotoksyny. Zalet¹ wykorzystania obu wspomnianych metod w rozpoznawaniu zaka¿eñ wywo³ywanych przez Cl. perfringens jest, oprócz usprawnienia pro-cesu diagnostycznego, mo¿liwoæ odst¹pienia od ba-dañ prowadzonych na zwierzêtach laboratoryjnych.
Celem badañ by³a charakterystyka wybranych cech fenotypowych i genotypowych szczepów Cl. perfrin-gens izolowanych od prosi¹t ss¹cych wykazuj¹cych objawy biegunki oraz próba oceny wystêpowania drob-noustrojów wymienionego gatunku u prosi¹t.
Materia³ i metody
Pobieranie próbek. Materia³ do badañ pochodzi³ z 15 ferm (o symbolach od P 1 do P 15), w których stwierdzano wystêpowanie biegunek u prosi¹t w wieku 1-10 dni. Gos-podarstwa te usytuowane by³y na terenie województw: lu-belskiego, ³ódzkiego, mazowieckiego, pomorskiego, wiê-tokrzyskiego i wielkopolskiego.
Z ka¿dej z ferm przesy³ano do badañ po 4-6 wymazów z prostnicy lub próbek ka³u. W przypadku wyst¹pienia zejæ miertelnych dodatkowo przesy³ano po 1-3 wycinków jelit lub pad³ych prosi¹t. Do pobierania materia³u od prosi¹t u¿ywano wymazówek transportowanych w pod³o¿ach aga-rowych z wêglem drzewnym (prod. Copan, W³ochy). Próbki ka³u i wycinki jelit pobierano do szczelnie zamykanych plastikowych pojemników, które umieszczano na czas trans-portu w izolowanych termicznie opakowaniach, umo¿liwia-j¹cych sch³odzenie przewo¿onego materia³u.
Badania. Z przes³anych próbek wykonywano posiewy na pod³o¿a mikrobiologiczne. Szczepy podejrzane o przy-nale¿noæ do gatunku Cl. perfringens po wyizolowaniu poddawano badaniom mikroskopowym (preparaty
barwio-ne metod¹ Grama) (ryc. 1), biochemicznym oraz typowa-niu metod¹ PCR. Zidentyfikowane szczepy Cl. perfringens badano w kierunku zdolnoci wytwarzania toksyn á i â z u¿yciem metody ELISA.
Hodowla szczepów. Do izolacji i hodowli szczepów Cl. perfringens wykorzystywano selektywny agar TSC z peptonem tryptozowym, dwusiarczanem sodowym, cykloseryn¹ i emulsj¹ ¿ó³tka jaja kurzego (prod. Oxoid), agar Columbia z dodatkiem 5% krwi owczej i bulion Wrzo-ska. Do uzyskiwania warunków beztlenowych dla hodowli na pod³o¿ach sta³ych wykorzystywano zestawy systemu AnaeroGen firmy Oxoid. Zestawy te wraz z zainokulowa-nymi pod³o¿ami umieszczano w szczelnych pojemnikach poliwêglanowych o pojemnoci 2,5 dm3 lub 3,5 dm3, które
wstawiano do cieplarki. Warunki beztlenowe dla hodowli w pod³o¿ach p³ynnych uzyskiwano przez pokrycie ich war-stw¹ parafiny. Inkubacjê hodowli na obu rodzajach pod³o-¿y prowadzono w temperaturze 37°C.
Badania biochemiczne. Do identyfikacji szczepów Cl. perfringens na podstawie w³aciwoci biochemicznych wykorzystywano zestawy Api ID32 A (prod. Biomerieux, Francja).
Ekstrakcja DNA. Do pozyskiwania matrycowego DNA ze szczepów referencyjnych i izolatów terenowych wyko-rzystywano metodê termiczn¹ przygotowan¹ na podstawie procedury opisanej przez Møllera i Ahrensa (21). Z czys-tych hodowli na pod³o¿ach sta³ych pobierano 1-2 kolonie, które zawieszano w 200 µl buforu PBS. Zawiesinê goto-wano przez 10 min., a po sch³odzeniu wirogoto-wano j¹ przy prêdkoci 10 000 obr./min. przez 20 s. Supernatant roz-cieñczano w wodzie dejonizowanej w stosunku 1 : 10 i w takiej postaci wykorzystywano go jako ród³o matrycowe-go DNA.
