Synthese van phosphatidezuren

w^^

SYNTHESE

VAN PHOSPHATIDEZUREN

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL TE DELFT KRACHTENS ARTIKEL 2 VAN HET KONINKLIJK BESLUIT VAN 16 SEPTEMBER 1927, STAATSBLAD Nr. 310, OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS DR O. B O T T E MA, HOOGLERAAR IN DE AFDELING DER ALGEMENE WETENSCHAPPEN, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE VERDEDIGEN OP

WOENSDAG 3 JUNI 1953 DES NAMIDDAGS 4 UUR DOOR

JAN HENDRIK UHLENBROEK

FIRMA P. HARTE - BERGEN OP ZOOM 1953

Pag. Hoofdstuk I. Algemene beschouwingen over

phosphatide-zuren. Doel van het onderzoek 1 Hoofdstuk II. Critisch literatuuroverzicht betreffende

syn-these van phosphatidezuren en

phosphoroy-leringsmethoden 10 Hoofdstuk III. Synthese van enige acylglycolphosphorzuren 27

Hoofdstuk IV. Synthese van enige glycerolphosphatidezuren 49 Hoofdstuk V . Onderzoek naar de zuiverheid van a- en

jS-phosphatidezuren met behulp van

per-joodzuur 68

Summary 72 Literatuurverwijzingen 76

A L G E M E N E B E S C H O U W I N G E N O V E R P H O S P H A T I D E Z U R E N . •• D O E L V A N H E T O N D E R Z O E K .

Inleiding.

De geschiedenis van de chemie der phosphatiden ^) begint reeds in 1719 met de vondst van H e n s i n g (1), dat de hersenen phos-phorus bevatten. Bijna honderd jaar later, omstreeks 1811, stelde V a u q u e l i n (2) vast, dat deze phosphorus verbonden was ,,avec la matière grasse du cerveau". Spoedig bleek, dat dergelijke ver-bindingen van phosphorus ,,avec une matière grasse" ook in ander dierlijk materiaal voorkwamen. Z o isoleerde G o b l e y (3) in 1845 uit eidooier, later ook uit hersenen, een ,,matière visqueuse" waar-aan hij in 1850 de naam lecithine toekende; bij behandeling met zuren of basen leverde deze ,,matière visqueuse" vetzuren en

glycerolphosphorzuur.

Ook S t r e c k e r (4) isoleerde in 1862 uit dierlijke gal een fractie, die bij koken met barietwater de bariumzouten van vetzuren en glycerolphosphorzuur leverde; deze fractie moest „ein dem Lecithin entsprechender Körper gewesen sein, oder mit anderen W o r t e n

Glycerinphosphorsaure, worin ein Theil des Wasserstoffs durch die Radicale fetter Sauren vertreten ist".

S t r e c k e r had verder uit de gal na een tamelijk rigoureuze behandeling met base of zuur ook een organische base in de vorm van een chloroplatinaat kunnen isoleren. Hij gaf aan deze base de naam choline, maar de mogelijke betekenis van deze vondst voor de structuur van het lecithine ontging hem voorlopig.

^) De naam „phosphatiden" werd voor het eerst in 1901 door THUDICHUM

aan de phosphorushoudende bestanddelen der hersenen toegekend. („Die chemische Konstitution des Gehirns der Menschen und der Tiere", Tubingen,

1901). 1

Intussen had ook L i e b r e i c h bij alkalische hydrolyse van een uit hersenen geïsoleerde phosphatidenfractie onder meer een base gevonden, die door hem neurine genoemd werd. Bij voortzetting van dit onderzoek kwam D i a k o n o w (5) in 1868 tot de con-clusie, dat het lecithine een zout van distearoylglycerolphosphorzuur en neurine moest zijn. Deze opvatting werd weldra door S t r e c k e r (6) bestreden. Men had namelijk inmiddels de structuur van het choline opgehelderd; dit bleek een amino-alcohol te zijn. S t r e c k e r vond nu, dat het lecithine zowel basische als zure eigenschappen vertoonde en dat het een chloroplatinaat kon vormen, hetwelk echter niet identiek was met het chloroplatinaat van choline. Deze feiten vormden volgens S t r e c k e r een bewijs dat het lecithine stellig geen zout, maar waarschijnlijk een ester was van een diacyl-glycerolphosphorzuur met choline. Tevens wees hij er terecht op, dat in het lecithine zeker niet uitsluitend stearinezuurresten aan-wezig waren.

Ook uit plantaardig materiaal had men intussen soortgelijke stoffen kunnen isoleren. Een volledige beschrijving van de ge-schiedenis van de chemie der phosphatiden valt vanzelfsprekend buiten het bestek van dit proefschrift. De ontdekking van de cephalinen, van het sphingomyeline, etc. moet stilzwijgend ge-passeerd worden. Slechts zij geconstateerd, dat enkele gemeen-schappelijke kenmerken van de stoffen in questie, welke men thans phosphatiden noemt, al spoedig naar voren kwamen:

Ie) in hun oplosbaarheden vertonen zij sterke verwantschap met de vetten;

2e) bij hydrolyse ontstaan vetzuren, een stikstofhoudende base en glycerolphosphorzuur (of glycerol en phosphorzuur); 3e) zij komen zowel in plant als dier, vooral in vitale delen

hier-van, zeer verspreid voor.

Phosphatidezuren.

Een nieuw gezichtspunt brachten de onderzoekingen van C h i b n a l l en C h a n n o n in 1927(7). Uit het cytoplasma van de bladeren van de koolsoort Brassica oleracea isoleerden zij door extractie met aether, gevolgd door een precipitatie met aceton een

phosphatidenfractie, welke tot hun verbazing vrijwel geen stikstof bevatte. Bij voortgezette zuivering daalde het stikstofgehalte van hun product zelfs tot 0,22 %; geheel stikstofvrij konden zij het echter niet verkrijgen. De stof bleek een niet onbelangrijke hoeveel-heid calcium te bevatten. Bij verzeping met barietwater verkregen zij, behalve de bariumzouten van (voornamelijk onverzadigde) vet-zuren, uitsluitend het bariumzout van glycerolphosphorzuur. Hun conclusie luidde, dat de door hen geïsoleerde phosphatiden diacyU

glycerolphosphorzuren waren, die in de plant klaarblijkelijk in de

vorm van calciumzouten voorkwamen; zij voerden voor deze ver-bindingen de naam phosphatidezuren in. Spoedig bleek, dat deze verbindingen niet alleen in koolbladeren voorkwamen; in een reeks van publicaties (8—10) vermeldden C h i b n a l l , C h a n n o n en hun medewerkers weldra de isolatie van phosphatidezuren uit ander plantaardig materiaal zoals tarwekiemen en gras, terwijl H a n a h a n en C h a i k o f f ( l l ) eveneens uit verschillende plant-aardige materialen phosphatidezuren konden isoleren. Desondanks betwijfelden de laatstgenoemde onderzoekers het voorkomen van phosphatidezuren of hun zouten in de levende plant. Hun onder-zoekingen wezen er namelijk op, dat bijvoorbeeld in koolbladeren een enzyme voorkomt, hetwelk in staat is, althans in vitro uit phosphatiden, welke choline bevatten, de laatstgenoemde base af te splitsen. Zij opperden de veronderstelling, dat tijdens de be-reiding van de plantenextracten en de verdere behandeling daarvan de phosphatidezuren door de werking van het enzyme zouden vrijkomen. Uit plantaardig materiaal, hetwelk aan een voorbehan-deling met stoom was onderworpen (waarbij het enzyme vernietigd wordt), kon inderdaad een phosphatidenfractie met een wat hoger stikstofgehalte geïsoleerd worden, waaruit bij hydrolyse onder meer choline vrij kwam, hetgeen met de Reineckaat-methode van G l i c k (12) aangetoond werd. In verband met de onzuiverheid van de geïsoleerde phosphatidenfracties moet evenwel de conclusie, dat phosphatidezuren niet in de plant voorkomen, toch enigszins voorbarig geacht worden; verder onderzoek is hier stellig gewenst. Intussen is gebleken, dat phosphatidezuren niet uitsluitend in de organen der hogere planten voorkomen. A n d e r s o n en mede-werkers slaagden erin, uit Mycobacterium tuberculosis en enkele andere zuurvaste bacteriën een phosphatidenfractie te isoleren,

welke eveneens een zeer laag stikstofgehalte had. Vermoedelijk was deze stikstof in de vorm van ammoniak gebonden; in ieder geval waren choline, colamine of soortgelijke basen afwezig (13—16). B l o c h (17, 18), die de onderzoekingen van A n d e r s o n her-haalde, kon zelfs een stikstofvrij product verkrijgen. Hij vond verder, dat per aequivalent phosphorus een half aequivalent mag-nesium aanwezig was en hij merkte op, dat deze uit Mycobacterium tuberculosis geïsoleerde producten in hun eigenschappen duidelijk verwantschap toonden met de phosphatidezuren van C h i b n a l l en C h a n n o n . In sommige gevallen heeft A n d e r s o n echter ook koolhydraten geïsoleerd uit zijn phosphatidenfracties; de vraag, of het hier om mengsels dan wel om verbindingen gaat, is nog niet opgehelderd.

Een meer ingewikkelde structuur heeft vermoedelijk het door P a n g b o r n (19) uit hartspier geïsoleerde ,,cardiolipine", waarin evenmin stikstof voorkomt. Bij behandeling met koude alcoholische kaliloog geeft ,,cardiolopine ' naast de vetzuren linolzuur en olie-zuur een complexe phosphorolie-zuurverbinding, welke vermoedelijk afwisselend uit moleculen glycerol en phosphorzuur is opgebouwd. Bij hydrolyse in zuur milieu ontstaan althans glycerolphosphorzuur en glycerol, benevens wat vrij phosphorzuur. Terwijl verder de phosphatidezuren als tweebasische zuren reageren, gedraagt het ,,cardiolipine ' zich als een éénbasisch zuur per atoom aanwezige phosphorus; het heeft dus het karakter van een secundaire phos-phorzure ester. Klaarblijkelijk is het structureel verwant aan de phosphatidezuren.

Biologische betekenis der phosphatidezuren.

