Wydział Biologii
Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych
Rola wybranych białek mitochondrialnych w chorobie Parkinsona - badania na modelu Drosophila melanogaster
Bartosz Doktór
Rozprawa doktorska wykonana pod opieką prof. dr hab. Elżbiety Pyzy w Zakładzie Biologii i Obrazowania Komórki Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych
Kraków 2019
1 Pani prof. Elżbiecie Pyzie dziękuję za opiekę naukową, cenne rady
oraz wsparcie merytoryczne.
Pani dr Milenie Damulewicz dziękuję za pomoc naukową oraz cenne rady.
Pracownikom i doktorantom Zakładu Biologii i Obrazowania Komórki dziękuję za wszelką pomoc.
Swoim rodzicom, dziadkom oraz narzeczonej dziękuję za wsparcie podczas studiów doktoranckich.
2
Spis treści
Wykaz stosowanych skrótów ... 3
Streszczenie ... 5
Summary ... 6
Wykaz publikacji naukowych oraz oświadczeń współautorów ... 7
Wprowadzenie ... 15
Choroba Parkinsona ... 15
Modele choroby Parkinsona ... 16
Zegar okołodobowy ... 19
Plastyczność synaptyczna ... 21
Cel pracy ... 23
Dyskusja ... 24
Wnioski ... 31
Piśmiennictwo ... 32
3
Wykaz stosowanych skrótów
ATG (ang. Autophagy-Related) – białka odpowiedzialne za proces autofagii
BRP (ang. Bruchpilot) – presynaptyczne białko budujące strefy aktywne u D. melanogaster CCG (ang. Clock–Controlled Gens) – geny, których ekspresja jest regulowana przez zegar okołodobowy
CK2 (ang. Casein Kinase 2) – kinaza regulująca pracę zegara okołodobowego Clk (ang. Clock) - gen zegara okołodobowego
Cry (ang. Cryptochrome) - gen zegara okołodobowego DBT (ang. Double-Time) – kinaza zegara okołodobowego
Dcp-1 (ang. Death Caspase-1) – białko odpowiedzialne za apoptozę u D. melanogaster Dlg1 (ang. Discs Large 1) – białko u D. melanogaster odpowiedzialne za transmisję synaptyczną
DN (ang. Dorsal Neurons) – neurony grzbietowe
DRP1 (ang. Dynamin-Related Protein 1) – białko wewnętrznej błony mitochondrialnej, niezbędne do procesu rozszczepienia mitochondriów
eIF2α (ang. Eukaryotic Initiation Factor 2) - czynnik translacyjny Elav – marker komórek nerwowych
LB (ang. Lewy Bodies) – ciałka Lewyego, złogi ubikwityny, α-synukleiny i innych białek LC3 (ang. Light Chain) – białko budujące autofagosom
l-LNvs (ang. Large Ventral Lateral Neurons) - neurony boczne brzuszne o dużym ciele komórkowym
LNd (ang. Lateral Dorsal Neurons) - neurony boczne grzbietowe LPN (ang. Lateral Posterior Neurons) – neurony boczne tylne
LRRK2 (ang. Leucine-Rich Repeat Kinase 2) – kinaza mitochondrialna i cytoplazmatyczna LTD (ang. Long-term Depression) – długotrwałe wyciszenie synaptyczne
LTP (ang. Long-term Potentiation) – długotrwałe wzmocnienie synaptyczne
Mfn (ang. Mitofusin) – białko zewnętrznej błony mitochondrialnej, odpowiedzialne za fuzję mitochondriów
MOA (ang. Monoamine Oxidase) – oksydaza monoaminowa, enzym
4 MPP (ang. Mitochondrial Processing Peptidase) – mitochondrialna peptydaza
MTS (ang. Mitochondrial Targeting Sequence) - domena kierująca białko PINK1 do mitochondriów
MUL1 (ang. Mitochondrial Ubiquitin Ligase 1) – ligaza mitochondrialna uczestnicząca w mitofagii
p62 – białko wyznaczające substraty do degradacji
PARKIN – parkina, ligaza mitochondrialna uczestnicząca w mitofagii
PARL (ang. Presenilin-Associated Rhomboid-Like) – mitochondrialna wewnątrzbłonowa proteaza
PD (ang. Parkinson’s Disease) – choroba Parkinsona
PDF (ang. Pigment Dispersing Factor) - czynnik rozpraszający pigment, neuropeptyd zegara
Pdp (ang. PAR Domain Protein) - gen zegara okołodobowego Per (ang. Period) - gen zegara okołodobowego
PINK1 (ang. PTEN-Induced Putative Kinase 1) – kinaza mitochondrialna uczestnicząca w mitofagii
REM (ang. Rapid Eye Movement) – sen paradoksalny, faza snu, w której występują szybkie ruchy gałek ocznych
ROS (ang. Reactive Oxygen Species) - wolne rodniki tlenowe
sLNvs (ang. Small Ventral Lateral Neurons) - neurony boczne brzuszne o małym ciele komórkowym
SNCA (ang. Synuclein Alpha) – gen kodujący białko α-synukleinę
SOD1/2 (ang. Superoxide Dismutase 1/2) – dysmutaza ponadtlenkowa, białko o funkcji antyoksydacyjnej
SUMO (ang. Small Ubiquitin-Like Modifier) – białko podobne do ubikwityny, dołączane w procesie SUMOilacji
Tim (ang. Timeless) - gen zegara okołodobowego
TMS (ang. Transmembrane Sequence) – domena kierująca białko PINK1 do mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej
VPS35 (ang. Vacuolar Protein Sorting 35) - białko transportujące białka z endosomów Vri (ang. Vrille) - gen zegara okołodobowego
5
Streszczenie
Choroba Parkinsona jest jedną z najczęściej występujących chorób neurodegeneracyjnych. Do najbardziej charakterystycznych objawów tej choroby zaliczane są: degeneracja neuronów dopaminergicznych, zmniejszenie poziomu dopaminy, wzrost poziomu wolnych rodników, a także problemy ze snem oraz poruszaniem się.
Do modelowania symptomów choroby Parkinsona najczęściej wykorzystywane są neurotoksyny hamujące aktywność pierwszego kompleksu mitochondrialnego bądź mutacje genów kodujących białka biorące udział w mitofagii.
W pierwszej części pracy zbadano związek pomiędzy chorobą Parkinsona wywołaną mutacjami genów mul1 oraz park a zaburzeniami pracy zegara okołodobowego u Drosophila melanogaster. Przeprowadzono analizę ekspresji głównych genów zegara (per, tim, clk) oraz białka (PER) w mózgu, a także analizę okołodobowej aktywności lokomotorycznej.
Otrzymane wyniki wykazały, że u mutantów mul1 oraz park faza rytmu ekspresji genów zegara jest przesunięta, natomiast rytm ekspresji białka PER jest całkowicie zniesiony, co skutkuje zaburzonym rytmem aktywności lokomotorycznej. Wykazano, że zmiana ta jest następstwem zahamowania autofagii u tych mutantów, a także zwiększonej liczby wolnych rodników w mózgu oraz zmniejszeniem poziomu SOD1.
W kolejnej części wykazano, że nadekspresja genów kodujących białka MUL1 oraz PARK w neuronach hamuje rozwój choroby Parkinsona wywołanej rotenonem. Wykonano analizę liczby neuronów dopaminergicznych, wyznakowanych immunohistochemicznie, zbadano poziom białek synaptycznych biorących udział w egzocytozie neuroprzekaźników (analiza Western Blot), zanalizowano błonę presynaptyczną w celu zbadania morfologii stref aktywnych synaps (elektronowy mikroskop transmisyjny), a także zbadano aktywność lokomotoryczną. Uzyskane wyniki wykazały, że szczepy z nadekspresją mul1 i park nie wykazują degeneracji neuronów dopaminergicznych po podaniu rotenonu, poziom badanych białek synaptycznych nie ulega zmniejszeniu, a strefy aktywne w elementach presynaptycznych nie posiadają żadnych nieprawidłowości. Ponadto aktywność motoryczna badanych osobników ulega poprawie. Wykazano, że obserwowane efekty są związane z obniżeniem poziomu apoptozy oraz zwiększeniem poziomu autofagii i poziomu białka SOD1. Stwierdzono również, że mutacja genu kodującego kinazę mitochondrialną PINK1 powoduje zaburzenia w morfologii i funkcjonowaniu synaps, podobne do obserwowanych na modelach wywołanych rotenonem.
