RO CZN . PZH, 1999, 50, N R 4, 409-419
LUDWIK CZERWIECKI, G R AŻYN A W ILCZYŃSKA
O Z N A C Z A N I E W IT A M IN В, I B 2 W W Y B R A N Y C H P R O D U K T A C H O W O C O W O -W A R Z Y W N Y C H
D E TE R M IN A TIO N OF VIT A M IN S Bi A N D B2 IN SELECTED VE G E TA B LE -FR U IT PRODUCTS
Zakład Analizy Żywności
Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego 02-532 Warszawa, ul. Rakowiecka 36
Kierownik: prof. dr hab. B. Szteke
Witaminy B i i B2 w sokach owocowych i owocowo-warzywnych oznaczano techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej par jonowych w odwróconym układzie faz. Średni odzysk witaminy Bi wahał się w zakresie od 85 do 104%, a witaminy B2 od 94 do 106%. Granice wykrywalności i oznaczalności, w mg/ml produktu, wynosiły, odpowiednio: 0,0008 i 0,0024 (witamina B i) oraz 0,0002 i 0,0007 (witamina В 2).
WSTĘP
T ia m in a , czyli w ita m in a Bi w ystępuje w różnych fo rm a c h (c h lo ro w o d o re k , p iro fo s- fo ra n ) w zb o ż ac h i ich p rz e tw o ra c h o ra z w m ięsie. W arzyw a, ow oce i ich p rze tw o ry są rów nież ź ró d łe m tej w ita m in y ch o c ia ż uboższym [7]. D o głów nych funkcji tia m in y w o rg an iz m ie ludzkim n ależy u d ział w rea k c ja c h cyklu p e n to z o w e g o i tw o rz e n ie rybozy n ie zb ę d n ej w sy n tezie n u k le o ty d ó w . W ita m in a ta sp e łn ia ró w n ież isto tn ą ro lę w p r o cesach za ch o d zący ch w k o m ó rk a c h u k ła d u n erw ow ego [10].
D ru g a z gru p y w ita m in В - w ita m in a B 2, czyli ryboflaw ina, w y stę p u je głó w n ie w p o sta c i zw iązanej w m le k u i je g o p rze tw o ra ch , w m ięsie, w w ęd lin ac h , w rybach, w p ro d u k ta c h zbożow ych o ra z w ro ślin ach strączkow ych [10]. P o n iew aż w o w o ca ch i w arzyw ach jej zaw arto ści są n iew ielkie je s t o n a często d o d a w a n a d o ich p rz e tw o ró w np. soków o ra z n e k ta ró w ow ocow ych i w arzyw nych w celu w zb o g a c e n ia ich w a rto śc i odżyw czej. R y b o flaw in a w ch o d zi w sk ład flaw o p ro te id ó w b io rą c u d z ia ł w p ro c e sa c h o k sydoredukcyjnych zach o d z ąc y ch w żywym o rg an izm ie.
G łów ny p ro b le m analityczny p o d cz as o zn a c z a n ia zaw arto ści w ita m in Bi i B 2 w żyw ności stanow i ich izolacja z p o łą cz eń w ja k ic h zazw yczaj w y stęp u ją. S to so w an e są ró ż n e m e to d y ek stra k cji p o łą c z o n e zazw yczaj z h y d ro lizą kw asam i m in e raln y m i, b ą d ź h y drolizą en zy m a ty cz n ą [2, 3, 8, 11]. Je d n y m z m ożliw ych i pro stszy ch ro zw iązań je s t rów nież e k s tra k c ja kw asem nad ch lo ro w y m [2, 3]. Z a w a rto ś ć w ita m in o z n a c z a się m e to d a m i biologicznym i, enzym atycznym i [7], s p e k tro fo to m e try c z n ie , k o lo ry m e try c z n e oraz flu o ry m etry cz n ie [7]. S to su je się rów n ież te c h n ik ę przepływ ow ej analizy nastrzy
-410 L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
kow ej z d e te k c ją w U V [5]. W p rzy p a d k u w itam iny Bi zw iązek m acierzysty p rze k szta łc a się d o tio c h ro m u , k tó re g o flu o re sc en cję m ierzy się przy 365/436 nm [7]. W m e to d z ie k o lo ry m e try c zn e j m ożliw e je s t w ykorzystanie reak cji barw n ej tia m in y z p -a m in o a c e to - fe n o n e m [7].
