„Sposób na bregmę”
Tomasz Błasiak
Pracownia N eurofizjologii, Instytut Zoologii, U niwersytet Jagielloński
Streszczenie
Jednym z warunków powodzenia wielu typów eksperym entów elektrofizjologicznych, prowadzonych in vivo, jest precyzyjne um ieszczenie czubka m ikroelektrody w konkretnej strukturze mózgu zw ierzęcia. By sprostać temu wym aganiu stosuje się technikę stereotaksji, służąca do precyzyjnego im plantow ania elektrod, sąd m ikrodializacyjnych oraz innych m ikroczujników w strukturach m ózgowia ssaków, podczas eksperym entów prowadzonych
in vivo. By zapewnić odpow iednią precyzję m anipulacji stereotaktycznych
stosuje się wysokiej klasy sprzęt m echaniczny oraz najnowsze, sporządzone przez specjalistów atlasy stereotaktyczne. Ponadto, niezbędne jes t bardzo dokładne i prawidłow e wyznaczenie położenia punktów charakterystycznych czaszki, będących odniesieniem dla m anipulacji stereotaktycznych. N iniejszy artykuł ma na celu przedstawienie udoskonalonego i praktycznie przetestow anego w Pracowni Neurofizjologii i C hronobiologii UJ sposobu w yznaczania punktów odniesienia dla m anipulacji stereotaktycznych. Nowa m etoda zostanie zilustrowana na przykładzie czaszki, powszechnie wykorzystywanego w badaniach laboratoryjnych, szczura rasy W istar.
Prowadząc eksperym enty elektrofizjologiczne in vivo często stajem y przed koniecznością um ieszczenia m iniaturowej elektrody w konkretnej strukturze mózgu zw ierzęcia. Problem stanowi fakt, że mózg je st otoczony kością, której w całości nie m ożna usunąć by odsłonić interesujący nas organ. N aw et jeśli taki zabieg m ożna by było wykonać bez ryzyka znacznego zaburzenia fizjologii zwierzęcia, to i tak w idoczne byłyby tylko powierzchniowe w arstwy mózgu (np. kora mózgowa, kora móżdżku, itp.), pod którym i ukryta je st znaczna część struktur mózgowia, często tych, które są obiektem bezpośredniego zainteresow ani badacza. Jeśli to właśnie jednej z takich głębokich struktur mózgu zam ierzamy zaim plantow ać np.: elektrodę rejestracyjną/stym ulującą, m ikropipetę w celu dom iejscow ego podania substancji, sondę m ikrodializacyjną, itp., stajem y przed problem em ja k tego dokonać. Z jednej strony cały zabieg
musi być wykonany przyżyciowo, a uszkodzenia tkanki nerwow ej m ają być m inim alne, z drugiej strony m iniaturowy elem ent pom iarowy musi się znaleźć bezpośrednio w interesującej nas, często niedużych rozm iarów, strukturze mózgu. Bardzo skutecznym rozwiązaniem tego problem u okazała się, wprowadzona na początku XX wieku, technika stereotaktycznego w yznaczania położenia struktur mózgu względem punktów charakterystycznych czaszki [1|. W spółcześnie, metoda ta je st powszechnie stosowana w laboratoriach badawczych, jak również, przy wsparciu nowoczesnych technik obrazowania, wykorzystuje się j ą z powodzeniem podczas operacji w ykonyw anych na ludziach. O piera się ona na założeniu, że położenie mózgu i jeg o poszczególnych części względem czaszki jest zbliżone w grupie podobnych osobników. Tak w ięc, w ykonując eksperymenty na zw ierzętach laboratoryjnych tego samego gatunku i rasy, cechujących się niew ielką zm iennością, będących tej samej płci, m ających tą sama masę i będących w tym samym w ieku, można przyjąć, że ułożenie mózgu tych zw ierząt w czaszce je st bardzo podobne. Bazując na tym założeniu, stworzono wiele, ciągle aktualizow anych, trójw ym iarow ych atlasów stereotaktycznych m ózgowia różnych gatunków zw ierząt laboratoryjnych. Z takiego atlasu m ożna odczytać, zwykle z dokładnością do 0,1 mm, położenie interesującej nas strukturę mózgu zw ierzęcia, w zględem określonych punktów na czaszce. N astępnie, ju ż podczas operacji neurochirurgicznej, głowę zw ierzęcia należy zam ocow ać w ramie stereotaktycznej, będącej rusztowaniem dla m ikrom anipulatorów , którymi możemy w ykonyw ać ruchy w trzech kierunkach, z dok ładnością do kilku m ikronów. Zam ocow aną na m ikrom anipulatorze elektrodę przesuwam y względem punktu odniesienia na czaszce (punkt zero), zgodnie z wcześniej odczytanym i z atlasu współrzędnymi. W ten sposób, czubek elektrody powinien się znaleźć w ew nątrz czaszki (niezbędne jest wykonanie niewielkiej trepanacji), w interesującej nas strukturze mózgu.