6
Summary
Parkinson's disease is one of the most common neurodegenerative diseases worldwide.
The most characteristic symptoms of this disease include loss of dopaminergic neurons, reduction of dopamine levels, increase of free radicals level, and problems with sleep and movement. Neurotoxins, which inhibit activity of the first mitochondrial complex or mutations of genes encoding proteins involved in mitophagy, are the most frequently used to model symptoms of Parkinson’s disease.
In the first part of this work, we examined the link between the Parkinson's disease caused by mutations of mul1 and park genes and circadian rhythmic disorder in Drosophila melanogaster. The circadian rhythm of locomotor activity depends on the cyclic expression of the main clock genes (per, tim) and protein (PER) in the brain. Flies with mu1l or park mutations showed half an hour phase shift of clock gene expression while the rhythm of PER protein expression was completely abolished. This resulted in disruption of locomotor activity rhythm. Our results suggest that observed changes are a consequence of the suppression of autophagy, as well as an increased number of free radicals in the brain and reduction of SOD1 level.
We also showed that overexpression of genes encoding MUL1 and PARK proteins in neurons suppresses development of rotenone-induced Parkinson's disease. The number of dopaminergic neurons was evaluated using immunohistochemistry. Western Blot analysis was used to investigate the level of synaptic proteins involved in neurotransmitter exocytosis.
Using a transmission electron microscope, the presynaptic membrane was visualized and examined. The negative geotaxis test was carried out to evaluate motor activity.
The conducted studies showed that mul1 or park overexpressing strains do not show dopaminergic neuron degeneration after administration of rotenone, the level of synaptic proteins was not reduced, active zones in the presynaptic elements did not have any abnormalities and motor activity of flies was improved. Our results suggest that these effects may result from decreased level of apoptosis and increased autophagy and SOD1 protein level. We also found that mutation of the gene encoding the mitochondrial kinase PINK1 also causes synaptic and motor disorders similar to those observed in the previously described rotenone-induced models.
7
Wykaz publikacji naukowych oraz oświadczeń współautorów
1. Doktór B., Damulewicz M., Krzeptowski W., Bednarczyk B., Pyza E. (2018). Effects of PINK1 mutation on synapses and behavior in the brain of Drosophila melanogaster. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 78, 231–241.
IF : 1.286 MNiSW : 20 Pierwszy autor
8
9
10
11 2. Doktór B., Damulewicz M., Pyza E. (2019). Effects of MUL1 and PARKIN on the circadian clock, brain and behaviour in Drosophila Parkinson’s disease models.
BMC Neuroscience, 20(1), 24.
IF : 2.665 MNiSW : 25 Pierwszy autor
12
13 3. Doktór B., Damulewicz M., Pyza E. (2019). Overexpression of mitochondrial ligases reverses rotenone-induced effects in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Frontiers in Neuroscience, 13(FEB), 1–10.
IF : 3.656 MNiSW : - Pierwszy autor
14
15
Wprowadzenie
Choroba Parkinsona
Choroba Parkinsona (ang. Parkinon’s disease, PD) jest jedną z najczęściej występujących chorób neurodegeneracyjnych. Częstotliwość występowania PD wynosi około 1% u osób w wieku około 60 lat i starszych a wzrasta do 3% u osób powyżej 60 roku życia (Driver i wsp., 2009). PD po raz pierwszy została opisana przez dr. Jamesa Parkinsona w 1817 roku jako „shaking palsy” (Parkinson, 2002). Jest to chroniczna, progresywna choroba neurodegeneracyjna, charakteryzowana przez objawy motoryczne i niemotoryczne.
Objawy motoryczne są konsekwencją degeneracji neuronów dopaminergicznych, natomiast obecność objawów niemotorycznych wiąże się z utratą neuronów z obszarów innych niż SN.
Określenie „parkinsonizm” jest kompleksem opisującym objawy motoryczne PD, do których zalicza się drżenie spoczynkowe, spowolnienie ruchu i sztywność mięśni (Twelves i wsp., 2003). Badania pokazują, że zmiany patofizjologiczne w mózgu związane z chorobą Parkinsona mogą pojawiać się przed wystąpieniem objawów motorycznych i obejmują szereg niemotorycznych cech, takich jak zaburzenia snu, depresja, zmiany poznawcze (Schrag i wsp., 2015).
Postępująca utrata neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej pars compacta (SNpc), której projekcje sięgają do prążkowia (szlak nigrostriatalny), powoduje utratę funkcji układu dopaminergicznego u osób z PD. Objawy motoryczne pojawią się u osób chorych po utracie od 50% do 80% neuronów dopaminergicznych (DeMaagd i Philip, 2015).
Drugą, ważną cechą histopatologiczną PD jest obecność ciałek Lewyego (ang. Lewy Bodies, LB), opisywanych jako wewnątrzkomórkowe agregaty cytoplazmatyczne złożone z białek, lipidów oraz innych komponentów (Del Tredici i Braak, 2012). Tworzenie LB wiąże się z nadmiernym wytwarzaniem nieprawidłowo sfałdowanych białek ubikwityny, które biorą udział w recyklingu innych białek. Ich zwiększona ekspresja może być przyczyną zahamowania procesów rozkładających nieprawidłowe białka. Stwierdzono, że mutacje w obrębie genu kodującego białko α-synukleiny (SNCA, z ang. Synuclein Alpha) powodują tworzenie się i agregację nierozpuszczalnych włókien tego białka, które są związane z LB (Del Tredici i Braak, 2012; Yasuda i Mochizuki, 2010). W rozwoju choroby Parkinsona istotnym elementem jest również obszerne zapalenie i udział cytokin prozapalnych. Reakcje zapalne pojawiające się podczas degeneracji neuronów dopaminergicznych przyczyniają się
16 do patogenezy choroby. Badania potwierdzają również aktywację mikrogleju i astrocytów w uszkodzonych komórkach dopaminowych (Kim i Joh, 2006; Whitton, 2009).
Z rozwojem choroby Parkinsona związane są liczne czynniki ryzyka oraz mutacje genetyczne. Do czynników ryzyka zalicza się stres oksydacyjny bądź wpływ toksyn środowiskowych (np. pestycydy, herbicydy) (Logroscino, 2005; Zhou i wsp., 2008). Badania wykazały również szereg genów wspomagających zapoczątkowanie choroby.
Do najważniejszych genów, których mutacje związane są z rozwojem PD zaliczane są: SNCA, LRRK2 (z ang. Leucine-rich repeat kinase 2), PINK1 (z ang. PTEN-induced putative kinase 1), parkin, SOD2 (z ang. Superoxide dismutase 2), VPS35 (z ang. Vacuolar protein sorting 35) (Singleton i wsp., 2013; Spatola i Wider, 2014). Do czynników środowiskowych zmniejszających ryzyko rozwoju PD zaliczyć można palenie papierosów i spożywanie kofeiny. Palenie tytoniu hamuje działanie enzymu monoaminooksydazy – MAO (z ang. Monoamine Oxidase) rozkładającej między innymi dopaminę, natomiast korzyści z kofeiny są związane z aktywnością antagonistyczną wobec adenozyny (Liu i wsp., 2012).
Blokowanie receptorów adenozyny wpływa na zwiększenie uwalniania neuroprzekaźników takich jak acetylocholina czy dopamina.
