Napięciowa zależność kinetyki prądów GABA ergicznych mierzonych przy różnych wartościach zewnątrzkomórkowego pH

Napięciow a zależność kinetyki prądów GA BA ergicznych

mierzonych przy różnych wartościach

zewnątrzkomórkow ego pH

M aria Pytel, Katarzyna Mercik, Jerzy W. M ozrzym as

Sam odzielna Pracownia Biofizyki Układu N erw ow ego Katedra Biofizyki

Akadem ia M edyczna we W rocławiu

Streszczenie

Zm iany w artości napięcia błonowego i stężenia jo n ów wodorow ych to jedne z najbardziej powszechnych czynników m odulujących układy biologiczne, szczególnie komórki nerwowe. W iele doniesień literaturow ych w skazuje, że zarówno potencjał błonow y jak i zmiana stężenia jo nó w wodorow ych w pływ ają na kinetykę prądów GA BAergicznych, ale zagadnienie rów noczesnej modulacji przez oba te czynniki nie zostało zbadane. W niniejszej pracy dokonaliśm y opisu wpływu napięcia błonowego i zew nątrzkom órkow ego pH w zakresie od 6.0 do 8.0 na kinetykę receptora G ABA a . Otrzymane wyniki w skazu ją na brak istotnego wpływu napięcia na kinetykę odpowiedzi prądowych mierzonych w kwaśnym pH, natom iast silna m odulacja przez napięcie dotyczyła odpowiedzi prądow ych rejestrowanych w pH=7.2 i 8.0.

Sło w a k lucz o w e : rece ptory G A B A a , patch-clam p, na pięcie błon ow e, pro to ny

Lokalne zmiany pH i napięcia błonowego są jednym i z podstawowych

i uniw ersalnych czynników modulujących kanały jonow e. Receptory G A BAa

w w arunkach fizjologicznych dobrze przepuszczają jo n y w odorow ęglanowe, których przepływ zm ienia lokalne wartości pH w bezpośrednim otoczeniu receptora [3]. Szczególnie w stanach patologicznych takich jak niedotlenienie czy udar mózgu, m oże dojść do wahań w pobudliwości błony komórkowej i istotnych zmian w wartości zew nątrzkom órkowego pH. Doniesienia literaturowe wskazują, że receptory GA BAa czułe są zarówno na zm iany pH roztworu zew nątrzkom órkow ego [3-6, 11,12, 14] i wartości potencjału *

Pra ca d ofin an so w a na p rze z W ellcom e T ru st Internatio nal Se nio r R ese arch Fe llow ship in B iom edical S cien ce (G ra nt N r 0 7 0 2 3 1/Z/03/Z).

błonow ego [9, 13]. Badania przeprow adzone ostatnio w naszym laboratorium wskazują, że protony [11] i napięcie błonowe m odelują bram kowanie receptora

GA BAa [13], przy czym w obydwu przypadkach m echanizm m odulacji,

związany był z wpływem na kinetykę desensytyzacji i w iązania agonisty.

Zagadnienie równoczesnej modulacji kinetyki receptora G A BAa przez te

czynniki je st o tyle ciekawe, że zarów no w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych dochodzi do równoczesnych zmian napięcia błonowego i stężenia jo nó w wodorow ych, a nie jest jasne czy te efekty m odulacyjne są addytywne czy też m odulacja przez jeden z tych czynników je st uzależniona od działania drugiego. Żeby udzielić odpowiedzi na to pytanie, przeprowadzono badania nad rów noczesnym wpływem napięcia błonow ego i zmian stężenia jonów wodorowych w roztworze zewnątrzkomórkowym na kinetykę receptora GA BA a.

W szystkie pom iary wykonane były na hodowli komórek nerwowych z hipokam pa szczura przy użyciu techniki patch-clam p i systemu ultraszybkiej perfuzji. Do opisu zm ian konformacyjnych zastosowano model Jonesa i W estbrooka, który zakłada istnienie dwóch identycznych i niezależnych miejsc wiążących na receptorze oraz stany konformacyjne zam knięty (A 2R), otwarty (A2R*) i zdesensytyzow any (A2D). Szybkość przejść pomiędzy stanam i opisana jest przez odpow iednie stałe kinetyczne [2].

