Fabrieksschema bereiding van streptomycine

•

J~~1:

.' -.' _..

.

~

\ , •

•

.

~ 1 f i B H I ~ K ~ S 0 HEM A

B ERE I DIN G V A TI S ~ REP TOM Y C I N E

,

.-

I .. , J l>i~J. G. U. u~ KftUH'F P. À . V Jili HElvlEhT M A ART 1~9

5

2

- - -':' .l. '" \I ~~~-~---I---·I----+~---­

I

...a;;;;;:·

I =ed",,'jii:"

~

~_

~

I~ I

:

!

:

I

:

i I ' : , I 6. 4. '.- -:: r - -::: :--_. -~~. ---- - - -- -- - - 1 0 . , 'i' ·0 \o~· Ict' 10\ 8! , 'lE'Q.'oOI.!J .xJ..IEM4.

-ZI.: D~EL K .

fAi1RILkSSCI-IEHA VOOR DE. BEREIDiNG VAN STREPTOMyciNE,....

-PRODUc:!TIECAPAC'ITEIT : PLM. '59= leg. p"" jaar_

SCHAAL 1 À b

I

..

r

~

I

FABRIEKSSCHEMA , S T REP TOM Y C I N E

!.

Antibiotica

De term antibiosis, zoals die door Vuillemin (1889) het eerst werd ge-brui.kt , geeft aan, hoe het ene organisme, geheel actief, het leven aan een ander beneemt, dat geheel passief is, om zijn eigen leven in stand te houden.

Zoals de term echter momenteel wordt gebruikt, verstaat men onder een antibioticum een product van het metabolisme van een mioDo-organisme, dat sohade-lijk of dodesohade-lijk is voor de levensactiviteiten van een ander. Antibacteriele stof-fen, afgeleid van hogere planten en dieren (anderen dan protozol!m), laten sommigen nog onder de defini~ie vallen, anderen niet.

Historie

De reden, waarom de antibiotica &et laatste deoennium zo op de voorgrond zijn gekomen, is d~ogelijkheid om de antibacteri~le stof te isoleren, te zuiveren en als geneesmiddel te gebruiken voor infectie-ziekten. Dit kamt dus in feite neer op een praotisohe, gecontroleerde en doelbewuste toepassing van verschijnàelen, die van nature onophoudelijk plaats vinden in grond, water en andere natuurlijke vind-plaatsen van micro-organismen.

Dat hierbij veelal andere dan de natuurlijke condities ter productie wor-den geschapen en geforceerde mutanten worwor-den gekweekt ter verhoging van de opbrengst doet niets af aan het zuiver biologische karakter van deze bereidingswijze~, die tot grote industri&le bloei zijn gekomen.

De therapeutisohe toepassing van antibiotisohe stoffen gaat terug tot in de grijze oudheid. De Chinezen gebruikten bij voorbeeld reeds

2500

jaar geleden ver-sohimmelde sojabonen voor uitwendige toepassing bij infecties (1), terwijl ook de Mafa' s een soortgelijke practijk kenden; ook nu nog zijn dergelijke methoden in

, I

vele primitieve gemeensohappen te vinden.

Tooh duurde het tot het einde der vorige eeuw, voordat men langzamerhand de waarde van mioro-organismen ter genezing van infecties ging inzien.

Pasteur zag, dat hij miltvuur-baoillen ~onder gevaàr in het liohaam kon brengen, als hij tegelijkertijd maar ngewonen bacteri~n er a~ toevoegde en sprak reeds van gereohtvaardigde hoop om zo therapeutioa te verkrijgen.

In 1880 kwam de nvervamgingstherapien in zwang, d.w.z. inspuiten van een niet-pathogene baoterie om de pathogene uit te drijven~

In 1890 kwamen vervolgens versohillende meer of minder zuivere extrac-ten van baoteri~n en schimmels in zwang. Zo werd, omstreeks 1900, pyooyanase (van Pseudomonas RYoqyapea), in Duitsland in de handel gebraoht en veel gebruikt. Hoewel wij de vele onderzoekingen over en de belangrijkheid van deze stof niet moeten onderschatten, is ze toch, waarschijnlijk wegens. de grote toxioiteit, in

onbruik geraakt.

Zonder op de, weinig besohreven, redenen van de bijzondere plaats van Fleming's ontdekking in 1929 in te gaan, zij hier vermeld, dat na zijn eerste proefnemingen pas de 'grote stoot werd gegeven door de Oxford-groep, die in de tweede wereldoorlog penioilline isoleerde, dat spoedig daarna in het groot werd ge-produceerde Deze opgang is vooral te danken aan de voortreffelijke therapeutisohe eigensohappen van dit antibioticum (2).

Penicilline werkte evenwel alleen

op~aoteri&n.

Spoedig

~-_ .. -

--_

.. _-...

_---eohter kwam een tweede zeer belangrijk antibioticum naar voren: het streptomyoine.

B. Actinomyoeten als antibiotioa-producenten.

De Actinomyoeten

Het ia nu, vooral de laatste jaren gebleken, dat actinomyoeten een bij*

3

-De actinomyceten vormen een familie van micro-organismen, die meestal groeien als fijne vertakte draden, maar genetisoh toch nauwer verwant zijn aan gao-teri'n dan aan schimmels. Ze leven in grote verscheid8heid in grond, mest, compost, zoetwater en stof.

Een groot aantal acttnomyceten vertoont antibiotische eigenschappen op testplaten. Het blijkt verder, dat deze eigenschappen eerder een stam- dan een ge-slachte-kenmerk zijn. Lang niet alle stammen van 8treptomjces gr.iseue bij voorbeeld produceren streptomycine. Het gelukt vaak niet een op de testplaat ontdekt anti-bioticum in vloeistof-cultuur, ter bereiding in het groot, te laten produceren; op die manier moeten voor practieche toepassing reede vele antibiotica-producenten afvallen.

Reeds Gasperini meldèin l8g0, dat bepaalde actinomyceten (toen nog Streptothrix genoemd) zich kunnen ontwikkelen op de oppervlakte van bacteri~n en svhimmels en hun cellen verteren. Lieske, die omstreeks 1921 de antibacteri~le ei-genschappen van de actinomyceten onderzocht vond, dat deze selectief waren en alleen bepaalde organismen aantastten. De grote verbreiding van antagonistische actinomyceten in de natuur werd feitelijk pas vastgesteld door Nakhimovskaia in 1937.

De eerst, antibiotica

Van

actinomyceten; streptomycine.

In

1939

begonnen Waksman en zijn medewerkers aan een syatamatisoh onder-zoek naar de antibiotische eigenschappen van actinomyoeten en de isolering daarvan.

Het eerste product, dat kristallijn werd verkregen, was actinomycine, van een stam van Streptomyces antibioticus. Di~ antibioticum bleek uitermate toxisch te zijn.

Hierna volgden proactinomycine en micromonosporine, die geen van beiden therapeutisch

~ belangrijk bleken. Toen nu ondertussen het penicilline verscheen, ging men zich vooral toeleggen op antibiotica, die een wijder antibiotisch spectrum (d.i. samenstel van ge-voelige organismen) bezaten en, met name ook tegen gram-negatieve en zuurvaste bacteri~

4

-In 1942 isoleerden Waksman en Woodruff uit Stro lavendulae

etreptothri-cine, dat echter op den duur toxisch bleek te werken op het menselijk lichaam.

Het vele werk verricht ter isolering van streptothricine bleek echter

niet tevergeefà. In

1944

isoleerde Waksman het streptomycine, waarvan de isolerings-methode en het antibiotisch spectrum sterk o? etreptothricine leken. Het bleek ook

in vivo remmend te werken op tuberkel-bacillen en zo'n lage toxiciteit te bezitten, dat klinische toepassing perspectieven bood.

Met veel minder overheidssteun dan yoor penicilline was verkregen, lukte het toch de wetensohappelijke en technische ontwikkeling in korte tijd te doen plaats vinden.

Andere antibiotica uit actinomyceten

Het zijn vooral de antibiotica uit aotinomyceten, die het streptomycine opvolgden, en hun reden van bestaan hoofdzakelijk ontlenen aan eeQbog wijder anti. biotisoh speotrum (o.a. ook virussen) en minder ontwikkeling van resistentie. Wij noemen hier sleohts de voornaamsten: chloromycetine (ohlorampheniool), aureamyoine, neomyoine, terramyoine.

Streptomyoine reeds "uitgediend"?

Uit de Verenigde staten bereiken ons al schaarse beriohten over ohemisoh eenvoudige derivaten van nicotinezuuramide, die verrassend goed werken bij tuberou-losis-pati&nten. Dit zou, gezien ook de goede eigensohappen van chloromycetine en

an-dere antibiotica de nekslag kunnen betekenen voor de streptomycine-industrie.

Q.

Streptomycine

Strepto!yces griseus; overentingen, groeioondities en media.