Leki dopaminergiczne są podstawą objawowej terapii stosowanej w PD. Odkryta w 1960 roku lewodopa była pierwszym lekiem objawowym w chorobie Parkinsona. Z czasem zaczęto stosować agonistów receptorów dopaminowych czy inhibitorów monoaminooksydazy B. Nie ma obecnie jednego leku zalecanego do rozpoczęcia kuracji, ale należy wziąć pod uwagę takie czynniki jak nasilenie objawów, bądź koszt kuracji i preferencje pacjenta. Aktualnie do najczęściej stosowanych leków zalicza się: lewodopę (zwiększającą metabolizm dopaminy), agonistów dopaminergicznych (np. Ropinirol), inhibitory katechol-O-metylotransferzay (np. Entacapone), blokery receptorów NMDA i cholinergicznych (Amantadyna) czy leki antycholinergiczne (Triheksyfenidyl) (Rizek i wsp., 2016). Należy również podkreślić, że jest to choroba jak dotąd nieuleczalna, a wszystkie leki stosowane w terapii mają za zadanie tylko spowolnić jej rozwój.
Modele choroby Parkinsona
Dokładne prześledzenie patogenezy choroby Parkinsona oraz tworzenie nowych opcji terapeutycznych możliwe jest przede wszystkim dzięki zwierzęcym modelom tej choroby.
Najczęściej stosowanymi organizmami modelowymi są szczury oraz myszy, u których
17 wywołuje się objawy chorobowe używając manipulacji genetycznych bądź odpowiednich neurotoksyn. Do grupy zwierząt modelowych zalicza się także muszkę owocową D. melanogaster. W 2000 roku naukowcy opracowali pierwszy transgeniczny szczep muszki owocowej prezentujący typowe objawy PD. Wprowadzili oni zmutowaną formę genu SNCA, co skutkowało degeneracją neuronów dopaminergicznych oraz defektami behawioralnymi (brak zdolności do wspinaczki) (Feany i Bender, 2000). Parę lat później udowodniono również, że stosując selektywne neurotoksyny można modelować objawy PD u muszki owocowej. W 2004 roku innej grupie naukowców udało się uzyskać podobny fenotyp używając neurotoksyny rotenonu. Po siedmiodniowej ekspozycji na 500 µM rotenonu, osobniki badane prezentowały utratę neuronów dopaminergicznych, a także osłabione czynności motoryczne (Coulom i Birman, 2004). W niniejszej pracy wykorzystane zostały cztery modele choroby Parkinsona muszki owocowej: trzy genetyczne (mutacje genów pink1, parkin oraz mul1), oraz jeden z wykorzystaniem neurotoksyny (rotenon).
PINK1 (z ang. PTEN- Induced Putative Kinase 1) jest mitochondrialną kinazą serynowo/treoninową, związaną z autosomalną recesywną chorobą Parkinsona. W komórkach białko to gromadzi się na powierzchni uszkodzonych mitochondriów, gdzie wraz z ligazą PARKIN, inicjuje proces mitofagii (Matsuda i wsp., 2010). PINK1 zawiera N-końcową sekwencję MTS (z ang. Mitochondrial Targeting Sequence), TMS (z ang. Transmembrane Sequence) oraz domenę kinazy Ser/Thr zlokalizowaną na C-końcu (Eiyama i Okamoto, 2015). W fizjologicznych warunkach PINK1 ulega translokacji do błony mitochondrialnej, gdzie jego domena MTS jest odcinana przez mitochondrialną peptydazę – MPP (z ang. Mitochondrial Processing Peptidase) (Greene i wsp., 2012), a TMS przez białko PARL (z ang. Presenilin-Associated Rhomboid-Like) (Deas i wsp., 2011). PINK1 bez domen TMS i MTS przenoszony jest do cytoplazmy, gdzie ulega degradacji w proteasomach (Yamano i Youle, 2013). Uszkodzone mitochondria nie utrzymują potencjału na wewnętrznej błonie i w efekcie domeny MTS i TMS nie mogą zostać usunięte, a PINK1 stabilizowane jest na zewnętrznej błonie mitochondrialnej (Chen i Dorn, 2013). W kolejnym etapie PINK1 wraz z PARKIN kierują mitofuzyny oraz poryny obecne na zewnętrznej błonie mitochondrialnej na drogę proteasomalnej degradacji, prowadząc tym samym do degradacji całego organellium (Thomas i wsp., 2014). W wyniku mutacji genu pink1, uszkodzone i stare mitochondria, które są źródłem dużej ilości wolnych rodników, nie mogą ulec degradacji, a zatem powodują dysfunkcję bądź śmierć neuronów, co prowadzi do powstania objawów PD. U muszki owocowej mutacja ta powoduje zmianę morfologii mitochondriów, zmniejszenie poziomu
18 ATP, skrócenie długości życia oraz redukcję aktywności motorycznej (Clark i wsp., 2006;
Park i wsp., 2006b).
Drugim z genów, którego mutacja prowadzi do powstania objawów PD jest gen kodujący białko PARKIN. Jest on, podobnie jak PINK1, związany z autosomalną recesywną chorobą Parkinsona (Kitada i wsp., 1998). PARKIN jest ligazą ubikwityny E3 znajdującą się w obrębie cytoplazmy. Enzymy E3, we współpracy z enzymami klasy E1 oraz E2, pośredniczą w kowalencyjnym wiązaniu ubikwityny z białkami substratowymi (Ciechanover, 2005; Winklhofer, 2014). PARKIN posiada N-końcową domenę podobną do ubikwityny (Ubl) oraz cztery domeny palca cynkowego (RING), z których trzy tworzą motyw RING1-In Between-RING2 (RBR) (Trempe i Fon, 2013). Tym samym białko to należy do rodziny ligaz E3 RBR, które w odróżnieniu od klasycznych ligaz E3, wiążą się z enzymem E2, z którego pobierają ubikwitynę do określonego miejsca w obrębie domeny RING1.
Następnie ubikwityna przenoszona jest na katalityczną cysteinę w domenie RING2, skąd trafia bezpośrednio na białko substratowe (Smit i wsp., 2012; Wenzel i wsp., 2011;
Winklhofer, 2014). Do pełnienia funkcji ligazy białko PARKIN musi zostać uprzednio zaktywowane przez białko PINK1. Jeśli mitochondrium utraci swój potencjał błonowy, PINK1 ulega autofosforylacji, a także bezpośrednio fosforyluje PARKIN oraz substraty na powierzchni mitochondriów. Następnie aktywne PARKIN ubikwitynuje wcześniej ufosforylowane substraty, które w takim stanie są zdolne do wiązania się z białkami autofagosomalnymi – LC3 oraz białkiem p62, co rozpoczyna proces autofagii całego organellum (Ordureau i wsp., 2014; Pankiv i wsp., 2007). Mutacja genu parkin powoduje powstanie podobnego fenotypu do tego obserwowanego u mutantów pink1.
U D. melanogaster mutanty tego genu wykazują spadek ilości ATP, degenerację neuronów dopaminergicznych, a także defekt morfologii mitochondriów (Sang i wsp., 2007; Yang i wsp., 2006).
Drugą ligazą mitochondrialną, której zmutowana forma powoduje powstanie objawów PD jest MUL1 (z ang. Mitochondrial Ubiquitin Ligase 1). Podobnie jak PARKIN, jest to ligaza ubikwityny E3, posiadająca w swojej strukturze domeny RING. MUL1 klasyfikowana jest także jako ligaza w procesie SUMOilacji (Braschi i wsp., 2009).
Jest to proces potranslacyjnej modyfikacji, w którym dochodzi do koniugacji białka SUMO (z ang. Small Ubiquitin-Like Modifier) z substratami, co w efekcie prowadzi fosforylacji, ubikwitynacji i stabilizacji białek. Podobnie do ubikwitynacji, jest to wieloetapowy proces obejmujący współpracę białek E1, E2 oraz E3 (Geiss-Friedlier i Melchior, 2007).
