UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ
KATEDRA PATOLOGII
ZAKŁAD PATOMORFOLOGII I WETERYNARII SĄDOWEJ
LEK.WET. IZABELA JANUS
ANALIZA PATOMORFOLOGICZNA LEWEGO PRZEDSIONKA SERCA U PSÓW Z KARDIOMIOPATIĄ ROZSTRZENIOWĄ (DCM) I CHOROBĄ
ZWYRODNIENIOWĄ ZASTAWKI MITRALNEJ (CMVD/MMVD)
PRACA DOKTORSKA
PROMOTOR: DR HAB. MARCIN NOWAK, PROF. NADZW.
WROCŁAW 2017
WROCŁAW UNIVERSITY OF ENVIRONMENTAL AND LIFE SCIENCES
FACULTY OF VETERINARY MEDICINE
DEPARTMENT OF PATHOLOGY
DIVISION OF PATHOMORPHOLOGY AND VETERINARY FORENSICS
IZABELA JANUS, DVM
PATHOMORPHOLOGICAL ANALYSIS OF THE LEFT ATRIUM IN DOGS WITH DILATED CARDIOMYOPATHY (DCM) AND
CHRONIC/MYXOMATOUS MITRAL VALVE DISEASE (CMVD/MMVD)
DOCTORAL THESIS
SUPERVISOR: MARCIN NOWAK, DVM, PhD
WROCŁAW 2017
5. Streszczenie
Badania przeprowadzono na wycinkach lewego przedsionka serca pochodzących od 58 psów: z klinicznie stwierdzoną i pośmiertnie potwierdzoną kardiomiopatią rozstrzeniową (grupa DCM; n=16), z klinicznie stwierdzoną i pośmiertnie potwierdzoną chorobą zastawki dwudzielnej (grupa CMVD/MMVD;
n=35), niewykazujących cech choroby serca, poddanych eutanazji z powodu innych schorzeń (n=7). U wszystkich psów z grupy DCM i CMVD/MMVD stwierdzono silne powiększenie lewego przedsionka serca (pomiar standaryzowany w odniesieniu do średnicy aorty).
Materiał zabezpieczony był w formie bloczków parafinowych pochodzących z Katedry Patologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu oraz Wydziału Nauk Weterynaryjnych Uniwersytetu w Turynie. Skrawki parafinowe zostały zabarwione standardową metodą z użyciem hematoksyliny i eozyny (HE) oraz dodatkowo trichromem Massona-Goldnera (MGt) w celu lepszego uwidocznienia tkanki łącznej. Ponadto przeprowadzono reakcje immunohistochemiczne (IHC) z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko:
1) desminie (DES), 2) wimentynie (VIM), 3) periostynie (PER), 4) kaspazie-3 (CAS-3),
5) ATPazom wapniowym siateczki śródplazmatycznej (białka SERCA1 oraz SERCA2),
6) aktyninie sarkomerów (SA), 7) aktynie mięśni gładkich (SMA), 8) dystrofinie (DMD).
Ekspresję badanych markerów oceniano z użyciem mikroskopu świetlnego.
Zdjęcia badanych tkanek poddano wspomaganej komputerowo analizie obrazu za pomocą komputera sprzężonego z mikroskopem optycznym Olympus BX53 (Olympus, Japonia) wyposażonym w cyfrową kamerę Olympus ColorViewIIIu (Olympus, Japonia). Oceny mikrofotografii dokonywano przy użyciu programu cell^A software (Olympus Soft Imagining Solution GmbH, Niemcy).
Dla każdego z badanych białek określano typ ekspresji w kardiomiocytach i tkance śródmiąższowej (błonowa lub cytoplazmatyczna) oraz, jeśli występowały, cechy charakterystyczne ekspresji białka (np. widoczne poprzeczne prążkowanie w barwieniu w kierunku desminy). Ponadto dla każdego z białek oceniano intensywność reakcji oraz procent komórek wykazujących pozytywną reakcję.