Jak to wykazali Pytel i wsp. [13], wielkości am plitud odpowiedzi prądowych wywołanych nasycającym stężeniem GAB A (10 m M) mierzonych przy pH=7.2, w ykazu ją silną zależność od napięcia na błonie, przy czym zależność ta ma charakter dokom órkowego prostow ania (nachylenie wykresu I-V przy potencjałach dodatnich je st mniejsze niż przy potencjałach ujemnych). W celu spraw dzenia w jak i sposób zmiany w wartości pH w pływ ają na prostowniczy charakter zależności prądow o-napięciow ej, wyznaczono zależność I-V dla odpowiedzi prądow ych mierzonych przy pH =6.0, 7.2 i 8.0. Jako stężenia nasycającego dla pH=7.2 i 8.0 użyto lOmM GABA, natom iast dla pH=6.0 użyto 30 mM GABA [11]. Pomiary odpowiedzi prądowych na ultraszybkie aplikacje GABA zostały wykonane w zakresie pH od 6.0 do 8.0, przy potencjałach błonowych z przedziału od -70 do 70mV. Przeprow adzone badania pozwoliły stwierdzić, że zależność prądowo-napięciowa dla pH=6.0 była bliska liniowej (ryc. IA), natom iast zarów no w pH=7.2 i 8.0 (ryc. IB) zależność wykazywała właściwości dokom órkow ego prostowania, przy czym efekt ten był silniejszy w przypadku pH=8.0. W yznaczony potencjał odwrócenia dla całego zakresu pH był bliski 0 mV, co zw iązane jest z faktem, że stężenie jo nó w chlorkowych w roztworach wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym jest bardzo zbliżone. Dla każdej komórki z osobna wyliczono stosunek kąta nachylenia charakterystyki I-V otrzymanej dla potencjałów dodatnich do nachylenia zależności

prądowo-napięciowej dla potencjałów ujemnych. Średnie wartości względnego nachylenia zależności wyniosły odpowiednio: 0.96 ± 0.04 (n=3, p>0.05) dla pH=6.0, 0.71 ± 0.04, (n=7, p<0.05) dla pH=7.2 i 0.59 ± 0.08 (n=4, p<0.05) dla pH=8.0 (rys. 1C). Wyniki te wskazują na m onofoniczną zależność wielkości dokom órkow ego prostowania od wartości pH (Rye. 1C).

A pH 6.0 В pH 8.0

_{« с}

»

R yc. 1. P rzyk ładow e w ykresy zależn ości am plitudy odpow iedzi prą dow ej na na sycające stę żenie G AB A od w artości po tencjału błonow ego d la p H =6 .0 (A) i pi 1=8.0 (В). С - Ś redn ie w artości nachylenia zależnośc i prą dow o-nap ięcio w yc h m ierzonych dla po te nc jałów do da tnich w zględem potencjałów ujem nyc h przy w a rtościach pH z zakresu od 6.0 do 8.0. G w iazdki w sk az ują na istotn ą statys tyc znie róż nicę w o dnies ieniu do w a rtości otrzym anych dla p otenc ja łów ujem nych.

Prostowniczy charakter zależności prądowo-napięciowej odpowiedzi prądowych m ierzonych dla pH=7.2, według Pytel i wsp. [13] był konsekw encją modulowania procesu desensytyzacji. Ponadto M ozrzymas i wsp. [11] wskazali, że kinetyka desensytyzacji jest w dużym stopniu m odulowana przez zmiany stężenia jo nó w wodorowych. Zatem zależność zjaw iska dokomórkowego prostowania od wartości pH może być spowodowana zmianam i w kinetyce desensytyzacji odpowiedzi prądowych mierzonych przy różnych w artościach pH i napięcia błonow ego.

