A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S
F O L IA B IO C H IM IC A E T B IO PH Y SIC A 9, 1992
Ludwik Biały, Roman Gondko
U P R O S Z C Z O N A M E T O D A IZ O LO W A N IA H E M O C Y JA N IN Y I K A R O T E N O P R O T E IN R A K Ó W
O p is a no u p ro s zc z o ną m e to dę o trzy m yw a nia z surow icy i he m olim fy ra kó w h em o cyjanin y o ra z k a ro te n o p ro te in . S p ra w d z o no e ks pe ry m e n ta ln ie , że ty lk o k a ro te n o- p ro tein y ob ecn e w surow icy rak ów w iążą się se lektyw nie na z łożu h y dro ks y ap a ty to w y m p rz y sile jon ow e j 0,33 M b u fo ru fos fo ra no w e g o o p H 6,8. W tych w a run k ac h h em o cy ja nina nie zo staje z a a d so rb o w a n a , elu ują c się tym sam y m b ufore m . Po o d w iro w an iu elue n tu przy 150 000 g przez 6 godz in w tem p e ra tu rz e 4°C otrz ym u je się o sa d „ c ru d e ” hem ocyjaniny.
Z a a d s o rb o w a n e na k olu m nie żó łto-c ze rw on e k a ro te n o p ro te in y e luują się 0,5 M b ufo re m fos fora no w ym o p H 6,8.
1. W ST Ę P
D o m inu jącym białkiem w hem olim fie niek tóry ch przedstaw icieli M ollusca i Arthropoda jest barw nik oddechow y h em ocyjanina (H c). U rakó w , jak to stw ierdziliśm y up rzednio, hem ocyjanin a stanow i ok. 90% zaw artości wszyst-kich białek [3].
W obecnie stosow anych p ro cedu rach izolow ania hem ocyjaniny raków , przyjęto dw ie po dstaw o w e zasady po stępo w an ia. Białko to otrzy m uje się na skalę prep araty w n ą bezpośrednio z hem olim fy bądź po w ykrzepieniu „fib- ry n o ge nu ” z surowicy.
W p rzy p ad ku izolow ania hem ocyjaniny b ezpo średn io z hem olim fy jak o an ty k o ag u lan tu najczęściej używa się 5% E D T A w 0,1 M buforze octanow ym o pH 5,7. Usunięcie białek tow arzyszących, tj. glikoprotein, lipo karoten o- p ro tein i białek skrzepu, następ uje po ich w ytrąceniu (w postaci osadu ) w w yniku dializy d o dużych objętości w ody destylow anej. U ltraw iro w anie po usunięciu w y trąconych białek pro w adzi do o trzy m an ia niebieskiego osad u surowej hem ocyjaniny [8],
W pozostaw ionej bez an ty k o a g u lan ta hem olim fie raków n astępu je szybkie tw orzenie skrzepu, po usunięciu k tórego otrzym ujem y surow icę [4], P od danie surowicy ultraw iro w an iu trw ającem u 6 godz. przy 150 000 g prow ad zi do o trz ym an ia o sad u hem ocyjaniny [3, 4],
W o b u w ym ienionych p ro ced u ra ch oddzielenie białek tow arzyszących Hc, tj. g likop ro tein, k aro ten o p ro tein , je st czasochło nne i niezupełne.
D o izolow ania k a ro ten o p ro te in z surowicy w p ro w adzo no w łasną m ody fi-kację op isan ą poniżej. W zap rop o n ow any m p ostępo w an iu z puli białek tow arzyszących hem ocyjaninie b ard zo szybko usun ięte zo stają k gro teno- proteiny.
2. M A T E R IA Ł I M E T O D Y
H em olim fę p o b ran ą z 1 oso bn ik a (Astacus astacus) przez iniekcję doser- cow ą, po zo staw io no w tem p. pokojow ej 2 godz. do w ykrzepienia. Skrzep po rozbiciu bagietką i przepuszczaniu przez w atę silikonow ą usuw an o przez w irow anie przy 12 000 g przez 15 min.
O trzy m an ą surow icę rozcień czano 1 M b ufo rem fo sforan ow ym o pH 6,8 do końcow ego stężenia 0,33 M (2: 1).
R o ztw ó r ten w ilości 3 cm 3 nan o sz on o na kolum nę 2,5 x 2 cm w ypełnioną h yd ro k sy ap aty tem (Bio-Gel H T), eluując hem o cyjaninę tym sam ym buforem z szybkością 30 cm 3/godz.