Dodatkowo dla desminy, wimentyny, periostyny i kaspazy-3 wyniki te (intensywność reakcji oraz procent komórek wykazujących reakcję) zestawiono w postaci 12- punktowej zmodyfikowanej skali wg Remmele. Wyniki badania IHC zestawiono z wynikami badań histopatologicznych celem oceny zależności między zmianami w ekspresji białek a przebudową mięśnia sercowego.
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu programu Statistica PL (StatSoft, Polska) oraz odpowiednich testów statystycznych. Poziom istotności przyjęto dla p≤0.05.
Wstępem do zaplanowanych badań było porównanie przebudowy miokardium zachodzącej w tkankach komór i przedsionków psów z DCM. Badaniu poddano wycinki pochodzące z przegrody międzykomorowej, ścian komór i ścian przedsionków pochodzące od 11 psów z klinicznie stwierdzoną i potwierdzoną pośmiertnie kardiomiopatią rozstrzeniową. Oceniano nasilenie włóknienia (śródmiąższowego oraz związanego z naczyniami krwionośnymi), stłuszczenia, przekrwienia, zwężenia światła naczyń wieńcowych, zmian kardiomiocytów (utrata prążkowania, zmiana struktury włókna mięśniowego, nieprawidłowy wygląd jądra komórkowego) oraz obecność nacieków komórek zapalnych. Ponadto dokonano klasyfikacji wycinków lewej komory serca w zależności od występującego typu zmian histologicznych (FID lub AWF).
Wycinki pochodzące od 4 psów zostały zakwalifikowane jako typ FID, a od 7 psów – jako typ AWF. Ponadto stwierdzono, że zmiany charakterystyczne dla danego typu były obecne także w innych częściach serca.
Stwierdzono zwiększoną ilość tkanki łącznej w mięśniówce przedsionków w porównaniu do mięśniówki komór (p<0.02) oraz brak różnic w nasileniu pozostałych ocenianych zmian między wycinkami przedsionków i komór (p>0.05).
Wyniki badania zostały opublikowane w czasopiśmie Bull Vet Inst Pulawy (Janus i wsp. Pathomorphological changes of the myocardium in canine dilated cardiomyopathy (DCM): Bull Vet Inst Pulawy, 2015).
Stwierdzenie równie lub bardziej nasilonych zmian w tkance przedsionków w odniesieniu do tkanek komór serca oraz niewiele doniesień literaturowych w tym temacie zainspirowało nas do dalszych badań dotyczących zmian zachodzących w lewym przedsionku serca u psów z DCM i CMVD/MMVD.
W kolejnym etapie pracy badaniu poddano wycinki LA pochodzące od 31 psów, w tym od 16 psów z klinicznie stwierdzoną i pośmiertnie potwierdzoną DCM i 15 psów z klinicznie stwierdzoną i potwierdzoną pośmiertnie CMVD/MMVD.
Skrawki parafinowe barwiono metodami HE i MGt i oceniano pod kątem szeregu zmian, tj.: zwłóknienia, nacieków tłuszczowych, zwężenia naczyń, obecności nacieków zapalnych, utraty prążkowania kardiomiocytów, zmiany ich struktury oraz zmian w wyglądzie jądra komórkowego.
U psów z DCM w porównaniu do psów z CMVD/MMVD stwierdzono bardziej nasilone włóknienie pozanaczyniowe (p=0.036) i mniej nasilone włóknienie okołonaczyniowe (p=0.006), a także mniej nasilone zwężenie naczyń krwionośnych (p=0.041). Ponadto u psów z DCM stwierdzono silnie wyrażone zmiany w budowie kardiomiocytów obejmujące utratę prążkowania (p=0.004), zmianę struktury włókna (p=0.004) oraz powiększenie jądra komórkowego (p=0.008).