Dokładność "trafienia" czubkiem takiej elektrody w konkretną strukturę zależy od kilku czynników. Aby zwiększyć praw dopodobieństwo powodzenia im plantacji, poza precyzyjnym wykonywaniem w szystkich zabiegów operacyjnych, należy m iędzy innymi:
• dołożyć starań aby zwierzę poddawane operacji spełniało wytyczne (gatunek, rasa, płeć, masa/wiek, sposób hodow li) autora atlasu stereotaktycznego,
• zastosow ać aparat stereotaktyczny i m ikrom anipulatory dobrej klasy, których konstrukcja i stan techniczny powinny zapew niać wysoką precyzję i stabilność,
• praw idłowo zamocować głowę zw ierzęcia w ramie aparatu stereotaktycznego, skonstruowanego/przeznaczonego dla danego typu zwierząt,
• precyzyjnie wyznaczyć na czaszce punkty odniesienia, względem których położenie badanej struktury zostało podane w atlasie stereotaktycznym i względem , którego wykonywane będą m anipulacje stereotaktyczne.
W ypełnienie dwóch pierwszych zaleceń w ydaje się dość proste i zależy przede wszystkim od ilości środków finansowych jak im i dysponujem y oraz możliwości prow adzenia hodowli lub zakupu odpowiednich zwierząt. Kolejne dwa punkty odnoszą się bezpośrednio do samego zabiegu neurochirurgicznego i d otyczą tych jeg o elem entów , które są źródłem wielu problem ów i błędów. O ile praw idłow e zam ocowanie zwierzęcia w ramie stereotaktycznej oraz m anipulacje stereotaktyczne to czynności, przy nauce których niezbędna jest praktyczna prezentacja i pomoc osoby dośw iadczonej, o tyle praw idłowe wyznaczenie położenia punktów odniesienia na czaszce może być obiektem teoretycznego, instruktarzowego opracowania.
Chociaż każdy atlas stereotaktyczny definiuje położenie zastosow anych punktów odniesienia, w praktyce praw idłowe ich w yznaczenie bywa trudne, a punkty, w yznaczone dokładnie według definicji, m ogą być błędne. N iniejszy artykuł ma na celu przedstawienie udoskonalonego i praktycznie przetestowanego w Pracowni Neurofizjologii i Chronobiologii UJ sposobu wyznaczania punktu odniesienia na czaszce, pow szechnie wykorzystyw anego w badaniach laboratoryjnych, szczura rasy W istar (dorosły samiec).
Aktualnie dostępnych je st kilka, współcześnie wydawanych atlasów stereotaktycznych mózgu dorosłego szczura [2, 3, 4]. W szystkie te atlasy podają położenie struktur mózgu szczura względem punktów charakterystycznych na powierzchni grzbietow ej mózgoczaszki. W niniejszej pracy, jako klasyczny, zostanie przedstaw iony sposób wyznaczania tych punktów, który został wykorzystany m iędzy innymi w najpowszechniej stosowanym i ciszącym się najlepszą o pinią atlasie stereotaktycznym autorstwa G eorga Paxinosa i Charlesa W atsona [2; tzw. atlas Paxinosa]. Jako klasyczny punkt odniesienia (punkt zero) w atlasie Paxinosa wykorzystuje się punkt zw any bregm ą (ß), który wyznacza się w m iejscu przecięcia szwu wieńcowego (sutura coronalis) ze szwem strzałkowym (sutura sagitta lis ) na grzbietowej powierzchni mózgoczaszki (Ryc. 1.).