Het feit, dat de phosphatiden in relatief grote hoeveelheden in vitale organen voorkomen wijst erop, dat wij hier te doen hebben met stoffen, welke in het levende organisme één of meer belang-rijke functies vervullen; men heeft echter nog weinig inzicht in de aard dezer functie(s). De biologische samenhang, welke zonder twijfel tussen phosphatiden en phosphatidezuren bestaat, brengt de vraag naar voren, welke rol de laatstgenoemde verbindingen in dit verband spelen. Sommige onderzoekers zoals bijvoorbeeld B a e r

opbouw of afbraak der phosphatiden door de levende cel vormen. Merkwaardigerwijze heeft men minder aandacht geschonken aan de evenzeer mogelijke opvatting, dat de phosphatidezuren een zelf-standige rol spelen in de levende cel, al of niet in samenwerking met de phosphatiden. Deze gedachte is door B u n g e n b e r g d e J o n g uitgesproken. Hij meent — op grond van modelproeven met complexe colloïdsystemen verricht — dat phosphatiden^) met door hydrolyse ontstane phosphatidezuuranionen en een passend kation tesamen een zogenaamd tricomplex colloïdsysteem kunnen vormen; aan dit tricomplexe systeem zou verder een bijzondere rol toe-gekend moeten worden bij de regeling van de permeabiliteit van het protoplasmamembraam. De aanwezigheid van stoffen als cholesterol zou hierbij tevens van betekenis zijn (26).

De waarnemingen van P a n g b o r n (19), aan het ,,cardioli-pine" verricht, bevestigen, dat aan het systeem phosphatidezuur

+ phosphatide een bijzondere betekenis moet worden toegekend. In de Wassermanntest — een serologische reactie op syphillus-serum — kan namelijk als antigeen eveneens een mengsel van een phosphatidezuur (of een daarmee structureel verwante verbinding zoals het ,,cardiolipine") met lecithine benevens cholesterol ge-bruikt worden.

F a u r e (23) constateerde, dat deze antigeenreactie qualitatief ongewijzigd blijft bij hydrering van de onverzadigde vetzuren in het „cardiolipine" of in het lecithine. Tevens vond deze onderzoek-ster (24), dat de phosphatidezuren van C h i b n a l l en C h a n n o n in de Wassermanntest een soortgelijke, zij het mindere activiteit vertonen dan het ,,cardiolipine". Ook T o d d (25) bevestigde, dat phosphatidezuren actief zijn in deze test.

De juiste rol, die de phosphatidezuren, het lecithine en het cholesterol in de Wassermanntest spelen, is nog niet opgehelderd. Op grond van de theoriën van B u n g e n b e r g d e J o n g (26) zou men geneigd zijn, te veronderstellen, dat colloïd-chemische eigenschappen de achtergrond vormen van de genoemde serologi-sche verschijnselen. In ieder geval verdienen de colloïd-chemiserologi-sche eigenschappen van de phosphatidezuren een nadere bestudering.

^) Met „phosphatiden" worden hier eenvoudigheidshalve uitsluitend lecithinen en cephalinen bedoeld.

Isolatie der phosphatidezuren.

Een eerste voorwaarde voor een nauwkeurig onderzoek van de aangeroerde en grotendeels nog onopgehelderde problemen, in het algemeen van de physische, physisch-chemische en biologische eigenschappen van de phosphatidezuren is echter, dat men de beschikking krijgt over homogene preparaten dezer stoffen. De bereiding van zuivere phosphatidezuren, uitgaande van biologisch materiaal, stuit evenwel op belangrijke bezwaren.

Ten eerste komen de phosphatidezuren slechts in zeer geringe hoeveelheden in zulk materiaal voor; C h i b n a l l en C h a n n o n schatten, dat het calciumphosphatidaat omstreeks 0,3—0,6 % van de in koolbladeren aanwezige vaste stoffen uitmaakt.

Ten tweede wordt hun isolatie in ernstige mate belemmerd door het feit, dat deze kleine hoeveelheden phosphatidezuren afgeschei-den moeten worafgeschei-den van relatief grote hoeveelheafgeschei-den vetten, phos-phatiden, koolhydraten, e t c , welke stoffen door hun physische, respectievelijk physisch-chemische eigenschappen hardnekkige be-geleiders der phosphatidezuren blijken te zijn. Een scheiding langs chemische weg — bijvoorbeeld door extractie van de phosphatide-zuren met behulp van een verdunde base — verdient weinig aan-bevehng, aangezien esters van glycerol in het algemeen een grote gevoeligheid voor hydrolyse bezitten. Tot nu toe heeft men dan ook overwegend gebruik gemaakt van een selectieve extractie met organische oplosmiddelen; het optreden van moeilijk te breken emulsies en de sterke wederzijdse beïnvloeding van oplosbaarheden vormen echter enkele bezwaren, die aan deze weg inhaerent zijn. Bovendien verkrijgt men, uitgaande van biologisch materiaal, de phosphatidezuren meestal in de vorm van een olie, welke spoedig tot ontleding neigt; ongetwijfeld speelt het gehalte aan onverza-digde vetzuren hierbij een rol.

Structuur en voorkomen der phosphatidezuren.

Bij al de in de vorige paragraaf genoemde bezwaren voegt zich nog een moeilijkheid van geheel andere aard. Bezien wij de struc-tuurformules, welke wij voor de phosphatidezuren kunnen opstellen, (I t/m I V ) , dan blijkt, dat we niet slechts kunnen onderscheiden

tussen a- (I en II) en j8-phosphatidezuren (III en I V ) , al naar de plaats van aanhechting van de phosphorzuurrest in het molecule, maar ook tussen tweezurige (I en III) en driezurige phosphatide-zuren (Il en I V ) , al naar gelang het aantal verschillende zuur-resten, dat aan de opbouw van het molecule deelneemt.

CH2OD I CHOD I CH20PO(OH)2 I. CH2OD I CHOE I CH20PO(OH)2 II. CH2OD I CHOPO(OH)2 I CH2OD III. CH2OD I CHOPO(OH)2 I CH2OE IV. D en E nemen in deze formules de plaats in van een acylgroep, R.CO—

Bovendien kan men zich indenken, dat slechts één, in plaats van twee hydroxylgroepen in het molecule een acylgroep dragen; dan ontstaan de zogenaamde lyso-phosphatidezuren ( V t/m V I I ) .

CH2OD I CHOH I CH20PO(OH)2 V. CH2OH I CHOD I CH20PO(OH)2 VI. CH2OD I CHOPO(OH)2 I CH2OH VII.

Geheel in overeenstemming met de ingewikkelde samenstelling, welke natuurlijke phosphatiden, oliën en vetten plegen te hebben, kan men verwachten, dat ook de uit biologisch materiaal geïsoleerde phosphatidezuren, gesteld dat deze vrij van andere stoffen zijn verkregen, mengsels zullen zijn van verschillende isomeren en ho-mologen. Blijkens de tot nu toe opgedane ervaring zijn de acyl-groepen overwegend, hoewel niet uitsluitend, van onverzadigde vetzuren afkomstig; verzadigde vetzuren komen echter eveneens voor onder de hydrolyseproducten. Overwegend treft men Cig-en Cjg-zurCig-en aan.

Natuurlijk kan men de vraag stellen, of de phosphatidezuren in de typen I t/m VII in de natuur zullen voorkomen, met andere woorden, of aan de verbindingen, die door de structuurformules I t/m VII voorgesteld worden, een biologische betekenis toegekend

moet worden. Over de chemische bouw der in de natuur voor-komende phosphatidezuren is nog weinig bekend. Men mag even-wel redelijkerwijs veronderstellen, dat er een verband bestaat tussen opbouw en/of afbraak van de in de natuur voorkomende phospha-tidezuren en phosphatiden^) en dit feit zal ongetwijfeld een ver-band in de chemische opbouw van de genoemde verbindingen tot gevolg hebben. Over de configuratie der in de natuur voorkomende phosphatiden is namelijk iets meer bekend.

Het staat vast, dat zowel a-phosphatiden als «-phosphatidezuren in de natuur aanwezig zijn; dit blijkt onomstotelijk uit het feit, dat men bij herhaling onder de hydrolyseproducten van uit biologisch materiaal geïsoleerde phosphatiden, respectievelijk phosphatide-zuren optisch actief glycerolphosphorzuur heeft aangetoond, het-geen alleen bij de a-configuratie mogelijk is.

Het voorkomen van j8-phosphatiden in de natuur is minder zeker. W e l heeft men onder de hydrolyseproducten van phosphatiden ook geregeld jS-glycerolphosphorzuur gevonden, maar B a e r en K a t e s (20) hebben aangetoond, dat tijdens zure of alkalische hydrolyse van lecithinen een a " ^ /3-verhuizing van de phosphorzuurrest in het molecule optreedt, met als gevolg, dat de momenteel beschikbare gegevens geen conclusie toelaten over het al of niet voorkomen van ;8-phosphatiden. Daarentegen zou volgens genoemde onder-zoekers bij phosphatidezuren alleen bij hydrolyse in zuur milieu verhuizing van de phosphorzuurrest optreden, niet echter in alka-lisch miheu, zodat het onderzoek van de onder laatstgenoemde om-standigheden verkregen hydrolyseproducten van phosphatidezuren wèl aanwijzingen zou kunnen geven over het al of niet voorkomen van verbindingen van de jG-reeks. Een dergelijk onderzoek is voor zover ons bekend nog niet verricht. Het al of niet voorkomen van ^-phosphatiden en van ;8-phosphatidezuren verdient zeker een nauwgezette bestudering, mede in verband met de vraag, of er verschillen in physiologische werking tussen a- en /8-verbindingen bestaan. Later in dit proefschrift zal de hydrolyse van phosphatide-zuren onder alkalische omstandigheden uitvoeriger besproken worden.

W a t betreft het voorkomen van twee- en driezurige phosphatide-zuren kan worden opgemerkt, dat de voorkeur van de natuur voor de vorming van gemengde (tweezurige en driezurige) triglyceriden duidelijk gebleken is. Deze neiging van de natuur tot differentiatie heeft men teruggevonden bij de phosphatiden en zij zal ongetwijfeld ook de structuur van de in de natuur voorkomende phosphatide-zuren in belangrijke mate beheersen. Reeds daarom mag de be-reiding van driezurige phosphatidezuren (II en IV) zeer belangrijk worden geacht.

