Wykład 3 i 4: Genetyka bakterii; antybiotyki

1

ELEMENTY GENETYKI BAKTERII

Genom bakterii

Zmienność mutacyjna

Zmienność rekombinacyjna:

Koniugacja

Transformacja

Transdukcja

Genom bakterii

Na genom bakteryjny składają się:

• genetyczne elementy translokacyjne (tj. sekwencje insercyjne – IS,

transpozony – Tn oraz integrony)

Plazmidy

- są pozachromosomalnymi czynnikami genetycznymi

- są autonomicznymi replikonami (posiadają własny układ replikacji,

niezależny od chromosomu)

- niektóre z nich (tzw. episomy, np. czynnik F) mają zdolność

rekombinacji z genomem bakteryjnym stając się jego integralną częścią.

3

Plazmidy dzielimy

ze względu na wielkość na:

- małe (poniżej 25 tys. par zasad) - i duże (powyżej 25 tys. par zasad)

ze względu na zdolność do autotransferu na:

- koniugacyjne (1-3 kopii w komórce)

np. plazmidy: R, F, Col B, Col V

- niekoniugacyjne (10 – 100 kopii w komórce) np. plazmidy Col E 1, Col

E 2 – są to na ogół małe plazmidy zakażające komórki bakteryjne na drodze mobilizacji, transformacji i/lub transdukcji

4

Podział plazmidów cd.

ze względu na warunkowane cechy fenotypowe na:

- płciowe (czynnik F) - lekooporności (plazmidy R) - bakteriocynogenii (plazmidy Col)

- warunkujące właściwości metaboliczne (plazmid Hys)

- warunkujące wirulencję (zjadliwość) bakterii (plazmidy Ent, Hly, CFA

I/II)

- warunkujące syntezę antybiotyków - kryptyczne (o nieznanej funkcji)

5

Genetyczne elementy translokacyjne:

- sekwencje insercyjne (IS) – kodują integrazę warunkującą

translokację między replikonami

- transpozony (Tn) – zawierają na obu końcach IS, pomiędzy którymi

zlokalizowany jest gen (geny) strukturalne warunkujące oporność na antybiotyki, sole metali ciężkich, czynniki wirulencji, właściwości kataboliczne

transpozony mogą integrować się z różnymi replikonami obecnymi w komórce

- integrony – sekwencje oflankowane IS zawierające tzw. kasetę

genową, do której mogą włączać się geny strukturalne np. warunkujące lekooporność

6

Zmienność mutacyjna

Mutacje dzielimy na:

• spontaniczne (np. oporność na streptomycynę zachodzą z niską

częstością (10-7 w przeliczeniu na populację bakterii)

• indukowane czynnikami mutagennymi (promieniowanie UV, kwas

azotowy (III), hydroksyloamina – HA, 5-bromouracyl – BU, 2-aminopuryna – AP, etylosiarczan etylu – EES), zwiększającymi wielokrotnie częstość występowania mutacji

7

Podział mutacji cd.

ze względu na rozmiar mutacje bakteryjne dzielimy na:

• punktowe (genowe) - tranzycje (pur/pur; pir/pir) - transwersje (pur/pir; pir/pur) - insercje – dodanie nukleotydu - delecje – wypadnięcie nukleotydu • chromosomowe.

- inwersje – odwrócenie kolejności nukleotydów - duplikacje – podwojenie sekwencji nukleotydów

- delecje – wypadnięcie znacznych fragmentów chromosomu - translokacje – przemieszczenie fragmentów DNA w obrębie

chromosomu

8

Przykłady mutantów bakteryjnych:

- mutanty oporne na antybiotyki, np. Staphylococcus aureus oporny na

metycylinę MRSA

- mutanty fermentacyjne, np. Lac+ → Lac-, Gal+ → Gal- - mutanty auksotroficzne (wymagające do wzrostu czynnika

wzrostowego): aminokwasu (np. Pro-, Try-), zasady organicznej (np. Ade-) czy witaminy (np. Bio-)

- mutanty szorstkie (S →R), np. Streptococcus pneumoniae – utrata

otoczki, Enterobacteriaceae – utrata O-swoistych łańcuchów bocznych LPS

9

Zmienność rekombinacyjna

Bakterie przekazują sobie DNA za pomocą trzech

podstawowych mechanizmów:

zmienność rekombinacyjna cd.

Koniugacja

Najczęściej obserwowany sposób przekazywania DNA.