R y c. 1. Szkic w id zian ej z góry czasz ki dorosłe go sam ca s zcz ura rasy W istar. Z az na cz o ne zostało p ołoż enie pu nk tó w bre gm a i lam bda, zgo dnie z d e fin icją s tos ow a ną w w ięk szości atlasów stereotaktyczn ych. Strzałki w s kaz ują szwy pom iędzy kośćm i sk lep ienia m ózgocza sz ki. Schem at czaszki z apo życ zo ny z Pa xino s i W atson, 1998.
Jako pom ocniczy definiuje się punkt lambda (À), którego położenie określa się na przecięciu bocznych fragm entów szwu w ęgłow ego (sutura
lam bdoidea) z przedłużeniem szwu strzałkowego (Ryc. 1.). Odległość pom iędzy
bregm ą i lam bdą pow inna wynosić 8,8 ± 0,6 mm zgodnie z pomiarami podanym i w atlasie Paxinosa, a oba punkty powinny leżeć w płaszczyźnie symetrii czaszki i mózgu (przyjm ując, że czaszka i m ózg są sym etryczne i posiadają jedn ą, w spólną płaszczyznę symetrii).
W praktyce jednak, przebieg szwów czaszkowych często odbiega od "typowego idealnego" układu według, którego m ożna by wiarygodnie wyznaczyć położenie punktów bregma i lambda. Na rycinie 2 przedstaw iony jest
taki właśnie przypadek, w którym, pomimo, że zwierzę spełniało wytyczne atlasu stereotaktycznego, przebieg szwów czaszkowych był nietypowy. Należy zaznaczyć, że w tym przypadku odstępstwa przebiegu szwów czaszkow ych od "typowego" przebiegu są nieznaczne. W praktyce laboratoryjnej często jednak spotykam y się z dużo bardziej zaburzonym układem szwów czaszkowych.
R y c. 2. Z dję cie przed sta w ia jące grzb ieto w ą pow ierzchn ię m ózgoczasz ki sz cz ura rasy W istar. Z azn acz on e z ostało po ło że nie pun któ w bre gm a (ß p „ i,„ J i lam b da ( X p a x i, „ B ) , w yzn aczonych
zgo dnie z d efin icją sto s o w a n ą w atlasie ste reotaktyczny m Pa xino sa (P ax in os i W atson, 1998). B iałe strzałki w s ka zu ją szwy pom iędz y kośćm i skle pien ia m ózgoczaszki.
W przykładzie przedstawionym na rycinie 2 wydaje się, że szew strzałkow y biegnie nieco skośnie, a jego położenie, szczególnie przedniego fragm entu, może odbiegać od płaszczyzny symetrii czaszki. Dodatkowo, szew wieńcowy przecina się ze strzałkowym w dwóch punktach, przesuniętych względem siebie z a n w n o w osi przód-tył, jak i lewo-prawo. W tym i podobnych przypadkach, bardzo pom ocne okazuje się wyznaczenie płaszczyzny symetrii względem grzebieni kostnych, do których przym ocowane są do mózgoczaszki mięśnie żuchw y (Ryc. 3.). N a tym etapie operacji głow a zw ierzęcia jest ju ż zam ocow ana (praw idłow o!) w aparacie stereotaktycznym i możemy przy pomocy m anipulatorów stereotaktycznych precyzyjnie poruszać się względem czaszki. N a uchw yt m anipulatora zakładam y cienką igłę strzykaw kow ą i pod kontrolą w zrokow ą (najlepiej pod powiększeniem , w ykorzystując m ikroskop
operacyjny o długiej ogniskow ej), ostrożnie operując m ikrom anipulatorem , należy dotknąć czubkiem igły grzbietu jednego z wcześniej odsłoniętych grzebieni. Po odczytaniu współrzędnych tego punktu należy przem ieścić igłę tak by jej czubek dotknął grzbietu przeciwległe położonego grzebienia (nie zm ieniając położenia igły w osi przód-tył!) i ponownie odczytać z m anipulatora współrzędne. W ykorzystując współrzędne obu punktów należy policzyć odległość w osi lewo-praw o pomiędzy grzebieniami. Jednocześnie, można spraw dzić czy położenie grzbietów grzebieni w osi grzbietow o-brzusznej jest podobne. Jeśli podczas preparatyki zachowaliśm y ostrożność i grzebienie nie zostały zbytnio "zeskrobane", różnica w ich położeniu na osi grzbietowo- brzusznej nie powinna przekraczać 0,2 mm. W iększa różnica oznacza, że głowa zwierzęcia je st praw dopodobnie nieprawidłow o zam ocowana w aparacie stereotaktycznym .