Pam iętać należy, że w stanie zdesensytyzowanym receptor je st nieprzepuszczalny dla jon ów i równocześnie jest nieczuły na działanie agonisty. W warunkach doświadczalnych proces desensytyzacji ujawnia się podczas długiej (np. 100 m s) ekspozycji receptora na nasycające stężenie GABA. Odpowiedzi prądowe w ywołane 100 ms aplikacją nasycającego stężenia GABA charakteryzowały się szybkim czasem narastania (aktyw acja receptorów) i powolnym zanikiem (związanym z desensytyzacją) aż do osiągnięcia wartości stacjonarnej (stedy-state). Kinetyka zaniku odpow iedzi prądow ych miała dw ufazowy charakter, co można opisać przy użyciu dw óch stałych czasowych,

w warunkach kontrolnych (pH =7.2) stałe czasowe szybka i wolna wyniosły odpowiednio xfast=2.41±0.17m s i xsi„w=126±7.5ms. W skali czasowej zdarzeń synaptycznych pow olna składowa desensytyzacji (xsiow) nie w pływ a na kinetykę

zaniku prądów synaptycznych, dlatego analizę procesu desensytyzacji

ograniczono do szybkiej składowej (xfast), która je st dom inująca w czasie do 50 ms po osiągnięciu przez odpowiedź prądow ą maksymalnej amplitudy.

A 30mM GABA, pH 6.0 В 10 mM GABA, pH 8.0 С

6-R y c. 2. Z no rm aliz ow ane od pow ie dz i prądow e w yw ołane 100 m s a plik a cją na sycająceg o stę żen ia G A B A re je strow an e p rzy p ote nc jale błono w ym -7 0 i 7 0 m V dla p H = 6.0 (A) i p H = 8.0 (B). Po niew aż p rze bieg i p rą dow e m ierzon e d la pH =6 .0 (R yc. A) nie ró ż n ią się z nacząco , dla uzy ska nia w iększej przejrzys tośc i z ostały prz esun ięte w zględem siebie. С - P oró w na nie śre dnich w artości stałych czas ow y ch de sens ytyza cji od pow ied zi prądow ych m ierz ony ch przy p ote nc jale -7 0 i 70 m V dla pH z za kresu od 6.0 do 8.0. G w iazdki w sk az ują n a istotn ą staty styc zn ie ró żn ic ę w o dnies ieniu do w artości otrzym anej dla po ten cjału ujem nego.

W celu zbadania równoczesnego wpływu pH i napięcia na kinetykę desensytyzacji, odpow iedzi prądowe wywołane 100 ms aplikacją nasycającego stężenia GABA w pH=6.0, 7.2 i 8.0 m ierzone były przy potencjałach -70 i 70 mV. K inetyka desensytyzacji odpowiedzi prądowych m ierzonych przy potencjale błonow ym -70 mV wykazywała m onotoniczną zależność od pH - w kwaśnym środowisku zewnątrzkomórkowym doszło do spow olnienia stałej czasowej desensytyzacji ( х ^ ) , natom iast w środowisku zasadow ym Xfast została przyspieszona w porów naniu z w artością m ierzoną dla warunków kontrolnych (pH =7.2, podobnie ja k donosi Mozrzymas i wsp. [ I I ] ) . Zm iana napięcia

błonow ego na dodatnie spow odow ała przyspieszenie stałej czasowej

desensytyzacji (Xfast) w całym zakresie badanych wartości pH, ale przyspieszenie istotne było tylko dla odpow iedzi prądowych mierzonych dla pH=7.2 i 8.0 (ryc. 2C). Średnie wartości stałych czasowych desensytyzacji odpowiedzi prądow ych m ierzonych przy potencjale -70 i 70 mV wyniosły odpow iednio: dla pH=6.0 Xfast

= 5.1 ± 0.3 ms dla V m = -70 i xdes = 4.3 ± 0.1 ms dla V m = 70 mV (n=3, P>0.05; ryc. 2C), dla pH=7.2 xfast = 2.6 ± 0.1 ms dla V m = -70 i xfast = 1.9 ± 0.1 dla V m =

pH 6.0

■ ■ ■ -70 mV (--- I *-70 mV

pH 7.2 pH 8.0

70 mV (n=9, P<0.05) i dla pH=8.0 xf„, = 2.3 ± 0.2 ms dla V m = -70 i xfast = 1.6 ± 0.1 ms dla V m = 70 m V (n=8. p<0.05; rye. 2C).