Czynnik F

• w koniugacji biorą udział dwa typy komórek: komórki dawców

zawierające czynnik F (F+) i komórki biorców bez tegoczynnika (F-)

• czynnik płciowy F (tzw. czynnik przenoszenia) koduje informację

niezbędną do koniugacji

• niezbędny jest bezpośredni kontakt komórek – czynnik F zawiera geny

specjalnej fimbrii płciowej, która bierze udział w koniugacji oraz geny innych struktur powierzchniowych zaangażowanych w kontakt z komórkami F-

11

koniugacja cd.

• czynnik F jest samoprzekazywalny, gdy zostaje on przekazany do

komórki F-, komórka staje się wówczas F+ i jest zdolna do przekazywania czynnika płciowego innym komórkom F-

W ten sposób bakterie nabierają wielooporności na czynniki

antybakteryjne.

Komórki HFR

Kiedy plazmid zawierający czynnik F zostaje włączony do

chromosomu bakterii, określa się ją jako komórkę HFR (czyli

komórkę szybko rekombinującą).

• bakterie HFR działają jako dawcy w czasie koniugacji • chromosomalny DNA jest replikowany

12

koniugacja cd.

• jedna nić kopii chromosomu jest przekazywana do komórki biorcy F-,

a druga pozostaje w komóce HFR

• dawca nie zmienia się genetycznie

• komórki F- otrzymują fragmenty chromosomu, których rozmiar zależy

od czasu koniugacji

• czynnikiem ograniczającym przekazywanie genów jest stabilność

połączenie między fimbrią płciową a receptorem (białko OmpA) zazwyczaj wiązanie to zostaje zerwane przed upływem 2 godzin, potrzebnych do przekazania całego chromosomu

13

zmienność rekombinacyjna cd.

Transformacja

Bakterie kończące swój żywot uwalniają DNA, który może

zostać wychwycony przez inne bakterie.

• każdy obcy DNA, kiedy dostaje się do komórki, jest trawiony przez

endonukleoazy restrykcyjne

• w pewnych warunków taki DNA może zostać jednak zintegrowany • transformujący DNA może być chromosomalny lub plazmidowy

i zawierać geny, które zmieniają komórkę biorcy

Transformacja może więc prowadzić do rozprzestrzeniania się

genów kodujących czynniki zjadliwości pomiędzy populacjami

bakterii.

14

transformacja cd.

Regulacja transformacji zależy od:

• kompetencji (zdolności bakterii do wychwytywania DNA i obecności na

błonie komórkowej białek, które mają swoiste powinowactwo do DNA

• cech transformującego DNA (homogenność, podwójna nić i duża masa

cząsteczkowa)

Etapy procesu transformacji:

a) w odwracalnym połączeniu DNA ze ścianą komorową uczestniczą siły jonowe między DNA a ścianą komórkową kompetentnego

drobnoustroju

Ten typ połączenia odbywa się u bakterii przez cały czas, ale jeśli komórka nie jest kompetentna, połączenie jest nietrwale i DNA uwalnia się i absorbuje gdzie indziej.

15

transformacja cd.

b) po przejściu DNA przez ścianę komórkową ustala się nieodwracalne połączenie DNA z wewnętrzną błoną komórkową

c) DNA wchodzi do cytoplazmy w formie pojedynczej nici d) integracja z chromosomalnym DNA

(wymaga istnienia regionów homologicznych i obejmuje

przemieszczenie jednej nici chromosomu, rekombinację wchodzącej nici, eliminację pozostałego fragmentu chromosomu i duplikację wchodzącej nici)

16

zmienność rekombinacyjna cd.

Transdukcja

W procesie transdukcji przekazanie DNA z jednej komórki do

drugiej odbywa się przez wirusy bakteryjne zwane

bakteriofagami.

Zakażenie umiarkowane (ograniczone, lizogenne,

lizogeniczne).

• charakteryzuje się włączeniem wirusowego DNA do chromosomu

bakteryjnego

• bakterie uzyskują w ten sposób nowy zestaw genów należących do

włączonych fagów (profagów)

• bakteriofagi wywołujące zakażenia lizogenne są również zdolne do

17

Przykładem bakterii, których czynniki zjadliwości (zwykle

egzotoksyny lub adhezyny) są kodowane przez lizogenne fagi

jest Corynebacterium diphtheriae. Bakteria zakażona wirusem

lizogenny jest więc zjadliwa, ale nie zakażony szczep jest

nieszkodliwy.

Rodzaje transdukcji:

Transdukcja uogólniona

• jest wynikiem pomyłki w łączeniu się główek faga napełnianych DNA –

główki zamiast wokół materiału genetycznego faga gromadzą się wokół fragmentu chromosomu bakterii lub plazmidu

• po włączeniu dostatecznej ilości DNA do główki faga wirusowa

endonukleaza przecina DNA, umożliwiając ostateczne skompletowanie cząstek faga zawierających DNA

• powstały fag jest określany jako uogólniona cząstka trandukująca

18

rodzaje transdukcji cd.