Wyniki tego etapu badań opublikowano w czasopiśmie BMC Vet Res (Janus i wsp. A comparison of the histopathologic pattern of the left atrium in canine dilated cardiomyopathy and chronic mitral valve disease: BMC Vet Res, 2016).
Zmiany struktury LA u psów z niewydolnością serca na tle DCM lub CMVD/MMVD oraz zaobserwowane interesujące różnice między badanymi grupami zainspirowały nas do poszerzenia badań nad zmianami w miokardium LA psów z niewydolnością serca o badania immunohistochemiczne.
Badania IHC rozpoczęto od oceny ekspresji 4 markerów komórkowych:
desminy, wimentyny, periostyny oraz kaspazy-3. Badaniu temu poddano 56 wycinków LA psów podzielonych na 3 grupy: grupa DCM (n=15), grupa CMVD/MMVD (n=34), grupa kontrolna (n=7).
W badaniu stwierdzono zmiany ekspresji wszystkich badanych markerów.
Desmina w porównaniu do grupy kontrolnej w grupach DCM i CMVD/MMVD wykazywała mniej uporządkowaną ekspresję w kardiomiocytach, a desmosomy stawały się niewyraźne i mniej widoczne. Ponadto stwierdzono niższą intensywność reakcji DES w kardiomiocytach grupy DCM w porównaniu do grupy kontrolnej
(p=0.006), niższe wyniki w skali Remmele w grupie DCM w porównaniu do grupy CMVD/MMVD (p=0.03) i do grupy kontrolnej (p=0.001) oraz niższą intensywność wybarwienia desmosomów w grupie DCM w porównaniu do grupy kontrolnej (p=0.02).
We wszystkich badanych preparatach wimentyna wykazywała ekspresję w obrębie tkanki śródmiąższowej. Stwierdzono większy odsetek komórek wykazujących ekspresję VIM w grupie DCM w porównaniu do grupy CMVD/MMVD (p=0.03) oraz do grupy kontrolnej (p=0.02).
W prawidłowej tkance LA periostyna wykazywała ekspresję w cytoplazmie kardiomiocytów. W grupach DCM i CMVD/MMVD stwierdzono ponadto silną ekspresję PER w obrębie tkanki śródmiąższowej z osłabieniem reakcji w obrębie kardiomiocytów. Stwierdzono też istotnie niższy odsetek komórek wykazujących ekspresję PER w grupie DCM w porównaniu do grupy kontrolnej (p=0.03).
Kaspaza-3 wykazywała reakcję cytoplazmatyczną we wszystkich preparatach grupy kontrolnej. Ulegała ona osłabieniu w grupach DCM i CMVD/MMVD, co wyrażało się zarówno w niższym odsetku komórek wykazujących reakcję, jak i niższych wartościach w skali Remmele. Wyniki te były istotne dla porównania grupy DCM do CMVD/MMVD (p=0.01 dla odsetka pozytywnych komórek oraz p=0.01 dla wartości skali Remmele) oraz porównania grupy DCM do grupy kontrolnej (p=0.01 dla odsetka pozytywnych komórek oraz p=0.01 dla wartości skali Remmele).
Poza oceną reakcji immunohistochemicznej badanych białek przeprowadzono także analizę zależności zachodzących zmian obserwowanych w badaniu IHC w porównaniu do przebudowy miokardium ocenianej po barwieniu HE i MGt.