N a to m ia s t w ita m in ę Bi, k tó ra p o d w pływ em św iatła w śro d o w isk u alkalicznym ulega p rz e m ia n ie d o lum iflaw iny (7 ,8 ,1 0 -trim ety lo izo a lo k saz y n a), o z n a c z a się fo to m e try c z n ie p rzy 450 nm lub flu o ry m etry cz n ie z em isją przy 513 nm [7].
W an a lity c e o b u w itam in В w ykorzyw ana je s t rów n ież c o ra z częściej te c h n ik a wy- so k o sp ra w n e j c h ro m a to g ra fii cieczow ej (H P L C ) w o d w ró co n y m u k ła d z ie faz, rów nież z z a sto so w a n ie m p a r jon o w y ch , z d e te k c ją w U V b ą d ź flu o ry m etry cz n ą [1, 2, 3, 8, 11].
C e le m n in iejszej p racy była a d a p ta c ja now oczesnej i m ożliw ie p ro ste j m e to d y o z n a c z a n ia w ita m in Bi i B i w p rz e tw o ra c h ow ocow ych i w arzyw nych, ta k ich ja k : soki, n e k ta ry lub p rz e c ie ry itp.
N a p o d sta w ie p rz e g lą d u lite ra tu ry i w łasnych b a d a ń w stęp n y ch , za n a jo d p o w ied n iejszą u z n a n o m e to d ę o z n a c z a n ia o b u w itam in В te c h n ik ą w y so k o sp raw n ej c h ro m a to g ra fii cieczow ej (H P L C ) z za sto so w a n ie m p a r jonow ych w o d w ró c o n y m układ zie faz, p o ek stra k cji kw asem n ad ch lo ro w y m z d e te k c ją w U V [2, 3]. P o n ie w a ż m eto d y o ry g in a ln e o d n o siły się d o tk a n e k zw ierzęcych [9] o ra z do p r e p a ra tó w odżyw czych dla n ie m o w ląt n a b az ie soji i m lek a, n ie z b ę d n e były m o dyfikacje u m o ż liw ia jąc e ich z a sto so w an ie d o innej g ru p y p ro d u k tó w , d o któ ry ch n a le ż ą w y m ie n io n e w cześniej p rze tw o ry ow ocow o-w arzyw ne.
M ATERIAŁY I M ETODYKA W y p o s a ż e n i e
Wykorzystano chrom atograf cieczowy firmy Milton-Roy/LDC Analytical zestawiony z na stępujących elementów: pompy izokratycznej Constametric III, detektora UV Spectro-M onitor 3100, zaworu dozującego Rheodyne 731 z pętlą o pojemności 20 ц1, kolumny chromatograficznej Nova Pak RP-C18, W aters z przedkolumną o analogicznych właściwościach. Pracę zestawu kontrolowano za pomocą kom putera z programem sterującym i integracyjnym Axxiom727. Do rejestracji chromatogramów wykorzystano drukarkę Epson LX-400.
Stosowano ponadto: systemy oczyszczania wody Elix™ i R iO S™ , Milipore, generator ultradźwięków Biichler, pH -m etr mikrokomputerowy CP-135 Elm erton z elektrodą zespoloną E R H -1 1 i czujnikiem tem peratury MT-100 AM, wagę analityczną WA34, wytrząsarkę laborato ryjną Lab-line Instrum ents Inc, mikrostrzykawkę Hamilton poj. 100 ц1, sączki Schotta G-2 z zestawem do sączenia pod zmniejszonym ciśnieniem oraz typowe szkło laboratoryjne takie jak: kolby miarowe, pipety, cylindry miarowe, kolby Erlcnmayera, lejki szklane.