Transdukcja specyficzna (czyli organiczna)

• zachodzi wtedy, gdy następuje replikacja profaga w bakterii lizogennej

•

wówczas DNA znajdujący się w cząsteczkach potomnych zawiera małe fragmenty genomu gospodarza, które są zawsze wysoce swoiste, ponieważ pochodzą z obrzeży genomu wirusa (genom wirusa jest zawsze włączany w kilku swoistych miejscach, gdzie istnieje dostateczna homologia, aby umożliwić rekombinację DNA fagowego i bakteryjnego)

19

ANTYBIOTYKI

Główne procesy bakteryjne zaburzane przez

antybiotyki

• replikacja i utrzymanie struktury DNA • transkrypcja

• biosynteza białka

• budowa ściany komórkowej • funkcjonowanie błony komórkowej • specyficzne dla bakterii szlaki metaboliczne

20

Klasyfikacje mechanizmów oporności

Według zasady działania

Według pochodzenia

Według sposobu ekspresji

Według miejsca kodowania

21

Zasada działania

• zmiana miejsca docelowego

• zmniejszenie stężenia leku w komórce - ograniczenie przepuszczalności - aktywne usuwanie

• inaktywacja cząsteczki leku

• stworzenie alternatywnego szlaku metabolicznego • zmniejszenie wrażliwości enzymu

22

Pochodzenie

• naturalna oporność • oporność nabyta

- w drodze mutacji lub rekombinacji - „importowana”

Rodzaje oporności

• oporność chromosomalna • oprność plazmidowa

• oporność związana z syntezą enzymu

23

Pożądane właściwości antybiotyku

• selektywne działanie wobec miejsc docelowych drobnoustroju – brak

lub słabe działanie na komórki ssacze

• skuteczność wobec określonych drobnoustrojów istotnych klinicznie • brak toksyczności

• długi czas półtrwania leku • dobra penetracja tkanek

• odpowiednie oddziaływanie z białkami osocza • łatwość podawania

• brak interferencji z innymi lekami

24

Podział preparatów o działaniu

przeciwbakteryjnym

Antybiotyki

Chemioterapeutyki

25

Antybiotyki naturalne

• penicylina benzylowa i fenoksymetylowa • glikopeptydy • aminoglikozydy • makrolidy • daptomycyna 26

Antybiotyki półsyntetyczne

Antybiotyki syntetyczne

Chemioterapeutyki

Mechanizm działania antybiotyków i

chemioterapeutyków na drobnoustroje

• blokowanie biosyntezy ściany komórkowej • uszkodzenie błony protoplazmatycznej • blokowanie biosyntezy białka • blokowanie syntezy dna

29

Główne grupy antybiotyków

• penicyliny • cefalosporyny • makrolidy • linkozamidy • glikopeptydy • aminoglikozydy • tetracykliny • fluorochinolony 30

β-Laktamy

Chromosomalne cefalosporynazy

• mogą być wytwarzane przez wszystkie bakterie Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae

• ekspresja cefalosporynaz chromosomalnych może być

- konstytutywna (np. Escherichia. coli, Acinetobacter), niezależna

od obecności antybiotyku w środowisku

- Indukcyjna, gdy ilość i aktywnośc wytwarzanego enzymu zależy

od obecności w środowisku induktora (antybiotyku)

32

Plazmidowe β-laktamazy

• są to penicylinazy i enzymy o szerokim spektrum substratowym • β-laktamazy o szerokim spektrum substratowym są wytwarzane przez

pałeczki ujemne i w mniejszym stopniu przez bakterie gram-dodatnie.

• dzielą się naβ-laktamazy:

- typu TEM i SHV - ESBL

33

Inhibitory β-laktamaz

• kwas klawulanowy • sulbaktam • tazobaktam

Antybiotyk skojarzony z inhibitorem wnika do komórki bakteryjnej i swobodnie wiąże się z receptorem (białko wiążące penicyliny – PBP), w tym czasie inhibitor wiąże się w sposób nieodwracalny z cząsteczką β-laktamazy.