MUL1 zlokalizowana jest na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, gdzie katalizuje proces
19 SUMOilacji białka DRP1 (z ang. Dynamin-Related Protein 1) stabilizując je oraz proces ubikwitynacji białka Mfn (z ang. Mitofusin) wyznaczając mitochondrium do degradacji (Braschi i wsp., 2009; Harder i wsp., 2004; Lokireddy i wsp., 2012). Powiązanie białka MUL1 oraz choroby Parkinsona zostało po raz pierwszy przedstawione w 2014 roku na modelu muszki owocowej. Wykazano, że MUL1 działa równolegle do białek PINK1/PARKIN promując mitofagię, natomiast jego mutacja powoduje defekt mitochondrialny podobny do obserwowanego u mutantów pink1 i parkin (Yun i wsp., 2014).
W pracy doktorskiej do uzyskania zwierzęcego modelu choroby Parkinsona o charakterze sporadycznym, została użyta neurotoksyna rotenon. Jest to powszechnie stosowany, naturalnie występujący pestycyd organiczny. Rotenon jest inhibitorem o wysokim powinowactwie do pierwszego kompleksu mitochondrialnego (Degli Esposti, 1998).
Jako substancja niezwykle lipofilna, łatwo penetruje błony komórkowe, jest niezależna od transporterów błonowych i szybko przechodzi przez barierę krew-mózg (Talpade i wsp., 2008). Po przedostaniu się do mitochondriów, łączy się on z I kompleksem oddechowym, hamując tym samym jego aktywność, co w efekcie powoduje powstanie dużych ilości wolnych rodników oraz przewlekłego stresu oksydacyjnego. Chroniczna ekspozycja szczurów na rotenon powoduje degenerację neuronów dopaminergicznych prążkowia oraz szlaku nigrostratialnego, a także utratę serotoninergicznych komórek prążkowia.
Skutkuje to wystąpieniem objawów motorycznych, podobnych do tych obserwowanych u ludzi (Betarbet i wsp., 2000). U D. melanogaster rotenon stosowany jest od 2004 roku w stężeniu 500 µM, który powoduje degenerację neuronów dopaminergicznych, zmniejszenie poziomu dostępnej dopaminy oraz mocno zredukowaną długość życia (Coulom i Birman, 2004).
Zegar okołodobowy
Chorzy cierpiący na chorobę Parkinsona, poza objawami behawioralnymi mają również szereg objawów niemotorycznych. Obejmują one ból, deficyty poznawcze, depresję, zespół niespokojnych nóg czy wcześniej wspominane zaburzenia snu. Do tych ostatnich zalicza się przede wszystkim zespół zaburzeń snu REM (z ang. Rapid Eye Movement), fragmentacja snu, nadmierna senność w dzień oraz bezsenność (Suzuki i wsp., 2017).
Fragmentacja i zmniejszona efektywność snu mają wpływ na jakość życia chorych i mogą przyśpieszyć rozwój PD. U osób chorych obserwuje się także nieprawidłowe zmiany
20 w okołodobowym rytmie temperatury ciała oraz ciśnienia krwi (Li i wsp., 2017c). Ponieważ zegar okołodobowy kontroluje wyżej wymienione procesy, może istnieć powiązanie między jego nieprawidłowym funkcjonowaniem a licznymi objawami niemotorycznymi (Ahsan Ejaz i wsp., 2006; Mistlberger, 2005; Tong i wsp., 2000). Większość z wymienionych objawów behawioralnych oraz niemotorycznych jest także obserwowana u zwierzęcych modeli choroby Parkinsona. W pracy doktorskiej jeden z poruszanych aspektów dotyczył zaburzenia zegara okołodobowego u muszki owocowej prezentującej objawy PD.
Jedna z testowanych hipotez zakładała, że uszkodzenie zaburzenie pracy zegara okołodobowego powoduje problemy ze snem, podobnie do tych jak u osób z PD.
Molekularny mechanizm zegara okołodobowego u D. melanogaster opiera się na ekspresji kilku genów oraz ich białek: per (z ang. period), tim (z ang. timeless), clk (z ang. clock), cyc (z ang. cycle), cry (z ang. cryptochrome), pdp (z ang. PAR domain protein) oraz vri (z ang. vrille) (Özkaya i Rosato, 2012). Jego główny gen – per, ulega ekspresji w wielu typach komórek: siatkówce, jelicie, komórkach glejowych, jajnikach, jądrach oraz neuronach zegara (Hardin, 2005). Poziom mRNA oraz poziom białka PER zmieniają się cyklicznie w trakcie doby. Ich maksimum obserwowane jest w nocy, kiedy występuje parogodzinne przesunięcie pomiędzy szczytem ekspresji genu a białka, spowodowane obróbkami potranskrypcyjnymi (Hardin i wsp., 1990; Zeng i wsp., 1994; Zerr i wsp., 1990a).
Białko PER powstaje w cytoplazmie, gdzie jako monomer ulega szybkiej fosforylacji i kierowane jest na drogę proteasomalnej degradacji (Edery i wsp., 1994; Kloss i wsp., 1998).
Natomiast po utworzeniu dimeru z białkiem TIM, PER nie jest więcej fosforylowane i tym samym jego poziom w cytoplazmie wzrasta. Tim, kolejny gen zegara, ulega ekspresji w niektórych fotoreceptorach, interneuronach L1 i L2 oraz w niektórych rejonach mózgu, jak np. ciele grzybkowatym, a także w neuronach zegara (Benna i wsp., 2010). Pod wpływem światła, TIM łączy się z białkiem CRY i kierowane jest do proteasomalnej degradacji (Hunter-Ensor i wsp., 1996; Myers i wsp., 1996a). Po połączeniu z białkiem PER, heterodimer PER-TIM wraz z kinazą DBT (z ang. Double-Time) są transportowane do jądra komórkowego, gdzie następuje fosforylacja białek CLK i CYC (Gekakis i wsp., 1995;
Vosshall i wsp., 1994; Zeng i wsp., 1996). Białka CLK i CYC to czynniki transkrypcyjne zbudowane między innymi z domen PAS i HLH, za pomocą których przyłączają się do sekwencji regulatorowych E-BOX w promotorach genów np. genach per i tim, aktywując ich transkrypcję (Allada i wsp., 1998; Darlington i wsp., 1998). W jądrze komórkowym obecność trimeru PER-TIM-DBT stymuluje fosforylację dimeru CLK-CYC hamując jego aktywność i kierując do degradacji białka CLK, tym samym hamując ekspresję genów per
21 i tim (Lee i wsp., 1999; Yu i wsp., 2006). W ciągu dnia, podczas ekspozycji na światło, TIM łączy się z białkiem CRY będąc tym samym kierowane na szlak proteasomalnej degradacji (Hunter-Ensor i wsp., 1996). Heterodimery PER-TIM nie są tworzone, co skutkuje ponownym przyłączeniem się białek CLK-CYC do sekwencji E-BOX i wznowieniu transkrypcji per i tim (Yu i wsp., 2007). Druga pętla zegara okołodobowego opiera się na ekspresji genów vri i pdp. białka CLK i CYC regulują ekspresję genów vri oraz pdp. VRI ulega translacji w jądrze komórkowym, gdzie rozpoznaje sekwencję V/P BOX w promotorze genu clk, następnie łączy się z nią i tym samym hamuje ekspresję tego genu. Translacja PDP jest opóźniona w stosunku do VRI. Jest to antagonista VRI, a wiążąc się do V/P BOX wznawia transkrypcję clk (Yu i wsp., 2007). Nadrzędny, okołodobowy zegar D. melanogaster, tworzy 150 neuronów, które są zgrupowane w różnych rejonach mózgu.