Poniew aż proces desensytyzacji wpływa na kinetykę narastania

odpowiedzi prądowych, m ożna przypuszczać, że obserw ow ana przy

potencjałach dodatnich zmiana kinetyki desensytyzacji odpowiedzi prądowych m ierzonych w pH =7.2 i 8.0, znajdzie swoje odzw ierciedlenie w zmianie szybkości narastania odpowiedzi prądowych. Zm ierzono odpow iedzi prądowe na krótkie (5 m s) aplikacje nasycającego stężenia GABA w pH=6.0, 7.2 i 8.0 przy potencjale błonowym -70 i 70mV. W pH=6.0 doszło do znacznego spowolnienia szybkości narastania odpowiedzi prądowych w porów naniu z warunkami kontrolnymi (pH =7.2) [I I], ale jed nocześnie zm iana potencjału z -70 na 70 mV nie wpłynęła na szybkość narastania odpowiedzi prądow ych (ryc. ЗА i 3C). O dpow iedzi prądow e rejestrowane w pH =7.2 i 8.0 w ykazyw ały natom iast różną kinetykę narastania przy potencjale ujem nym i dodatnim . Szybkość narastania m ierzona pomiędzy 10-90% m aksym alnej am plitudy wynosiła w pH =7.2 dla potencjału -70 mV 0.24 ± 0.015 ms i 0.20 ± 0.015 ms dla potencjału 70 mV (n = l 1, p<0.05; ryc. 3C), natom iast w pH=8.0 dla napięcia -70mV 0.22 ± 0.013 ms i dla napięcia 70 mV 0.16 ± 0.023 ms (n=4, P<0.05; ryc. 3C).

Hyc. 3. Z no rm aliz ow a ne prz ebieg i prąd ow e rejes trow a ne w od pow ie dzi n a 5 m s aplikację n asycając ego stęż en ia G A B A przy po tencjale błono w ym -70 i 7 0 m V d la p H = 6.0 (A) ■ pH =8 .0 (B ). P on ie w aż od pow ied zi prąd ow e rejestrow an e dla pH = 6.0 nie ró ż n ią się zn acząco , dla uzy sk ania w iększej p rzejrz ysto ści zo stały prz esunięte w zględem sie bie. С - P orów na nie szybkości n arasta nia od po w ied zi prą dow y ch m ierzon ych dla pH = 6.0, 7.2 i 8.0 przy p ote nc jale błono w ym '7 0 i 70 m V. G w ia zdki w s ka zu ją na istotną statystyc znie ró żn ic ę w o dn ies ie niu d o w artości otrzym anej d la po te nc jału ujem ne go.

Zaprezentow ane wyniki wskazują, że napięciow a zależność receptora

g AB Aa silnie zależy od wartości pH roztworu zewnątrzkom órkow ego, ale

efekty te nie są addytywne. Doniesienia literaturow e wskazują, że zarówno napięcie jak i pH w pływ ają znacząco na kinetykę desensytyzacji i wiązania

agonisty [11, 131. Fakt ten może sugerować, że protony m ogą wpływać na strukturę kanału odpow iedzialną za wrażliwość receptora G A B Aa na zmiany napięcia. Wyżej przedstaw ione dane dośw iadczalne wskazują na brak istotnego wpływu napięcia na kinetykę odpowiedzi prądowych m ierzonych w kwaśnym pH. Natom iast silna m odulacja przez napięcie dotyczyła odpow iedzi prądowych rejestrowanych w pH=7.2 i 8.0. Przy alkalizacji środow iska doszło do