Amplifikacja DNA. Do amplifikacji wykorzystano ze-staw starterów zaproponowany przez Songera i Bueschela
plexprocedure.pdf). Umo¿liwia³ on wykrywanie genów 4 toksyn g³ównych oraz CPB2 i CPE. Opisy starterów po-dano w tab. 1. Wszystkie startery stosowane by³y w reakcji multiplex PCR.
Mieszanina reakcyjna w objêtoci 50 µl zawiera³a: 3 µl zawiesiny matrycowego DNA, 5 µl 10 × stê¿onego buforu Tris-HCl (o pH 8,8 w temp. 25°C) (prod. Fermentas, Litwa), po 0,25 µM ka¿dego ze starterów, 3,0 mM MgCl2 (prod. Fermentas, Litwa), 0,2 mM mieszaniny dNTP (prod. Fermentas, Litwa) i 1,5 jednostki polimerazy Taq DNA Polymerase (prod. Fermentas, Litwa).
Amplifikacjê prowadzono w termocyklerze T3 Thermo-cycler (prod. Biometra) w nastêpuj¹cych warunkach: wstêp-na dewstêp-naturacja DNA 94°C 3 min., 34 cykle dewstêp-naturacji (1 min. 94°C), przy³¹czenie starterów (1 min. 55°C) i wyd³u¿anie starterów (1 min. 72°C). Koñcowe wyd³u-¿anie produktów amplifikacji prowadzono przez 10 min. w temperaturze 72°C.
Elektroforeza produktów PCR. Produkty PCR podda-wano elektroforezie w 2% ¿elu agarozowym. Do baseni-ków w ¿elu wprowadzano po 10 µl mieszaniny poreakcyj-nej i 2 µl buforu obci¹¿aj¹cego. Elektroforezê prowadzono przez oko³o 30 min. w buforze 1 × TAE przy sta³ym natê-¿eniu 350 mA. ¯el barwiono w roztworze bromku etydyny o stê¿eniu 1 µl/ml. Wielkoæ produktów oceniano przez porównanie z markerem masy molekularnej Gene-RulerTM
100 bp DNA Ladder Plus (prod. Fermentas, Litwa). Badania przy u¿yciu ELISA. Zdolnoæ wytwarzania toksyn przez wyizolowane szczepy Cl. perfringens badano przy u¿yciu zestawów Bio-X Alpha Toxin Elisa Kit i Bio-X Bbeta Toxin Elisa Kit (prod. Bio-X Diagnostics, Belgia).
Wyniki i omówienie
Z przes³anego materia³u wyizolowano ³¹cznie 39 szczepów Cl. perfringens. Próbki dodatnie, z których dokonano izolacji omawianych drobnoustrojów po-chodzi³y ze wszystkich 15 objêtych badaniami ferm (tab. 2). Badanie metod¹ PCR (ryc. 2) wykaza³o wy-stêpowanie koduj¹cego toksynê á genu plc u wszyst-kich wyizolowanych szczepów. U ¿adnego z tych izo-latów nie stwierdzono obecnoci genów pozosta³ych
toksyn g³ównych. Wyniki te wskazuj¹ na przynale¿noæ omawianych szczepów Cl. perfringens do typu A. U 16 szczepów tej grupy, pochodz¹cych z 9 ferm, stwier-dzono wystêpowanie genu toksyny â2. U ¿adnego z izolatów nie stwierdzono wy-stêpowania genu cpe koduj¹cego entero-toksynê.
Badanie testem ELISA wykaza³o eks-presjê toksyny á Cl. perfringens u wszyst-kich wyizolowanych szczepów. Wyniki te stanowi³y potwierdzenie dla obserwowa-nego w trakcie hodowli ka¿dego z tych szczepów na agarze TSC z dodatkiem ¿ó³t-ka zjawis¿ó³t-ka zmêtnienia pod³o¿a wokó³ ko-lonii, zwi¹zanego z aktywnoci¹ lecyty-nazy charakterystyczn¹ dla wytwarzanej przez te drobnoustroje toksyny á. U ¿ad-nego z omawianych izolatów nie stwier-dzono metod¹ ELISA ekspresji toksyny â, co stanowi potwierdzenie wyników PCR.