N astępnie, przesuw am y czubek igły w kierunku dośrodkowym czaszki 0 połowę obliczonej w cześniej odległości pomiędzy grzebieniam i, tak by znalazł się dokładnie pośrodku, pom iędzy nimi. Teraz, jeśli przy pom ocy m ikrom anipulatora będziem y dokonywać przesunięć w zdłuż osi przód-tył, czubek igły powinien przem ieszczać się w płaszczyźnie sym etrii czaszki 1 mózgu, po tzw. linii środkowej. Przykład tak wyznaczonej linii środkowej czaszki je st zaznaczony przeryw aną linią naniesioną na zdjęcie po prawej stronie ryciny 3. Jak widać na tym przykładzie, punkty bregma i lam bda wyznaczone dokładnie w edle przepisu P axinosa ( ß p aXmos i ŹWinos), leżą u tego zw ierzęcia poza linią środkow ą w yznaczoną naszą metodą. Dokładność tej m etody w ielokrotnie potwierdzono w naszej Pracowni podczas histologicznej weryfikacji położenia elektrod rejestracyjnych, lub też obserw ując wzajem ne położenie wyznaczonej linii środkowej i górnej, żylnej zatoki strzałkowej biegnącej grzbietowo na powierzchni mózgu, dokładnie pom iędzy półkulam i. Z naszych obserwacji wynika, że m etoda w yznaczania osi środkowej czaszki względem grzebieni jest znacznie dokładniejsza od klasycznej metody podawanej przez Paxinosa, zwłaszcza gdy przebieg szwów czaszkowych jest nietypowy, ja k na podanym przykładzie.
M ając tak w yznaczoną linię środkow ą czaszki pozostaje jeszcze ustalić gdzie na tej osi znajdu ją się punkty bregm a i lambda. N ajp rostszą m etodą jest przyjęcie za punkt ß przecięcia linii środkowej ze szwem wieńcowym kości sklepienia mózgoczaszki. Sposób ten można zastosow ać pod warunkiem , że przebieg szwu w ieńcow ego jest bardzo regularny. Gdy jedn ak przebieg szwu je st zaburzony, praw idłowość wyznaczenia punktu bregm a tą drog ą może budzić duże wątpliwości. W takiej sytuacji m ożna zweryfikow ać położenie punktu bregma opierając się na stałym położeniu tego punktu (8,8 mm do przodu) względem punktu lambda. Chociaż z naszych obserwacji wynika, że szew
węgłowy, częściej niż szew wieńcowy, ma typow y przebieg, może się jednak zdarzyć, że w konkretnym przypadku tak nie jest. Ponadto, sama metoda określania położenia punktu lam bda jest szacunkow a - opiera się na ekstrapolow anym przedłużeniu bocznych fragm entów szwu węgłow ego, a to może być przyczyną dużych niedokładności.