34

Oporność gronkowców na metycylinę (MRSA)

• oporne na metycylinę szczepy Staphylococcus aureus wytwarzają

białko pbp-2’ lub pbp-2a, którego syntezę determinuje gen mecA zlokalizowany w chromosomie komórki bakteryjnej

• szczepy S. aureus oporne na metycylinę wykazują krzyżową oporność

ze wszystkimi antybiotykami β-laktamowymi, a często także z aminoglikozydami, fluorochinolami i makrolidami

• S. aureus są wrażliwe na antybiotyki glikopeptydowe i kotrimoksazol

35

Oporność na aminoglikozydy polega na:

• enzymatycznej modyfikacji leku

• zmianie receptora komórkowego np. Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis

• zaburzeniach przepuszczalności i transportu antybiotyku do wnętrza

komórki

Zdolność syntezy enzymów modyfikujących antybiotyk determinowana jest informacją zakodowaną w genomie plazmidu, transpozonu, rzadziej chromosomu.

36

Oporność na makrolidy, linkozamidy i

streptograminy (MLS)

U bakterii Gram-dodatnich

• modyfikacja miejsca docelowego działania – białko 23S RRNA

(związana jest z obecnością w komórce genów erm , ten mechanizm oporności oznacza krzyżową oporność na wszystkie makrolidy, linkozamidy i streptograminy)

• enzymatyczna modyfikacja antybiotyku • aktywne usuwanie antybiotyku z komórki

37

Oporność na fluorochinolony

• geny oporności na fluorochinolony są zlokalizowane na chromosomie

bakteryjnym, a podstawowym mechanizmem oporności są mutacje

• mutacje występują w genie odpowiedzialnym za syntezę gyrazy lub

rzadziej topoizomerazy IV

• gyraza jest głównym miejscem docelowego działania fluorochinolonów

u bakterii ujemnych, zaś topoizomeraza IV u bakterii Gram-dodatnich – Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumoniae

38

Oporność na glikopeptydy

• geny oporności mogą być zlokalizowane na chromosomie lub

transpozonach

• oporne na glikopeptydy mogą być Enterococcus, Staphylococcus • za oporność enterokoków na glikopeptydy odpowiedzialne są zespoły

genów vanA, vanB, vanC, vanD i vanE

• naturalnie oporne na glikopeptydy są Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus

39

Oporność na tetracykliny

Mechanizm oporności polega na:

• utrudnionym dostępie leku do miejsca docelowego działania

(rybosomu)

• aktywnym usuwaniu leku z komórki

• zmianie miejsca docelowego działania na skutek enzymatycznej

modyfikacji

Geny determinujące oporność na tetracykliny są zlokalizowane na plazmidach lub traspozonach

40

Antybiotyki zostały wykorzystane w produkcji

żywności jako:

• środki przyspieszające wzrost • środki konserwujące

41

W latach 1949-1950 zaczęto dodawać

antybiotyki do pasz dla zwierząt, głównie w USA

i w Wielkiej Brytanii potem w Polsce.

Większość podawanych zwierzętom antybiotyków, była równocześnie wykorzystywana w terapii ludzi. Wkrótce stało się to powodem znacznego przyśpieszenia procesu rozwoju oporności bakterii na antybiotyki. U ludzi i zwierząt następował wzrost zakażeń grzybami patogennymi, wirusami, a także pojawienie się enzymów bakteryjnych inaktywujących antybiotyki.

Większość antybiotyków działała hamująco na czynności układu immunologicznego, zmniejszając odporność zwierząt i ludzi na infekcje. W 1998 roku wprowadzono w Unii Europejskiej zakaz dodawania do pasz antybiotyków, wykorzystywanych w leczeniu ludzi.

42

Zagrożenia dla zdrowia człowieka wynikające ze

stosowania antybiotyków i innych leków w

weterynarii:

• wywołanie alergii

• powstawanie i narastanie oporności drobnoustrojów

chorobotwórczych na antybiotyk

• toksyczność samych związków

43

Od 1 stycznia 2006 roku we wszystkich krajach

Unii Europejskiej, w tym także w Polsce

(rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dn. 28 lipca 2006 w sprawie sposobu postępowania z substancjami niedozwolonymi, pozostałościami chemicznymi, biologicznymi, produktami leczniczymi i skażeniami promieniotwórczymi u zwierząt i w produktach pochodzenia zwierzęcego, Dz. U. Nr 147, poz. 1067, z późn. zm.)

, obowiązuje

całkowity zakaz używania antybiotykowych

stymulatorów wzrostu (ASW) w paszach dla

zwierząt, w produkcji zwierzęcej.

44

Skutki uboczne antybiotyków

Antybiotyki są lekami, które hamują rozmnażanie się bakterii

lub je zabijają.