Stwierdzono następujące zależności:
- korelację negatywną dla intensywności reakcji DES oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.53), utraty prążkowania kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.48) i zmiany struktury kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.53),
- korelację pozytywną dla odsetka komórek pozytywnych dla DES oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=0.37), utraty prążkowania kardiomiocytów (p<0.05; r=0.49) i zmiany struktury kardiomiocytów (p<0.05; r=0.46),
- korelację negatywną dla wartości skali Remmele dla DES oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.44), utraty prążkowania kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.38) i zmiany struktury kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.45),
- korelację negatywną dla intensywności reakcji DES w desmosomach oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.5), utraty prążkowania kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.44) i zmiany struktury kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.53),
- korelację pozytywną dla intensywności reakcji DES w desmosomach oraz zwężenia naczyń krwionośnych (p<0.05; r=0.38),
- korelację negatywną dla odsetka komórek pozytywnych dla VIM oraz zwłóknienia okołonaczyniowego (p<0.05; r=-0.39) i zwężenia naczyń krwionośnych (p<0.05; r=-0.37),
- korelację pozytywną dla odsetka komórek pozytywnych dla VIM oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=0.34),
- korelację negatywną dla wartości skali Remmele dla VIM oraz zwłóknienia okołonaczyniowego (p<0.05; r=-0.33) i zwężenia naczyń krwionośnych (p<0.05; r=-0.39),
- korelację negatywną dla odsetka komórek pozytywnych dla PER oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.3),
- korelację negatywną dla wartości skali Remmele dla PER oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.3),
- korelację negatywną dla intensywności reakcji dla CAS-3 oraz utraty prążkowania kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.28),
- korelację pozytywną dla intensywności reakcji dla CAS-3 oraz zwężenia naczyń krwionośnych (p<0.05; r=0.51),
- korelację negatywną dla odsetka komórek pozytywnych dla CAS-3 oraz powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.44), utraty prążkowania (p<0.05; r=-0.38) i zmiany struktury kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.36), - korelację negatywną dla wartości skali Remmele dla CAS-3 oraz
powiększenia jąder kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.47), utraty prążkowania (p<0.05; r=-0.48) i zmiany struktury kardiomiocytów (p<0.05; r=-0.43).
Uzyskane wyniki opublikowano w formie artykułu w czasopiśmie Irish Vet J (Janus i wsp. The immunohistochemical evaluation of selected markers in the left atrium of dogs with end-stage dilated cardiomyopathy and myxomatous mitral valve disease – a preliminary study: Irish Vet J, 2016).
W dalszym etapie pracy poszerzono badania IHC o szereg markerów: białka SERCA1 i SERCA2, aktynina sarkomerów, aktyna mięśni gładkich oraz dystrofina.
Badania te przeprowadzono na wycinkach LA pochodzących od 56 psów podzielonych na 3 grupy, podobnie jak w poprzednim etapie: grupa DCM (n=15), grupa CMVD/MMVD (n=35), grupa kontrolna (n=6).
W badaniu oceniano charakter reakcji komórkowej (cytoplazmatyczna lub błonowa), intensywność reakcji oraz odsetek komórek pozytywnych dla każdego z markerów komórkowych.
Białka SERCA1 i SERCA2, aktynina sarkomerów i aktyna mięśni gładkich wykazywały reakcję cytoplazmatyczną, a dystrofina – reakcję błonową w badanych preparatach.
Stwierdzono większy odsetek komórek pozytywnych dla SERCA1 w grupie CMVD/MMVD w porównaniu do grupy kontrolnej (p=0.05) oraz mniejszą intensywność ekspresji DMD (p=0.02) i niższy odsetek komórek pozytywnych dla DMD (p=0.02) w grupie DCM w porównaniu do grupy kontrolnej.
Analiza zmian stwierdzonych w badaniu IHC w odniesieniu do zmian miokardium uwidocznionych w standardowym barwieniu HE i MGt wykazała następujące zależności:
- korelację negatywną dla odsetka komórek pozytywnych dla SERCA2 i powiększenia jąder kardiomiocytów (p=0.05; r=-0.33) oraz zmiany struktury kardiomiocytów (p=0.05; r=-0.29),
- korelację pozytywną dla odsetka komórek pozytywnych dla SMA i powiększenia jąder kardiomiocytów (p=0.05; r=0.3) i zmiany struktury kardiomiocytów (p=0.05; r=0.27),
- korelację negatywną dla odsetka komórek pozytywnych dla DMD i powiększenia jąder kardiomiocytów (p=0.05; r=-0.42), zmiany struktury kardiomiocytów (p=0.05; r=-0.43) oraz utraty prążkowania kardiomiocytów (p=0.05; r=-0.38).