De lysophosphatiden hebben bekendheid verworven door hun sterke haemolytische werking; hun aanwezigheid in het levende dierlijke organisme is evenwel dubieus. Verschillende dierlijke se-creten, zoals slangengif en bijengif, bevatten een enzyme, dat uit lecithinen één vetzuurrest kan afsplitsen onder vorming van lysolecithinen. De toxische werking van deze secreten wordt hier-mede wel in verband gebracht. Een overzicht van het voorkomen van lysophosphatiden en de genoemde enzymen biedt bijvoorbeeld W i t t c o f f (22). Zonder twijfel vormen ook de lysophosphatide-zuren ( V t/m V I I ) een interessante groep van verbindingen, al is over hun eventuele voorkomen in de natuur niets bekend.

Doel van het onderzoek.

Het in dit hoofdstuk besproken feitenmateriaal mag beschouwd worden als een voldoende aanleiding tot een nadere bestudering van de eigenschappen van phosphatidezuren. Teneinde een der-gelijke studie op een in chemisch opzicht verantwoorde basis mo-gelijk te maken werd besloten, allereerst een onderzoek in te stellen naar de mogelijkheden tot synthese van de met de structuurformules I t/m IV aangeduide phosphatidezuren. Dit onderzoek vormt het onderwerp van dit proefschrift.

In hoofdstuk II zal een critisch overzicht worden geboden van de literatuur, welke in verband met de preparatieve zijde van dit onderwerp van belang mag worden geacht. De hoofdstukken III, I V en V beschrijven tesamen het verrichte onderzoek, waarna ter afsluiting een samenvatting van de bereikte resultaten volgt.

C R I T I S C H L I T E R A T U U R O V E R Z I C H T

B E T R E F F E N D E S Y N T H E S E V A N P H O S P H A T I D E Z U R E N E N P H O S P H O R O Y L E R I N G S M E T H O D E N .

§ 1. Onderzoekingen over de synthese van phosphatidezuren. A) P h o s p h o r o y I e r i n g v a n d i g l y c e r i d e n m e t

p h o s p h o r p e n t o x y d e .

Aan H u n d e s h a g e n komt de eer toe de eerste pogingen tot synthese van phosphatidezuren gewaagd te hebben. In 1883 (27) reeds beschreef deze onderzoeker een product, dat hij verkreeg door een mengsel van gelijke gewichtsdelen ,,a-distearoïne" en phosphorpentoxyde gedurende enige uren op omstreeks 100° te verhitten en het ontstane reactiemengsel met verdunde alcohol te behandelen. Verwarmen van ,,a-distearoïne" met phosphoroxy-chloride leverde minder succes op. De verhitting met phosphor-pentoxyde is blijkens het D.R.P. 193.189 (28) op naam van U l z e r en B a t i k ook op andere diglyceriden toegepast; deze onderzoekers voegden aan het reagerende mengsel wat water toe.

Het zijn vooral G r ü n en zijn medewerkers geweest, die een omvangrijke studie gewijd hebben aan de betekenis van deze methode voor de bereiding van phosphatidezuren en phosphatiden (31). G r ü n en K a d e (29) constateerden allereerst, dat de ver-hitting van een diglyceride met phosphorpentoxyde tot 110° tot verkoling leidde. Indien echter aan de smelt van een diglyceride met phosphorpentoxyde een kleine hoeveelheid water werd toe-gevoegd, bij voorkeur in de vorm van vochtige aether en de tem-peratuur op ongeveer 80° werd gehouden, dan zouden volgens G r ü n en K a d e , afhankelijk van de gebruikte gewichtsverhouding diglyceride : phosphorpentoxyde, hetzij het met het gebezigde digly-ceride corresponderende diglydigly-ceride-pyrophosphorzuur (bij een

molaire verhouding 1:1) of diglyceride-phosphorzuur, d.w.z. phos-phatidezuur (bij een molaire verhouding 2 : 1 ) ontstaan. De in het laatste geval verkregen producten smolten weliswaar niet scherp, maar de waterige oplossingen reageerden zwak zuur en bevatten geen anorganisch phosphaat. Deze feiten, tesamen met de ver-kregen analysecijfers, lieten volgens G r ü n en medewerkers weinig ruimte voor twijfel aan de identiteit van deze producten.

Merkwaardigerwijze bleken de door G r ü n bereide phosphatide-zuren niet stabiel te zijn. Reeds bij enige tijd bewaren, sneller bij verwarmen in diverse oplosmiddelen, splitste zich anorganisch phosphaat af, terwijl producten met een lager gehalte aan phopho-rus ontstonden. Een stellig niet geoorloofde interpretatie van ana-lysecijfers bracht G r ü n tot de opvatting, dat deze ontleding traps-gewijs zou verlopen. Uit de phosphatidezuren (I) zouden eerst secundaire (II), daarna tertiaire phosphorzure esters (III) ontstaan, en tenslotte zelfs producten met de vermoedelijke samenstelling

( I V ) ; elke trap zou onder afsplitsing van phosphorzuur verlopen.

CH20St I CHOSt I CH2OH P2O5 CHnOSt I CHOSt (smelt, enz.) | CH20PO(OH)2 I. CH20St I CHOSt I CH2O— PO (OH) CH20St I CHOSt I CH2O— -PO CHïOSt I CHOSt I CH2O— IV. III.

Jarenlang heeft men aan dit werk van G r ü n c.s. grote betekenis toegekend. K i n g (32) constateerde echter in 1934, dat de syn-thetische producten van G r ü n in hun gedrag ten opzichte van een uit nieren geïsoleerde phosphatase afweken van de ,,natuurlijke" phosphatidezuren. Dit behoeft ons nauwelijks te verwonderen, want tegen de door G r ü n c.s. toegepaste bereidingswijze moeten

ernstige bedenkingen ingebracht worden en de producten, die de genoemde onderzoekers uiteindelijk in handen hebben gehad, zijn zonder enige twijfel gecompliceerde mengsels geweest. De invoe-ring van een phosphorzuurrest in een glyceride door verwarmen met phosphorpentoxyde (en wat water) moet als een zeer grove methode beschouv/d worden; deze bewerking leidt ongetwijfeld tot een ingewikkeld samenstelsel van reacties, waarbij zeker niet uit-sluitend phosphatidezuren ontstaan. Reeds L a n g h e i d (33) merkte op, dat de instabiUteit van G r ü n s producten eerder ver-wacht kon worden bij pyro- of polyphosphaten dan bij primaire aliphatische orthophosphaten. In dit verband zij er aan herinnerd, dat volgens G r ü n zelf bij gebruik van een aequimolaire hoeveel-heid phosphorpentoxyde onder overigens gelijke omstandigheden diglyceridc-pyrophosphorzuren zouden ontstaan.

Ook geheel andere overwegingen leiden tot verwerping van de door H u n d e s h a g e n en door G r ü n gebruikte methode.

Bij onderzoekingen over de synthese van glyceriden heeft F i s c h e r namelijk in 1920(34) voor het eerst waargenomen, dat acylgroepen in glyceriden onder bepaalde omstandigheden kunnen verhuizen. Latere onderzoekingen hebben aangetoond, dat vooral ;8-monoglyceriden en «jS-diglyceriden, welke een vetzuurrest als acylgroep dragen, dit verschijnsel vertonen; onder invloed van sporen zuur of alkali treedt hier omlegging op tot de overeen-komstige isomere or-monoglyceriden, respectievelijk ay-diglyceriden. Alleen ten aanzien van de acylgroepverhuizing, welke in zuur milieu in monoglyceriden kan optreden, is met zekerheid vastgesteld, dat het hier om een evenwichtsreactie gaat (35).

In het licht van de na 1920 verworven ervaringen betreffende deze verhuizingen is gebleken, dat de oudere bereidingsmethoden voor a/S-diglyceriden en ay-diglyceriden in feite slechts tot meng-sels van isomeren konden voeren; ook de door H u n d e s h a g e n en later door G r ü n en K a d e als uitgangsproducten gebruikte diglyceriden zijn zonder enige twijfel geen zuivere stoffen geweest. Veel ernstiger is echter, dat ook tijdens de reactie met phosphor-pentoxyde de omstandigheden uitermate gunstig zijn voor het op-treden van verhuizingen. Blijkens een mededeling van V e r k a d e

(36) kan men zich door een eenvoudige proef hiervan overtuigen: verhit men zuiver «jS-distearoylglycerol, c.q. zuiver

ay-distearoyl-glycerol in tegenwoordigheid van een weinig phosphorpentoxyde tot omstreeks 85°, dan verkrijgt men uit beide diglyceriden practisch hetzelfde evenwichtsmengsel. Bij gebruik van grotere hoeveelheden phosphorpentoxyde leveren beide diglyceriden vanzelfsprekend niet eenzelfde evenwichtsmengsel, omdat de phosphoroyleringsreactie niet wacht tot het evenwicht der diglyceriden zich volledig inge-steld heeft. De door G r ü n en K a d e verkregen producten zijn dientengevolge zonder enige twijfel mengsels, van isomeren geweest, afgezien nog van de eerder besproken vorming van pyro- of poly-phosphaten. Ook G r ü n zelf heeft, blijkens een opmerking in een latere publicatie (30), het optreden van isomerisatie mogelijk ge-acht; desondanks beschrijft hij nog in 1936 (31) de reactie van een diglyceride met phosphorpentoxyde als een bruikbare synthese voor phosphatidezuren, hoewel de ondeugdelijkheid van deze me-thode uit het bovenstaande voldoende duidelijk is gebleken; zij komt voor de bereiding van zuivere phosphatidezuren — het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek — niet in aan-merking.

B) P h o s p h o r o y 1 e r i n g v a n d i g l y c e r i d e n m e t p h o s p h o r o x y c h l o r i d e .