· antybiotyki powinny być stosowane tylko w przypadku infekcji

bakteryjnych

· antybiotyki są bardzo często przepisywane bez potrzeby, co na ogół źle

odbija się na zdrowiu człowieka

· bakterie zwalczane nieodpowiednio dobranymi antybiotykami, stają się

na nie oporne

45

Osłabienie odporności organizmu

Antybiotyk nie działa jedynie na bakterie, które wywołują

infekcje.

· niszczą też fizjologiczną florę bakteryjną – jelit, skóry i błony śluzowej

pochwy

· niszczą naturalne bariery chroniące nas przed drobnoustrojami

Skutki:

· znacznie obniżenie naszej odporności · przedłużeniem infekcji

· nadkażeniami innymi drobnoustrojami, opornymi na aktualnie

stosowany antybiotyk

46

Dlatego podczas kuracji antybiotykiem ważne są:

· cieplejsze okrycie

· unikanie wychłodzenia i przegrzania

· stosowanie probiotyków np. Trillac, Linex Forte, Lacidofil

oraz prebiotyków, zawartych m.in. w czosnku, cebuli, kaszach, bananach, płatkach kukurydzianych i chlebie

47

Reakcje uczuleniowe

· najczęściej spotykamy się z uczuleniem na penicyliny, czyli jedne ze

starszych antybiotyków znanych ludzkości.

· aby zapobiec reakcjom uczuleniowym, zleca się wykonanie prób

uczuleniowych na dany lek (eżeli koś jest uczulony na jakikolwiek medykament, musi o tym poinformować każdego lekarza, który będzie udzielał pomocy i innych świadczeń)

Podanie uczulającego leku grozi wstrząsem anafilaktycznym,

a w najgorszym przypadku zgonem.

48

Biegunki i stany zapalne jelit

Z powodu redukcji flory bakteryjnej jelit dochodzi do rozwoju

dysbakteriozy jelit.

Zazwyczaj ma to miejsce podczas doustnego przyjmowania

antybiotyku.

Manifestuje się ona głównie objawami ze strony przewodu pokarmowego i obejmuje:

· zapalenie błon śluzowych · biegunki, niestrawność · pleśniawki

49

Postępowanie w przypadku biegunek poantybiotykowych

· nie wolno spożywać jednocześnie probiotyków i antybiotyków · zaleca się, by probiotyk przyjąć kilka godzin po antybiotyku i podczas

kuracji antybiotykami spożywać fermentowane produkty mleczne np. jogurty, kefiry

· należy pamiętać o właściwym nawodnieniu organizmu (ok. 2-2,5l

płynów) i diecie lekkostrawnej, by nie obciążać już i tak osłabionego układu pokarmowego

50

Infekcje grzybicze pochwy

· antybiotyki niszczą florę bakteryjną pochwy, którą tworzą m.in. z

pałeczki kwasu mlekowego, zapewniające kwaśne pH pochwy (kwaśne środowisko pochwy uniemożliwia rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych, głównie grzybów)

· wiele kobiet właśnie po antybotykoterapii, zmuszona jest szukaać

pomocy u ginekologa, z powodu nieprzyjemnych infekcji pochwy, którym towarzyszy świąd okolic intymnych i obfite upławy

· grzybicy również możemy zapobiegać, przyjmując preparaty

z probiotykiem, a także dbając o higienę intymną

51

Inne: uszkodzenia narządów wewnętrznych

Działania toksyczne.

Pewne antybiotyki mogą działać:

· ototoksycznie –uszkadzać słuch, zwłaszcza u małych dzieci np.

gentamycyna, amikacyna, neomecyna,

· hepatotoksycznie – negatywnie wpływajć na wątrobę np. doksycyklina,

nowobiocyna,

· nefrotoksycznie – upośledzać funkcjonowanie nerek np. kolistyna, · neurotoksycznie – uszkadzać układ nerwowy np. kolistyna, · toksycznie na szpik kostny – np. nowobiocyna, detromycycna.

52

Stosowanie antybiotyków:

· zawsze musi być zlecone przez lekarza.

· niekoniecznie podczas zwykłego przeziębienia konieczne jest podanie

antybiotyku.

· antybiotyk to lek zarezerwowany do leczenia zakażeń bakteryjnych, a

nie wirusowych, grzybiczych, czy stanów zapalnych związanych ze zwyrodnieniem stawów.

· leki te przyjmujemy regularnie, o stałych porach i w niezmiennych

dawkach. To, że lepiej się poczujemy podczas antybiotykoterapii wcale nas nie obliguje do samowolnego zaprzestania leczenia

· antybiotyk przyjmujemy wg. zaleceń lekarza – więc jeśli trzeba zażywać