R ys. 1. R o zd z ia ł he m o cyjanin y i k a ro te n o p ro te in ra k a A . astacus n a złoż u Bio-G el H T bufo rem fo sfora no w y m p H 6,8
U staliliśm y dośw iadczalnie, że w po dan ych w aru nk ach na hydrok sy- ap aty cic selektywnie ab sorb u ją się tylk o k a ro te n o p ro tein y (rys. 1). N a pod staw ie pow yższego fak tu o p raco w an a została m etod a izolow ania hem o-cy janiny i k a ro ten o p ro te in z surowio-cy pojedynczego oso bn ik a (skala m ikro) o raz z hem olim fy w skali m akro. O gólny to k p ostępo w ania p reparatyw n eg o p rzedstaw ion o schem atycznie na rys. 2.
H E M O L IM F A 1. p o b ra n ie i po zo sta w ien ie he m o -lim fy d o w yk rze pien ia (2 g odz.) 2. ho m og en iz ac ja sk rz e pu p rze są -czenie prz ez w atę silik ono w ą , w irow an ie 12 000 g 15 m in
S U R O W IC A roz cieńcz enie b u fo rem fo s fo ra
-n ow y m 1 M p H 6,8 w s to s u-n k u 2: 1
H Y D R O K S Y A P A T Y T (B io-G e l H T )
elucja hem oc yjaniny 0,33 M b u fo re m fosfo ra no w ym p H 6,8
H E M O C Y J A N IN A
u ltra w irow a nie 6 godz. 150 000 g K A R O T E N O P R O T E IN Y ż ółtocze rw on e p as m o k a ro -te n o p ro -te in z a ad s o rb ow an e n a k olu m nie elucja 0,5 M bu fo rem fo s fo ra n o w y m p H 6,8 osa d H E M O C Y J A N IN Y K A R O T E N O P R O T E IN Y Rys. 2. O g óln y sc he m a t p os tę po w a n ia p re p ara ty w n e g o
Celem o trzym ania hem ocyjaniny w po staci o sadu eluent pozbaw iony k a ro ten o p ro te in należy p od d ać u ltraw iro w aniu przy 150 000 g przez 6 godz. w tem p. 4°C (skala m ikro).
D o o trzym ania hem ocy janiny w skali m ak ro łączy się hem olim fę z kilku oso bników . N astępnie w opisany m powyżej p ostępo w aniu otrzym ujem y surow icę, k tó r ą po ddajem y u ltraw iro w an iu przy 150 000 g przez 6 godz. (tem p. 4°C). O trzy m an y niebieski osad hem ocyjaniny zanieczyszczony jest k arote no
-protein am i. O sad należy rozpuścić w niewielkiej ilości b u fo ru fo sforano w ego 0,33 M o pH 6,8 i nanieść na ko lu m nę z hy dro k syap atytem . Dalsze postępow anie: wym yw anie i ultraw irow anie należy w y konać w edług opisu p od an eg o powyżej.
Z atrzy m an e na złożu hy d ro ksyap atyto w ym k aro ten o p ro te in y eluuje się 0,5 M b uforem fosforanow ym o p H 6,8.
3. K R Y T E R IA C Z Y S T O Ś C I
C zystość i jed n o ro d n o ść p re p ara tó w hem ocy janiny o kreślan o na p o d -stawie:
w idm a p ochłanian ia (280: 340), - ro zdziału elektroforetycznego.
Jed n o r o dn o ść frakcji k aro teno p ro teino w ej u stala no elektroforetycznie. Elektro fo rezę o 10% żelu poliakrylo am ido w y m z SD S w y k on an o według Laem m li [5].
4. WY N I K I I D Y S K U S J A
N a rys. 2 zam ieszczono schem at w łasnego p o stęp ow a nia p reparaty w neg o w stosow anej uproszczonej m etodzie otrzy m y w ania hem ocyjaniny i k aroten o - pro tein raków . Rów nolegle o trzym a no p re pa raty hem ocyjanin dotychczas stosow anym i dw om a m etodam i - według: Pilz i wsp. [8],
P rzy kładow y rozdział k a ro ten o p ro te in i hem ocyjaniny m eto dą ch ro m ato -grafii kolum now ej na hy d rok syapaty cie H T przed staw io no na rys. 1.
N a po dstaw ie w y kon an ych widm absorpcji hem ocyjanin wyliczone sto -sunki p o ch łan iania 280/340 zeb ran o w tab. 1.
T a b e l a 1
S to sunk i a b so rba n cji p re p a ra tó w H c (n = 5)
Po s tęp ow an ie p re p araty w ne A 280 : A34o
U ltra w iro w a n ie surow icy 5,61
U ltraw iro w a n ie hem olim fy [5] 5,95
O czyszczanie n a h y dro ks ya p atyc ie 5,48
Rozdziały elektro foretyczne poró w ny w any ch pre pa rató w hem ocyjanin, w yizolow anych k aro te n o p ro tein o raz białek w zorcow ych w żelu p oliak -rylo am id ow ym p rzedstaw io no n a rys. 3.