In het D.R.P. 608.074 vermeldden G r ü n en M e m m e n (37) nog een andere methode voor de bereiding van phosphatidezuren en wel de behandeling van diglyceriden met phosphoroxychloride in tegenwoordigheid van droge pyridine. Deze phosphoroylerings-methode had F i s c h e r reeds in 1914 op suikers toegepast (38) en later ter verkrijging van glycerolphosphorzuur ook op aceton-glycerol (39). Ook W a g n e r - J a u r e g g en A r n o l d (40) heb-ben getracht, langs deze weg zouten van van chaulmoogra- en hydnocarpuszuur afgeleide phosphatidezuren te maken.

Een tweetal vrij recente publicaties, van R o s e (41) en van H u n t e r , R o b e r t s en K e s t e r ( 4 2 ) leent zich het beste voor de beoordeling van de preparatieve waarde van deze bereidings-wijze. Deze onderzoekers lieten op een ay-diglyceride ( V ) bij kamertemperatuur één mol phosphoroxychloride in tegenwoordig-heid van een overmaat droge chinoline en chloroform inwerken. Het verkregen reactieproduct werd vervolgens met ijswater

ge-hydrolyseerd, waarbij merkwaardigerwijze een zout van twee moleculen phosphatidezuur met een molecule chinoline ontstond

( V I I ) . CH2OD I CHOH I CH2OD POCI3 >• (chinoline) CH2OD I CHOPOCI2 I CH2OD VI. CH20D CHOPO(OH)2 1 CH2OD VII. J/2 chinoline -^ CH2OD 1 CHOPO(OH)2 1 CH2OD VIII.

Met veel moeite slaagde R o s e (41) er in, door een kortstondige behandeling van dit zout met geconcentreerd zoutzuur in warme alcohol het phosphatidezuur vrij te maken. Aldus verkreeg hij uit ay-dipalmitoylglycerol ( V ; D = palmitoyl) met nog geen 4 0 % opbrengst het ay-dipalmitoyl-^-glycerolphosphorzuur (VIII; D = palmitoyl) van smpt 62—63°. H u n t e r c.s. (42) wijzen er na-drukkelijk op, dat het uiterst moeilijk is uit het aanvankelijk ver-kregen zout (VII) het zuivere phosphatidezuur vrij te maken; mede daardoor blijft het totaal rendement tamelijk laag.

Een nadere beschouwing van deze synthese brengt verschillende bezwaren aan het licht. Ten eerste leidt de reactie van het diglyceride met phosphoroxychloride tot vorming van nevenpro-ducten, daar meer dan één chlooratoom van laatstgenoemde ver-binding in reactie kan treden. F i s c h e r en P f a h l e r (39) vonden reeds, dat bij de reactie van acetonglycerol en phosphoroxychloride in tegenwoordigheid van droge chinoline een kleine hoeveelheid ( 2 % ) bis(acetonglycerol)monophosphorzuur ontstond, hetwelk zij ook in de vorm van een bariumzout konden isoleren. Tevens ver-meldden zij uitdrukkelijk, dat voor de bereiding van deze laatste verbinding zelf het chinoline beter door pyridine vervangen kon worden. Klaarblijkelijk is de neiging van het phosphoroxychloride om met meer dan één chlooratoom te reageren in pyridine groter dan in chinoline. B a e r en K a t e s (43) hebben later soortgelijke verschijnselen ten aanzien van het monophenyldichloorphosphaat

( P h O ) P O C l 2 vermeld.

Ten tweede is de volledige verwijdering van de beide chloor-atomen uit het vermoedelijke tussenproduct ( V I ) slechts mogelijk

door zeer intensief te roeren met ijswater, terwijl de daaropvolgende zuivering van het zout ( V I I ) veelvuldig omkristalliseren vergt.

Tenslotte leidt de omzetting van het zout (VII) in het vrije phosphatidezuur (VIII) door middel van geconcentreerd zoutzuur in warme alcohol zonder twijfel tot gedeeltelijke verzeping van de vetzuurresten; R o s e (41) vermeldt zelf reeds, dat deze be-werking snel moet gebeuren teneinde een dergelijke hydrolyse zoveel mogelijk tegen te gaan.

Desondanks biedt de phosphoroylering van diglyceriden met phosphoroxychloride in tegenwoordigheid van een tertiair amine een mogelijkheid om phosphatidezuren te bereiden, gelijk ook V e r k a d e en V a n d e r L e e in 1937 (36) reeds veronderstelden; van een elegante synthese kan men echter stellig niet spreken. Daar de meeste der hiervoor genoemde bezwaren van deze synthese inhaerent zijn aan het gebruik van phosphoroxychloride als phos-phoroyleringsmiddel werd van de toepassing van deze methode afgezien.

C) A c y l e r i n g v a n g l y c e r o l p h o s p h a t e n.

O p een principieel andere wijze hebben K a b a s h i m a en S u z u k i de bereiding van phosphatidezuren (en phosphatiden) aangepakt.

In plaats van een phosphorzuurrest in het glyceride-molecule in te voeren hebben zij getracht in een a-, respectievelijk j8-glycerol-phosphaat rechtstreeks acylgroepen in te voeren. Zij lieten daartoe

(44, 45) het bariumzout van a-, respectievelijk /3-glycerolphosphor-zuur reageren met twee mol /3-glycerolphosphor-zuurchloride (bijv. palmitoylchloride) in tegenwoordigheid van een waterige barietoplossing. De ver-kregen phosphatidezuren werden als monozilverzouten omgezet in phosphatiden; bijvoorbeeld ontstonden door reactie met j8-broom-aethylamino-pikraat cephahnen.

Het is echter geenszins bewezen, dat de door K a b a s h i m a en S u z u k i verkregen acyleringsproducten van glycerolphosphaten inderdaad zuivere phosphatidezuren waren. R o s e (41) vermeldt, dat het hem ondanks herhaalde pogingen niet gelukte het glycerol-phosphorzuur volgens de methode B a u m a n n - S c h o t t e n met palmitoylchloride te acyleren. Ook V e r k a d e c.s. slaagden er

niet in bij de acylering van glycerolphosphaten producten te ver-krijgen, die bevredigende resultaten bij de elementairanalyse op-leverden. De oorzaak hiervan is niet met zekerheid bekend; het is evenwel niet uitgesloten, dat het acylchloride ook in reactie treedt met de phosphaatrest, onder vorming van gemengde anhydriden. In dit verband zij herinnerd aan het werk van L i p m a n n en T u t t i e (46); deze onderzoekers verkregen door op een mengsel van één mol trizilverphosphaat en twee mol phosphorzuur (welk mengsel zij als monozilverphosphaat opvatten) in aetherische suspensie het zuurchloride van een lager vetzuur te laten inwerken, gemengde anhydriden van deze vetzuren met phosphorzuur. In ieder geval is reserve ten aanzien van de door K a b a s h i m a en S u z u k i verkregen resultaten geboden; de door hen beschreven synthese leidt trouwens in het gunstigste geval slechts tot (zouten van) tweezurige phosphatidezuren; het invoeren van twee ver-schillende acylgroepen in het glycerolphosphaat zou stellig moeilijk te verwezenlijken zijn. CH2OH CH2OD I + 2 DCI I CHOPOsBa ». CHOPOsBa I Ba(OH)2 I CH2OH CH2OD CH2OD CH-OD CHOPO<gH^ + ""^^H. -* f ° ^ ° < f f l c H 2 N H 2 . CH2OD CH2OD

Volledigheidshalve dient vermeld te worden, dat A r n o l d (47) getracht heeft op dezelfde wijze verschillende van chaulmoogra- en hydnocarpuszuur afgeleide phosphatidezuren te maken; het doel van deze onderzoeker was echter in hoofdzaak therapeutica tegen lepra te bereiden. De strikte zuiverheid en de feitelijke structuur van zijn producten waren voor hem van secundaire betekenis.

Ook K a r r e r en B e n z (48) verkregen door verhitten van het bariumzout van «-glycerolphosphorzuur met azijnzuuranhydride aan

een terugvloeikoeler een product, waarvan de elementairanalyse ruwweg overeenstemde met hetgeen voor het bariumzout van aj8-diacetylglycerolphosphorzuur werd berekend.

Het feit, dat door acylering van glycerolphosphaten geen drie-zurige phosphatidezuren bereid kunnen worden, maakte deze me-thode onbruikbaar voor het in dit proefschrift beschreven onder-zoek.

Samenvattend kan gezegd worden, dat geen der in het voor-gaande overzicht beschreven methoden kan gelden als een een^

voudige, algemeen bruikbare synthese van zuivere phosphatide^

zuren. Bovendien is in verband met de reeds eerder besproken neiging tot acylgroepverhuizing een nauwgezet onderzoek naar de structuur van de als uiteindelijk resultaat ener synthese verkregen producten geen overbodige luxe. Een dergelijke controle wordt bij de onder A t/m C genoemde methoden echter in ernstige mate belemmerd door het feit, dat de phosphatidezuren hierbij in de vorm van zouten worden verkregen, die zich door het ontbreken van bijvoorbeeld scherpe smeltpunten slecht lenen voor een nadere karakterisering, terwijl de omzetting van deze zouten in de cor-responderende zuren met grote moeilijkheden gepaard gaat.

Het is duidelijk, dat voor de synthese van phosphatidezuren een phosphoroylering van diglyceriden onder milde reactieomstandig-heden de aangewezen weg is. Bij een onderzoek van de literatuui over phosphoroyleringsreacties bleek ons, dat bijvoorbeeld voor de bereiding van biochemisch belangrijke phosphorzuurderivaten van suikers en nucleotiden gedurende de laatste jaren tal van nieuwe phosphoroyleringsmethoden zijn toegepast; deze methoden zijn ook voor de bereiding van zuivere phosphatidezuren van belang ge-bleken. In de volgende paragraaf zal een overzicht van deze ma-terie worden gegeven, waarbij wij ons zullen beperken tot een bespreking van die methoden, welke bij nader onderzoek van alge-mene betekenis zijn gebleken voor de bereiding van biochemisch belangrijke phosphorzure esters.

§ 2. Phosphoroyleringsmethoden.