Wszystkie szczepy Cl. perfringens izolowane z prze-s³anych próbek wykazywa³y cechy typu toksycznego A. Interesuj¹cy jest brak przypadków izolacji Cl. per-fringens typu C szczególnie w zestawieniu z faktem pochodzenia próbek od wykazuj¹cych biegunki pro-si¹t w wieku 1-10 dni. Przy wyjanieniu przyczyn ta-kich wyników nale¿y braæ pod uwagê kilka czynni-ków. Jednym z istotniejszych wydaje siê coraz szer-sze ostatnio stosowanie w profilaktyce biegunek pro-si¹t szczepionek skojarzonych przeciwko zaka¿eniom
a n y s k o T Sekwencjestatrerów ampDil³ifukgoowaænego A N D u t n e m g a rf Pimiennictwo a 55''CGCCTTCATAGTGATTTAACACTTGCGCTCGGTTATAGGA''33 324pz 29 b 5'GCGAATATGCTGAATCATCTA'3 3 ' C T T C T A T A T G A T T A C A A G G A C G ' 5 196pz 16 e 5'GCGGTGATATCCATCTATTC'3 3 ' C A A T C A T C C T G T T C A T T C A C C ' 5 655pz 17 i 5'ACTACTCTCAGACAAGACAG'3 3 ' G C A T A T C A T T A T C T T C C T T T C ' 5 446pz 23 b2 5'AGATTTTAAATATGATCCTAACC'3 3 ' C T C A T A A A C C A C T T C C C A T A A C ' 5 567pz 12 a n y s k o t o r e t n e 55''GGGGAACGCAATGGGCTATGGTTGGATTAAGTTAATAG'G3'3 233pz 19
Tab. 1. Charakterystyka stosowanych w reakcji multiplex PCR starterów umo¿liwiaj¹cych amplifikacjê fragmentów genów koduj¹cych poszczególne toksyny Cl. perfringens
Tab. 2. Charakterystyka genotypowa szczepów Cl. perfrin-gens izolowanych od prosi¹t ss¹cych z poszczególnych ferm
a m r e F Wojewódtzwo LCic.lzpbeafrziironlgaetónws h c y c ¹ j u z a k y w w ó t a l o zi a b z c i L n y s k o t w ó n e g æ o n c e b o a b b2 1 P wiêtokrzyskie 2 2 2 2 P lubelskie 4 4 4 3 P lubelskie 1 1 1 4 P lubelskie 1 1 1 5 P lubelskie 3 3 2 6 P ³ódzkie 3 3 7 P lubelskie 2 2 8 P pomorskie 3 3 9 P mazowieckie 1 1 0 1 P mazowieckie 5 5 1 1 P wielkopolskie 3 3 1 2 1 P wielkopolskie 3 3 3 1 P wielkopolskie 4 4 2 4 1 P wielkopolskie 2 2 1 5 1 P lubelskie 2 2 2 m e z a R 39 39 16
wywo³ywanym przez Escherichia coli oraz Cl. per-fringens typ C.
Innym czynnikiem, zwi¹zanym bardziej z technicz-nymi aspektami izolacji Cl. perfringens, jest wystêpo-wanie koduj¹cego toksynê â genu cpb na plazmidzie. Warunkuje to znaczne prawdopodobieñstwo utraty wspomnianego genu w trakcie pasa¿owania na pod³o-¿ach mikrobiologicznych. Chocia¿ w trakcie izolacji z materia³u terenowego liczbê pasa¿y przed zastoso-waniem metody PCR ograniczano do niezbêdnego minimum, nie mo¿na wykluczyæ wp³ywu wspomnia-nego czynnika na skutecznoæ wykrywania nios¹cych gen cpb szczepów typu C lub B.
W badaniach przegl¹dowych stad wiñ szczepy Cl. perfringens typu C izolowane s¹ rzadziej ni¿ szcze-py typu A (6, 7, 28, 30). Wynika to, miêdzy innymi, z faktu, ¿e Cl. perfringens typu A wchodzi w sk³ad normalnej flory przewodu pokarmowego tych zwie-rz¹t. Prezentowane w ostatnich latach przez autorów z wielu krajów wyniki badañ coraz czêciej wydaj¹ siê wskazywaæ na istotn¹ rolê szczepów Cl. perfrin-gens typu A w etiologii zaka¿eñ przewodu pokarmo-wego wiñ (1, 3, 7, 11, 15, 19, 26, 30). Jedn¹ z zasad-niczych przyczyn tego stanu mo¿e byæ brak szczepio-nek dla wiñ umo¿liwiaj¹cych profilaktykê zaka¿eñ wywo³ywanych przez Cl. perfringens typ A.