— 3 3 0 t y s t y r e og l o bu l in a
6 7 t y s B S A 6 0 t y s k a t a l a z a
■ 36 t y s d e h y d r o g e n a z a m l e c z a n o w a
Rys. 3. R ozdział e le ktrofo re ty cz ny k a ro te n o p ro te in (4) i białek w z orco w y ch (W z) o ra z hem o- cyjanin: 1 H e po u ltraw iro w an iu surow icy; 2 H c p o u ltra w irow a n iu hem olim fy; 3 H e po
oczyszczan iu n a h yd rok s y ap aty cie
O trzym any p rep a rat k ar o ten o p ro tein o kazał się być h om o gen ną frakcją białkow ą (rys. 3; 4).
R ozdziały elektro forety czne p re p arató w hem ocyjaninow ych (rys. 3; 1,2, 3) nie ró żn ią się m iędzy sobą i p ozo stają w zgodności z danym i literaturow ym i.
H em ocyjaniny m iedzioprotein y spełniające w hem olim fie Arthropoda i M ollusca rolę przenośników tlen u m ogą w ystępow ać u osob nik ów tego sam ego g atu n k u w postaci ag regatów (składnik ów ) o różnych stałych sedy-m entacji [7]. M a to sedy-miejsce również w p rzy p adk u Hc raków , gdzie u jedn eg o osob nik a występują składniki 5 S, 16 S i 24 S [6],
O bo k hem ocyjanin w hem olim fie Crustacea obecne są zawsze kar oten o- proteiny (astak san ty n a, k aroten y) m. in. odpow ied zialne za charakterystyczne zabarw ienie pancerzy sk orup iakó w [1, 2], Związki te tw orzą trw ałe połączenia z białkam i występującym i w hem olim fie po d og ólną nazw ą ka roten o p rotein . Im też przypisuje się w ażną funkcję zm iataczy w oln orodn ikow y ch, w tym an io n o ro d n ik a po nadtlen ko w ego [9],
Z ap rezen tow an e postępo w anie prep araty w n e daje m ożliwość rów noczes-nego o trzy m ania w ym ienionych białek w stanie czystym , będąc wielce użytecz-nym do dalszych b ad ań ich stru k tu ry i funkcji.
5. B IB L IO G R A F IA
[1] B a u c h a u A. , d e B r o u w e r M. B. (1974). J. M ic rosc., 19, 37-46.
[2] C z e c z u g a B., K r y w u t a S. (1981), C o m p . Biochem . Physiol., 68B, 339-343.
[4] G o n d k o R ., M i c h a 1 a k W ., Ś w i e r c z y r i s k i B. (1981), C o m p . B iochem . Phys io l., 69A, 637 -640 .
[5] L a e m m l i U. K. (1970), „ N a tu r e ” , 227, 68 0 685.
[6] M i c h a l a k W ., G o n d k o R. (1988), A cta U n iv. L odz., Fo lia biochim . biop hy s., 6, 135 144. [7] M i c h a l a k W ., G o n d k o R. (1988), A cta U niv. L o dz., Folia biochim . biop hy s., 6, 145 175. [8] P i l z J., G o r a l K. , H o y l a e r t s M. , W i t t e r s R. , L o n t i e R. (1980), E ur. J. B iochem .,
105, 539-543.
[9] P ł o n k a A. (1976), A cta U niv. L o dz., 19, 27 66.
W płynę ło d o R edakcji
„ F o lia b ioch im ic a et b io p hy s ica ” 25.07.1991
L udw ik B ialy, R om an G ondko
S IM P L IF IE D M E T H O D O F T H E IS O L A T IO N
O F C R A Y F IS H H A E M O C Y A N IN A N D C A R O T E N O P R O T E IN S
T h e sim plified m eth o d o f th e iso la tio n o f h ae m oc yja nin an d c a ro te n o p ro te in s fro m cray fish h e m o ly m ph w as describ ed a n d ch a ra cterize d . It h as been hy po th es ized a n d c on firm ed ex pe rim en -tally th a t only c aro te n o p ro te in s pres en t in crayfis h h em o ly m p h selectively bind to h yd ro x y a p atite b ead a t the ion ic s tren g th c orre sp o n d in g to 0.33 M p h o s p h a te bu ffer p H 6.8. U n de r these c o n d itio n s h a em oc y an in rem a in s u n a d s o rb e d in the s olu tion a n d m a y be e lute d w ith th e sam e bu ffer. F o llo w in g th e c e ntrifu g a tion a t 150 000 x g fo r 6 h (4°C) th e res iduem o f „ c ru d e ” h aem oc y an in m ay be ha rve sted . R e d-yello w ish c a ro te n o p ro te in s , a d so rb ed a t the to p o f h y d ro x y a p a tite be ad, m a y be su b seq ue n tly e luted w ith 0.5 M p h o s p h a te b u ffer p H 6.8.
K a te d ra Biofizyki U n iw ers ytetu Ł ó dz kiego