De phosphoroyleringsreacties, welke in deze paragraaf zullen worden besproken, kunnen in drie groepen worden onderscheiden:

A ) de reactie tussen een epoxyverbinding en een zout of een ester van phosphorzuur;

B) de reactie tussen een halogeenverbinding en een zilverphos-phaat;

C) de reactie tussen een hydroxylverbinding en een phosphor-zuurderivaat van het algemene type (RO)2POCl of ( R O ) P O C l 2 , in tegenwoordigheid van een tertiair amine. A) D e r e a c t i e t u s s e n e p o x y v e r b i n d i n g e n e n

z o u t e n of e s t e r s v a n p h o s p h o r z u u r .

Bij de bestudering van de reactie tussen glycerol-a-chloorhydrine en trinatriumphosphaat ontdekte B a i l l y (49), dat glycidol

(IX, R = H ) bij kamertemperatuur langzaam met een waterige oplossing van dinatriumphosphaat reageert onder vorming van a-glycerolphosphaat. Ook andere epoxyverbindingen, bijvoorbeeld die, welke van suikers zijn afgeleid, kunnen volgens L a m p s o n en L a r d y (50) en volgens T o d d (72) met passende zouten of esters van phosphorzuur ( Z e t s c h e en A e s c h l i m a n n (51); T o d d (77)) reageren onder vorming van gephosphoroyleerde producten; L a m p s o n en L a r d y (50) bevelen deze methode in het bijzonder voor de invoering van een phosphorzuurrest met radioactief phosphorus (P^s) aan. Uit de geciteerde verhandelingen blijkt, dat bij epoxyverbindingen, waarin het epoxyzuurstofatoom aan een primair èn een secundair koolstofatoom is gebonden, de phosphorzuurrest aan het primaire koolstofatoom in het molecule treedt; een strikt bewijs, dat niet tevens aan het secundaire koolstof-atoom gephosphoroyleerde producten ontstaan, ontbreekt nochtans. De opbrengsten van de reacties in questie zijn doorgaans tamelijk laag (zelden meer dan 5 0 % ) .

Zoals uit het onderstaande reactieschema blijkt, dragen de ver-kregen phosphorzuurderivaten allen een vrije hydroxylgroep aan het koolstofatoom, gelegen naast datgene, waarmede de

phosphor-zuurrest zich heeft verbonden. Van de op pagina 7 van dit proef-schrift genoemde verbindingen zouden dus langs deze weg in het gunstigste geval slechts zouten (bijvoorbeeld X, R = acyl) of esters (Xa, R = acyl; zie T o d d (77)) van a-acyl-y-lysophospha-tidezuren verkregen kunnen worden.

CH2OR I CH + Na2HP04

I >o

I >o

Bij invoering van een tweede acylgroep in verbindingen van het type X (R = acyl) zullen zich zonder twijfel dezelfde moeilijkheden voordoen, welke reeds bij de acylering van zouten van glycerol-phosphorzuren (zie pagina 15) ter sprake kwamen. Misschien zou-den verbindingen van het type Xa (R = acyl) door acylering en passende afsplitsing van de benzylgroepen in /3y-diacyl-a-phospha-tidezuren kunnen worden omgezet. y8-Phospha/3y-diacyl-a-phospha-tidezuren kunnen echter met behulp van de hier beschreven phosphoroylerings-methode stellig niet worden bereid.

Zowel om deze reden alsook wegens de andere reeds genoemde bezwaren is de hier beschreven phosphoroyleringsmethode voor de door ons beoogde synthese van phosphatidezuren onbruikbaar.

B) P h o s p h o r o y l e r i n g m e t z i l v e r p h o s p h a t e n. De reactie van een zilverphosphaat met een halogeenverbinding werd als phosphoroyleringsmethode _ in de suikerchemie verschil-lende male toegepast. C o r i c.s. (52) en anderen (53) beschreven

de bereiding van bijvoorbeeld a-glucose-1-phosphaat, welke stof verkregen werd uitgaande van a-broomacetoglucose en trizilverphosphaat. De van dibenzylphosphaat ( Z e r v a s , (54); W o 1 -f r o m c.s. (55)) en van diphenylphosphaat ( P o s t e r n a k , (56)) afgeleide zilverzouten voldeden bij deze en analoge reacties beter, daar zij minder aanleiding gaven tot vorming van bijproducten. De reacties worden meestal uitgevoerd door de halogeenverbinding tesamen met het zilverzout enige tijd in droge benzeen aan een terug-vloeikoeler te verhitten. Uit de verkregen dibenzyl-, respectievelijk diphenylphosphoroylverbindingen kunnen de benzyl-, respectievelijk phenylgroepen door katalytische hydrogenolyse afgesplitst worden. Voor de synthese van a-phosphatidezuren biedt deze phospho-royleringsmethode enige perspectieven (57). Door het werk van F i s c h e r (34), respectievelijk van G r ü n (58) zijn namelijk een-zurige, respectievelijk tweezurige a-jood-)8y-diacylglycerolen toe-gankelijk geworden; voor de isomere j8-halogeenverbindingen zijn daarentegen in de literatuur geen betrouwbare synthesen bekend, zodat momenteel het uitgangsmateriaal ontbreekt voor de bereiding van j8-phosphatidezuren langs deze weg. Ongetwijfeld zal de bereiding van zulk uitgangsmateriaal een omvangrijk onderzoek vergen, zodat van toepassing van de hier beschreven phosphoroyle-ringsmethode voor de synthese van zuivere phosphatidezuren werd afgezien. Bovendien mag op grond van het werk van W i n s t e i n c.s. (59) de mogelijkheid van het optreden van verhuizingen tijdens de reactie van een jooddiacylglycerol met een zilverphosphaat a priori niet uitgesloten worden.

C) P h o s p h o r o y l e r i n g m e t c h l o o r p h o s p h a t e n . Een buitengewoon elegante phosphoroyleringsmethode hebben B r i g l en M ü l l c r ( 6 0 ) in 1939 ingevoerd. Zij stelden vast, dat het diphenylchloorphosphaat (XI) in tegenwoordigheid van een watervrij tertiair amine, bijvoorbeeld pyridine, vlot reageert met hydroxylverbindingen onder vorming van de corresponderende tertiare phosphaten van het type XII.

(PhO)2POCl + ROH -1- Pyridine - » (PhO)2PO(OR) + pyridine.HCl

XI XII (PhO)2PO(OR) + liVNaOH (H20)-!>> (NaO)2PO(OR) + PhONa

XII XlIIa. (PhO)2PO(OR) + H2, (Pt, latm) ->> (HO)2PO(OR) + C6H12

XII XIIL

Dezelfde ontdekking werd vrijwel gelijktijdig gedaan door B r e d e r e c k , B e r g e r en E h r e n b e r g (61); terwijl de laatsten echter uit de verkregen reactieproducten (XII) door alkahsche hydrolyse phenol afsplitsten en aldus — in zeer onbevredigende opbrengsten — de corresponderende primaire phosphorzure esters ( X l I I a ) verkregen, vonden B r i g l en M u l l e r , dat de phenyl-groepen gemakkelijk door een katalytische hydrogenolyse in de vorm van cyclohexaan afgesplitst kunnen worden; daarbij ontstaan de corresponderende primaire phosphorzure esters (XIII) in uit-stekende opbrengsten. Op deze wijze heeft men verschillende phosphorzuurderivaten, onder andere van suikers (62), van nucleosiden (63), van inositol (64) en van glycerinezuur (65) kunnen bereiden. Voor de synthese van lecithinen en cephalinen — deze verbindingen kunnen als secundaire phosphorzure esters worden beschouwd — hebben B a e r c.s. (66) het

monophenyl-dichloorphosphaat toegepast.

Behalve het diphenylchloorphosphaat treft men in de literatuur nog enkele andere phosphoroyleringsagentia van het algemene type X I V aan, namelijk het dibenzylchloorphosphaat (XIV, R = ben-zyl) en het o-phenyleenchloorphosphaat ( X V ) ; nauw verwant met deze groep van phosphoroyleringsmiddelen zijn verder de

anilido-chloorphosphaten ( X V I en X V I a ) , wier bruikbaarheid als zodanig

door Z e t s c h e en B ü t t i k e r (67) is onderzocht.

De door Z e t s c h e en B ü t t i k e r voorgestelde phosphoroy-leringsmethode schijnt door niemand anders met enig succes te zijn toegepast; de moeilijkheden, waarmede de bereiding van de anilidochloorphosphaten en de afsplitsing van de anilidogroepen uit de als tussenproduct verkregen phosphorzuurverbindingen blijkens onze eigen ervaring gepaard gaan, zullen wel de voornaamste oorzaak daarvan zijn.

Het gebruik van o-phenyleenchloorphosphaat ( X V ; zie 68) voor de invoering van een phosphorzuurrest is door R e i c h (69) aan-bevolen; uit onderzoekingen van L o r a T a m a y o en C a l d e r o n (70) is evenwel gebleken, dat voor de bereiding van phosphorzuur-derivaten van het type XIII het o-phenyleenchloorphosphaat stellig minder bruikbaar is dan het diphenylchloorphosphaat.

(RO)2POCl XIV ( > ^ ^ - N H ) P O C l 2 (XVI) ( ) : : : POCl

V ° ,/~^_

T o d d en zijn medewerkers hebben een uitgebreide studie ge-maakt van de mogelijkheden, die het dibenzylchloorphosphaat^)

(XIV; R = benzyl) als phosphoroyleringsmiddel biedt, in het bijzonder in verband met synthesen van nucleotiden (71). Daarbij is gebleken, dat het gebruik van dibenzylchloorphosphaat enkele voordelen heeft boven dat van diphenylchloorphosphaat. Niet alleen laten de beide benzylgroepen zich uit de verkregen reactieproducten door hydrogenolyse (in tegenwoordigheid van een palladium-katalysator) wat gemakkelijker verwijderen dan de corresponderende

phenylgroepen, maar ook de selectieve verwijdering van één benzyl-rest bleek mogelijk, hetgeen van belang is voor de bereiding van pyro- en andere polyphosphaten. Behalve door een voorzichtige hydrolyse (76) of een tijdig onderbroken hydrogenolyse (72) kan deze monodebenzylering eveneens bereikt worden door inwerking van tertiaire aminen of hun zouten (74) waarbij dan tegelijkertijd het amine gebenzyleerd wordt tot een quaternaire verbinding. Neutrale zouten, zoals lithiumchloride bleken eveneens in staat monodebenzylering teweeg te brengen (75); in dat geval ontstond behalve benzylchloride een in het reactiemilieu slecht oplosbaar

*) De door TODD gebezigde naam „dibenzylchlorophosphonate" leidt tot verwarring en dient vervangen te worden door „dibenzylchlorophosphate". Zie bijvoorbeeld: ,,The Naming and Indexing of Chemical Compounds by Chemical Abstracts" (1945), Introduction to the subject index.

lithiumzout van de gevormde phosphorzuurverbinding. Dergelijke reacties bleken bij de analoge phenylverbindingen niet te verlopen.