Badania metod¹ PCR nie wykaza³y wystêpowania genu enterotoksyny (cpe) u ¿adnego z badanych szcze-pów terenowych. Dane z pimiennictwa wskazuj¹, ¿e rozpowszechnienie szczepów nios¹cych cpe lub wy-kazuj¹cych zdolnoæ wytwarzania CPE bywa wród prosi¹t zró¿nicowane i waha siê od 0% do oko³o 25% pozyskiwanych izolatów (4, 10, 19, 27). W przeciwieñ-stwie do szczepów Cl. perfringens izolowanych od
ludzi, gdzie cpe zlokalizowany jest zwykle na chromosomie u izolatów pochodz¹cych od zwierz¹t, wymie-niony gen ulokowany jest czêciej na plazmidzie (8, 25). Mo¿e to, podob-nie jak w przypadku genu cpb, wp³y-waæ na obni¿enie liczby identyfiko-wanych szczepów cpe +.
U ponad 41% wyizolowanych w ba-daniach szczepów stwierdzono obec-noæ genu cpb2 koduj¹cego toksynê â2. Prowadzone w ostatnich latach badania wykaza³y, ¿e cpb2 mo¿e wy-stêpowaæ u szczepów nale¿¹cych do ró¿nych typów toksycznych Cl. per-fringens. Obecnoæ wspomnianego genu stwierdzano m.in. u izolatów po-chodz¹cych z próbek materia³u pozy-skiwanych od koni (14), byd³a i ma-³ych prze¿uwaczy (11, 13, 20). Od wiñ szczepy takie izolowane s¹ czê-ciej ni¿ od innych gatunków zwierz¹t (3). Gen cpb2 wykrywano zarówno u izolatów nale¿¹cych do typu tok-sycznego A, jak i typu C (3, 12, 19, 26, 30). Klaasen i wsp. (19) w badaniach 44 prosi¹t z objawami bie-gunki pochodz¹cych z 18 ferm wyizolowali od 18 (41%) z nich szczepy Cl. perfringens wykazuj¹ce obec-noæ genu plc koduj¹cego toksynê á oraz genu cpb2. Prowadzone przez Watersa i wsp. (30) badania 21 szczepów Cl. perfringens typu A izolowanych od pro-si¹t z biegunk¹ wykaza³y obecnoæ cpb2 u 20 z nich. W innych badaniach amerykañscy autorzy (3), bada-j¹c kilkaset szczepów typu A izolowanych od prosi¹t z biegunk¹, stwierdzili wystêpowanie cpb2 u prawie 91% z nich. Oba wspomniane zespo³y (3, 30) wyka-za³y równie¿ wystêpowanie cpb2 u szczepów typu A izolowanych od wiñ nie wykazuj¹cych objawów cho-robowych. Ich liczba by³a jednak ni¿sza.
W odniesieniu do wyników badañ w³asnych nale¿y zwróciæ uwagê, ¿e wyizolowane szczepy wykazuj¹ce obecnoæ cpb2 pochodzi³y z przypadków o zró¿nico-wanym przebiegu i obrazie zmian patologicznych. Szczepy z ferm P 1, P 3 i P 4 pozyskano z przypadków o przebiegu ostrym. Szczep z fermy P 3 izolowano ze zmian krwotoczno-martwicowych b³ony luzowej je-lita czczego, a szczep z fermy P 4 ze zmian za-palnych o charakterze krwotocznym bez martwicy. W fermach P 7, P 13 i P 14 omawiane szczepy wyizo-lowano ze zmian zapalnych o charakterze luzowym. Izolaty cpb2 + z ferm P 2 i P 5, a równie¿ jeden z izolatów z fermy P 14 wyosobniono z wymazów lub próbek ka³u o konsystencji od wodnistej do pasto-watej.
Zastosowana do typowania szczepów Cl. perfrin-gens metoda PCR wykorzystywana mo¿e byæ do badañ szczepów wyizolowanych metodami mikrobio-logicznymi. U¿ycie PCR do bezporedniego wykry-Ryc. 2. Obraz elektroforezy produktów PCR szczepów Cl. perfringens
Objanienia: M wzorzec masy molekularnej; cie¿ki 1-7 szczepy kontrolne, 1 typu A (gen toksyny á), 2 typu B (geny toksyn á, â, å), 3 typu C (geny toksyn á, â), 4 typu D (geny toksyn á, å), 5 typu E (geny toksyn á, é), 6 typu A z genem enterotoksyny (geny toksyn á i enterotoksyny), 7 typu A z genem toksyny â2 (geny toksyn á, â2); 8 kontrola negatywna; 9-16 szczepy terenowe wykazuj¹ce obecnoæ genu toksyny á oraz (na cie¿kach 9, 10, 11, 12, 14) genu toksyny â2
wania poszczególnych typów toksycznych Cl. perfrin-gens w próbkach materia³u klinicznego nie jest, jak dot¹d, rutynowo stosowane. Wprowadzenie PCR po-zwoli³o na szybkie i precyzyjne typowanie omawia-nych drobnoustrojów. Wykorzystanie tej metody stwa-rza równie¿ mo¿liwoæ rezygnacji z badañ na zwie-rzêtach laboratoryjnych.