Zoals reeds opgemerkt is, wordt atreptomycin~geproduoeerd door Stro griseus. Deze aotinomyceet werd het eerst beschreven door Krainsky in 1914 en door Wakaman en

I

•

.

I

5

-tures van dit organisme geisoleerd, nu echter in verband met het zoeken naar anti-biotica-afscheidenden st~en. Zij zochten bewust naar een antibioticum, dat

werk-zäam was tegen gram-negatieve bacillen.

Al deze st~en geleken zeer veel op elkaar, maar toonden kleine onder~ linge verschillen o.a. in groei, pigmentafscheiding en quantitatieve antibioticum-produotie. Later werden nog vele~. ~riseus stammen geisoleerd, die ook deze ver-schillen toonden. Daar tegenover staat, dat men ook nog andere actinomyceten, met name Stro bikiniensis vond, die het streptomycine produceren.

De cultuur van Waksman (No. 18-16) werd echter de "voorvadern_{· van de nog}

steeds gebruikte stam bij de industri~le productie van het streptomycine. Toch doen zich bij het gebruik van de~e stam weer moeilijkheden voor. Het blijkt, dat ook de verschillende koloni~n onderling weer variaties vertonen in groei, streptomycine-pro-duotie en gevoeligheid tegenover actinophaag.

Door selectie van mutanten, bestraling met ultra-violet en r&ntgenstralen

gelukte het koloni~n te verkrijgen, waarvan de streptomycine-productie tien maal zo groot was als van de oorspronkelijke, en wel 900 tot 1000~g1ml. Bij overenting

hier-van gaat echter dikwijls de antÜioticum .-vcbrming achteruit. Het bleek mogelijk te

zijn tot tien maal toe overentingen te maken met het vegetatieve mycelium, waarna

men echter weer~ens moest enten met de sporen, daar anders de opbrengst zeker achter-uit ging. Voortdurende controle is noodzakelijk en men moet steeds verder werken met

uitgezochte, meest actieve stammen.

De beste methode om ee~cultuur te bewaren is lyophilizing van verse sporen, ge~uspendeerd in taptemelk. Eenvoudiger te bereiden, maar niet zo lang houd.

baar is een sterk sporulerende cultuur op agar, bewaard bij ~-4°0.

Een groot gevaar levert ook de aanwezigheid van een virus of phaag, ge

-noemd actinophaag, die zowel het mycelium als de sporen van de gebruikte Stro griseus

..

--"

I • •

.

...

,"

6

-vernietigt. De optimale temperatuur voor zijn groei ligt, evenals voor Stro griseus

bij 2800. Bij 100°0. wordt hij in 10 minuten gedood. Dus bij het normale

sterili-seren (15 min. of langer bij 120°0.) raakt men deze phaag in he~edium zeker kwijt.

In vloeistofcultures groeien d~sporen van Stro griseus eerst niet en

vormen veel mycelium, dat vervolgens weer in stukken uiteenvalt, waarna nieuwe sporevorming optreedt of opnieuw mycelium gevormd wordt.

Nadat het mycel'ium een maximale groei heeft bereikt, zet celafbraak in.

De maximale streptomyoine-productie valt korte tijd nadat de maximale groei heeft

pitats gevonden. Is de aanvangs-pH van het medium

7,

dan daalt deze eerst

enigs-zins om daarna bij het begin der lysis weer te stijgen tot ca. 8.6. Een en ander is duidelijk te zien uit nevenstaande grafiek.

Een zeer geschikt medium is samengesteld uit glucose, pepton, vlees-extract en keukenzout (volgens Waksman). Hierin kunnen echter vele veranderingen gebracht worden. In plaats van glucose: zetmeel, glycerol, pentosen, andere hexo-sen. In plaats van pepton: caselne, trypton, aminozuren, natrium-nitraat. In plaats

van vleesextract

:

(

~~:,::.st

_

e~p --=~

~

,

gist-extract, sojameel. Tegenwoordig gebruikt

men echter veelal de goedkope "distillers' solubles", een protelnen bevattend

bij-product van de alcohol-bereiding door gisting van fijngemaakte granen. Ook een

syn~tisch medium ~s· beschreven, bestaande uit de volgende stoffen: glucose,

Toevoeging van amino-zuren of meer complexe organische verbindingen sti-muleert de streptomyoine-productie. Uit het feit, dat bij lage zoutconcentratie vm

het medium het streptomycine hoofdzakelijk in het myce~imm aanwezig is, volgt , dat

het vermoedelijk een intra-cellulair gesynthetiseerd product is. Andere antibiotica van Stro griseus; het biologisch spectrum.

Behalve streptomyoine produoeert Stro griseus ook nog andere antibiotica.

,. I

..

r - ~---,....--.-~" 7

-Hieronder bevindt zich naast griseine en strentocine, het actidion, dat uitalui-tend remmend werkt op gisten.

Verder wordt ook nog gevormd het mannosido-streptomycine, dat echter door de mannosido-streptomycinase, een enzym, dat ook door Stro griseus wordt af-gescheiden, ontleed wordt in streptomycine en mannose. He~lijkt veel op strepto-mycine, maar ie minder actief.

De grote belangrijkheid van het streptomycine ligt dus in het feit, dat het, in tegenstelling tot penicilline, werkzaam is tegen gram-negatieve en

zuurvaste bacteri~n. Enkele pathogene micro-organismen, waartegen streptomycine

werkzaam is, zijn: Mycobacteriym tuberculosis, Paeteurella pestis, Brucella

ab-ortus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhosa, Shigella dysenteriae. Met de volgende feiten moet men echter rekening houden:

1. De meeste micro-organismen ontwikkelen na enige tijd resistentie tegen een bepaald antibioticum. Men moet dan dus, bij langdurige gevallen, tot andere middelen overgaan.

2. Als het streptomycine niet zuiver is, voora~ls er hiatamine-achtige producten in aanwezig zijn, ontstaan intoxicatie-verschijnselen.

~., Ook het zuivere streptomycine is nog enigszins towisch. Vooral na

langdurige toediening kunnen zich o.a. neurologisch afwijkingen voordoen. Goede

resultaten worden verkregen door gelijktijdig gebruik van atreptomycine en andere

therapeutica, o.a. sulfa-preparaten.

Veel minder toxisch ia ook het dihydro-atreptomycine (zie blz.9 ). Chemische formule •

Nadat men er ,in geslaagd was het streptomycine zuiver in handen te krijgen, gelukte het 'ook de chemische formule ervan te bepalen, die hieronder in Haworth-p~

jeetie wordt weergegeven. Het is dus opgebouwd te denken uit de ~ stoffen: streptidine,

Nt-!

11 I:4HCNH~

H

OH

o

014

8

-S

h-ep+id

,'ne

streptose en N~ethyl-L-glucosamine,

waar-uit het ontstaan gedacht kan worden door afscheiding van 2 moleculen water.

Deze formule klopt met de bruto-samenstel-ling, die men bepaalde uit de zouten van

.streptomycine, namelijk:

Aanwezig zijn dus ~ basische groepen en een

reactieve carbonyl-groep. Deze laatste toonde

N~tYlet"'yl-L-

men aan, doordat men uit het streptomycine

-gluco.sam,'oe

een oxime zowel als een s8micarbason kon bereiden.

Eigenschappen

Het streptomycine is een sterke base, zeer goed oplosbaar in water, maar onoplosbaar in aceton, chloroform en aether. Uit waterige oplossing is het niet te

extraheren met butanol of andere veel gebruikte extractie-middelen.

(3).

Het wordt

•

gemakkelijk geadsorbeerd aan actieve kool, uit alkalische oplossing. Door middel van verdund zure oplossingen, b.v. zoutzure alcohol, is het weer te elueren.

Het is vrij stabiel. Enkele opgaven hierover zijn: bevat het minder dan

1% vocht, dan is de activiteit bij kamertemperatuur na 12 maanden nog onverminderd.

In waterige oplossing van pH ~-7 bij 28°0. is het na

60

dagen nog goed. Bij 28°0.

is de half-waarde tijd bij pHls van 1.7, 8.6, 0.8,

9.5,

respectievelijk 1500, 1100,

100, en ;00 uren; bij

95

00. en pH

5.5

is de halfwaarde-tijd ~7 uren; bij verhitting

op 1000_{0. loopt de activiteit in 10 min. nog niet tot op de helft terug; in een}

op-lossing van 1 N HOl of 0.1 N NaOH wordt het snel afgebroken.

Men heeft er verscheidene zouten van kunnen bereiden, Fried en Wintersteiner

•

JI

,

9

-verkregen het

~inec~

smeltpunt 164-165°0. Kühl,

~,

Walti en Folkers

verkre-gen een goed kristallijn product door uit concentraten van het

streptomyoine-hydrochloride met methJl-oranje het helianthaat neer te slaan, smeltpunt 220-226°0.