Een vergelijking van de eigenschappen van het diphenylchloor-phosphaat en van het dibenzylchloordiphenylchloor-phosphaat brengt echter ook belangrijke bezwaren aan het licht, verbonden aan het gebruik van het laatstgenoemde phosphoroyleringsmiddel.

1°) De bereiding van het dibenzylchloorphosphaat ( X V I I I ) verloopt aanmerkelijk omslachtiger dan die van het diphenylchloor-phosphaat. Laatstgenoemde verbinding kan men op zeer eenvoudige wijze bereiden door phenol en phosphoroxychloride in een passende verhouding enige tijd samen aan een terugvloeikoeler te verhitten; na afloop van de reactie levert een gefractioneerde vacuumdestillatie zowel het monophenyldichloorphosphaat ( X l a ) als het diphenyl-chloorphosphaat ( X I ) ; bij een juiste keuze van de reactie-omstandigheden ontstaat betrekkelijk weinig triphenylphosphaat.

De synthese van het dibenzylchloorphosphaat vergt daarentegen allereerst de bereiding van het dibenzylphosphiet ( X V I I ) , hetwelk door behandeling in chloroformische oplossing met chloor in het dibenzylchloorphosphaat omgezet kan worden.

PhOH + POCI3 -*- (PhO)POCl2 + (PhO)2POCl + (PhO)3PO Xla XI Xlb (C6H5CH20)2POH + CI2 -^ (CoH5CH20)2POCl

XVII XVIII

Het aldus verkregen dibenzylchloorphosphaat kan niet door destillatie of anderszins gezuiverd worden en is evenmin lang houdbaar; de sub 1) vermelde chloroformische oplossing wordt direct voor verdere reacties gebruikt. Daarentegen is het diphenyl-chloorphosphaat lange tijd onveranderd houdbaar, mits het bij uitsluiting van vocht wordt bewaard.

2°) Terwijl de reactie van het dibenzylchloorphosphaat met aminen onder passende omstandigheden vlot verloopt en tot uit-stekende opbrengsten leidt, leveren de reacties met alcoholen vaak veel lagere rendementen tengevolge van het meer naar voren komen van een nevenreactie tussen het dibenzylchloorphosphaat en het aanwezige tertiaire amine (vorming van quaternaire verbindingen; zie 73, 74).

Op grond van deze bezwaren kan worden gezegd, dat het gebruik van dibenzylchloorphosphaat als phosphoroyleringsmiddel slechts in speciale gevallen voordelen biedt boven dat van diphenylchloor-phosphaat. Dit is bijvoorbeeld het geval bij de bereiding van pyro- en andere polyphosphaten; hiertoe behoren echter niet de ons interesserende verbindingen, namelijk de phosphatidezuren. Bovendien deelde T o d d (25) mede, dat bij de phosphoroylering van diglyceriden met behulp van dibenzylchloorphosphaat com-plicaties optreden in verband met de hiervoor sub 2) genoemde nevenreactie.

§ 3. Conclusies in verband met het eigen onderzoek.

Uit het voorgaande blijkt, dat het diphenylchloorphosphaat zich in vele opzichten gunstig onderscheidt van de andere in de literatuur beschreven phosphoroyleringsmiddelen; met name zij geconstateerd, dat zowel de reacties tussen hydroxylverbindingen en het diphenylchloorphosphaat in tegenwoordigheid van een tertiair amine als de katalytische hydrogenolyse van de aldus verkregen tertiaire phosphorzuurderivaten blijkens de in de literatuur be-schreven toepassingen doorgaans onder zeer milde reactieomstandig-heden verlopen en met uitstekende rendementen gepaard gaan. Wij besloten daarom, het diphenylchloorphosphaat voor de phosphoroy-lering van aP- en ay-diglyceriden te gebruiken. Voor de synthese van twee- en driezurige a- en j8-phosphatidezuren werd het volgende

reactieschema ontworpen:

CH2OD CH2OD CH2OD I + (PhO)2POCl I + H2 I

CHOE * CHOE • ^ CHOE CH2OH XIX (pyridine) (katalysator) CH20PO(OPh)2 XXI C H 2 0 P 0 ( 0 H ) 2 XXIII

CH2OD CH2OD CH2OD I + (PhOjïPOCl I + H2 I

CHOH : r-»- CHOPO(OPh)2 *• CHOPO(OH)2 (pyridine) CH2OE XX CH2OE XXII (katalysator) CH2OE XXIV

Bij een nadere beschouwing van dit schema komen enkele belang-rijke voordelen naar voren. In de eerste plaats zijn de als uitgangs-producten benodigde diglyceriden van de typen XIX en X X (zowel voor het geval, dat D = E alsook voor D - / = E ) door talrijke onder-zoekingen uitstekend toegankelijk gemaakt (78), zodat voor de bereiding van zowel tweezurige als driezurige CL- en j8-phosphatide-zuren dezelfde methode kan worden toegepast.

Ten tweede zij geconstateerd, dat bij acylering van glyceriden door behandeling met een zuurchloride in tegenwoordigheid van droge pyridine of chinoline nooit enige neiging tot acylgroep-verhuizing is waargenomen; dit feit wettigde de veronderstelling, dat de omzetting van X I X en X X in respectievelijk XXI en XXII, onder volkomen vergelijkbare omstandigheden, een strikt éénduidig verloop zou hebben. Een bewijs voor de juistheid van deze ver-onderstelling was evenwel gewenst; eveneens moest het uitblijven van acylgroepverhuizingen tijdens de hydrogenolyse worden be-wezen. In hoofdstuk I V zal op deze questie nader worden ingegaan.

De katalytische hydrogenolyse van de phenylgroepen beperkt de bruikbaarheid van de door B r i g l en M u l l e r geïntroduceerde werkwijze tot die gevallen, waarbij elders in het molecule geen groepen aanwezig zijn, welke onder de omstandigheden van deze hydrogenolyse eveneens gereduceerd zullen worden. Phosphatide-zuren, welke onverzadigde vetzuurresten als acylgroepen dragen, kunnen dus op de in het bovenstaande reactieschema aangegeven wijze niet worden bereid. B r i g l en M u l l e r vermeldden evenwel, dat afsplitsing van de phenylgroepen in sommige gevallen, met name bij de diphenylphosphoroylverbindingen van acetonglycerol en van ay-benzylideenglycerol, ook gelukte door hydrolyse met een warme 60—70 %ige waterige azijnzuuroplossing; in de ge-noemde gevallen ontstaat dan glycerolphosphorzuur. In het ver-loop van het in dit proefschrift beschreven onderzoek bleek ons, dat de diphenylesters van de typen XXI, XXII en XXVI bij bewaren aan vochtige lucht na kortere of langere duur een phenolgeur ontwikkelen. Deze waarnemingen deden ons besluiten, mede te onderzoeken in hoeverre de phosphatidezuren via een passende hydrolyse van de corresponderende diphenylphosphoroyl-verbindingen bereid zouden kunnen worden, zulks met het oog op een eventuele synthese van phosphatidezuren met onverzadigde

vetzuren als acylgroepen. De terzake verrichte proeven zullen in hoofdstuk III van dit proefschrift worden beschreven.

Om een juist beeld te krijgen van de mogelijkheden en moeilijk-heden, welke zich bij de gekozen phosphoroyleringsmethode zouden kunnen voordoen, werd allereerst de bereiding van enkele monoacyl-glycolphosphorzuren ( X X V I I ) , uitgaande van monoacylglycolen

( X X V ) ter hand genomen; daar hier acylgroepverhuizingen niet kunnen optreden, lenen deze stoffen zich bij uitstek voor model-proeven.

CH2OD + (PhO)2POCl CH2OD + H2 CH2OD I > I *• I

CH2OH (pyridine) CH20PO(OPh)2 (katalysator) CH20PO(OH)2

XXV XXVI XXVII

In hoofdstuk III wordt een beschrijving van de in dit verband verrichte proeven gegeven en van de ondernomen pogingen, om uit X X V I de phenylgroepen door hydrolyse af te splitsen.

In hoofdstuk IV wordt de synthese van de eigenlijke phosphatide-zuren (glycerophosphatidephosphatide-zuren) behandeld. Tevens zal aldaar op critische wijze een recente publicatie van B a e r (21) worden besproken, waarin de synthese van enkele optisch actieve twee-zurige L-a-phosphatidezuren wordt beschreven, eveneens door toe-passing van de phosphoroylering van (optisch actieve) diglyceriden met diphenylchloorphosphaat en daaropvolgende hydrogenolyse.

Tenslotte wordt in hoofdstuk V een methode beschreven, volgens welke op ondubbelzinnige wijze de zuiverheid der door ons bereide glycerophosphatidezuren werd bevestigd.

S Y N T H E S E V A N E N I G E A C Y L G L Y C O L P H O S P H O R Z U R E N .

Monoacylglycolen vormen volgens het op pagina 26 aangegeven

schema de uitgangsproducten voor de synthese van acylglycol-phosphorzuren. Een betrouwbare bereidingswijze voor verbindingen van dit type werd tot op heden slechts beschreven door V e r k a d e, T o l l e n a a r en P o s t h u m u s ( 7 9 ) . Deze onderzoekers gingen uit van monotritylglycol, hetwelk op eenvoudige wijze te verkrijgen is, namelijk door inwerking van triphenylmethylchloride ( = trityl-chloride) op een overmaat glycol, opgelost in een ruime hoeveelheid droge pyridine. Bij deze reactie ontstaat tevens een kleine hoeveel-heid ditritylglycol, hetwelk door behandeling van het reactie-product bij kamertemperatuur met 96%igeaethylalcohol gemakkelijk af te scheiden is.