R y c. 3. Po lew ej - szk ic grz bie tu czaszki d oros łeg o sam ca s zc zura rasy W istar. C z arn a linia za ko ń cz o na strzałk am i łąc zy o ba grz ebien ie kostne, do których p rzy m o cow an y je s t m ięsień żuchw y. L inia kro p ko w a na je s t pro sto pa dła do czarnej linii ciągłej i prze bieg a dokładnie w po łow ie o dc in ka łącząc ego grzebienie, a tym sam ym p ow inna przeb ieg ać w płas zczyź nie sym etrii czaszki. Po praw ej - zd jęcie prz edsta w ia jące grzb ie to w ą po w ie rzc hn ię m ózgoczaszki szczura rasy W istar. Z azn ac zo ne zostało poło żenie pun któ w bre gm a (ßpaxiIK>s) ' lam bda (Xpaxi„„s), w yzn aczo nych z go dn ie z d efin ic ją sto so w an ą w atlasie stereotak tyc znym Paxinosa . B iała linia z ako ńc zon a strz ałkam i łączy o ba grz ebienie kostne, do których prz ym o cow an y je s t m ięsień żuchwy. L inia kro pk ow a na je s t pro stop a dła do białej linii ciągłej i p rze b ie ga d ok ła dn ie w połow ie od cink a łącząceg o grz eb ien ie , a tym sam ym p ow inn a p rzeb iega ć w płasz czy źnie sym etrii czaszki. W yraźnie w idać, że punk ty ßpaxi„os i >.p™,K.s leż ą poz a lin ią śro dk ow ą czaszki.
W ydaje się więc, że pomimo dość dokładnego w yznaczenia linii środkowej czaszki, praw idłow e w yznaczenie położenia na niej punktów bregma i lambda je st zadaniem bardzo trudnym , a szacunkow e ("na oko") jeg o rozwiązania są potencjalnym źródłem błędu. W ostatniej części tego artykułu zostanie pokrótce przedstawione, aktualnie testow ane w Pracowni N eurofizjologii i Chronobiologii Instytutu Zoologii UJ, rozw iązanie tego problemu. O piera się ono na połączeniu wcześniej opisanej m etody wyznaczania linii środkow ej czaszki z cyfrowym i metodami obróbki i analizy m atem atycznej obrazu. W m etodzie tej punkty bregma i lambda są w yznaczane w m iejscu przecięcia się linii środkowej czaszki (wyznaczonej względem grzebieni)
z krzywym i, m atem atycznie dopasowanym i do szwów czaszkowych: wieńcowego i węgłowego. Poniższy opis w skrócie przedstawia procedurę wyznaczania punktów bregm a i lambda tą metodą.
Pierwszy krok wygląda podobnie ja k we wcześniej opisanej m etodzie w yznaczania linii środkowej czaszki, z tą różnicą, że punkty pom iarowe na grzebieniach czaszki należy w w idoczny sposób zaznaczyć. M ożna to zrobić w prosty sposób, nanosząc na czubek igły niew ielką ilość wodoodpornego baiw nika (np. z w odoodpornego flamastra). W drugim etapie, przy pomocy cyfrowego aparatu fotograficznego, należy wykonać zdjęcie grzbietowej powierzchni mózgoczaszki, takie jak na rycinie 4. Następnie, po wczytaniu zdjęcia do kom puterow ego programu graficznego (np. Corel PhotoPaint, Adobe PhotoShop, Paint Shop Pro) należy sporządzić obrys, widocznych na zdjęciu szwów czaszkowych. W przypadku szwu węgłowego należy sporządzić obrys tylko jeg o bocznych fragm entów (Ryc. 4.).
R y c. 4. Po lewej - Z dję cie prz edstaw iają ce grzb ie tow ą po w ie rzc hnię m ó zgoczasz ki s zc zura rasy W istar, w yk onan e prostym aparate m cyfrow ym . В iałe strzałki w s k az u ją szwy pom iędz y kośćm i sk lep ienia m ózg oczaszk i. P o prawej — obrys szw ów cza szkow yc h, w id oc znyc h na z djęciu po lewej. W prz ypa dku szw u w ęglow ego sp orz ądz ono obry s tylko je g o bo czn ych frag m entów . O brys w ykon ano prz y pom ocy ko m p ute ro w e go pro gram u do obró bki grafiki (C ore l Ph otoP aint).