Zalicza się do nich: neurony brzuszne boczne o dużych ciałach komórkowych lLNvs (z ang. Large Ventral Lateral Neurons), neurony brzuszne boczne o małych ciałach komórkowych sLNvs (z ang. Small Ventral Lateral Neurons), neurony grzbietowe boczne LNd
(z ang. Lateral Dorsal Neurons), neurony grzbietowe DN (z ang. Dorsal Neurons) oraz neurony boczne tylne LPN (z ang. Lateral Posterior Neurons) (Helfrich-Förster, 1998;
Kaneko i wsp., 1997; Siwicki i wsp., 1988a; Zerr i wsp., 1990b). Głównym neuropeptydem zegara, służącym do koordynowania porannych i wieczornych szczytów aktywności, jest PDF (z ang. Pigment Dispersing Factor) (Renn i wsp., 1999). Informacja o zmianach ekspresji genów zegara jest przekazywana szlakami eferentnymi (drogą synaptyczną, między innymi przez PDF) oraz pozasynaptycznymi do komórek niezwiązanych bezpośrednio z zegarem, ustalając tym samym ich okołodobowy profil. Kontrolując ekspresję wielu genów - ccg (z ang. Clock–controlled gens), zegar okołodobowy jest w stanie regulować aktywności komórek i tkanek oraz różne procesy biologiczne, fizjologiczne i behawioralne, takie jak aktywność lokomotoryczna i sen.
Plastyczność synaptyczna
Objawy behawioralne i niemotoryczne występujące w PD mogą być następstwem uszkodzenia neuronów, jak również zaburzonej komunikacji neuronalnej, za którą odpowiedzialne są synapsy. Plastyczność synaptyczna to zdolność synaps do zmian w ich funkcjonowaniu oraz budowie w odpowiedzi na spadek bądź wzrost ich aktywności (Hughes, 1958). Drugi z poruszanych aspektów w pracy doktorskiej dotyczy zaburzenia
22 w funkcjonowaniu synaps w patogenezie choroby. W tej części pracy, próbowano zweryfikować hipotezę, czy poprawa kondycji mitochondriów poprzez zastosowanie manipulacji genetycznych będzie skutkować zahamowaniem uszkodzenia synaps i neuronów w rozwoju choroby Parkinsona.
Plastyczność synaptyczna w określonych obszarach mózgu była szczegółowo badana w patologii PD, a jej zmiany po degeneracji neuronów dopaminergicznych są krytyczne dla rozwoju choroby. W modelach zwierzęcych spadek poziomu dopaminy indukuje szybką i znaczną utratę kolców dendrytycznych i synaps glutaminergicznych w prążkowiu (Day i wsp., 2006). Dopamina odgrywa także istotną rolę w dwukierunkowej plastyczności w ośrodkowych neuronach kolczystych w warunkach fizjologicznych, natomiast w PD plastyczność ta jest zaburzona (Shen i wsp., 2008). Większość badań nad chorobą Parkinsona skupia się na badaniu prążkowia i neuronów tam zlokalizowanych, z uwagi na największą gęstość unerwienia dopaminergicznego w tej strukturze (Graybiel, 1990).
Wykazano, że gęstość kolców dendrytycznych w neuronach prążkowia maleje wraz z rozwojem choroby Parkinsona (Nishijima i wsp., 2014). W zwierzęcych modelach choroby zarówno długotrwałe wzmocnienie synaptyczne – LTP (z ang. Long-term Potentiation) jak i długotrwałe obniżenia synaptyczne – LTD (z ang. Long-term Depression) są nieobecne w średnich neuronach kolczystych (Calabresi i wsp., 2007; Kreitzer i Malenka, 2007).
Przywrócenie LTP w tych samych neuronach jest możliwe poprzez zastosowanie kuracji lewodopy (Picconi i wsp., 2003). Wiele badań wykazało także, że kora ruchowa również jest uszkodzona w PD. Ostatnie badania donoszą o nieprawidłowej przebudowie sieci neuronalnej w korze ruchowej u różnych modeli choroby (Guo i wsp., 2015). Stwierdzono, że w warstwie V kory ruchowej dochodzi do znaczącej eliminacji i nieprawidłowego formowania dendrytów, co w efekcie powoduje zmniejszenie objętości tkanki. Również LTP oraz LTD w korze ruchowej jest silnie zredukowane (Eggers i wsp., 2010; Suppa i wsp., 2011;
Ueki i wsp., 2006), co może być przyczyną niefunkcjonalnych receptorów dopaminowych (Molina-Luna i wsp., 2009). Powyższe doniesienia wskazują na fakt, że zredukowanie plastyczności synaptycznej oraz uszkodzenie synaps w obrębie kory ruchowej mogą być bezpośrednią przyczyną objawów motorycznych w chorobie Parkinsona. W niniejszej pracy scharakteryzowane zostały również strukturalne uszkodzenia synaptyczne u modelu sporadycznego jak i genetycznego PD.
23
Cel pracy
Celem prezentowanej rozprawy doktorskiej było poznanie roli dwóch ligaz mitochondrialnych MUL1 oraz PARKIN w rozwoju choroby Parkinsona z wykorzystaniem modelu D. melanogaster. Scharakteryzowano powiązanie PD z zaburzeniami zegara okołodobowego, który odpowiada za kontrolę rytmiki snu i czuwania oraz opisano możliwy mechanizm tego zaburzenia. Przedmiotem badań było także ustalenie czy zwiększenie ekspresji badanych ligaz mitochondrialnych wpłynie protekcyjnie na neurony wystawiane na działanie rotenonu. Przy zastosowaniu technik mikroskopowych oraz technik biologii molekularnej badano strukturalne nieprawidłowości synaps na modelach genetycznych i sporadycznych choroby Parkinsona u D. melanogaster.
24
Dyskusja
W rozprawie doktorskiej pt. „Rola wybranych białek mitochondrialnych w chorobie Parkinsona - badania na modelu Drosophila melanogaster” wykazano, że zaburzenia zegara okołodobowego odgrywają ważną rolę w patogenezie choroby Parkinsona. W badaniach wykorzystano modele genetyczne – mutacje genów mul1 oraz park, w celu scharakteryzowania możliwego mechanizmu tego zaburzenia. Dodatkowo, w osobnym cyklu prowadzonych badań, wykazano rolę ligaz MUL1 i PARK w neuroprotekcji w PD, z wykorzystaniem sporadycznego modelu choroby poprzez ekspozycję D. melanogaster na rotenon. Scharakteryzowano także molekularne i strukturalne (poprzez wykorzystanie elektronowej mikroskopii transmisyjnej) uszkodzenie synaps wywołane wpływem rotenonu oraz mutacji pink1. Zestawienie wyników otrzymanych z przeprowadzonych eksperymentów pozwala na bardziej dokładne poznanie patogenezy choroby Parkinsona oraz tłumaczy, że zaburzenie zegara biologicznego oraz mitofagii są najprawdopodobniej przyczyną problemów ze snem oraz obumierania neuronów występujących w trakcie trwania choroby.
W ramach przygotowania niniejszej rozprawy doktorskiej opublikowano trzy oryginalne publikacje naukowe o zasięgu międzynarodowym. W pierwszej z nich „Effects of MUL1 and PARKIN on the circadian clock, brain and behaviour in Drosophila Parkinson’s disease models” zbadano rolę zaburzenia zegara okołodobowego w rozwoju choroby Parkinsona. Głównym założeniem pracy było sprawdzenie czy zaburzenia snu, które występują u chorych, mogą wynikać z nieprawidłowo funkcjonującego zegara okołodobowego. W pracy jako model wykorzystano szczepy D. melanogaster z mutacją genu mul1 oraz park, wykazujące typowe objawy PD. Mutacje tych genów prowadzą do zmniejszenia ilości mitochondriów oraz zwiększenia ich wymiarów (Park i wsp., 2006a; Yun i wsp., 2014). Udowodniono, że u mutantów mul1 i park występuje wyższy poziom wolnych rodników, co jest wynikiem występowania uszkodzonych mitochondriów w komórkach, jak również zmniejszony poziom endogennego antyoksydantu – SOD 1, który odpowiada za ich rozkład (Bunton-Stasyshyn i wsp., 2015). U mutantów wykryto również mniejszy poziom białka ATG5 (z ang. Autophagy-related 5), odpowiedzialnego za prawidłowy przebieg procesu autofagii. Zahamowanie procesu autofagii zwiększa liczbę uszkodzonych organelli i białek komórkowych, co w rezultacie wzmaga proces degeneracji komórki (Henchcliffe i Beal, 2008). Z drugiej strony, wyniki innych autorów wykazały, że wzmożony stres oksydacyjny stymuluje proces autofagii w celu usunięcia uszkodzonych białek,
25 które mogą być źródłem stresu oksydacyjnego (Li i wsp., 2017a; Matus i wsp., 2008).