Wyniki wspomnianej analizy IHC opublikowano w czasopiśmie Folia Histochem Cyto (Janus i wsp. Cardiomyocyte marker expression in dogs with left atrial enlargement due to dilated cardiomyopathy or myxomatous mitral valve disease: Folia Histochem Cyto, 2017).
8. Abstract
The study was conducted on left atrial specimens obtained from 58 dogs. 16 specimens were obtained from dogs with dilated cardiomyopathy, which was diagnosed based on the clinical and post-mortem findings (DCM group; n=16) 35 specimens were from dogs with confirmed chronic/myxomatous mitral valve disease (CMVD/MMVD group; n=35), which was diagnosed based on clinical and post- mortem features. Specimens from seven dogs without signs of heart disease, euthanized due to other non-cardiac diseases (n=7) formed the control group. All the dogs in the DCM and CMVD/MMVD groups presented with severe left atrial enlargement (measurement standardized to the diameter of the aorta).
The tissues were collected in the Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Wrocław University of Environmental and Life Sciences and at the Faculty of Veterinary Science, University of Turin. They were fixed in paraffin blocks and the slides were stained using standard haematoxylin-eosin (HE) and Masson-Goldner trichrome (MGt) methods. An immunohistochemical (IHC) examination was performed using antibodies against:
1) desmin (DES), 2) vimentin (VIM), 3) periostin (PER), 4) caspase-3 (CAS-3),
5) sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPases (SERCA1 and SERCA2 protein), 6) sarcomeric actinin (SA),
7) smooth muscle actin (SMA), 8) dystrophin (DMD).
The reaction of the examined proteins was evaluated using an optical microscope. Photomicrographs of the examined tissues were subjected to computer- assisted image analysis, using a computer coupled to an optical Olympus BX53 microscope, equipped with an Olympus Color View IIIu digital camera (Olympus, Japan) and cell^A software (Olympus Soft Imaging Solution GmbH, Germany).
The type of reaction (membranous or cytoplasmic) and characteristic features of the protein reaction (e.g. presence of cross striation in desmin staining) were
recorded. In addition, the intensity of the reaction and the percentage of protein- positive cells were evaluated for every cell marker. Furthermore, a 12-point modified Remmele scale was used to present the results of the reaction of in desmin, vimentin, periostin and caspase-3. The results of the IHC examination were compared to the results obtained during the histopathologic examination to assess the relationship between changes in the protein reaction and cardiac tissue remodelling.
The obtained results were subjected to statistical analysis using StatisticaPL software (StatSoft, Poland) and appropriate statistical tests. Statistical significance was set at p≤0.05.
In the first section of this thesis the remodelling of the atrial tissue in dogs with DCM was compared to the remodelling of the ventricular tissue in these animals.
The examination was performed on specimens from the interventricular septum, ventricular and atrial free walls obtained from 11 dogs with a clinical and post- mortem diagnosis of dilated cardiomyopathy. The presence of fibrosis (interstitial and perivascular), fatty infiltration, congestion, vessel wall hypertrophy, loss of cross striation in cardiomyocytes, cardiomyocyte degeneration, an enlargement of the cardiomyocyte nuclei and the presence of inflammatory infiltrates were assessed.
Moreover, the lesions in the left ventricular specimens were classified as either FID or AWF.
Specimens obtained from four dogs were classified as FID, while specimens from seven dogs were classified as AWF. Lesions typical of the two types of remodelling were also noted in other parts of the examined hearts.