Hieruit konden zij vervolgens het hydrochloride of sulfaat maken.

Peck et al. ontdekten, dat het streptomycine-hydrochloride of het helian-thaat met oalcium-ohloride een kristallijn dubbelzout vormde, dat twee moleculen streptamycine-trihydrochloride en een molecuul OaOl

2 bevatte. Deze stof ontleedt

bij 200~2~OoC. Dit dubbelzout is zeer belangrijk bij de industri~le bereiding van

het streptomycine, omdat het gemakkelijk kristalliseert en zeer zuiver blijkt te

zijn. Men bereidt dit dubbelzout door eenvoud_. ig toevoegen van OaOI ₂ in zoutzure

methanol aan een oplossing van streptomycine-hydrochloride of

streptomycine-helian-thaat

.

(cv

J

~5

;:

-

760

•

Het trichloride is te reduoeren tot dihydro-streptomycine-!richloride,

o.a. in waterige oplossing door _{schudden met H2 met als katalysator nikkel,}

plati-na of piladium. Ook hiervan is het helianthaat bereid; een dubbelzout met OaOl laat

2

zich hiervan eohter niet bereiden. De reductie vindt plaats in de carbonjl~-groep.

Dit dihydro-streptomycine heeft ongeveer dezelfde antibiotische werking

ale het streptomycine zalf, o.~. tegen Mycobacterium tuberculosis. Het is echter

minder toxisch en wordt dan ook bij voorkeur gebruikt als grote doses en langdu-rige toepassing nodig zijn.

De isolering van streptomycine.

Daar streptomycine niet gemakkelijk te extraheren is uit zijn

oultuur-vloeistof, moet men andere middelen gebruiken. Schatz, Bugie en Waksman (4) wezen

op d~ogelijkheid van adsorptie aan actieve kool , in overeenstemming met de iso-lering van het eerder ontdekte streptothrioine.

Nadat het mycelium is afgefiltreerd, waarbij ee~ilterhulp gebruikt moet

~~,

-

-10-aangezuurd met zoutzuur of zwavelzuur tot pH 2-4, waarna actieve kool (~) wordt toegevoegd. Het streptomycine wordt bij deze lage zuurgraad niet geadsorbeerd, ver-sohillende verontreinigingen echter wel. Vervolgens wordt het geheel afgefiltreerd, het filtraat met loog op pH

7,0-7,5

gebracht en weer actieve kool toegevoegd.

Onder deze omstandigheden gelukt het, om het streptomycine te adsorberen

(5).

Andere stoffen, zoals silica-gel, diatome~n-aarde, magnesium-phosphaat adsorberen

het streptomycine slecht. Ook kationen-uitwisselaars bleken niet gebruikt te

kun---

---nen worden.

•

Om

nog weer verontreinigingen af te scheiden,wordt de kool na de adsorp- ,

tie uitgewassen met water of met waterige methanol of aethanol. Het streotomyoine blijft hierbij aan de kool gebonden en kan nu ge~xtraheerd worden met behulp van zoutzure aloohol, pH

1,5-2,5.

Vervolgens neutraliseert men met soda en dampt de oplossing in onder verlaagde druk, waarna de neergeslagen anorganisohe zouten wor-den afgefiltreerd. Een neerslag van het ruwe streptomycine wordt nu verkregen door toevoeging van methanol en aoeton.

Een kleine variant op deze methode is het volgende: voeg aan het eluaat toe 0,1 N methanolisoh zoutzuur. Voeg soda toe, damp in en sla het streptomyoine neer met aceton (zoveel, dat de oonoentratie hiervan

80%

bedraagt). Een nog zui-verder product kan men verkrijgen door aan het eerste eluaat nog eens kool toe

•

te voegen, eerst bij pH

4

en dan bij pH

6,

waarbij het streptomyoine geadsorbeerd

wordt. Vervolgens kan men het op de hiervoor beschreven wijze afsoheiden.

Om dit ruwe streptomycine verder te zuiveren, staan verschillende me~

thoden ter beschikking:

• 1. Chromatográphie.

Hierbij gebruikt men een aluminium-oxyde-kolom, waarover een oplossing van strepto-mycine-hydroohloride of -sulfaat in 80% methanol-water van pH

5-6

gegoten wordt. Na

"

.

.

•

. .

~)

•

:.i "',

'10

·

.'

..

.

\ . ~

•

- 11

-2. Via het zout.

Heeft men het streptomycine voor minstens

50%

zuiver, dan is verdere zuivering zeer goed mogelijk, door het in waterige oplossing neer te slaan als reineokaat of helianthaat; Reinecke-zout is NH4 [cr (SCN)4

(NH~)2

]

• Door toevoeging van de stoechiometrisohe hoeveelheid anorganisoh zuu~s het dan om te zetten in het hydroohloride, hydrobromide of sulfaat, dat nu

@a:liti~Ch

-

~

-

~i~~!>

is.

Nog beter is de bereiding van het dubbelzout met Ca6l 2, temeer omdat dit direct therapeutisch te gebruiken is. Het streptomyoin~ moet nu 40-50% zui-ver zijn. Men voegt bij elkaar alooholisohe oplossingen van het streptomycine en het OaC1

2• Gebruikt men hierbij de juiste hoeveelheden, dan slaat het dubbelzout neer in de vorm van lange naalden (6). Ook uit dit dubbelzout zijn eventuele an-dere zouten te bereiden

Enige cijfers (7)

De productie van het streptomycine in Amerika bedroeg in de jaren: 1946 - 1.174.582:gr.

1947 - 9.675.9l9'gr. 1948 - ~7.709.l60· gr.

1949 - 8~.699.1~7: gr. 1950 - 92.446.;42gr.

Het verbruik in Nederland bedroeg in 1950: 2.500.000 gr.

De Centrale Suiker Mij. ,Den Haag, zou ~OOO kg./jaar gaan maken.

Enige getallen van de fabriek van Merck in 1946 (toen men nog slechts 50ug/ml. produoeerde) zijn:

~osten

van

de

(

~

$

~.500.000;

\." ; / . / .

Maandproductie: 100.000 gr. streptomycine;

Gebruikt: 50.000 ton grondstoffen (waarin ook oplosmiddelen die teruggewoD~n worden) en 45.000.000

tv

~ater.

Nog enkele algemene opmerkingen

.

-.

.

.

.

.

. : ! ( .:. •

..

~--- - - _{- - - ---}

~wq_r 12 ~wq_r

-aan de volgende voorwaarden vold-aan worden (8):

1.

Het

-

micro-organi~me, d~t

de gewenste stof'

levert~

moet gemakkelijk voort te

~lllten zijn, zijn biologische eigenschappen b-ehouden en behoorlijke onbrengsten

geven.

2. De materialen, _{nodig voor de bereiding van het substraat, moeten}

goedkoop zi jn.

~. D_{e fermentatie moet snel verlopen.}

~. Het gevraagde product moet gemakkelijk _{gewonnen en gezuiverd kunnen worden.}

Methoden ter bepaling van streptomycine

Ter vervolging van het proces, als ook ter bepaling van de zuiverheid vm preparaten heeft men een bepalingsmethode van streptomycine nodig. Ook voor klinische doeleinden i~ een methode vereist. Al naar gelang de eisen van nauwkeurigheid, snelheid en eenvoud, hebben zich verscheidene methoden ontwikkeld. Men kan ze verdelen in bac-teriologische en chemische methoden. De eersten berusten op de waarneming of' meting van bacteri~le remming en zijn functies vande biologische activiteit van streptomycine; ze zijn afhanli:elijk van veel variabelen.

De chemische methoden berusten op chemische structuur. Hier is een grote specificiteit wenselijk, daar iedere reactie met gelijksoortige verbindingen of met verbindingen, die gelijksoortige groepen bevatten, de bepaling stoort.

Zonder verder op details in te gaan, zij hier vermeld, dat de bacteriolo-gische methoden (zoals agar-diffusie, turbidimetrie, serie-verdunning) vaak zeer nauw-keurig zijn; de duur der methode wordt bepaald door de grosienelheid van het

test-organisme; enige uren is hiervoor al heel snel. Aan de chemische methoden ie de voorkeur te geven, als het gaat om een proces te vervolgen en aan de hand van de resultaten maat-regelen te nemen, b.v. het constateren of een. kool-kolom vol is of geheel ge~lueerd (zie pag.

19).

Het beste neme men die chemische methoden, die OP een reactie met een bacte-riologische actief deel berusten, daar men dan niet de kans loopt, een onwerkzame stof t e bepalen. De op pag. 19 voorgestelde malt ol-methode berust on de vorming, in

woordigheid van verdunde alkali, van maltol (2-met~oxy-~-hydroxY-G-pyroon).

Het wordt gevormd uit het streptoae-deel van het intacte atreptomycine-mo~ecuul

_.

•

Na ontwikkelen van, de kleur met ferri-ammonium-sulfaat of een apeoi~al

ph~nol-reagens bepaalt men de licht-abaorntie.