Wyniki przeprowadzonych badañ terenowych wy-kaza³y wystêpowanie w pozyskanym materiale szcze-pów Cl. perfringens typu A. Zwraca uwagê fakt, ¿e z materia³u klinicznego o zró¿nicowanym stopniu za-awansowania zmian patologicznych izolowano szcze-py wykazuj¹ce obecnoæ genu koduj¹cego toksynê â2. Uzyskane wyniki mog¹ wskazywaæ na ograniczone wystêpowanie zaka¿eñ Cl. perfringens typu C w po-pulacji wiñ. Wydaj¹ siê one równie¿ sk³aniaæ do weryfikacji pogl¹dów na temat znaczenia zaka¿eñ wywo³ywanych przez Cl. perfingens typu A u tego gatunku zwierz¹t. Powy¿sze przes³anki wskazuj¹ te¿ na potrzebê prowadzenia badañ nad opracowaniem metod zwalczania, a w szczególnoci profilaktyki swo-istej zaka¿eñ wywo³ywanych przez Cl. perfingens typu A u wiñ.
Pimiennictwo
1.Ahola H. S., Fossi M., Raunio-Saarnisto M., Korhonen T., Pajala A.: Clostridium perfringens type A with Beta 2 toxin gene in porcine diarrhea. A case report. Proc. 19th IPVS Congress, Copenhagen 2006, 2, 324.
2.Baums C. G., Schotte U., Amtsberg G., Goethe R.: Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates. Vet. Microbiol. 2004, 100, 11-16.
3.Bueschel D. M., Jost B. H., Billington S. J., Trinh H. T., Songer J. G.: Preva-lence of cpb2, encoding â2 toxin, in Clostridium perfringens field isolates: correlation of genotype with phenotype. Vet. Microbiol. 2003, 94, 121-129. 4.Collins J. E., Bergeland M. E., Bouley D., Doucommun A. L., Francis D. H., Yeske P.: Diarrhea associated with Clostridium perfringens type A entero-toxin in neonatal pigs. J. Vet. Diagn. Invest. 1989, 1, 351-353.
5.Cygan Z.: W³aciwoci, mechanizm dzia³ania i rola chorobotwórcza toksyny alfa C. perfringens. Medycyna Wet. 1997, 53, 73-76.
6.Cygan Z. M.: Choroby beztlenowcowe zwierz¹t. Wydawnictwo Pol-Druk, Kraków 1999.
7.Czanderlova L, Lány P., Hloek P., ilavský M.: Clostridium perfringens genotyping in suckling piglets: benefits for practice. Proc. 18th IPVS
Con-gress, Hamburg 2004, 1, 296.
8.Czeczulin J., Colie R. E., McClane B. A.: Regulated expression of Clostri-dium perfringens enterotoxin in naturally cpe-negative type A, B and C iso-lates of Clostridium perfringens. Infect. Immun. 1996, 64, 3301-3309. 9.Czeczulin J., Hanna P. C., McClane B. A.: Cloning, nucleotide sequencing,
and expression of the Clostridium perfringens enterotoxin gene in Escheri-chia coli. Infect. Immun. 1993, 61, 3429-3439.
10.Damme-Jongsten M. Van, Haagsma J., Notermans S.: Testing strains of Clostridium perfringens type A isolated from diarrhoeic piglets for the presence of enterotoxin gene. Vet. Rec. 1990, 126, 191-192.
11.Garmory H. S., Chanter N., French N. P., Bueschel D., Songer J. D., Tiball R. W.: Occurrence of Clostridium perfringens â2-toxin amongst ani-mals, determined using genotyping and subtyping PCR assays. Epidemiol. Infect. 2000, 124, 61-67.
12.Gibert M., Jolivet-Reynaud C., Popoff M.: Beta2 toxin, a novel toxin produ-ced by Clostridium perfringens. Gene 1997, 203, 65-73.