A greater amount of fibrous tissue was noted in the atria compared to the ventricles (p<0.02) without significant differences in remodelling patterns (p>0.05).
The obtained results were published in Bull Vet Inst Pulawy (Janus et al.
Pathomorphological changes of the myocardium in canine dilated cardiomyopathy (DCM): Bull Vet Inst Pulawy, 2015).
Due to the fact that equal or more pronounced changes were noted in the atrial tissue compared to the ventricular tissue and that there is limited literature concerning this topic, we studied the remodelling of the left atrium in dogs with DCM or CMVD/MMVD further.
In the next part of the thesis, a study of the LA specimens obtained from 31 dogs, including 16 dogs with DCM confirmed based on the clinical and post-mortem
findings and 15 dogs with CMVD/MMVD diagnosed based on clinical and post- mortem features was performed. The paraffin sections were stained with HE and MGt. We evaluated various signs of remodelling, including fibrosis, fatty infiltration, narrowing of the blood vessels, the presence of inflammatory infiltrates, loss of cardiomyocyte cross striation, changes in the structure of the cardiomyocytes and the presence of abnormal cardiomyocyte nuclei.
Dogs with DCM presented with more distinct interstitial fibrosis (p=0.036), less distinct perivascular fibrosis (p=0.006), and less distinct vessel narrowing (p=0.041) than dogs with CMVD/MMVD. Moreover, dogs with DCM showed more cardiomyocyte degeneration, including loss of cross striation (p=0.004), changes in the cardiomyocyte structure (p=0.004), and an enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p=0.008) than dogs with CMVD/MMVD.
The results of this part of the research were published in BMC Vet Res (Janus et al. A comparison of the histopathologic pattern of the left atrium in canine dilated cardiomyopathy and chronic mitral valve disease: BMC Vet Res, 2016).
Changes in the LA tissue in dogs with heart failure due to DCM or CMVD/MMVD and the observed differences between the examined groups prompted us to expand the research to include an immunohistochemical examination.
The reaction of four cell markers, including desmin, vimentin, periostin and caspase-3, was assessed. The study was conducted on 56 LA specimens obtained from dogs divided into three groups: the DCM group (n=15), the CMVD/MMVD group (n=34) and the control group (n=7).
We noted changes in the reaction of all the examined markers. The reaction of desmin was less organised and the desmosomes were faint and less visible in the DCM and the CMVD/MMVD group than in the control group. Moreover, we noted a fainter DES reaction in cardiomyocytes in the DCM group compared to the control group (p=0.006), lower values on the Remmele scale in the DCM group than the CMVD/MMVD group (p=0.03) and the control group (p=0.001), as well as a reduced staining intensity in the desmosomes in the DCM group compared to the control group (p=0.02).
Vimentin showed reaction within the interstitial tissue in all the examined specimens. A higher percentage of VIM-positive cells was observed in the DCM group than the CMVD/MMVD (p=0.03) and the control group (p=0.02).
In the normal LA tissue, PER was expressed in the cytoplasm of the cardiomyocytes. In the DCM and the CMVD/MMVD groups, PER was expressed in interstitial tissue and there was reduced reaction within the cardiomyocytes.
Moreover, a significantly lower percentage of PER-positive cells was noted in the DCM group as compared to the control group (p=0.03).
Caspase-3 showed cytoplasmic reaction in all of the specimens in the control group. It was reduced in the DCM and the CMVD/MMVD group, which was noted based on a lower percentage of CAS-3-positive cells and lower values on the Remmele scale. The differences in the caspase-3 reaction between the DCM and the CMVD/MMVD group (p=0.01 for the percentage of CAS-3-positve cells; p=0.01 for Remmele scale values) were statistically significant. Similarly, there were statistically significant differences in the reaction of caspase-3 between the DCM group and the control group (p=0.01 for the percentage of CAS-3-positive cells; p=0.01 for Remmele scale values).