O d c z y n n i k i i m a t e r i a ł y p o m o c n i c z e
1. W oda do HPLC uzyskana z wody wodociągowej po oczyszczeniu za pomocą systemów Elix™ i R iO S IM Milipore 2. kwas solny 67% cz.d.a., Analar BDH do przygotowania roztworu 0,1 molowego, 3. w odorotlenek potasowy cz.d.a., PPH Standard, Lublin (do przygotowania 6 molowego roztworu), 4. kwas nadchlorowy 70%, Aristar BDH, 5. kwas heksanosulfonowy 99%, Lancaster, 6. amoniak 25% cz.d.a., Analar BDH, 7. acetonitryl do HPLC, Promochem GmbH, 8. kwas o-fosforowy 85% cz.d.a., PPH POCh, Gliwice, 9. tiamina 99%, Lancaster do przygoto wania roztworu wzorcowego podstawowego o stężeniu 0,1 mg/ml w 0,1 molowym roztworze kwasu solnego, 10. ryboflawina 98%, Lancaster do przygotowania roztworu wzorcowego pod stawowego o stężeniu 0,02 mg/ml w 0,1 molowym roztworze kwasu solnego, 11. standard wewnętrzny jako kwas 3-hydroksybenzoesowy (m-HBA) 97%, Lancaster do przygotowania
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności 411 roztworu o stężeniu 0,55 mg/ml cieczy elucyjnej roboczej, 12. bufor o pH 4, Eurosensor, Gliwice, 13. bufor o pH 7, Eurosensor, Gliwice.
Z a s a d a m e t o d y
Zasada metody polega na ekstrakcji witamin z próbki przy użyciu kwasu nadchlorowego, usunięciu jego nadm iaru za pomocą 6 molowego roztworu wodorotlenku potasowego i dopro wadzeniu analizowanego roztworu do wartości pH 3,0-3,6 [2, 3]. Witaminy B| i B2 rozdzielano i oznaczano techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem par jonowych na kolumnie RP-C18 z detektorem UV przy długości fali X. 254 nm.
O b r ó b k a w s t ę p n a b a d a n e g o m a t e r i a ł u
Soki i soki przecierowe: bezpośrednio po otwarciu opakowania pobierano 20 ml soku do kolby Erlenmayera poj. 100 ml. Próbkę rozcieńczano 30 ml wody i zakwaszano 2 ml kwasu nadchlorowego.
Kolbę zamykano korkiem szlifowym i zabezpieczano folią aluminiową przed dostępem świat ła. Zawartość kolby wytrząsano przez 1 godzinę na wytrząsarce mechanicznej, następnie prze noszono do zlewki pojemności 150 ml i doprowadzano do pH 3,0-3,6 dodając kroplami 6 mo lowy roztwór wodorotlenku potasowego. Próbkę przenoszono następnie ilościowo do kolby miarowej pojemności 100 ml uzupełniając jej objętość do kreski cieczą elucyjną roboczą1. Tak przygotowaną próbkę przechowywano przez 24 godziny w lodówce w celu sklarowania. W przy padku niecałkowitego sklarowania zawartość kolby sączono przez sączek z bibuły. Przed wyko naniem analizy H PLC pobierano 5 ml klarownego roztworu do kolbki miarowej poj. 10 ml, do której uprzednio dodano 100 ц1 roztworu wzorca wewnętrznego (m-HBA). Zawartość kolbki uzupełniano do kreski roztworem cieczy elucyjnej roboczej i mieszano w łaźni ultradźwiękowej 15-20 sek. Równolegle, w podobny sposób przygotowywano roztwór bez dodatku wzorca wewnętrznego.
P r z y g o t o w a n i e k r z y w e j w z o r c o w e j
Do kolby Erlenmayera poj. 100 ml zabezpieczonej folią aluminiową przed dostępem światła odmierzano 2 ml roztworu podstawowego witaminy Bi, 10 ml roztworu podstawowego witaminy B2, 40 ml wody i 2 ml kwasu nadchlorowego. Dalej postępowano jak z próbkami soków.
Bezpośrednio przed wykonaniem analizy HPLC do 3 kolbek miarowych poj. 10 ml zawie rających 100 (il wzorca wewnętrznego pobierano po 2,5; 5,0 i 7,5 ml uprzednio przygotowanego roztworu wzorcowego witamin Bi i B2. Zawartość kolbek uzupełniano do kreski roztworem cieczy elucyjnej roboczej i mieszano w łaźni ultradźwiękowej w czasie 15-20 sek. W tak przygo towanych roztworach wzorcowych stężenie witamin Bi i B2 wynosiło odpowiednio: 0,0005, 0,0010 i 0,0015 mg/ml, a stężenie wzorca wewnętrznego (m-HBA) - 0,0055 mg/ml.