Natomiast przewlekły stres oksydacyjny powoduje defekt autofagii, co również potwierdzają prezentowane wyniki (Cai i Liu, 2012).
W kolejnym etapie badań wykazano, że długość życia badanych mutantów jest krótsza, a czas snu zredukowany. Skrócenie długości życia u mutantów jest najprawdopodobniej konsekwencją zahamowania autofagii. Wyniki innych autorów sugerują, że redukcja poziomu innego białka zaangażowanego w autofagię - ATG9 również skraca długość życia (Wen i wsp., 2017). Oprócz skróconego czasu życia, u mutantów zaobserwowano także zwiększoną aktywność lokomotoryczną i zaburzenia snu.
Ponadto mutacja park zwiększa poziom aktywności muszki owocowej w ciągu dnia (Julienne i wsp., 2017), co również potwierdziły prezentowane wyniki (dla mutantów park oraz dodatkowo mutantów mul1). Jak wspomniano wcześniej, sen jest regulowany przez zegar okołodobowy (Cavanaugh i wsp., 2016; Zhou i wsp., 2014), a u muszki owocowej kontrolowany za pośrednictwem PDF-pozytywnych neuronów lLNvs (Parisky i wsp., 2008).
Pokazuje to, że zaburzenia snu mogą prawdopodobnie wynikać z zahamowania autofagii w tej grupie neuronów, co prezentowane wyniki. W kolejnym etapie badań scharakteryzowano molekularne zmiany w zegarze biologicznym u mutantów park i mul1.
Po pierwsze, stwierdzono, że w przypadku mutacji park następuje parogodzinne przesunięcie w fazie rytmu i szczytu poziomu mRNA genów per i tim oraz zmiany w dobowej ekspresji clk. Z kolei u mutantów mul1 zaobserwowano zmiany w poziomie ekspresji genów zegara, podczas gdy ich rytm został zachowany. Pomimo faktu, że u obu mutantów rytmika ekspresji badanych genów była wyraźna, rytm zmian poziomu białka PER jest całkowicie zniesiony.
Różnice pomiędzy transkrypcją, a translacją PER mogą wynikać z nieprawidłowo działających czynników translacyjnych, co może powodować wysoki poziom ROS. Badania innych autorów potwierdziły, że zwiększona aktywność czynnika translacyjnego eIF2α (z ang. Eukaryotic Initiation Factor 2) wzmaga ekspresję PER (Lee i wsp., 2018).
Wysoki poziom stresu oksydacyjnego może także degradować białko SLIMB, odpowiedzialnego za degradację PER w proteasomach (Grima i wsp., 2002).
Niska aktywność SLIMB może zahamować degradację PER, zwiększając w ten sposób jego poziom i zmieniając profil jego ekspresji. Wolne rodniki mogą także bezpośrednio
„resetować” zegar okołodobowy poprzez modyfikację aktywności kinazy kazeinowej CK2 (z ang. Casein Kinase 2) (Tamaru i wsp., 2013). CK2 fosforyluje PER i TIM oraz reguluje ich poziom w czasie potranslacyjnej modyfikacji PER (Lin i wsp., 2002). Wolne rodniki mogą również wpływać na ekspresję genów zegara. U ssaków wysoki poziom ROS powoduje silną
26 indukcję ekspresji genów zegara (Tahara i Shibata, 2018). Wolne rodniki mogą także degradować czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów zegara i białek stabilizujących mRNA, takich jak kinaza NEMO, VRILLE czy PDP1 (Akten i wsp., 2003;
Cyran i wsp., 2003; Kloss i wsp., 1998). Zaburzenie zegara może być także spowodowana wcześniej wspominanym wpływem stresu oksydacyjnego i zahamowaniem autofagii w komórkach zegara. Wspólna lokalizacja białek ATG5 i PDF w ciele komórkowym neuronów lLNvs zaobserwowana w obecnych badaniach, wskazuje, że białka zegara mogę także być degradowane na drodze autofagii. W tej grupie neuronów wszystkie badane geny ulegają ekspresji, podobnie jak zmiany poziomu białka PER (Myers i wsp., 1996b; Siwicki i wsp., 1988b; Zerr i wsp., 1990a). Ponadto zaobserwowano, że poziom ATG5 w tych neuronach jest mniejszy u obu mutantów niż u szczepów kontrolnych, co potwierdza związek molekularnego mechanizmu zegara z autofagią. Mutanty mul1 prezentowały także zmniejszony poziom badanego białka względem mutantów park, co najprawdopodobniej spowodowane jest różnymi funkcjami tych białek. Pomimo, że są to ligazy mitochondrialne zaangażowane w mitofagię, MUL1 uczestniczy także w SUMOilacji, za pośrednictwem którego różne białka są stabilizowane np. transporter glukozy czy α-synukleina (Dorval i Fraser, 2006; Giorgino i wsp., 2000). SUMOilacja zabezpiecza również białka przed wpływem wolnych rodników (Marcelli i wsp., 2018), więc jej zahamowanie tłumaczy zwiększoną wrażliwość białek na stres oksydacyjny. Podsumowując, w tym artykule wykazano, że mutacje genów mul1 i park, biorące udział w patogenezie choroby Parkinsona, zakłócają pewne procesy fizjologiczne, w tym molekularny mechanizm zegara okołodobowego, co z kolei wpływa na sen. Prawdopodobnie efekt ten wynika ze zwiększonego poziomu wolnych rodników i zahamowania autofagii, co jest kluczowe w generowaniu rytmów okołodobowych.
W kolejnym artykule zatytułowanym „Overexpression of Mitochondrial Ligases Reverses Rotenone-Induced Effects in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease” opisano potencjalną metodę neuroprotekcji w chorobie Parkinsona. Głównym założeniem było zweryfikowanie czy zwiększenie poziomu mitofagii przez nadekspresję ligaz MUL1 i PARK będzie wpływało protekcyjnie na synapsy i neurony w PD. Do wywołania objawów choroby wykorzystano w tym przypadku wcześniej opisywaną neurotoksynę – rotenon. W badaniach udowodniono, że mechanizm działania rotenonu jest podobny do mechanizmu wywołanego mutacjami genów mul1 oraz park, który opisano w poprzednim artykule. Ekspozycja na 500 µM rotenon (Coulom i Birman, 2004) zmniejszyła poziom białek ATG5 oraz SOD1.
27 Udowodniono także, że rotenon wpływa na apoptozę zwiększając poziom białka Dcp-1 (z ang. Death caspase-1) (Xu i wsp., 2009). W badaniach innych autorów zaobserwowano także, że neurotoksyna indukuje zmiany w poziomie kliku innych białek apoptotycznych, takich jak Bcl2, Bax, kaspaza-8 i cytochrom C (Dhanalakshmi i wsp., 2016) oraz, że autofagia zapobiega apoptozie zależnej od stresu oksydacyjnego (Li i wsp., 2017b).