Een andere chemische methode ie bij voorbeeld het vormen van een complex

met 4~-4(n-chlorophenylazo)-l naphthyl)aemicarbazidej dit complex ia gekleurd en

kan colorimetrisch worden bepaald.

/

j '

1)

~~~:0~

,~~

Lr

---

----

---

--- - - -

-

-- - - .

1)

-Q.

Keuze van het fabrieksschema

Overzicht

In het voorafgaande is, naast vele algemene zaken, reeds een idee ge-geven van de versohillende stappen, die bij de fabriekmatige bereiding van strepto-myoine te pas komen. In het kort vinden de volgende bewerkingen plaats:

1. (laboratorium) net overenten van 8treptomyces griseus en op peil houden van de

reinculturesj overenten in

k~jeS

voor schudcultuur.

2. (fabriek) het overenten van de schudcultuur in steeds grotere tanks.

). (fabriek) filtratie van het mycelium, adsorptie van het antibioticum aan kool,

elutie, indampen, neerslaan en drogen; omzetten in CaC1₂-dubbelzout.

4.

(kleine fabr. schaal) verdere zuivering door de uitvoering van verschillende

bewerkingen, om toxische stoffen en andere

5.

(steriele kamers) de afWerking in steriele

nge~e verwijderen.

-...:~,..., .. _. '1J. -

(A

? - i

~

h-

Lt

i.It.lJ

c-J.

~

malen, afwegen en verpakken.

Aan de hand van de in enige uitvoerige artikels

(2)

(9)

(10) (11)

gevon-den gegevens, aangevuld met de kennis uit de patent-litteratuur (zie v~der), is

nu een keuze gemaakt. In het hier volgende isnu, stap voor stap, het .proces nage~

gaan en de methode gekozen; alle cijfers, die betrekking hebben op de capaciteit van de fabriek en hiervan afgeleide dimensies, zijn vooralsnog weggelaten. Deze worden hierna apart besproken.

Ad 1.

a) Reinoultuur van Stro griseus.

In het laboratorium wordt een atam bewaard, die door mutatie (zie pag.5 ) uit de

stam 18-16 van Wakaman is verkregen. Bij overenting wordt toegezien, dat de antibio;

ticum-produotie niet terugloopt. De best houdbare vorm van het organisme is in ge-

•

14

-verse sporen van een goea-producerende cultuur (later in de productie: vaneen bij-zonder gOede·e worden in taptemelk

steriele buisjes drooggedampt en

. . 0

gesuspendeerd en nu in vacuo bij -10 C. in

kleine ingesmolten. Deze kunnen nu maanden lang

be-waard worden.

b) Schudcultuur in kolfjes.

Deze stap wordt overal toegepast en is haast niet voor variatie vatbaar. De inhoud van een gelyophiliseerd buisje wordt gesuspendeerd in steriel water en verdeeld over enige glazen kolfjes (volume 1 1.), die voor plm.

!

gevuld zijn met cultuurmedium. Op een roterende schudmachine (~00-400 omw./min.) worden deze nu geschud tot maxi-male myoeliumgroei (plm. 2 tot

4

dagen).

c) Het cultuurmedium.

Hierover is reeds gesproken op pag.

J

.

Voor

industri~le

toepassing moet men rekening houden met de volgende factoren:

10 de kosten van de oomponenten. o

2 de opbrengst aan antibioticum. ~o het gedrag bij de zuivering.

Wat betreft punt 10 kan men licht begrijpen, dat vleesextraot en ~pton zwaar op de

financi~le balans van een fabriek gaan drukken. In geheel synthetische media zijn de opbrengsten vaak niet bevredigend. Bij het goedkope cornsteep-liquor gaat het

b ezwaar su / b ~o overwegen; d e a8.nWez1ge histamine-achtig. e product.a zijn lastig af

te scheiden en zeer toxisch.

H8wel men aanvankelijk toch met Waksman' s medium (9) (12) met vleesextract, p. pton, glucose en NaCl heeft gewerkt, is er nu toch een goedkoper recept vrijgegeven, waarin goede opbrengsten worden verkregen en waaruit een zuiver product is te

verkrij-gen (1;). Dit medium is gekozen:

sojameel

2.0%

dextrose

_1.0%

-15"

derest~~

(waarin spore-elementen) pH brengen op Jim.

7.0

Voor de kolfjes sub 1 b wordt een passende hoeveelheid van dit medium bereid en in de kolfjes (plm. 250 mI. bevattend) gesteriléseerd gedurende 15 min. bij

o

120 C. in een autoclaaf.

Voor het medium in de tanks sub 2 voegt men in een mengt ank dusdanige hoe-veelheden van de stoffen aan water toe, dat de concentrati~ het tienvoudige bedraagt v~

de straks vereiste.

Ad 2. De fermentatie-ketels.

a) Het inbrengen van medium en het enten.

Om nu in de.eigenlijke productieketels, welks afmeting aan de vereiste pro-ductiekapaciteit iS,aangepast, een goede en snelle ontwikkeling van antibioticum te verkrijgen, dient men vanaf de kolfjes het voll~e geleidelijk te vergroten, en wel

tel-\

,

kens met een factor 10 a 20 (2) (14). Hierop komen we later terug. b) Het medium; sterilisatie.

Zoals sub Ic vermeld is wordt het medium voor de ketels gemaakt in de tien-voudige concentratie in een mengketel. Van öier wordt het gepompt naar de fermentatie-ketels en met water op de vereiste concentratie gebracht.

De ketels bevatten een stoomspiraal, w·armee men het medium op 120 0 C. brengt

ter 8terilisatie.~.Gr0ndtgeBterilisatie is zeer belangrijk, omdat een infectie

verminder-de opbrengst en moeilijkheden met de zuivering ten gevolge heeft. Een gelnfecteerde

ketel-inhoud wordt dan ook alti;d weggedaan.

Men moet zich wachten voor te lang steriliseren, ~a8r dit onnodige afbra8k

van de componenten (bijv. glucose) tengevolge heeft, hetgeen ook grote zuivering

smoei-lijkheden geeft.

o

Sterilisatie gedurende een half uur op 120 C., aangenomen dat het gehele medium die tijd op temperatuur is, is in de nr~~ijk voldoende gebleken.

•

Op deze wijze is het Beer goed mogelijk de drie eerste ketels met hun inhoud te steriliseren; hierna worden ze geloeId met water. Voor de grootste ketel, wordt dit echter bezwaarlijk, aangezien zowel het opwarmen als het afkoelen nu veel te veel tijd in beslag memen. Daarom wordt hier een andere methode toegepast. (20):

Voor de fermentatie-ketel staat een kookketel, voorzien van een intensief roerwerk. Hierin brengt men de cultuur-vloeistof, waarna stoom in deze vloeistof wordt geleid. Hierdoor wordt sne~en hoge temperatuur bereikt. De ketel wordt

t

tot 1 uur

o

op 120 C gehouden. Voortdurend wordt geroerd.

Hierna gaat de cultuur-vloeistof via een koeler naar de fenmentatieketel,

o

waarin hij op de vereiste temperatuur (28 0) aankomt. Het afgevoerde koelwater wordt gebruikt om de cultuur-vloeistof te verdunnen in de kookketel.

c) Temperatuur en luchttoevoer; antischuim.

De "fermentatie" van stro griseus is een aeroob proces, datVItij veel warmte ontwikkelt. De gunstigste temperatuur blijkt 280 C te zijn. Ter handhaving van deze temperatuur kan men zowel stoom als water (vooral bij de grote ketels is koeling nodig: relatief minder warmte-uitwisseling met de omgeving) door spiralen laten gaan.

De zuurstof-behoefte van het organisme is zo groot, dat geforceerde aeratie nodig is. Hiertoe laat men gesteriliseerde lucht toe via een luchtverdeler, bijvoorbeeld geperforeerde buizen onderin de ketel, OP een gunstige plaats ten opzichte van de roerder; dan stijgt de luchtbel niet rechtstreeks omhoog, maar maakt een lange weg door de vloei-stof, zodoende het rendement van de luchttoevoer vergrotend. De roerder slaat bovendien de luchtbellen nog stuk.

De sterilisatie van de lucht geschiedt door leiden door watten, actieve kool, of andere fijn verdeelde materialen. Wij kozende tegenwoordig veel in gebruik zijnde kool; korrelgrootte hit:rvan plm. 8-14 mesh (20); verwarming van de filters tot boven het dauw-punt van de lucht is geboden; anders wordt de kool nat en gaat "doorslaan".

. - . _

-tegelijk met 'e fermentatie-ketels. Inactivering treedt haast niet 0Pi de kolommen

zijn jaren te gebruiken.

De luchttoevoer in dit proces, is, blijkens litteratuur-opgaven (9) ongeveer

i

liter lucht per minuut per liter cultuurvloeistof.

Tengevolge van de aeratie en mede door de aanwezigheid van eiwitachtige

bestanddelen, gaat de vloeistof soms sterk schuimen. Dan is het gebruik van een

anti-schuim middel noodzakelijk.

\

Voorwaarde voor een goed anti-schuim middel is, daVhet niet toxisch is en

geen moeilijkheden geeft bij de zuivering. Velen zijn beschreven (10), vele anderen nog

geheim (2). Vaak dienen plantaardige of dierlijke vetten als zodanig (lanoline, reuzel,

reuBelolie,sojabonenolie) , en derivaten (turks-rood olie, oliezuur), alsook hogere

al-coholen en esters (octadecanol, tributyl-citraat), terwijl vele producten met

handels-namen in zwang zijn (vlllgifat Y, garfett, lipon, nopco).

Sinds kort maken ook siliconen als zodanig opgang; zeer recent zijn voor

streptomycine de voortreffelijke eigenschappen in zeer geringe concentratie van siliconen

beschreven (16).

Dit stellen wij ons dan ook voor toe te passen (bijv. DO anti-foam A van

r-~~.

~~

..

