Wymagania dla analiz GMO w materiale siewnym
Przygotowanie próbek w analizach GMO
dr Ewelina Żmijewska
Laboratorium Kontroli GMO, Zakład Biotechnologii i Cytogenetyki Roślin, IHAR-PIB
• Dokument powstał na
podstawie ISO 6498:2012
• Procedury zaadaptowano dla żywności, pasz, nasion
• Najważniejsze procedury dotyczą: wielkości próbki laboratoryjnej, techniki zmniejszania masy próbki, rozdrabniania, mieszania
Pobieranie prób
• Etap przygotowania próbki przyczynia się do błędu w oznaczeniu analitycznym
• Błąd próbkobrania jest na ogół znacznie większy niż błędy wynikające z kolejnych procedur analitycznych
• Konieczność zrozumienia możliwych źródeł błędów i sposobów ich ograniczenia
Rozkład w próbie
Homogenny
Próby pierwotne mogą być pobierane z
każdego miejsca w partii bez wpływu na błąd analizy
Heterogenny (najczęstszy)
Niejednorodny rozkład w partii. Próby pierwotne pobierane z różnych miejsc będą dawały niejednorodne wyniki w analizie
Błędy związane z charakterystyką analizowanego materiału
• Błędy wynikające z niejednorodności próbki
• Heterogeniczność składu- różna wielkość cząstek w próbce
• Heterogeniczność rozkładu- niejednorodny rozkład cząstek w próbce
• Stężenie analitu ma wpływ na wielkość błędu (im niższa zawartość docelowego analitu, tym większa
Charakterystyka materiału GM
Heterogeniczność składu
• Rozdrabnianie (kruszenie/cięcie/mielenie) lub inne metody zmieniające fizyczne właściwości próbki
• Mieszanie nie wpływa na zmianę heterogeniczności
Charakterystyka materiału GM
Heterogeniczność rozkładu
• Mieszanie ogranicza heterogeniczność rozkładu prób
Błędy związane z procesem wyznaczania prób pierwotnych
• Wyznaczanie prób pierwotnych generuje błędy próbkobrania
• Błędy te są podstawową przyczyną wszystkich błędów związanych z próbkobraniem
• Błędy te można podzielić na trzy główne typy (Esbensen i Julius, 2010):
– Błąd wyznaczania prób pierwotnych, – Błąd pobierania prób pierwotnych
– Błąd przygotowania prób pierwotnych
Błąd wyznaczania prób pierwotnych
Błąd pobierania prób pierwotnych
Błąd przygotowania prób pierwotnych
• Kontaminacja
Narzędzia używane w czasie próbkobrania
Wyposażenie wymagane przy próbkobraniu
• Narzędzia do pobierania próbek
• Narzędzia do przygotowania próbek
• Narzędzia do czyszczenia
• System suszenia
• System mielenia
• Pochłaniacz pyłów
• System mieszania prób
• Przechowywanie prób
Środowisko pracy
• Norma ISO 24276: 2006
• Specjalnie przeznaczone do mielenia pomieszczenie lub obszar roboczy
• Zasysanie pyłu, czyszczenie na mokro
• Degradacja DNA za pomocą:
- podchlorynu, - kwasu solnego,
- 3% roztworu nadtlenku wodoru,
- gotowych do użycia produktów do usuwania DNA
Środki ostrożności
• Odzież i obuwie ochronne
• Nauszniki lub zatyczki do uszu
• Zachowanie środków ostrożności podczas mielenia, blokady bezpieczeństwa
• Pochłanianie pyłu
• Ochrona dróg oddechowych
Postępowanie z próbką laboratoryjną
• Rejestracja i sprawdzenie próbki laboratoryjnej
• Rekomendowana wielkość próbki
• Reprezentatywne zmniejszenie masy próbki laboratoryjnej
• Opcjonalnie częściowe wysuszenie przed mieleniem
• Rozdrobnienie materiału
• Specjalne procedury dla prób płynnych, oleistych, itp.
• Przechowywanie odpowiednich warunkach próbek przed, podczas i po wykonaniu analiz
Rejestracja i sprawdzenie próbki laboratoryjnej
• Próbka powinna być bez jakichkolwiek oznak uszkodzeń
• Próbka powinna być schłodzona lub zamrożona, jeżeli jest to określone w warunkach wysyłki
• Informacje dotyczące próbki powinny być dostępne i kompletne
• Brak informacji na temat rodzaju próbki, błędne informacje o próbce - powinny być dokumentowane i eliminowane
• W przypadku podejrzenia zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami, próbki nie mogą być analizowane
• Zleceniodawca powinien zostać poinformowany o brakach w dostarczonych próbkach.