13.Gkiourtzidis K., Frey J., Bourtzi-Hatzopoulou E., Iliadis N., Sarris K.: PCR detection and prevalence of á-, â-, â2-, å-, é-, and entertoxin-genes in Clostri-dium perfringens isolated from lambs with clostridial dysentery. Vet. Micro-biol. 2001, 82, 39-43.
14.Herholz C., Miserez R., Nicolet J., Frey J., Popoff M., Gibert M., Straub R.: Prevalence of â2-toxigenic Clostridium perfringens in horses with intestinal disorders. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 358-361.
15.Holmgren N., Båverud V., Lindberg A., Linder A.: Clostridium perfringens type A from indoor and outdoor sows and piglets. Proc. 19th IPVS Congress,
Copenhagen 2006, Vol. 2, s. 322.
16.Hunter S. E. C., Brown E., Oyston P. C. F., Sakurai J., Titball R. W.: Mole-cular genetic analysis of beta-toxin of Clostridium perfringens reveals sequence homology with alpha-toxin, gamma-toxin, and leukocidin of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 1993, 61, 3958-3965.
17.Hunter S. E. C., Clarke I. N., Kelly D. C., Titball R. W.: Cloning and nucleo-tide sequencing of Clostridium perfringens epsilon-toxin gene and its expres-sion in Escherichia coli. Infect. Immun. 1992, 60, 102-110.
18.Jab³oñski L.: Podstawy mikrobiologii lekarskiej. Pañstwowy Zak³ad Wydaw-nictw Lekarskich, Warszawa 1986.
19.Klaasen H. L. B. M., Molkenboer M. J. C. H., Bakker J., Miserez R., Häni H., Frey J., Popoff M. R., van den Bosh J. F.: Detection of the â2 toxin gene of Clostridium perfringens in diarrhoeic piglets in The Netherlands and Switzerland. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999, 24, 325-332. 20.Manteca C., Daube G., Jeuniaux T., Linden A., Pirson V., Detilleux J.,
Ginter A., Coppe P., Kaeckenbeeck A., Mainil J. G.: A role for the Clostri-dium perfringens â2 toxin in bovine enterotoxaemia? Vet. Microbiol. 2002, 86, 191-202.
21.Møller C., Ahrens P.: Comrarison of toxicity neutralization-, ELISA- and PCR tests for typing of Clostridium perfringens and detection of enterotoxin gene by PCR. Anaerobe 1996, 2, 103-110.
22.Pejsak Z.: Choroby wiñ. Polskie Wydawnictwo Rolnicze, Poznañ 2002. 23.Perelle S., Gibert M., Boquet P., Popoff M. R.: Characterization of
Clostri-dium perfringens iota-toxin genes and expression in Escherichia coli. Infect. Immun. 1993, 61, 5147-5156.
24.Quin P. J., Carter M. E., Markey B. K., Carter G. R.: Clinical veterinary microbiology. Mosby International Limited, London 2000.
25.Rood J. I., Cole S. T.: Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens. Microbiol. Rev. 1991, 55, 621-648.
26.Schmidt A. S., Angen Q., Jorsal S. E., Møller C.: Prevalence of Beta 2 produ-cing Clostridium perfringens and Clostridium difficile among danish piglets a case study. Proc. 18th IPVS Congress, Hamburg 2004, t. 1, s. 330.
27.Songer J. G.: Clostridial enteric diseases of domestic animals. Clin. Micro-biol. Rev. 1996, 9, 216-234.
28.Songer J. G., Taylor D. J.: Clostridial infections, [in:] Straw B. E., Zimmer-man J. J., DAllaire S., Taylor D. J. (red.): Diseases of Swine, 9th Edition.
Blackwell Publishing/Iowa State University Press, Ames, Iowa 2006, 613--627.
29.Titball R. W., Hunter S. E., Martin K. L., Morris B. C., Shuttleworth A. D., Rubidge T., Anderson D. W., Kelly D. C.: Molecular cloning and nucleotide sequence of the alpha-toxin (phospholipase C) of Clostridium perfringens. Infect. Immun. 1989, 57, 367-376.
30.Waters M., Savoie A., Garmory H. S., Bueschel D., Popoff M. R., Songer G. J., Titball R. W., McClane B. A., Sarker M. R.: Genotyping and phenotyping of Beta2-toxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with gastrointestinal diseases in piglets. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 3584-3591. Adres autora: dr Bernard Wasiñski, al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: wasinski@piwet.pulawy.pl