Apart from a standard IHC examination, the relationship between the changes noted in the IHC examination and myocardial remodelling, evaluated using HE and MGt staining, was assessed. The following relationships were noted:
- a negative correlation between the intensity of the DES reaction and: the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.53), loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.48) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=-0.53),
- a positive correlation between the DES-positive cells and: the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=0.37), loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=0.49) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=0.46),
- a negative correlation between the DES values on the Remmele scale and:
the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.44), loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.38) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=-0.45),
- a negative correlation between the intensity of the DES reaction in desmosomes and: the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05;
r=-0.5), loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.44) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=-0.53),
- a positive correlation between the intensity of the DES reaction in desmosomes and blood vessel narrowing (p<0.05; r=0.38),
- a negative correlation between the percentage of VIM-positive cells and:
perivascular fibrosis (p<0.05; r=-0.39) as well as blood vessel narrowing (p<0.05; r=-0.37),
- a positive correlation between the percentage of VIM-positive cells and the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=0.34),
- a negative correlation between the VIM values on the Remmele scale and:
perivascular fibrosis (p<0.05; r=-0.33) as well as blood vessel narrowing (p<0.05; r=-0.39),
- a negative correlation between the percentage of PER-positive cells and the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.3),
- a negative correlation between PER values on the Remmele scale and the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.3),
- a negative correlation between the intensity of the CAS-3 reaction and a loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.28),
- a positive correlation between the intensity of the CAS-3 reaction and blood vessel narrowing (p<0.05; r=0.51),
- a negative correlation between the percentage of CAS-3-positive cells and:
the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.44), loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.38) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=-0.36),
- a negative correlation between the CAS-3 values on the Remmele scale and:
the enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.47), loss of cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.48) and changes in the structure of cardiomyocytes (p<0.05; r=-0.43).
The results were published in Irish Vet J (Janus et al. The immunohistochemical evaluation of selected markers in the left atrium of dogs with end-stage dilated cardiomyopathy and myxomatous mitral valve disease – a preliminary study: Irish Vet J, 2016).
In the final phase of the study, the IHC examination was extended to include SERCA1 and SERCA2 proteins, sarcomeric actinin, smooth muscle actin and dystrophin. The study was conducted on LA specimens obtained from 56 dogs
divided into three groups, as in the preceding stage: the DCM group (n=15), the CMVD/MMVD group (n=35), and the control group (n=6).
The type (cytoplasmic or membranous) and the intensity of the cellular reaction as well as the percentage of antibody-positive cells were evaluated for each of the examined cell markers.
In the examined specimens, SERCA1 and SERCA2 proteins, sarcomeric actinin and smooth muscle actin showed a cytoplasmic reaction, while dystrophin showed a membranous reaction.
There was a higher percentage of SERCA1-positive cells in the CMVD/MMVD group compared to the control group (p=0.05). In the DCM group, the DMD reaction was of a reduced intensity (p=0.02) and there was a lower percentage of DMD- positive cells (p=0.02) compared to the control group.
The analysis of the relationship between the results of the IHC examination and myocardial remodelling (assessed after HE and MGt staining) showed:
- a negative correlation between SERCA2-positive cells and: an enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.33) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=-0.29),
- a positive correlation between the percentage of SMA-positive cells and: an enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=0.3) and changes in the cardiomyocyte structure (p<0.05; r=0.27),
- a negative correlation between the percentage of DMD-positive cells and:
an enlargement of the cardiomyocyte nuclei (p<0.05; r=-0.42), changes in the structure of cardiomyocyte (p<0.05; r=-0.43) and loss of the cardiomyocyte cross striation (p<0.05; r=-0.38).
The results of abovementioned IHC analysis were published in Folia Histochem Cyto (Janus et al. Cardiomyocyte marker expression in dogs with left atrial enlargement due to dilated cardiomyopathy or myxomatous mitral valve disease: Folia Histochem Cyto, 2017).