W y s o k o s p r a w n a c h r o m a t o g r a f i a c i e c z o w a
Analizę chromatograficzną próbek wykonywano w tem peraturze otoczenia (20-25°C). Fazę rozwijającą (roztwór stężony) przygotowywano rozpuszczając 0,95 g kwasu heksanosulfonowego w mieszaninie o składzie: woda : acetonitryl : amoniak (904,5 : 95 : 0,5). Roztwór ten zo bojętniono do pH 3,6 kwasem o-fosforowym. W celu przygotowania cieczy elucyjnej roboczej, do 950 ml cieczy podstawowej dodawano 50 ml wody.
Optymalna prędkość przepływu cieczy elucyjnej wynosiła 1 ml/min. Pomiaru absorbancji w UV dokonywano przy długości fali A. 254 nm.
W analogicznych warunkach chromatografowano roztwory wzorcowe witamin Bi i B2. Z a wartość witamin В w mg/ml próbki obliczano z krzywej wzorcowej za pomocą program u kom puterowego wykorzystującego następujące wzory:
412 L. Czerwiecki, G. Wilczyńska N r 4
WYNIKI I ICH OM Ó W IENIE
W b a d a n ia c h w stępnych n a ro ztw o rac h w zorcow ych w itam in sp ra w d z o n o o p ty m a ln e długości fali ab so rp c ji w U V . S tw ierd zo n o , że przy 254 nm m o ż n a o z n a c z a ć z a ró w n o w ita m in ę Bi ja k i B 2 (p o m im o ich różnych m aksim ów ab so rp cji; o d p o w ie d n io : 246, 266 n m ). U s ta lo n o p o n a d to , że roboczy za k res liniow ości d e te k to r a przy tej dłu g o ści fali o b e jm o w a ł s tę ż e n ia o d 0,0005 d o 0,0015 m g/m l k aż d ej z o zn a cz an y c h w ita m in . W y k a z a n o ró w n ież pozytyw ny wpływ (lepszy ro zd z iał o b u su b stan cji n a c h ro m a to g ra m a c h przy n ie z n a c z n ie dłuższych czasach re te n c ji) ro zc ie ń c z e n ia 950 ml cieczy elucyjnej 50 ml w ody.
W p ierw szej fazie b a d a ń p rz e śle d z o n o rów n ież (n a ro ztw o rac h w zorcow ych) dw a sp o so b y o b lic z a n ia w yniku: m e to d ą sta n d a rd u w e w n ętrz n eg o o ra z m e to d ą sta n d a rd u z e w n ę trz n e g o . U z n a n o , że wyniki o trz y m a n e w ob u p rz y p a d k ach były poró w n y w aln e. J e d n a k w p ó źn iejszej fazie b a d a ń n a rzeczyw istych p ró b k a c h , o k a z a ło się, że w o p isa nych w a ru n k a c h m e to d a s ta n d a rd u w e w n ętrz n eg o z m -H B A n ie m o ż e być sto so w a n a d o soków , np. d o soku ja b łk o w eg o , soku p rze cie ro w eg o z m archw i o ra z so k u z ja b łe k i b rzoskw iń z e w zględu n a o b ec n o ść w nich n ie zid e n ty fik o w an e j su b sta n c ji o czasie re te n c ji zbliżonym d o sto so w a n e g o sta n d a rd u w e w n ę trz n e g o (rye. 1).
Z a s to s o w a n ie w ięc w zo rca w e w n ętrz n eg o m o ż e być celow e je d y n ie w p rzy p a d k u , gdy w b a d a n e j p ró b c e nie w ystęp u je su b sta n c ja o p o d o b n y m czasie re te n c ji d o u żytego w zo rca, a w ykonyw ane czynności w sp o só b isto tn y m o g ą rzu to w a ć n a p o p ra w n o ść
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności 413
Ryc. 1. Chromatogramy próbki soku jabłkowego z dodatkiem HBA (I) oraz próbki fortyfiko- wanej witaminami Bi i B2 bez dodatku HBA (II)
Chrom atogram s of apple juice samples with HBA (I) and fortified by vitamins Bi and B2 without HBA (II)
w yniku o zn a c z e n ia . W p rze d staw io n y c h b a d a n ia c h nie stw ie rd z o n o isto tn e g o w pływ u zabiegów zw iązanych z izo lo w an iem w itam in z p ró b k i n a w ynik o zn a c z e n ia .