Het monotritylglycol (I) reageert bij kamertemperatuur in aan-wezigheid van een overmaat waiervrije pyridine of chinoline vlot met een mol. zuurchloride D.Cl, opgelost in droge chloroform, onder vorming van het corresponderende acyltritylglycol II.

CH2OH + DCI CH2OD CH20Tri (pyridine) CH20Tri

I II CH2OD CH2OH III Q^>4. CH2OD I + PhaCH PhsCCI CH2OH III

D = acylgroep; Tri = tritylgroep {= triphenylmethylgroep).

Detritylering van verbindingen van het type II tot monoacylglycolen (III) geschiedt door hydrogenolyse, dat wil zeggen door reductie met waterstof in tegenwoordigheid van een palladium-kool

kata-lysator. Het tevens ontstaande triphenylmethaan kan in de gevallen waarin een hoger vetzuur de acylgroep vormt — en alleen met dergelijke gevallen hebben wij ons bezig gehouden — door om-kristallisatie uit petroleumaether gemakkelijk en volledig verwijderd worden.

De detritylering van verbindingen van het type II tot die van het type III kan in vele gevallen ook geschieden door een be-handeling met droog zoutzuurgas in een passend oplosmiddel; dit oplosmiddel wordt zo mogelijk zodanig gekozen, dat de verbinding II daarin goed, maar de verbinding III weinig oplosbaar is. Deze detrityleringsmethode is vooral van belang voor die gevallen, waar-in de acylgroep onder de omstandigheden der hydrogenolyse reduceerbaar is, zoals bij onverzadigde vetzuurresten, nitrobenzoyl-groepen, enz. het geval is. De synthese van acylglycolphosphorzuren volgens het op pagina 26 aangegeven schema omvat echter in de laatste trap eveneens een katalytische reductie; dit sloot bij voor-baat het gebruik van monoacylglycolen met een reduceerbare acyl-groep als uitgangsmaterialen uit, zodat bij ons onderzoek uitsluitend de detritylering door middel van katalytische reductie werd toe-gepast.

In het experimentele gedeelte van dit hoofdstuk wordt de be-reiding van een viertal verbindingen van het type III beschreven, welke als acylgroep respectievelijk de myristoylgroep, de

palmitoyl-groep, de stearoylgroep of de behenoylgroep bevatten. V a n deze vier monoacylglycolen werd slechts de stearoylverbinding in de genoemde verhandeling van V e r k a d e c.s. (79) beschreven. Alle bereide monoacylglycolen kristalliseren in de vorm van fraaie zilverachtig glanzende schubben. In verband met de aard van de in de natuur voorkomende phosphatidezuren werd dit onderzoek beperkt tot verbindingen met hogere vetzuurresten als acyl-component.

Laat men op een monoacylglycol (III), wederom opgelost in een ruime overmaat watervrije pyridine of chinoline, iets meer dan een mol. diphenylchloorphosphaat inwerken, dan treedt een geringe warmteontwikkeling op en weldra scheiden zich fraaie kristallen van pyridine-, respectievelijk chinolinehydrochloride af. Koeling tijdens deze reactie is niet nodig en zelfs niet gewenst; de

oplos-baarheid van het monoacylglycol in het gebruikte reactiemilieu wordt hierdoor namelijk ongunstig beïnvloed. Deze oplosbaarheid, j die bij toenemende grootte der acylgroep afneemt, is een belangrijke

factor bij de reactie; bij de phosphoroylering van behenoylglycol bleek het bijvoorbeeld wenselijk om droge pyridine als reactiemilieu te kiezen — hierin lossen de monoacylglycolen beter op dan in chinoline —, terwijl bovendien de oplossing van behenoylglycol in droge pyridine vóór de toevoeging van het diphenylchloorphosphaat tot omstreeks 40° moest worden verwarmd teneinde een volledige omzetting te verkrijgen.

CH2OD + (PhO)2POCl CH2OD H2, Pt CH2OD I > ' I >• I

CH2OH (pyridine of chinoline) CH20PO(OPh)2 CH20PO(OH)2 III. IV. V.

De diphenylphosphoroyl-acylglycolen ( I V ) , welke na opwerken van het reactiemengsel in 80—90 %ige opbrengst verkregen wer-den, konden door omkristallisatie uit petroleumaether vlot gezuiverd worden. In de meeste organische oplosmiddelen zijn zij bij kamer-temperatuur goed oplosbaar; in koude petroleumaether lossen zij echter slecht, in koude aethylalcohol tamelijk slecht op. Zij kristal-liseren uit de laatstgenoemde oplosmiddelen als kleurloze verbindin-gen, die scherp smelten. De smeltpunten van de vier bereide homo-logen (IV; D = myristoyl, palmitoyl, stearoyl, behenoyl) stijgen bij toenemende grootte van de acylgroep regelmatig, zoals dit voor een dergelijke reeks mag worden verwacht. Onder uitsluiting van vocht zijn de diphenylphosphoroyl-acylglycolen (IV) goed houd-baar; bewaart men ze echter aan vochtige lucht, dan treedt lang-zamerhand ontleding op, hetgeen kenbaar wordt door de ontwik-keling van een duidelijke phenolgeur. Het diphenylphosphoroyl-tritylglycol — verkregen op analoge wijze, uitgaande van mono-tritylglycol en diphenylchloorphosphaat — is nog gevoeliger voor deze ontleding; het verkleurt bij bewaren tamelijk spoedig. Deze grotere gevoeligheid behoeft geen verwondering te wekken; onge-twijfeld gaat de ontleding gepaard met de vorming van zuur-reagerende verbindingen en het is bekend, dat de tritylgroep onder invloed van zuur gemakkelijk afgesplitst wordt.

Als katalysator voor de afsplitsing van de phenylgroepen uit verbindingen van het type ( P h O ) 2 P O ( O R ) door hydrogenolyse wordt in de literatuur uitsluitend platinadioxyde genoemd, bereid volgens het voorschrift van A d a m s c.s. (80). A priori was het evenwel niet ondenkbaar, dat ook andere metaaloxyden (of me-talen) zoals bijvoorbeeld palladiumoxyde (of palladium) deze reactie zouden katalyseren, mogelijk zelfs op doeltreffender wijze.

Pogingen, om het diphenylphosphoroyl-stearoylglycol (IV; D = stearoyl) door behandeling met waterstof in tegenwoordigheid van palladiumoxyde (81) om te zetten in het overeenkomstige phos-phorzuur V , hadden evenwel geen succes. In overeenstemming met de in de literatuur voor andere, verwante gevallen beschreven ervaringen verliep de reactie daarentegen vlot (bij kamertempera-tuur en onder een overdruk van slechts enkele cm H g ) in tegen-woordigheid van platinadioxyde (bereid volgens A d a m s c.s.); hetzelfde bleek later ook voor andere platina-katalysatoren het geval te zijn. Droog, zuiver aethylacetaat of dioxan voldeden als reactiemilieu het beste. Indien het onder gebruik van dioxan als oplosmiddel en van platinadioxyde volgens A d a m s c.s. als kata-lysator verkregen reactiemengsel na ophouden van de waterstof-opname tot koken werd verhit, loste het tijdens de reactie uitgekris-talliseerde product volledig op. Na affilteren van het platina en afdestilleren van het dioxan werd een kristallijn residu verkregen. Bij behandeling met droog kokend aethylacetaat of aceton ging de hoofdmassa van dit residu in oplossing; echter niet alles. De slecht oplosbare fractie — welke na affiltreren door omkristalliseren uit aethylalcohol gezuiverd kon worden — bestond uit een bijproduct. Uit het fikraat, dat na verwijdering van het bijproduct overbleef, kristalliseerde bij staan in de ijskast het acylglycolphosphorzuur vrijwel volledig uit. Aldus leverden de verbindingen van het type IV (D = resp. myristoyl, palmitoyl, stearoyl en behenoyl) met 80—90 % opbrengst de corresponderende acylglycolphosphorzuren V , die in zuivere toestand scherp smolten en in aethylalcohol met 0,1 N loog tegenover phenolphtaleïne als tweebasische zuren ge-titreerd konden worden.

De acylglycolphosphorzuren ( V ) zijn in de meeste organische oplosmiddelen bij kamertemperatuur weinig oplosbaar; voor zui-vering verdient omkristallisatie uit droog aethylacetaat of aceton

de voorkeur. Bij bewaren onder normale omstandigheden (bij ka-mertemperatuur, in een witglazen stopflesje) vertoonden zij na ruim een jaar nog geen spoor van ontleding.

Het in kokend aceton of aethylacetaat weinig oplosbare bij-product, welks hoeveelheid in de verschillende gevallen omtrent

10 % van de totale opbrengst bedroeg, smolt steeds ongeveer 40—50° hoger dan het corresponderende acylglycolphosphorzuur. Het reageerde eveneens zuur; de elementairanalyse gaf resultaten, welke enigszins afweken van hetgeen voor acylglycolphosphorzuur berekend werd. Titratie van het bijproduct tegenover phenol-phtaleïne gaf een belangrijke aanwijzing inzake de structuur. Per atoom aanwezig phosphorus werd namelijk anderhalf aequivalent loog gebonden. Dit feit leidde tot de veronderstelling, dat het hier om een natriumzout van het acylglycolphosphorzuur, bevattende één atoom natrium per twee moleculen van dit zuur, zou gaan; het natrium zou dan afkomstig zijn van in de platinadioxyde-katalysator ingesloten verontreinigingen^).