Obrysy poszczególnych szwów stanowią trzy zbiory punktów, do których dopasowujem y krzywe. Rów nania poszczególnych krzyw ych to odpowiednio: wielom ian stopnia drugiego (parabola) dla szwu w ieńcow ego i węgłowego oraz wielomian stopnia pierw szego (prosta) dla szwu strzałkowego. W połowie odcinka łączącego oba, zaznaczone na grzebieniach i widoczne na zdjęciu
punkty, należy przeprowadzić prostą prostopadłą do tego odcinka, która wyznaczy nam linię środkow ą czaszki. Dopasow ane krzywe, oraz linię środkow ą czaszki wygodnie je st wykreślić na wcześniej wykonanym zdjęciu, co znacznie ułatwia popraw ne zlokalizow anie punktów bregma i lambda. W naszej Pracowni, w ykorzystując uniw ersalne środow isko program owe MATLAB, stworzyliśm y specjalny program, który po wczytaniu do niego zdjęcia czaszki oraz wykonanego obrysu szwów, dokonuje obliczeń matem atycznych, a następnie wszystkie krzywe nanosi na zdjęcie. Na rycinie 5 znajduje się przykładowy wynik takiej analizy z zaznaczonym i punktam i bregm a i lambda wyznaczonym i klasyczną ( ß Paxinos i ßpaxinos) oraz naszą, now ą m etodą ( ß Neurochrono
R yc . 5. Z djęcie p rze dsta w iając e grzb ie tow ą pow ierzch nię m ózgocza szki s zc zura rasy W istar. C iąg le linie sta n ow ią n an ie sio n e na zdję cie krzywe do p aso w an e m a tem atyc zn ie do pos zc zegó lnyc h sz w ów c zaszkow ych. L inia prz ery w ana w yzn acz a lin ię ś ro d k o w ą czaszki, w yz n ac zo n ą w z ględe m g rzeb ieni kostnych. Z azn aczo ne z ostało p ołoże nie p un któ w bregm a i lam bda w y zna czon e m eto dą klasy czn ą (ßpilxl„„s i Ä.Paximls) o ra z n o w ą m eto d a tes to w a n ą w P rac ow ni N e urofiz jolo gii i C h ro no biolo gii U J (ßNeurochrono i
^NeuroChrono)-Jak widać, w tym przypadku punkty, zw łaszcza ß Paxinos i ßNeurochrono. są od siebie znacznie oddalone (ok. 0,7mm). W praktyce oznacza to, że przyjmując ßpaxinos za odniesienie dla m anipulacji stereotaktycznych, praw dopodobnie
trafimy czubkiem elektrody do innej struktury niż gdybyśm y za punkt zero przyjęli
ßNeuroChrono-Otwartym pozostaje pytanie, który z tych dwóch punkt uznać za w łaściw ą bregmę. Nasze dotychczasow e doświadczenia pozw alają nam zaufać położeniu punktu ßNeuroChrono na osi lewo-prawo ponieważ jest ono ustalone względem grzebieni czaszki, czyli m etodą od daw na z powodzeniem stosow aną w Pracowni N eurofizjologii i Chronobiologii UJ. Czy rów nież położenie
ßNeuroChrono na osi przód-tył, wyznaczone m atem atycznie, okaże się w praktyce lepsze od klasycznego przecięcia ze szwem wieńcow ym ? O dpowiedź na to pytanie przyniosą, specjalnie w tym celu zaplanow ane, eksperym enty jakie zostaną w najbliższym czasie przeprow adzone w Pracowni N eurofizjologii i Chronobiologii Instytutu Zoologii UJ.
Piśmiennictwo
1. V. H ors ley i R.H. C larke. T he struc ture and func tio ns o f the ce reb ellum e xam ine d by a new m ethod. B rain, 3 1:45 -12 4 , 1908.
2. G. Pax ino s i C. W atso n. T h e rat brain in stereotaxic coordina tes . Fourth E d ition . Academ ic Press 1998.
3. L.W . Sw ans on. B rain M aps: Struc ture o f the R at Brain. Sec ond E ditio n. E ls evie r 1998. 4. L. K ruger, S. Sa p orta i L.W . Sw anson. Ph otog ra phic Atlas o f the R a t B rain: T he C ell and
Fib er A rchite cture Illustrate d in T hree Pla nes with Stereo taxic C o ordinates . C a m bridge U niversity Press 1995.
A d res d o k o re s po nd en cji: T o m a s z B ła siak Pra cow n ia N eu rofizjo logii, Instytut Z oo log ii UJ
ul. R .Ing ard e na 6 30 -0 60 Kraków tel.: (48 12) 663 2 6 12 e-m ail: b las k@ zu k.z i.u j.ed u.p l tb lasiak @ w p.pl