P rz y d a tn o ść o p isa n e j p ro c e d u ry analitycznej d o o z n a c z a n ia w ita m in Bi i B 2 w poszczeg ó ln y ch ro d z a ja c h p ro d u k tó w sp ra w d z o n o fo rty fik u jąc p ró b k i soków i soków p rzeciero w y ch o k reślo n y m i p o zio m am i o b u w itam in . M e to d a ek stra k cji w ita m in В kw asem n ad c h lo ro w y m sto s o w a n a d o tk a n e k zw ierzęcych [9] o ra z p re p a ra tó w sojow ych i p rz e tw o ró w m lecznych, o k a z a ła się p rz y d a tn a rów n ież d o p ro d u k tó w ta k ich ja k soki ow ocow e i w arzyw ne. W p rz y p a d k u p ró b e k zaw ierających te w itam iny, odzysk m e to d y o k re śla n o w sto su n k u d o te o re ty c z n ie o b liczonej ich zaw arto ści sta n o w iąc ej su m ę o z n a c z o n e g o s tę ż e n ia i p o z io m u fortyfikacji, przy jm u jąc tę w arto ść za 100% . D o o b lic za n ia z a w arto śc i w itam in y B, i B 2 sto so w a n o m e to d ę s ta n d a rd u z e w n ę trz n e g o . W ta b e la c h l - I I I z e b ra n o m .in. w artości śred n ie g o odzysku o b u w itam in .
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności 417 Jak wynika z przedstaw ionych danych zawartych w tabelach, średni odzysk w itam iny Bi wahał się w granicach od 85 do 104% w zależności od rodzaju próbki i poziom u wzmocnienia. W zględne odchylenie standardow e (współczynnik zm ienności) wynosiło 1,5 do 10,6%.
W przypadku witam iny B2 w tych samych produktach, przy tym samym poziom ie fortyfikacji, w artości te wynosiły odpow iednio: 94-106% i 1,6-10,0% .
W celu obiektyw nego wyznaczenia granicy wykrywalności i oznaczalności m etody zastosowano postępow anie wg H adricha i wsp. [6]. D la w itam iny Bi w ykonano zatem po 3 rów noległe w zm ocnienia soku z czarnej porzeczki (nie zawierającej tiam iny) na poziomie: 0,020; 0,010 i 0,002 mg/ml soku określając dla każdego poziom u odpow iedź detektora. P odobnie postępow ano w przypadku witaminy B2 w ykonując po 3 rów no ległe pom iary w soku pom idorow ym (nie zawierającym ryboflawiny) fortyfikowanym poziomami: 0,0050; 0,0025 i 0,0005 mg/ml soku. W ten sposób w yznaczono rów nanie regresji opisujące zależność pom iędzy stężeniem dodanych witam in a wielkością syg nału d etek to ra. N astępnie korzystając dalej z tego sposobu, który zastosow ano rów nież z pow odzeniem we wcześniejszej pracy własnej dotyczącej oznaczania witam iny С [4], wyznaczono m.in.: rów nania regresji opisujące zależność pom iędzy stężeniem ro z tworów wzorcowych w itam in a sygnałem d etek to ra oraz wykreślono krzywe odzysku, czyli zależności pom iędzy stężeniam i dodanych do p róbek witam in В a stężeniam i obliczonymi z rów nań regresji krzywych kalibracyjnych roztw orów wzorcowych. W yra żają to rów nania: у = 0,00011855 + 1,0011 x (dla witam iny Bi) oraz у = -0,0000568 + 1,00457 x ( dla w itam iny B2 ) (ryc. 2 i 3). O bliczono także granice wykrywalności oraz oznaczalności dla obu witamin.
Ryc. 2. Krzywa odzysku witminy Bi z soku z czarnej porzeczki Recovery curves of vitamin Bi for black-currant juice
418 L. Czerwiecki, G. Wilczyńska N r 4
Ryc. 3. Krzywa odzysku witaminy B2 z soku pomidorowego.