~~~n=ng ~~.

~_

_ .) en wel in een conoentratie van 2-?

~~~

.

s~elen

op 1

milli~

\'el.'lmed el en.. vloei_e~~ ( 16) .Di t wordt apart gesteriliseerd oen na het enten aan het medium

---

toegevoegd.

d) Tijdsduur.

Terwijl de eigenlijke productieketel draait, totdat maximum

anti-bioticum-opbrengst is verkregen, hoeft het mycelium in de tussenketels slechts zodanig te groeien

dat goed overge~nt kan worden. Hiertoe is plm. 2 tot 4 dagen nodig. Voor d~productie

'.

is oen wat langere tijd nodig (zie ook grafiek op pag.

6

).

Deze gegevans zijn niet te voorspellen en ook nergens precies in de litteratuur

vermeld.Ze hangen trouwens af van de speciale (SOliS onherkenbare) condities van het

•

..

-bedrijf en de ketel. Teneinde toch iets concreets te hebben Bal verderop hiervoor een waarschijnlijke aanname worden vastgesteld •

.

a::l ~. Van de filtratie tot aan het ruwe product.

Te beginnen bij dit punt, kar. men het proces heel geschikt continu laten verlopen, hetgeen wij ook voorstellen.

a) De filtratie.

Na de productie in de tanks moet men de vloeistof van het mycelium scheiden. Het mycelium blijkt zeer fijn en gelatineus te zijn, zodat centrifugeren niet mogelijk is. Drukfiltratie bleek het beste te zijn (9) met een filterhulp, die zowel als deklaag op het filter komt, alsook aan de vloeistof wordt toegevoegd.

De filterhulp moet zo gekozen worden, dat er geen streptomycine aan

ge-adsorbeerd wordt. Slechts schaarse gegevens sto"den hierover ter beschikking. Wij stellen

•

het door Sheehan en Tishler (17) gebruikte 11 super cel" (diatomaceous silica) voor.

De menging vindt plaats in een tank met roerderj hiervandaan gaat het

ge-'heel naar het ~XXX~~ drukfilterj het neersla§Wordt met water uitgewassen, waarna het

~~~~wordt verwijderd.

k

Het ~oevoegen van filterhulp kan men automatisch, evenredig met de hoeveel-heid doorstromende vloeistof, doen plaatsvinden.

b) De adsorptie aan kaol.

Zoals reeds op p'ag. 10 vermeld, laat men eerst bij pH 2-4 de verontreinigingen aan kool adsorberen en daarna bij pH

6.5 -7.5

het strentomycine.

De soort kool moet a~gepast zijn aan het doel en varieert bovendien met het gebruikte medium. Bij het door ons gebruikte medium was geen soort opgegeven, zodat we hierbij van ,aangeven van de soort kool moeten afzien.

Hoawel men aanvankelijk met toevoegen V~1 kool 'werkte

(9),

is het werken met vaste kool-bedden later van voordeel gebleken

(5).

Ons inziens is echter voor de

-19-verwijdering van de verontreinigingen bij pH 2-4 toevoegen van kool beter, daar hier

nooit volledige regeneratie van de kool mogelijk is en deze dus toch weggegooid wordt. Terwijl bij het toevoegen van kool, vooral bij de adsorptie van

strepto-mycine in neutrale oplossing, gelet moet worden op de juiste dosering van de

hoeveel-heid kool ( te weinig: geen volledige adsorptie; teveel: onvolledige elutie), moet men.

bij vaste bedden de door te voeren hoeveelheid vloeistof bepalen, of, indien men direct een monster kan analyseren, doorvoeren, totdat in de afloop, streptomycine is aan te tonen.

Een directe analyse-máhode bezitten we in de maltol-methode (zie pag. /2).

Als richtlijn voor de hoeveelheid kool hebben we de opgave van Waksman

(18) genomen, dat in een cultuur-vloeistof met 300-400~g/ml capaciteiten worden bereikt

van 10.000 - 20.000~g/g.

Met deze gegevens wordt de procedure nu: Het heldere filtraat wordt op pH

2.2 gebracht (19) en het geringe gevormqe neerslag (vooral eiwitten) afgefiltreerd pver

een xmt.x.K~ persfilter,

Automatisch wordt nu actieve kool toegevoegd (orde van grootte ~, sterk

afhankelijk van medium). In een ketel wordt de vloeistof nu plm.

t

uur geroerd met de kool, in 3 adsorptietanks in serie.

Ka wordt afgefiltreerd over een ~~ft~BX~ persfilter en uitgewassen; de

filter-koek wordt weggedaan. Vervolgens komt de vloeistof in een tank, waarin de pH met 30%

NaOR op pH

6.6

(19) wordt gebracht. Na passeren van een x«k«x~~ filter voor eventueel

gevormd neerslag komt de vloeistof in enige parallel geschakelde kool-kolammen. De

beste inrichting leek ons de helft der kolommen op te laden en tegelijkertijd de andere

te elueren. Uit de afloop kan men proefjes nemen, waarmede men zowel het opladen als

het elueren controleert. Met een stelsel van afsluiters kan men de invoer in de kolommen

- - -

-•

...

20-Na het passeren van de kolommen kan men de vloeistof weggooien; bij

water-tekort is indampen in een guadrupel-effect verdamper voordelig. (9)

Wanneer.de kolommen vol zijn (analytische controle), schakelt men over op andere. Nu wast men de gevulde kolommen in serie (zie c) eerst uit met aethanol om verontreinigingen weg; te wassen (plm. 10% van het gepasseerde volume (1.9». Deze alcohol wordt na passeren weer teruggewoneen in een aparte installatie.

c) De e1utie.

Omdat hierbij een veel kleiner volume door de kolommen passeert (bijv. 10%, vergeleken met de cultuurv1oeistof)(19), kan men, ons inziens, het beste nu alle ko-lommen in serie schakelen. Hierdoor verkrijgt men ook een langere weg en een voordelig~

elutie.

Men kan als vloeistof gebruiken een zoutzuur alcohol-water mengsel van

Hierna worden de kolo~~en door uitwassen met water weer gereed gemaakt voor de adsorptie. Het eluaat wordt met soda op pH

6.5

gebracht.

d) Het indampen en neerslaan.

Dit geschiedt het beete in een _filin~verdamper (: .,Qnder_eenvaç"ywn ) ),':;, waar-uit men tenslotte een concentraat verkrijgt, dat voornamelijk keukenzout bevat, naast streptomycine en wat verontreinigingen.

Door toevoegen van aceten slaat men nu het strptomycine-hydrochloride neer. Dit wordt afgefiltreerd op een raampers. Het filtraat gaat naar de terugwinning van op-losmiddelen. Het hydrochloride wordt gedroogd op roestvrij stalen bakken, omdat bij het neerslaan met Oa01

2 geen vocht aanwezig mag zi jn (10). e) Neerslaan als dubbelzout; drogen.

De voordelen van het neerslaan met CaCl

2 zijn reeds op pag.11 besproken. Aan de absoluut-alcoholische oplossing van het hydrochloride wordt, na af-filtreren van het keukenzout op een roterend drukfilter, nu een absoluut-alcoholische

...

21-,oplossing van CaCl

2 toegevoegd. Het complexe dubbelzout slaat nu neer. Het wordt over

een raampers afgefiltreerd en gedroogd op roestvrij stalen bakken in een vacuum droger.

ad

4.

Verdere zuiverihg.

Over deze zuiveringen is zeer weinig bekend. Het passeren van een biologisch

filter is een van de voornaamste bewerkingen.

Men gebruikt hier pyrogeen-vrij water.

ad 5. Afwerking.