In overeenstemming met deze veronderstelling gaf het bijproduct na afroken met geconcentreerd zwavelzuur een asrest. Verder bleek het mogelijk door behandeling met een kationenuitwisselaar van het Amberlite type, uitgaande van het bijproduct, het acyl-glycolphosphorzuur te verkrijgen. Een definitief bewijs dat slechts één atoom natrium op twee moleculen van laatstgenoemd zuur aanwezig was, werd verkregen door het acylglycolphosphorzuur in de molaire verhouding 2 : 1 met een alcoholische natrium-hydroxideoplossing tot koken te verwarmen; het natriumzout, dat bij afkoelen uitkristalliseerde en dat op grond van de verkregen hoeveelheid slechts de beschreven samenstelling kon bezitten, stemde in eigenschappen volledig overeen met het corresponderende

^) Reeds A d a m s c.s. (80) geven aan, dat het volgens hun voorschrift door smelten van platinachloride met natriumnitraat bereide platinadioxyde enkele procenten alkahsch reagerende natriumverbindingen insluit, die niet door uit-wassen te verwijderen zijn en die bij de reductie van het oxyde tot metaal in het oplosmiddel overgaan. Het is trouwens een bekend feit, dat volgens A d a m s c.s. bereid platinadioxyde alkalisch reageert ten opzichte van vochtig lakmoes-papier. De literatuur vermeldt enkele gevallen, waarin de aanwezigheid van dergelijke verontreinigingen tot storing van een normaal reactieverloop leidde

bijproduct. Uit een oriënterende proef bleek, dat zulk een natrium-zout reeds in beduidende mate gevormd wordt, indien het acyl-glycolphosphorzuur tesamen met een viervoudige overmaat (neutraal reagerend) natriumnitraat in droog aethylacetaat of droog dioxan enige tijd aan een terugvloeikoeler wordt gekookt. Een nader onderzoek van de literatuur bracht aan het licht, dat dergelijke zouten van twee moleculen van een organisch phosphorzuur met één molecule van een base ook door anderen beschreven zijn; H u n t e r c.s. (42) verkregen dergelijke zouten van phosphatidezuren met chinoline; F r i e d m a n en S e l i g m a n (84) verkregen j8-naphtylphosphaten met één atoom natrium per twee moleculen ySnaphtylphosphorzuur en ook W a g n e r -J a u r e g g (85) evenals T i p s o n (86) vermeldden soortgelijke gevallen.

De vorming van het natriumzout werkt overigens weinig storend op de zuiverheid van de verkregen acylglycolphosphorzuren, daar \ , het frappante verschil in oplosbaarheid in kokend aethylacetaat / \ . een volledige scheiding mogelijk maakt. Zoals later (hoofdstuk IV) bij de glycerophosphatidezuren beschreven zal worden, kan de vorming van natriumzouten vermeden worden door gebruik te maken van een platina/kool katalysator en dioxan als reactiemilieu te kiezen.

Het leek ons van belang te onderzoeken, in hoeverre de be-reiding der acylglycolphosphorzuren vereenvoudigd kon worden door de hiervoor beschreven volgorde, waarin de acylgroep en de diphenylphosphoroylgroep in het glycol-molecule ingevoerd wer-den, te wijzigen, zoals dat in het onderstaande reactieschema is

CH2OH y CH2OH CH20Tri CHaOTri I -^ I CH2OH CH2OPO1 L VL (P, '^Oj^

f^o,

aangegeven. Volgens dit schema vergt de bereiding van ver-schillende diphenylphosphoroyl-acylglycolen (IV) slechts één grondstof — namelijk het mono (diphenylphosphoroyl) glycol VII — in plaats van een reeks verschillende monoacylglycolen (III).

De pogingen, welke wij tot dusverre ondernamen om het mono (diphenylphosphoroyl) glycol ( V I I ) te bereiden, werden even-wel niet met succes bekroond. De inwerking van diphenylchloor-phosphaat op een overmaat droge glycol bij kamertemperatuur en in tegenwoordigheid van droge pyridine leidde steeds tot producten, welke in belangrijke mate door phenol verontreinigd waren en waaruit geen zuiver mono (diphenylphosphoroyl) glycol

(VII) kon worden geïsoleerd.

De katalytische detritylering van het gemakkelijk toegankelijke diphenylphosphoroyl-tritylglycol (VI) in absolute alcohol in tegen-woordigheid van de door V e r k a d e , C o h e n en V r o e g e (95) beschreven palladium-kool katalysator leidde evenmin tot het gewenste resultaat. W e l bleek onder deze omstandigheden uit VI bij omtrent 50° onder opname van één mol waterstof uitsluitend de tritylgroep afgesplitst te worden, maar uit het gevormde reactiemengsel konden slechts tritaan en phenol, doch geen

mono-(diphenylphosphoroyl)glycol geïsoleerd worden. In het experi-mentele gedeelte van dit hoofdstuk treft men een overzicht aan van enkele proeven, die de verwezenlijking van het hierboven-genoemde reactieschema ten doel hadden.

Teneinde de mogelijkheden van de bereiding van phosphatide-zuren met onverzadigde vetzuurresten te bestuderen, werd ook getracht, uit de diphenylphosphoroyl-acylglycolen de phenylgroe-pen door hydrolyse af te splitsen. B r i g l en M u l l e r (60) ver-meldden, dat het in sommige gevallen — o.a. bij het a-diphenyl-phosphoroyl-acetonglycerol en bij het j8-diphenylphosphoroyl-ay-benzylideenglycerol — mogelijk was, een dergelijke hydrolyse teweeg te brengen door zachte verwarming met 60 %ig waterig azijnzuur. Bij de diphenylphosphoroyl-acylglycolen gelukte dit echter niet. Onder milde omstandigheden (koken aan een terug-vloeikoeler met vochtige aether of verwarmen met waterig azijnzuur of waterige pyridine tot 50—60°) trad geen reactie op; bij wat hogere temperatuur of bij gebruik van krachtiger hydrolyserende

middelen trad afsplitsing van de vetzuurrest op. De bereiding van acylglycolphosphorzuren schijnt langs deze weg niet mogelijk te zijn. In het experimentele gedeelte van dit hoofdstuk wordt een overzicht gegeven van de terzake verrichte proeven.

EXPERIMENTEEL G E D E E L T E i ) . § 1) Bereiding van de vetzuren en hun zuurchloriden.

Vanzelfsprekend vormde de zuiverheid der als grondstoffen te gebruiken vetzuren een belangrijke factor in dit onderzoek. Als criterium voor de zuiverheid der vetzuurpreparaten werd het stol-punt genomen; de gebruikelijke smeltstol-puntsbepaling is wegens zijn onnauwkeurigheid en wegens de geringe smeltpuntsdepressies, die de homologe vetzuren onderling geven, voor dit doel ongeschikt. Als stolpunt werd de hoogste temperatuur genomen, die tijdens het stolproces optrad (afgelezen tot op 0,1° nauwkeurig). Deze waarde is nauwkeurig reproduceerbaar. De in het onderstaande ter ver-gelijking vermelde literatuurstolpunten zijn ontleend aan de meest recente publicatie op dit gebied (87).

M y r i s t i n e z u u r (C14H28O2): Uit muskaatboter werd tri-myristine geïsoleerd volgens de aanwijzingen van V e r k a d e en C o o p s (88) en een voorschrift in Organic Syntheses (89). De verzeping van het trimyristine werd uitgevoerd volgens de methode van v a n E l d i k T h i e m e (90); in plaats van natriumhydroxide

werd evenwel kaliumhydroxide als base gebruikt, omdat bleek, dat

daardoor tijdens het afdampen van de alcohol een beter roerbare massa ontstaat. Het verkregen myristinezuur had een stolpunt van

1) De bereiding van de in dit hoofdstuk beschreven diphenylphosphoroyl-acylglycolen alsmede van de daarbij behorende tussenproducten werd reeds eerder door de Heer J. H. V a n d e r N e u t in het Laboratorium voor Organische Scheikunde der Technische Hogeschool te Delft verricht. De thans beschreven experimenten hebben betrekking op de resultaten, verkregen bij nawerken en zonodig verbeteren van het onderzoek van de Heer V a n d e r N e u t .

Alle smelt- en stolpunten, vermeld in de experimentele gedeelten van dit proefschrift, zijn gecorrigeerd,

53,6° (lit.: 53,65°) en een aequivalentgewicht (titratie) van 229,0 (ber.: 228,4).

P a l m i t i n e z u u r (Ci(jH3202): Hiervoor werd palmolie als grondstof genomen. Door geruime tijd koken aan een terugvloei-koeler met een drievoudige hoeveelheid absolute methylalcohol, waarin 5—10% droog zoutzuurgas was opgelost, werden uit deze olie de methylesters der aanwezige vetzuren bereid. Na gedeel-telijk afdampen van de methylalcohol werden de zich als olielaag afscheidende methylesters van nog aanwezig zoutzuur bevrijd door wassen met een verdunde sodaoplossing en met water, en vervolgens gedroogd. Volgens de broomestermethode van G r ü n (91) werden de methylesters der verzadigde vetzuren ge-scheiden van die der onverzadigde vetzuren; de eersten werden daarna zorgvuldig in vacuo gefractioneerd, totdat het stolpunt van de opgevangen hoofdfractie niet meer steeg. Het verkregen methyl-palmitaat stolde bij 29,0° (lit.: 29,20°) en gaf bij verzeping volgens de eerder genoemde methode palmitinezuur met een stolpunt van 62,3° (lit.: 62,60°). Het aequivalentgewicht (titratie) bedroeg 256,9 (ber.: 256,4).

S t e a r i n e z u u r (CigH3g02): Af geharde lijnolie met een joodgetal van 1,7 diende hiervoor als grondstof. O p de hier-boven aangegeven wijze werden de methylesters der vetzuren bereid, die na zorgvuldig fractioneren in vacuo methylstearaat met een stolpunt van 37,6° (lit.: 37,85°) leverden. Verzeping volgens de eerder genoemde methode leverde stearinezuur met een stolpunt van 69,2° (lit.: 69,39°) en een aequivalentgewicht (titratie) van 284,7 (ber.: 284,5).

B e h e e n z u u r (C22H44O2): Katalytische reductie van zuiver erucazuur in absolute aethylalcohol, in tegenwoordigheid van een palladium/kool katalysator leverde in vrijwel quantitatieve op-brengst beheenzuur met een stolpunt van 79,6° (lit.: 79,70°) en een aequivalentgewicht (titratie) van 341,1 (ber.: 340,6). Het erucazuur werd verkregen uit raapolie volgens de door B e r t r a m

(92) beschreven methode; het had een stolpunt van 33,4°