W dalszych badaniach wykazano, że rotenon obniża zdolność muszek owocowych do wspinania się i ich aktywność lokomotoryczną w ciągu dnia. Jest to najprawdopodobniej spowodowane zwiększonym poziomem wolnych rodników i apoptozą (Rosińczuk i wsp., 2018), a także degeneracją neuronów. We wcześniej pracach pokazano również, że stres oksydacyjny wpływa na zachowanie (Camargo i wsp., 2018). W prezentowanych badaniach udowodniono, że nadekspresja ligaz MUL1 i PARK w neuronach przywraca prawidłowy poziom autofagii, apoptozy i endogennego antyoksydantu, co w rezultacie przekłada się na kolejny wynik – poprawę wspinaczki oraz aktywności lokomotorycznej. Zaburzenia motoryczne mogą także wynikać z uszkodzonych synaps w układzie nerwowym i połączeń nerwowomięśniowych po ekspozycji na rotenon. Zaobserwowano, że rotenon zmniejsza poziom kilku białek związanych z transmisją synaptyczną: Dlg1 (z ang. Discs Large 1), synapsyny oraz synaptotagminy. Dlg1 odpowiedzialne jest za grupowanie receptorów neurotransmiterów i kanałów jonowych w błonie postsynaptycznej i pośredniczenie w adhezji komórkowej (Kim i wsp., 2014). Synapsyna jest ważnym białkiem grupującym pęcherzyki synaptyczne w miejscu presynaptycznym i regulującym plastyczność synaptyczną (Vasin i wsp., 2014). Z kolei synaptotagmina działa jak czujnik Ca2+ i odpowiada za egzocytozę neuroprzekaźnika (Geppert i wsp., 1994). Niski poziom synapsyny bądź synaptotagminy prowadzi do słabej transmisji synaptycznej i zaburzeń motorycznych (Lai i wsp., 2015; Sampedro-Piquero i wsp., 2014). Co więcej, niski poziom białek synaptycznych jest także skorelowany z wysokim poziomem wolnych rodników, które jak opisano powyżej, nasilają apoptozę i zmniejszają autofagię. Niski poziom białek synaptycznych wynika także ze słabej aktywności czynników translacyjnych, biorących udział w translacji tych białek, za co również odpowiedzialny jest stres oksydacyjny (Lee i wsp., 2018). Jak pokazują prezentowane wyniki, rotenon zmniejsza poziom białek ATG5, SOD1, podczas gdy ekspresja ich genów pozostaje prawidłowa. Aby podkreślić, że rotenon uszkadza synapsy, ich strukturę zanalizowano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Zbadano morfologię elementów presynaptycznych w synapsach tetradycznych, w pierwszym neuropilu płata wzrokowego D. melanogaster. Synapsy te przekazują informacje wzrokowe z fotoreceptorów oka do interneuronów płata wzrokowego
28 mózgu. Stwierdzono, że rotenon wpływa na morfologię pęcherzyków synaptycznych oraz stref aktywnych, odpowiedzialnych za egzocytozę neuroprzekaźnika do szczeliny synaptycznej. Strefa aktywna w presynaptycznem elemencie synapsy jest miejscem, w którym dochodzi do fuzji pęcherzyka synaptycznego z błoną presynaptyczną pod wpływem wzrostu stężenia jonów wapnia (Wichmann i Sigrist, 2010). Prawidłowy rozwój synaps jest także zależny od autofagii (Shen i Ganetzky, 2009), która jest obniżona przez działanie rotenonu, a także od wpływu wolnych rodników (Kamat i wsp., 2016; Milton i Sweeney, 2012). Zmian w synapsach spowodowanych rotenonem nie odnotowano u szczepów z nadekspresją ligaz MUL1 i PARK. Strefy aktywne wyglądały prawidłowo w obu przypadkach, a pęcherzyki synaptyczne były okrągłe, elektronowo gęste, co jest typowe dla prawidłowych synaps. W kolejnym eksperymencie zbadana została liczba neuronów dopaminergicznych u szczepów z nadekspresją w/w ligaz po ekspozycji na rotenon.
Wcześniej opublikowane wyniki innych naukowców wykazały, że rotenon w stężeniu 500 µM wywołuje degenerację neuronów dopaminergicznych u muszki owocowej (Coulom i Birman, 2004). Spadek liczby neuronów jest skorelowany ze spadkiem poziomu dopaminy, co prawdopodobnie prowadzi do problemów motorycznych (Santiago i wsp., 2014; Smith i wsp., 2013). Zaobserwowano zmniejszoną liczbę neuronów dopaminowych po ekspozycji na rotenon, podczas gdy nadekspresja ligaz mitochondrialnych w neuronach szczepów karmionych rotenonem chroniła przed jego toksycznością i zapobiegała procesom neurodegeneracyjnym. Podsumowując, w niniejszym artykule wykazano że rotenon w stężeniu 500 µM zmniejsza poziom autofagii, a zwiększa apoptozę i ilość wolnych rodników. Prowadzi to do zaburzenia funkcji i morfologii synaps, aktywności lokomotorycznej oraz zmniejsza liczbę neuronów dopaminergicznych w mózgu D. melanogaster. Udowodniono także, że nadekspresja dwóch głównych ligaz mitochondrialnych we wszystkich neuronach działa protekcyjnie, ponieważ hamuje działanie rotenonu. Neurodegeneracja wydaje się zależeć nie tylko od braku ATP z powodu uszkodzonych mitochondriów, ale także z powodu ich niszczącego działania w komórce.
W ostatnim artykule, stanowiącym część prezentowanej rozprawy doktorskiej, pt. „Effects of PINK1 mutation on synapses and behavior in the brain of Drosophila melanogaster” zbadano zmiany morfologiczne synaps w genetycznym modelu choroby Parkinsona. Założeniem tej pracy było zweryfikowanie czy genetyczne modele choroby wykazują podobne uszkodzenie synaps jak modele sporadyczne (ekspozycja na rotenon).
29 W tym przypadku jako model genetyczny wykorzystano szczepy D. melanogaster z mutacją genu kodującego białko PINK1. Mutacja pink1 u muszki owocowej powoduje zmiany morfologii mitochondriów (Clark i wsp., 2006; Park i wsp., 2006c), prowadzące do zmniejszonej ilości dostępnej energii w postaci ATP (Liu i wsp., 2011), co przekładać się może na zaburzenia behawioralne i niemotoryczne. Ponadto u mutantów pink1 zaobserwowano defekt morfologiczny mięśni odpowiadających za lot (Park i wsp., 2006c) oraz apoptozę tych komórek (Clark i wsp., 2006). Park i wsp. (2006c) stwierdzili, że mutacja ta nie tylko powoduje zaburzenia ruchowe i obniża aktywność lokomotoryczną, ale także wpływa na synapsy i aktywność synaptyczną w mózgu. Wykazano, że mutanty mają też nieprawidłowy profil snu, a ich całkowita aktywność mierzona w trakcie 24 godzin jest obniżona. Wyniki te sugerują rolę PINK1 w utrzymaniu cyklu snu i czuwania.
Co ciekawe, zmiany aktywności zaobserwowano tylko w ciągu dnia, kiedy liczba mitochondriów jest największa. Na podstawie tych wyników możemy wnioskować, że cykl snu/aktywność D. melanogaster w ciągu dnia jest najprawdopodobniej skorelowana z obniżeniem aktywności mitochondriów w komórkach mózgu w ciągu dnia. W kolejnych badaniach stwierdzono, że mutacja pink1 wpływa na synapsy poprzez zmniejszenie ilości presynaptycznego białka BRP (z ang. Bruchpilot), budującego strefę aktywną oraz odpowiedzialnego za egzocytozę neuroprzekaźnika (Wagh i wsp., 2006), a także innych białek zaangażowanych w transmisję synaptyczną. Wykazano, że mutacja pink1 zmniejsza ilość białka BRP zarówno w mózgu, jak również w poprzednio opisywanych synapsach tetradycznych układu wzrokowego. W synapsach tetradycznych białko BRP ulega dobowym zmianom, które skorelowane są ze zmianami liczby elementów presynaptycznych (Górska-Andrzejak i wsp., 2013) Jednak dobowy rytm zmian BRP utrzymywany jest u szczepów z badaną mutacją. Fakt, że dobowa ekspresja białka BRP w synapsach tetradycznych nie ulega zmianie jest zaskakująca, ponieważ zaangażowanie mitochondriów w neuroplastyczność i plastyczność synaptyczną jest dobrze udokumentowane.