Rekomendowana wielkość próbki
Reprezentatywne zmniejszenie masy próbki laboratoryjnej
• Maksymalna masa próbki laboratoryjnej powinna być dostosowana do rodzaju analizowanej macierzy
• Proces redukcji masy musi być udokumentowany
• W niektórych przypadkach należy przeprowadzić
etap wstępnego rozdrobnienia przed redukcją masy
• Rozdrobnienie próbki laboratoryjnej w całości
Wstępne rozdrobnienie próbki
• Gdy cząsteczki "suchej” próbki laboratoryjnej > 6 mm, całą próbkę laboratoryjną należy wstępnie zmielić
• Przed redukcją masy / podpróbkobraniem
• Zalecane jest zmniejszenie masy przy użyciu
dedykowanych urządzeń, np. dzielniki obrotowe, rozdzielacze riffla
• Ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego
Fractional (alternate) shovelling
• Może być wdrożony w laboratorium lub w polu
• Można wygenerować dowolną liczbę podpróbek
• Bardzo niski błąd podziału próbki
• Brak kosztownego wyposażenia
• Minimalne wymagania dotyczące czyszczenia i odkażania
The spoon method/ Metoda łyżki
• Próbka laboratoryjna rozłożona jest w równej, cienkiej warstwie (<2 cm), w kształcie litery S w jednym kierunku
• Powtarza się to następnie w kierunku prostopadłym do pierwszego
• Próbki są pobierane z losowych miejsc, przy każdym z pobrań osiąga się dno zasobnika
The long pile method/ Metoda długiego stosu
• Próbka jest wysypywana z torby i rozprowadzana na płaskiej powierzchni w długim stosie
• Stos powinien mieć długość co najmniej 20-krotnie większą niż szerokość, a wysokość nie powinna przekraczać szerokości stosu.
• Losowo pobierane są przekroje poprzeczne
• Wszystkie te techniki obejmują zwiększenie ilości próbek
• Błędy próbkobrania, wynikające z niejednorodności próbki
• Ustalenie liczby elementów w oparciu o wielkość błędu uznanego za akceptowalny, a nie według łatwości obsługi
• Zasadniczo zaleca się przyjmowanie 10 podpróbek, gdy nie ma wcześniejszej wiedzy na temat heterogeniczności próbki
Zmniejszenie masy próbki laboratoryjnej
Rozdrobnienie materiału (ISO 6498: 2011)
• Cięcie
• Kruszenie
• Mielenie
• Mieszanie (homogenizacja)
• Pulverising
Konieczność rozdrabniania i homogenizacji dla
wybranych matryc
Technika mieszania
• Mieszanie jest często wykorzystywane w celu homogenizacji próbki
• Mieszanie może sprzyjać segregacji cząstek, szczególnie w przypadku materiałów o różnych rozmiarach i gęstościach
• Odradza się:
– mieszania za pomocą szpatułki w górnej części pojemnika z próbką i mieszanie jej kilkukrotne w pionie
– wstrząsania pojemnikiem z próbką, gdy jest pełen lub prawie całkowicie wypełniony. Zaleca się pozostawienie co najmniej jednej trzeciej otwartej przestrzeni w pojemniku
• Mechaniczne urządzenia do mieszania: mieszalnik bębnowy, mieszalnik łopatkowy, itp.
Technika plastikowej torby
• Zmielony materiał umieszczany jest w plastikowej torbie i zamykany
• Połowa torby jest pusta
• Homogenizacja zachodzi poprzez 20 kolejnych obrotów worka
• Przykładowa wielkość worka:
- w przypadku 1 kg próbki mielonej: plastikową torebkę o wymiarach 30 cm na 40 cm
- w przypadku 2 kg próbki mielonej: plastikowa torebka o
Częściowe suszenie
• Przeprowadzane w temperaturze < 55-60 ° C
• Matryce półstałe (próbki o wilgotności < 85% suchej masy, np. żywność)
• Można przeprowadzić za pomocą pieca z wymuszonym obiegiem powietrza lub kuchenki mikrofalowej
• Suszenie w temperaturze> 60 ° C może powodować zmiany chemiczne, mogące wpływać na stężenie DNA w próbce
Specjalne procedury przygotowywania próbek
• Używanie suchego lodu podczas mielenia
• Używanie młynków typu blending, pracujących w odstępach czasowych (minimum 30 s)
• Ogrzewanie lepkich próbek (np. płynna lecytyna, miód), w temperaturze 40-60° C poprawia homogenność próbki i pozwala na uzyskanie reprezentatywnej próbki
• Próbki cieczy są uważane za homogenne, nie wymagają uprzedniej homogenizacji, wyjątek stanowi olej, w
którym DNA występuje w stałych cząstkach, które mogą znajdować się w zawiesinie w cieczy
Świeże tkanki roślinne
• Roztarcie próbek w moździerzu w obecności ciekłego azotu lub przeznaczonych do tego młynkach
• Liofilizacja i zmielenie wysuszonego materiału
Minimalna masa próbki testowej, w oparciu o odchylenie standardowe i rozmiar cząstek
w próbce
Masa próbki, a możliwość analizy ilościowej
Konieczność przeprowadzenia działań sprawdzających
• Mielenie
• Mieszanie
• Czystość obszaru roboczego