In dit deel wordt onder streng-steriele condities gewerkt. Hi,ertoe zijn o~a.

u~tra-violet lampen opgesteld en wordt bes~etting door menielijke aanraking vermeden. Het gezuiverde dubbelzout, nu opgelost in pyrogeen-vrij water wordt in be-vroren toestand gedroogd en gemalen in kleine roestvrij stalen kogelmolens.

Hierna volgt de verpakking~Bpoeder of het vullen van amnullen, na oplossen

in pyrogeen-vrij water.

E. Capaciteit en globale berekening der hoeveelheden en afmetingen.

Voor de aanname van de productie-capaciteit van de fabriek, stonden ons alleen de

op pag. 11 genoemde gegevens ter beschikking. Aannemend, dat het verbruik in Neder

-land de laatste twee jaren is verdubbeld, zal een productie van 5000 kg./jaar

vo1-doende zijn. Indien we nu verder aannemen, datwij, met~een goede geselecteerde stam

(zie pag.

5)

een opbrengst van 1000~g/ml. kunnen bereiken, dan moet dus jaarlijks

een hoeveelheid vloeistof van 5 x 10

6

1. verwerkt worden; wanneer we een rendement

van

80%

aannemen en de hoeveelheid vloeistof vbbr filtratie van het mycelium op

10%

meer stellen, wordt dit:

~

x 5 x 1.1 x 106

=

6.9 x loP l./jaar.

Indien we nu, in verband met schoonmaken en vervangings-werkzaamheden,

~50 werkdagen per

Als we

jaar aannemen, dan moet er dus worden verwerkt ,6.9 x 106.. =plm. 2xi.041./e'trl

~50

de fermentatieduur in de productie-ketel op

4

etmalen a~emen (cfr.

"

22

-4

redelijke vloeistof-inh~ud voor'deze ketel 5 x 10 1. nemen, dankunnen we dus wer-ken met twee zulke ketels; dan moeten we er dus elke 2t dag een inzetten om aan de productie van 2 x 10

4

l./etmaal te komen.

Onder andere in verband met schuimen, vullen we de ketels voor iets meer dan de helft. We gaan uit van een hoeveelheid cultuur-vloeistof van 250 mI. uit een

kolfje (pag. 14). Om mu het volume geleidelijk met een factor vanplm. 20 (pag. 15) te vergroten, brengen we dit eerst op 125 1., vervolgens op 2500, en tenslotte in de productie-ketel op 50.0001. Achter deze zetten we een buffer-tank van 100.000 1., waarin wedus de voorraad van 5 dagen kunnen bewaren.

We nemen aan, dat de tussentanks (pag. 17) drie dagen draaien. Voor een, mede hieruit volgend, schema van vullen en leegmaken der ketels, zie bijgaande

gra-riek.

Voor het filtreren van d~ultuur-vloeiatof, waarbij we van een

filter-hulp gebruik maken (zie pag. 18), zal een Sparkler druk-filter met horizontal& pla-ten geschikt zijn, evenals voor de nog volgende filtraties (No's

7

b ,

8

d , ge , led).

Stel,dat het volume door het filtreren en wassen door deze filters, alsook dus de toevoeging van zuur en later loog, gekomen is op 2.2 x 104 l./etmaal.

Uit deze hoeveelheid mloeistof moet nu het streptomycine aan actieve kool

geadsorbeerd worden. Aangezien in onze vloeistof een vrij hoge concentratie

strep-tomycine is aangenomen, kunnen we ook de hoge adsorptie-capaciteit van 18000 g/gr. (pag. 19) van de kool aannemen. In de vloeistof is 18 kg. streptomycine aanwezig. 2 x 1041. cultuur-vloeistof - 10% van dit volume aan mycelium

=

1.8 x 1041. vloei-stof. Concentratie van het streptomycine 1000;ug/gr. Per etmaal moet dus 1000 kg. kool gebruikt worden. Het leek ons het beste deze hoeveelheid kool te verdelen over

twee batterijen. Terwijl in de ene de adsorptie plaats vindt, karyde andere

uitgewas-sen en ge~lueerd worden. De adsorptie kan b.v. in 12 uur tijd plaats vinden. Per

i

van de kool (eigen laboratorium-bepaling), moet het totaal volume v~een bat-terij zijn

4

x 500 1. - 2000 1.

Stel', dat een batterij bestaat uit vier kolommen, dan moet het volume ,

van een kolom gelijk zijn aan 500 1. Door een kolom passeert dan:

t

x

t

x 2.2 x 10

4

1./12 uur

~

0,275 x 10

4

1./12 uur

=

230 l./uur. Stel nu nog, dat de

doorstroom-snelheid 0,1 1./cm2/uur bedraagt, dan vol(';t hieruit, dat de doorsnede van een

ko-lom gelijk is

aan~f

cm2

=

plm 0.20 m2 , zodat de hoogte 2,5 m. moet zijn.

Nu worden de kolommen uitge\'lassen met

96%

aethanol in een hoeveelheid, die gelijk is aan 10% van de oorspronkelijke hoeveelheid vloeistof (pag. 20), dit is dus 2,2 x 10; l.petmaal. Deze alcohol wordt afgevoerd naar een installatie om

de alcohol weer terug te winnen. Vervolgens wordt ge~lueerd met een zoutzuur-alc

ohol-water mengsel, weer met een hoeveelheid, die 10% bedraagt van de oorspronkelijk

door-gevoerde hoeveelheid vloeistof. Aangezien ons over de verhoudingen in het elut1emengsel niets bekend is, hebben we aangenomen, dat hierbij 50%-ige alcohol gebruikt wordt. Deze aanname i~odig, om straks een berekening te kunnen maken bij het terugwinnen van de aloohol. Bovendien houden we nu,na indamping (zie onder), een waterige

oplos-sing over. Het eluaat wordt geleid naar een buffert ank' en de kool uitgewassen met

water.

In twee kengketels wordt nu tenheutralisatie een 10%-ige soda-oplossing

toegevoegd (pag. 20) en wel 10 l./etmaal. Deze hoeveelheid i~epaald uit d~olgende, zeer ruwe berekening;

neem aan, dat het eluaat een pH heeft gelijk aan 2,0; dit komt overeen

met 0,1 N HCl. Hieruit vormt zich 0,6 gr./l. NaCl, dus totaal ruim 1 kg. NaCl/etmaal,

zodat ook ongeveer 1 kg. Na2CO;/etmaal nodig is. Deze sodaoplossing wordt

opgesla-r gen in een tank van ruim 50 1., zodat hier een voorraad voor vijf dagen aanwezig is.

De verdamper: we nemen aan, dat het volume tot op 1/20 wordt ingedampt.,

24

-om het strept-omycine en het keukenzout in oplossing te houden. Het volume van 2,2 x 10;1. wordt hier dus verkleind tot op 110 l./etmaal.

Daar het streptomyoine niet te hoog verhit mag worden (pag. 8), wordt in de gebruikte film-verdamper geen stoom, maar warm water gebruikt. Het vacuum

wordt onderhouden door middel van een Nash-pomp. Het afgevoerde alcohol-water mengsel wordt naar de reeds genoemde installatie gevoerd, om de aloohol terug te winnen •.

De ingedampte streptomycine-oplossing wordt opgevangen in twee vaten. Viermaal per etmaal wordt deze oplossing verder verwerkt. De verder opgegeven hoeveelheden gel-den dan ook voor

i

van de hoeveelheid/etmaal.

In een mengtank wordt 88 1. aceton toegevoegd. De concentratie hiervan in het mengsel bedraagt dan dus 80% (pag. 10). De neergeslagen streptomyoine (4,5 kg.) met het keukenzout (ongev.

*

kg.) wordt afgefiltreerd in een raampers. Aannemende,

dat de afmeting van een raam 250 x 250 mm2 is en de koekdikte 15 mm., moeten er, bij aanname van een schijnbaar soortelijk gewioht van het neerslag van

i,

dus 11 platen gebruikt worden. Het neerslag wordt gedroogd met verwarmde luoht. Maken we nu laagjes van 1 cm. dikte en nemen we platen van 300 x ;00 mm2 , dan zijn hiervoor 9 platen nodig. Nu wordt het streptomycine-keukenzout mengsel gebracht in 25 1. absolute aloohol (pag. 20). Het streptomycine lost op, het keukenzout wordt afge-centrifugeerd met behulp van een Sharples-centrifuge.

In de volgende tank wordt nu 25 1. van een oplossing van CaC1

2 in absolu-te aloohol toegevoegd. De hier gebruikabsolu-te hoeveelheden alooho~ijn beide aangenomen,

daar ze in de' litteratuur niet vermeld worden. De benmigde hoeveelheid CaC1

2 is eohter als volgt uit te rekenen:

Voor twee molt.culen streptomyoine is bbn molacuul CaC12 nodig Opag. 9}, dus hoeveelheid CaC12 bedraagt 0,;6 kg. voor 4,5 kg. streutomycine. De opslagtank heeft een volume van 500 1., zodat ook hier weer een voorraad voor 5 dagen aanwezig is.