wzm ocnienia zjaw iska dokom órkowego prostow ania skorelow anego

z przyspieszeniem kinetyki desensytyzacji. Jak zaproponował M ozrzym as i wsp. [11] am plitudy odpowiedzi prądowych rejestrow anych w pH=8.0 są silnie zredukowane w porów naniu z odpowiedziam i mierzonymi w pH=7.2 przy analogicznej wartości siły elektrycznej napędzającej. W obecności nasycających stężeń GABA stan w pełni związany zam knięty osiągany je st bardzo szybko i zgodnie z przew idyw aniami modelu Jones i W estbrooka [2], kanał ze stanu

związanego zamkniętego może wejść do stanu otw artego lub

zdesensytyzow anego. Proporcje obsadzenia tych stanów określone są przez relacje pom iędzy stałym i kinetycznymi otwarcia ( ß 2) i desensytyzacji (d2). Mozrzymas i wsp. [11] wskazali, że obserw ow ane w pH zasadowym zm niejszenie wielkości am plitudy odpowiedzi prądowych je st prawdopodobnie wynikiem zw iększenia szybkości wejścia do stanu zdesensytyzowanego (d2), w którym to stanie receptor nie przewodzi jonów . O dnosząc tę obserwację do zależności prądow o-napięciowej m ożna przypuszczać, że wzrost właściw ości prostow niczych wiąże się ze wzm ocnieniem procesu desensytyzacji przy wzroście pH. Argum entem przemawiającym za takim m echanizmem m odulacji jest fakt, że przy kw aśnym pH zależność napięciowo-prądow a je st bliska liniowej i m odulacja procesu desensytyzacji przez napięcie błonowe jest słaba,

podczas gdy przy pH zasadowym stw ierdzono w ystępow anie efektu

dokom órkow ego prostow ania zależności prądow o-napięciow ej i silnej

zależności kinetyki desensytyzacji od napięcia. Prezentow ane powyżej dane m ogą wskazywać, że w ejście do stanu zdesensytyzowanego może wym agać deprotonacji m akrom olekuły kanału, stąd słabszy w pływ napięcia na kinetykę desensytyzacji w kw aśnym pH. Alternatywnym m echanizmem pozwalającym wytłum aczyć prezentowane obserwacje mógłby być wpływ rozważanych czynników (n apięcia i pH) na przewodnictwo pojedynczych kanałów . W ydaje się to jedn ak mało praw dopodobne, ponieważ wiele badań wskazuje na brak wpływu pH [6] i napięcia błonowego [1, 7, 8, 10, 15] na przewodnictwo pojedynczych kanałów .

Fizjologiczne znaczenie zm iany napięciowej zależności kinetyki receptora GA B Aa przy różnych wartościach nie je st jasne. M ożna przypuszczać, że m echanizm m odulacji kinetyki receptora GA BAa jedn ocześnie przez napięcie i pH działa na zasadzie ujemnego sprzężenia zw rotnego. Przy kwaśnym pH

sprzężenie ulega osłabieniu czyniąc transm isję G AB A ergiczną bardziej efektyw ną w dodatnich potencjałach (co może m ieć korzystny wpływ w stanach patologicznych, takich jak epilepsja czy niedotlenienie, którym towarzyszy zakwaszenie środow iska zewnątrzkomórkow ego [3]).

Piśmiennictwo

*• B orm ann J., H am ill O .P ., Sakm ann B. (1 987) M e chanis m o f anio n pe rm e atio n through c ha nn els ga ted b y glyc ine and gam m a-am inobutyric acid in m ouse cu ltured spin al neu rones. J. P hysiol. 385: 24 3-28 6.

2- Jon es M .V ., W es tbro o k G .L. (1 995) D esensitized states p rolon g G A B A a cha nnel res pon ses to b rie f a go nis t pulses. N euron 15: 181-191.

K a ila K. (199 4) Ionic b asis o f G A B A a re cep tor c hannel fu nc tio n in the n ervous system . Prog. N eurobiol. 42: 4 89 -53 7.