Objaśnienia: G 0Zn - graficzne odwzorowanie granicy oznaczalności metody Recovery curves of vit. B2 for tom ato juice
D la w ita m in y Bi g ra n ic a w ykryw alności d la odzysku p o m ię d zy 70 a 120% (ró w n an ia: у = 0,7 x i у = 1,2 x) w ynosiła 0,0008 m g/m l p ro d u k tu , n a to m ia st g ra n ic a o zn a cz aln o ści 0,0024 m g/m l. W p rz y p a d k u w itam iny B 2 w arto śc i te w ynosiły, dla w a ru n k u ja k p o p rz e d n io , o d p o w ie d n io : 0,0002 i 0,0007 m g/m l an a liz o w a n e g o p ro d u k tu (ryc. 2, 3).
WNIOSKI
1. O p is a n a m e to d a o z n a c z e n ia w ita m in Bi i B 2 w so k ach ow ocow ych i ow ocow o- w arzyw nych je s t sto su n k o w o p ro s ta i c h a ra k te ry z u je się d o b ry m i p a ra m e tra m i śre d n ie g o o dzysku i p o w tarz aln o śc i, a ta k ż e w ykryw alności i o zn a cz aln o ści. M oże w ięc być sto so w a n a w b a d a n ia c h rutynow ych. Jej e w e n tu a ln e z a sto so w a n ie do innych p ro d u k tó w spożywczych w ym aga je d n a k sp raw d ze n ia .
L . C z e r w i e c k i , G . W i l c z y ń s k a
D E TE R M IN A T IO N O F VITAMINS Bi AND B2 IN SELECTED V EG E T A B L E -FR U IT PRODU CTS
Summary
A simple m ethod was described to determ ine vitamins Bi and B2 in fruit and vegetable-fruit juices. Vitamins were extracted with perchloric acid and for their determ ination an ion pairing R P-H PLC technique with U V detection by 254 nm was applied.
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności 419 The average recovery for vitamin Bi was 85-104% and 94-105% for vitamin B2. The statitically estim ated limits o f identification and detection were respectively, for both vitamins: for Bi: 0,008 and 0,0024, and for B2 0,0002 and 0,0007 mg/ml o f product.
PIŚM IENNICTW O
1. Albada-Hurtado S., Veciana-Nogues M.T., Izquierdo-Pulido M. i wsp.: D eterm ination of water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography. J. Chrom. A. 1997, 778, 247-253.
2. Chase G.W. Jr, Landen IV.O. Jr, EitenillerR.R. i wsp.: Liquid chromatographic determ ination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in infant formula. J. A O AC Int. 1992, 75, 561-565. 3. Chase G.W. Jr, Landen W.O. Jr, Saliman E.G. i wsp.: M ethod modification for liquid
chrom atographic determ ination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in medical foods. J. A O A C Int. 1993, 76, 1276-80.
4. Czerwiecki L., Wilczyńska G.\ Oznaczanie witaminy С w wybranych produktach owocowo- warzywnych. Roczn. PZH 1999, 50, 77-87.
5. Danet A.F., Calatayud J.M .: FIA-spectrophotometric determ ination of thiamine after UV- irradation. Talanta 1994, 41, 2147-2157.
6. Hadrich J., Vogelgesang J.: Konzept 96 zur Ermittlung von Nachweis-Erfassungs-und Bestim- mungsgrenze. Deutsch. Lebensm. Rdsch. 1996, 92, 341-350.
7. Moszyński P., Pyć R.: Biochemia witamin. Cz. I. Witaminy grupy В i koenzymy. PWN, Warszawa 1998, 24-76.
8. Ótles S.: Vergleichende Vitamin Bi und B2 Bestimmungen in Lebensmitteln. Z. Lebensm. Forsch. 1991, 193, 347-350.
9. Pierotti J.A., Dickson A.G ., Palmer J.К. i in.: Liquid chromatographic separation and quan titation of B6 vitamers in selected rat tissues. J. Chrom. 1984, 306, 377-382.
10. Secomska B.\ Tiamina. W: Wybrane metody badania składu i wartości odżywczej żywności, ed. U. Rutkowska, PZW L, Warszawa 1981, 253-258.
11. Vidal-Valverde С., Reche A.: Reliable system for the analysis o f riboflavin in foods by high-performance liquid chromatography and UV detection. J. Liq. Chrom. 1990, 10, 2089-2101.