I

I

_ . _

-- -

25-Het neergeslagen dubbelzout wordt afgefiltreerd in een raampers,

af-metingen der platen weer 250 x 250 mm2 , koekdikt~ 15 mm., dus te gebruiken:

9

pla-ten. Aa ·.nnemende, dat d8Ir de verschillende behandelingen 20% verloren gegaan is,

verkrijgen we hier dus ongev. 4 kg. dubbelzout. Het afgefiltreerde dubbelzout wordt

tot slot gedroogd. Stel afmetingen van een raam

=

400 x 400 mm2 en laagjes van

1 cm. dikte, dan ziJn hier

5

nlaten nodig.

F. Be gebruikte anparatuur

Hieronder volge, voor de overzichtelijkheid een lijst van de gebruikte apparaten

met hun inhoudsmaten. Alle maten zijn vol o~gegeven, dus geen rekening houdend met

de normale vulhoogte.

Het geschiktste materiaal voor de ketels is roestvrij st~al (b.v. type

;04;

de in Nederland gebruikte benaming is

18/8,

dUB

18%

Cr en

8

%

Ni bevattend).

De ketels, die niet met cultuurvloeistof of corroderende vloeistoffen in

aanraking komen, zoals b.v. ketels voor kool en filterhulp, kunnen van gewoon constructie-staal uitgevoerd worden.

De fermentatie-ketels, warmte-uitwisselaars e.d. zijn geisoleerd met li"

magnesia-blokken. Apparaat Inhoud in 1. 1. Eerste fermentatie-ketel 12 a. kool-kolom

1.5

b. warmte-uitwiaaelaar c. anti~schuim vaatje 2. ~weede fermentatie-ketel 250 a. kool-kolom

,0

b. warmte-uitwisselaar c. anti-schuim vaatje

~---

._~--- -- 26 -Apparaat Inhoud in 1-). Derde fermentatie-ketel 5000 a. kool-kolom 700 b. warmte-uitwisselaar c. anti-schuim vaatje

4.

Productie-ketel 100.000 a. kool-kolom 10.000 b. ",armte-ui twisselaar c. anti-schuim vaatje d. kook-ketel 50.000 e. warmwater-ketel 50.000 f. cultuur-vloeistof-koeler g. loogveatje 500 5. Buffer-ketel 100.000 6. Grondstof-mengketel 10.000 7. filterhulp-mengketel 6000 a. fil terhuln-voorraad 5000 b. Sparkler-filter ,~

.

a. pH-instelketel 500 b. 11 11 11 c. zuurketel 400 d. Snarkler-ketel

9.

af b, c. Koolmengketels 500 d. kool-voorraad 6000 e. Snarkler-filter 10. a, b. pH-instelketels 500

I

..

c. loogketel

400 d. Sparkler-fil ter

- 27 -Apparaat Inhoud in 1. 11. a

,

b, c, d. Kool-kolommen 500 e. alcohol-ketsl 2000 f. elutie-vloeistof-ketel 2000 12. Buffer-ketel 2000

13·

a, b. Soda-mengketels ₇₅ " v. soda-ketel ₅₀ 14. a. Verdamner b, c. ontvangers ₃₅ p. Nash-pomn l ~ 15. Aceton-mengketel 100 ,. _{a. aceton-ketel} r 500 b. filterpers 16. Droogkast

17.

Oploeketel 50 a. alcohol-ketel 500 b. SharpIes centrifuge 18. CaC12-mengketel 100 a. CaC1₂-oplossing-ketel 500 b. filterpere 19. Droogkaet

20, 21, 22. Terugwinning van oplosmiddelen: zie bij tekening deel 11

Compreseor

..

- 28

-LITTERATUUR-VERWIJ7.INGEN

(1) Prat~. , and Dufre9n~ Antibiotics.,L Phi1ade1nhia, 1':)49. (2) Flore, et al., Antibiotica, Oxford 1949.

( 3) Carter_z H.E. z et al., J. Biol. Chem., 160, 337, (1945).

(4 ) Schatz_l Bugie and Wakaman, Proc. Soc. Exp. Bio1. Mad.,

.22,

66 (1944) ..

( 5) Woodthor2e. D.M·1 and Sealand.

J.

Gen. Microbi01.,

1,

)44, (1947).

(6) Porter. R.W., Merck report, ~, July 1947.

(7) Leel S.B., Ind. Eng. Chem., 41,1868, (1949) en 4?, 1955, (19~H).

"

}

(8) Silcox, H.E., and Lee, Ind. Eng. Chem., 40, 1602 (1948). (9) Porter, R.W., Chem. Eng.,

2.2

(10),94, (1946).

[

)

(10) Prescottl S.C., and Dunn, Industria1 Microbio10gy, 1949.

(11) Silcox, H., C.n;em. Eng. Newa, 24, 2762, (1946).

(12) Wakaman, S.A., and Schatz, U.S.P., 2.499.866 (21 Sept. 1948). (13) Brit. P., 650.187 (14 Mei 1951).

(14) Colingaworth. z D.R., U.S.P., 2.504.067 (11 April 1950).

(15) • (2)

{/6) ,~A, o,~t.:~ er ~r./.~ c.-aI ?/.. Z>. (}"d0C.~~ IJ ... '/'

P.

,53/.

:;-07 (

;72",. 3" ~o;y.J.

(17)· Sheeham, J.C., and Tish1er, U.S.P., 2.480.611 (30 Aug. 1949). (18) Wakaman, S.A., Streptomycin, 194 •

(19) Babson. R.D., and Tiah1er, U.S.P., 2.521.770., (12 Sept. 1950). (20) Inakeeo, P.C., et al., Ind. Eng. Chem., ~, 1488, (1951) •

Inleiding.

-Ivei

t

-29-Berekening van de drukverhoudingen in de persluchtleiding en van

de afmetin~en van de luchtvoorwarmer.

-= , !lz.O

dW

"

1

·-

'

" ---'.

'

M ij "·13': j,;-() / ',I'

Zoals op pag. 16, alsmede op de grote tekening en on bovenstaande schets is te zien, wordt er in de ketels lucht geblazen en wel 1/4 1./1. cultuur-vloeistof/min.

Ik heb me nu ten doel gesteld, om enige berekeningen uit te voeren om-trent het systeem, dat via een luchtvoorwarmer en een ~ool-kolom twee ketels, ieder met een inhoud van 50.000 1. van lucht voorziet (efr. pag. 16.).

We denken ons even in, dat de comoressor slechts lucht levert voor dit systeem, dat tenslotte in werkelijkheid meer dan 90% ervan consumeert.

We veronderst,ellen,. dat de uitwendige tem'Jeratuur overal15°C.( = 59° F.) is en dat ook het koelwater deze temperatuur heeft.

We zien nu dus achtereenvolgens:

1. Compressor; deze zuigt 1ueht aan uit de omgeving en perst ze samen tot? ata.

2. Luchtkoeler; deze koelt de door comnressie verwarmde lucht af tot practisch

15°

C.; hij bezit een vochtafscheider en wordt verondersteld een verwaarloosbare luchtweer-stand te bezitten.

). Voorwarmer; hierin wordt de, doorgaans aan water verzadigde (zie verder), lucht met stoom in gelijkstroom verwarmd; zoals we later zullen zien, is een verwarming van 15° naar ?5° C. wenselijk. Ook hier een verwaarloosbare luchtweerstand.

I

I

.

-;0-4. Koolkolomj hier passeert de lucht een kool-bed van 6,25 m hoogte en 8-14 mesh

korrelgrootte (zie pag. 16.). Er treedt een drukverval oP, dat plm. 0,15 atm. blijkt

te bedragen (zie verder), en dientengevolge een tem~eratuur.daling; daar de lucht

was opgewarmd, is toch g~en condensatie te verwac~ten.

5.

Automatische regelkleu; deze regelt de luchttoevoer zb, dat de juiste hoeveelheid

lucht in de ketel wordt geblazen. Stel, volkomen arbitrair, de drukverlaging hierbij 0,35 atm.

6. De twee productieketels; hierin wordt de lucht door zeer nauwe gaatjes in de

vloei-stof ge~erst; neem drukverval hierbij aan o~ 0,5 at~.

Daar men graag een 1/2 ato in de ketel houdt (o.a. voor steriel houden),

en de vloeistof kolom

4-5

m bedraagt, is de druk, waarmee de lucht in de vloeistof

komt plm. 2 ata.

Vochtgehalte van de gecomprimeerde lucht.

tdd·~

Bij benadering geldt, dat de maximale hoeveelheid vocht per volume wordt

bepaald door ·de temperatuur. Iaothermische compressie leidt dus altijd tot een

verho-Pn

ging van de relatieve vochtigheidsgraad, en wel met een factor Pv ' als Pv.de absolute druk vbor, en Pn deze nà compressie is.