4- K rishek B .J., A m ato A., C on n olly C .N., M oss S.J., Sm art T .G. (199 6) P roton s en sitiv ity o f the G A B A A re ce ptor is asso ciated with the rec epto r su b un it com p os ition . J. Physiol. (Lo nd on ) 4 9 2 :4 3 1 -4 4 3 .

K rishek B .J., M oss S.J, Sm a rt T .G. (1998) Interaction o f H + and Z n 2 + on rec om b ina n t and na tive rat ne uron al G A B A a re ce ptors. J. P hysiol. (Lo ndo n) 507: 6 3 9 -6 5 2 .

6 ' K rishek B .J., Sm a rt T .G . (2 001) Proton sensitivity o f rat c ereb ella r g ran ule cell G A BA A receptors: d ep en d en ce on neuronal developm ent. J. P hysiol. 530: 219 -23 3.

7 M a J.Y., R eu ven y E., N araha sh i T. (1994) T erbiu m m odu latio n o f single y-am inob uty ric ac id-activa te d c hlo ride ch anne ls in rat dorsal root ga nglio n neu rons. J. N eurosc i. 14: 3835- 3841.

8- M a cd on ald R .L., R ogers C .,J ., T wym an R E. (1989) K inetic pro pe rties o f the G A B A a re ce p to r m ain c on du ctan ce state o f m ouse spinal cord ne uro ne s in cu lture. J. P hysiol. 410: 479 -49 9.

9 M el lor J .R ., R a ndall A.D. (1 998) V oltag e-d epe nde nt d eac tiv ation a nd d es en sitiz atio n o f G A BA resp onse s in c ultured m urine c erebe llar gran ule c e ll s ../. P hysiol. 506: 3 7 7 -3 9 0 . •0. M istry D .K ., H a blitz J.J. (1 990) A ctiva tion o f sub con duc tan ce sta tes by ga m m a-a m ino butyric

acid and its an alogs in c hic k cerebral neurons. P ßugers. A rch. 416 : 45 4-461 .

П . M oz rzym as J.W ., Ż am o w sk a E .D ., Pytel M ., M ercik K. (2 003 ). M od ulatio n o f G A B A a re cep to rs by hy dro ge n ion s revea ls synaptic G A BA tran sien t an d a crucial role o f the de se ns itization pro cess . J.N eurosc i. 23: 7981 -7992.

*2. Pa ste rna ck M ., S m irn ov S., K aila K. (1996) P roton m od ula tio n o f fun c tio na lly distinct G A B A a rec ep to rs in ac utely isolated pyram idal ne uro ns o f rat h ippocam pus. N e u ro p ha rm ac o lo g y 35: 12 79-128 8.

13- Pytel M ., M e rcik K., M ozrzy m as J.W . (2005) M em brane vo ltag e m od ula te s the G A B A a re ce pto r g atin g in c u ltured ra t hippoca m pal ne urons. N e u ro p ha rm ac o lo g y, in press.

14 R obe llo M., B arduzzi R., C upe llo A. (2000) M odulation b y e xtrac ellu la r pH o f G AB A A re cepto rs e xp res se d in X e no pu s o ocytes injec ted with rat b rain m R N A. Int. J. N eurosci. 103: 4 1 -5 1 .

W eiss D .S., B arnes E .M ., H a blitz J.J. (19 88) W hole-ce ll and sin gle-cha nne l rec ording s o f G A B A -g ated cu rren ts in cu ltu red chick cerebral neurons. J. N e uro phy sio l. 59: 4 95-513 .

A d res d o k o re sp o n de n cji: M a r ia P y tel Sam odzie lna Pra co w n ia B iofizy ki U k ład u N e rw ow ego K a tedra Biofizyki A k ad em ia M ed yc zna we W rocław iu ul. C ha łub iń sk ie go 3 50 -36 8 W rocław T eł.: (48 7 1 )7 8 4 15 51 e-m ail: m aja@ b iofiz .am .w roc .p l