In het systeem compressor+ koeler, waarin \'le onder de boven beschreven

condities (150 C.) bij benadering een isothermische compressie realiseren, zal het

vocht-gehalte dus driemaal zo groot worden.

Indien de lucht dus in de compressor komt met meer dan 3~% relatieve

voch-tigheid - en dit zal meestal het geval zijn - dan is hij na comnrimeren en koelen

ver-zadigd.

We kunnen dus veilig ~eronderstellen, dat de lucht bij 150 0., met ~ ata

--~---~-I I •

-31-·Druk - en temperatuur-verval in de kool-kolom.

De t wee ketels samen consumeren lnO~QQQ 1 /

•

m~n ~.

=

25 m

3/·

m~n.= 1500 m/ ua, ~I

4

gerekend bij de uitstroomdruk 2 ata.

DUB in de kool-kolom komt 16,67 m)/min bij ? ata.

De diameter van de kolom is 1,5 m., dus het onpervlak is 1,8 m2 • DuB

door-stroom-snelheid

~

=

9,27

m./min. :

;0,4

ft./min.

1,0

Perry (pag.

1314)

geeft nu voor kool van

8-14

mesh: gewicht

30

lbs/cub.ft ••

Dit geeft een "bed density" van 6,25X ~,28X~0

=

615 lbs/sq.ft ••

Nu geeft lineaire extrapolatie van een tabel van Perry (pag. 1;14) voor

615 lbs/Bq.ft. nbed density" en 30 ft/min. 'stroomsnelheid een drukverval van plm. 50

in. water; daar deze geldt voor

4-14

mesh, zal het drukverval voor

8-14

mesh wat hoger

zijn, bijv.

60

in.~ 152 cm. water, d.i. plm.

0,15

atm. drukverlies door de gehele kolom.

Nu kunnen we de t.emneratullr-daling berekenen, veronderstellend adiabatische

expansie van

3

tot 2,85 ata.

Hiervoor geldt (21)

T2 =(P2)

Kyl , waarbij

K.

ongev.

1,4

voor lucht.

Tl PI

Hieruit volgt: log ~i ~ 0,286 log 0,95 dUB-~ ='0,985. Dit betekent, dat in de buurt

-1

van

;00

0

_K

_{de temperatuur-verlaging nIm.}

₄

0

_C

_bedraagt.

Berekenen we nu meteen, on dezelfde wijze, de daling, indien we

adiaba-tisch expanderen van; tot 2,50 atm., dus tot na de regelklep. Want ook hier zou veel

condensatie nog schadelijk kunnen zijn. Hiervoor geldt dus:

log T2

=

0,286 log 0,834

Tl

We krijgen nu twee effecten, die elkaar tegenwerken:

1. Vochtafscheiding door afkoeling. Bij 4° C daling plm. ~5% eruit, indien tevoren verzadigd; bij 15° a daling vlm.

65%

eruit.

2. Expansie, dus onverzadigd worden van de damp; bij expansie tot 2,85 ata, tot 95% rel. vochtighei~ bij expansie tot 2,50 ata, tot 84% rel. vochtigheid.

Dit laatste effect ie due veel kleiner, dan het eerste en kan bij onze globale bere-kening verwaarloosd worden.

Om nu dus aan de veilige kant te blijven, concluderen we, dat een voor-verwarming van minstens 150 C, liefst van 20° a gewenst is.

Berekening van de voorwarmer.

Deze zal nu dus 16,67 m?/min. bij; ata moeten o-pwarmen van 15° tot~P

c.

We kunnen hiervoor dus beat afgewerkte stoom van 1000 _{a nemen, die dus vochtig bij}

1000 a weer uittreedt.

a) Globale berekening. / j -~ (~J

"

7'-Neem aan, dat het Reynolds-getal plm. 4000 is, dus

tur-LJ!-

'iJ- .':/~';

.: bulente stroming in de koel buizen.

De logarithmisch gemiddelde temperatuur tussen

/iJt) oef

I

1.:' .": ~- // :.~ De logarithrnisch gemiddelde temveratuur tussen +---+-I---P-3~'

"é'1j

j-

"1

'

-1 - - - , - - - -1 65° en 850 C

=

75,20 C

= 168

oF.

Nu weegt vochtige lucht van 74° F: 1,19 g./l. bij 1 ata, dus ?,57 g./l. bij? ata. Invoer: 16,67 m?/min.

=

1000 m?/hr

DUB gewicht : ?,57~ 1000

=

;570 kg/hr

De soortelijke warmte bij contante druk is hier: 0,25 kcal/kg.oa.

Dus voor 200 a temperatuur-verschil ;570 X 2()~ 0,25

=

17900 kc al. /hr

•

·~-_._--~

De oondensatie-warmte van water is 5~9 koal./kg.

Dus we verbruiken 17900

=

~),2 kg. stoom/hr •

5~9

A

=

Q waarin A verwarmend onpervlak in sq.ft.

U4t

Q warmte-hoeveelheid in B.T.U./hr.

U over-all co~ffi4ient in B.T.U./sq.ft.oF.hr.

t temperatuur-verschil in 0 F.

stellen we voorlopig U

=

6

Dan A

=

71.200 _ 70,6 sq. ft.

6 X 168

Nemen we nu stalen koelbuizen van de volgende afmetingen:

uitwendige diameter 0,67'5 "

inwendige ti _{0,49~ ti}

wanddikte

inw. oppervlak 0,129? sq.ft. /ft.

dwars doorsnede 0,00211 Bq.ft.

Stellen we nu, dat alle lucht door ~èn buis ging, dan was de snelheid

van de luchtstroom: 25,~15XIOOO

=

167,~ 105 ft./hr.

0,00211

Nu is het Reynolds getal: Re - Di

V;O

~

Waarin Di inwendige diam. in ft.

v

snelheid in ft/hr

J

diohtheid in lb/cu.ft. ~ absolute viscositeit lb/ft.hr .Q.4~; X 167 ,~XI05)\0,0742 Dus Re

=

t _ 11,6X 105 0,044

- - - -

---

---_.

Indien we nu on een Re aansturen van minstens 4000, dan is het aantal buizen:

:: 290 buizen.

Nu geeft Downingtown's catalogus voor een lichaam van 12" diameter 241 buizen. Dit nemend, wordt Re _ 4800.

Per ft. lengte is nu het verwarmend opnervlak:

Het totale verwarmende opryervlak was 70,6 sq.ft.

Dus lengte van de afzond,erli jke buizen: ~~:8

::

2,? I .

De snelheid in de buizen is nu : 167.3 105

=

6,98Xl04 ft.jhr.

241 Berekening over-all coefficient.

Deze hadden we in het vorige op

6

aangenomen, afgaande op een schatting

in Perry betreffende dit geval.

Voor de nauwkeurige berekening, gaan we nu alsvolgt te werk:

We kunnen de U opbouwen uit de verschillende thermische weerstanden door de verschil-lende lagenl

U

=

- -

- -

-

- -

1

-

_

.

_---uitwendige dia~eter in ft.

wanddikte in ft.

k thermische geleidbaarheid van staal.

--·C'~..,dc~(.--'~t''' /

." ~ . . ',' _.r'~a,~-7, /fl..?

r.

')

'.

.

/ (..v-n&.t.~

_ •• ~--:;- /" ;:> " . . ~ ' .

J

---

- - - _ . _ - - ' - - -

-,~

•

-;5-. "

Uitleen eerste bereking, op dezelfde wijze als onderstaande, met een aangenomen tem~

I

peratuursverschil, konden we nu deze waarden corrigeren tot de bovenstaand" die nu

• zo weinig van de juiste zullen afwijken, dat er practisch geen verschil in de daaruit

berekende U is •.

Nu volgen afzonderlijk de berekeningen van de verschillende delen,

waar-•

in we U hebben gesplitst.

h

_i• Deze inwendige film-co&fficient berekent men uit: Nu

=

f

(Re)0,8(pr)P~333,

waar-bij: Nu

=

_{Nusselt-getal: hiDi Re}

==

_{Reynolds-getal: Di v)'}

-k- _~

Pr

=

_{Prandtl-getal: cp ',J,L}

/

k

Hierin zijn alle termen die van lucht bij de film-temperatuu, 2080 _F.

~oor

_de

co~ffi-cient

f

en de exponent van Pr zijn die, bepaald door Colb'urn genomen (22); hierbij

is

f

=

0,023.

Nu hieruit h i oplossend en de waarden uit Bro ... m en Marco (2;) invullend,

krijgen we:

De factor: l,l~l ~~ log Do ,waarin k : 2~ voor staal; ~it is de wand-co~fficient •.

k Di

Deze wordt dus: 1,15l XO,OGl

l2X26 log

O

(),

'

É

9

7

'5 5 = 4,6X10-5.

t

dit is de co~fficient van de wand-aanslag aan de stoomzijde. Deze nemen we aan

p 500 •