Ponieważ taki sam wynik zmian BRP stwierdzono również w homogenacie otrzymanym z całego mózgu, upośledzenie synaps występuje prawdopodobnie także w synapsach nerwowo-mięśniowych, w których białko BRP również występuje (Wagh i wsp., 2006).
Uszkodzenie synaps potwierdzają dodatkowo mikrofotografie z mikroskopu elektronowego, pokazujące pęknięte pęcherzyki synaptyczne i mniejsze strefy aktywne u mutantów pink1.
Wyniki te wskazują na fakt, że mutacja pink1 wpływa na transmisję synaptyczną, najprawdopodobniej przez zwiększoną produkcję wolnych rodników (Chien i wsp., 2013), które bezpośrednie powodują uszkodzenie układu nerwowego. Wagh i wsp. wykazali,
30 że szczepy ze zredukowaną ilością białka BRP mają podobne problemy motoryczne do tych obserwowanych w prezentowanych badaniach (Wagh i wsp., 2006). W badaniach opisanych w niniejszym artykule wykazano, że białko PINK1 jest niezbędne do utrzymania prawidłowego profilu snu w ciągu dnia i nocy, a także do odpowiedniej aktywności i morfologii synaps. Brak tego białka powoduje zmniejszenie ilości białek synaptycznych oraz zmiany ich morfologii, co w rezultacie najprawdopodobniej prowadzi do wcześniej opisanych zaburzeń motorycznych.
31
Wnioski
Wyniki uzyskane w prezentowanej rozprawie doktorskiej pozwalają na sformułowanie następujących wniosków :
1) Białka MUL1 i PARK zaangażowane są w prawidłowe funkcjonowanie zegara okołodobowego u D. melanogaster. Mutacje ich genów powodują parogodzinne przesunięcie w rytmicznej ekspresji głównych genów zegara, a także znoszą rytm zmian poziomu białka PER, co łącznie skutkuje wydłużonym okresem rytmu aktywności lokomotorycznej.
2) Białka MUL1 i PARK odpowiadają za utrzymanie prawidłowego procesu autofagii oraz eliminacji uszkodzonych mitochondriów, które są źródłem wolnych rodników.
3) Nieprawidłowe funkcjonowanie zegara okołodobowego w chorobie Parkinsona najprawdopodobniej jest przyczyną obserwowanych problemów ze snem.
4) Białka zegara najprawdopodobniej są również degradowane na drodze autofagii.
Tłumaczy to obecności białka ATG5 w neuronach lLNvs oraz fakt, że w genetycznych modelach PD poziom białka ATG5 w tych neuronach jest zmniejszony, a molekularny zegar uszkodzony.
5) Nadekspresja genów kodujących MUL1 i PARK wpływa protekcyjnie na neurony i synapsy w sporadycznym modelu choroby Parkinsona wywołanym rotenonem.
Degeneracja neuronów dopaminergicznych w mózgu jest zahamowana, jak również zmiany w morfologii i funkcjonowaniu synaps nie są obserwowane pomimo ekspozycji na neurotoksynę.
6) Nadekspresja ligaz mitochondrialnych MUL1 i PARK przywraca prawidłową autofagię, apoptozę oraz ilość SOD1 podczas stosowania rotenonu.
7) Białko PINK1 jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania synaps oraz utrzymaniu ich prawidłowej morfologii, jak również jest niezbędne do utrzymania prawidłowego profilu rytmu snu i aktywności lokomotorycznej.
32
Piśmiennictwo
Ahsan Ejaz, A., Sekhon, I. S., i Munjal, S. (2006). Characteristic findings on 24-h ambulatory blood pressure monitoring in a series of patients with Parkinson’s disease. Eur. J. Intern.
Med. 17, 417–420. doi:10.1016/j.ejim.2006.02.020.
Akten, B., Jauch, E., Genova, G. K., Kim, E. Y., Edery, I., Raabe, T., i wsp. (2003). A role for CK2 in the Drosophila circadian oscillator. Nat. Neurosci. 6, 251–257.
doi:10.1038/nn1007.
Allada, R., White, N. E., So, W. V, Hall, J. C., i Rosbash, M. (1998). A mutant Drosophila homolog of mammalian Clock disrupts circadian rhythms and transcription of period and timeless. Cell 93, 791–804. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9630223 [Accessed December 10, 2018].
Benna, C., Bonaccorsi, S., Wülbeck, C., Helfrich-Förster, C., Gatti, M., Kyriacou, C. P., i wsp. (2010). Drosophila timeless2 Is Required for Chromosome Stability and Circadian Photoreception. Curr. Biol. 20, 346–352. doi:10.1016/j.cub.2009.12.048.
Betarbet, R., Sherer, T. B., MacKenzie, G., Garcia-Osuna, M., Panov, A. V., i Greenamyre, J.
T. (2000). Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nat. Neurosci. 3, 1301–1306. doi:10.1038/81834.
Braschi, E., Zunino, R., i McBride, H. M. (2009). MAPL is a new mitochondrial SUMO E3 ligase that regulates mitochondrial fission. EMBO Rep. 10, 748–754.
doi:10.1038/embor.2009.86.
Bunton-Stasyshyn, R. K. A., Saccon, R. A., Fratta, P., i Fisher, E. M. C. (2015). SOD1 Function and Its Implications for Amyotrophic Lateral Sclerosis Pathology. Neurosci.
21, 519–529. doi:10.1177/1073858414561795.
Cai, D., i Liu, T. (2012). Inflammatory cause of metabolic syndrome via brain stress and NF- κB. Aging (Albany. NY). 4, 98–115. doi:10.18632/aging.100431.
Calabresi, P., Picconi, B., Tozzi, A., i Di Filippo, M. (2007). Dopamine-mediated regulation of corticostriatal synaptic plasticity. Trends Neurosci. 30, 211–219.
doi:10.1016/j.tins.2007.03.001.
Camargo, A., Dalmagro, A. P., Rikel, L., da Silva, E. B., Simão da Silva, K. A. B., i Zeni, A.
L. B. (2018). Cholecalciferol counteracts depressive-like behavior and oxidative stress induced by repeated corticosterone treatment in mice. Eur. J. Pharmacol. 833, 451–461.
doi:10.1016/j.ejphar.2018.07.002.
33 Cavanaugh, D. J., Vigderman, A. S., Dean, T., Garbe, D. S., i Sehgal, A. (2016). The Drosophila Circadian Clock Gates Sleep through Time-of-Day Dependent Modulation of Sleep-Promoting Neurons. Sleep 39, 345–356. doi:10.5665/sleep.5442.
Chen, Y., i Dorn, G. W. (2013). PINK1-phosphorylated mitofusin 2 is a Parkin receptor for culling damaged mitochondria. Science 340, 471–5. doi:10.1126/science.1231031.
Chien, W. L., Lee, T. R., Hung, S. Y., Kang, K. H., Wu, R. M., Lee, M. J., i wsp. (2013).
Increase of oxidative stress by a novel PINK1 mutation, P209A. Free Radic. Biol. Med.
58, 160–169. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2012.12.008.
Ciechanover, A. (2005). Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat.
Rev. Mol. Cell Biol. 6, 79–87. doi:10.1038/nrm1552.
Clark, I. E., Dodson, M. W., Jiang, C., Cao, J. H., Huh, J. R., Seol, J. H., i wsp. (2006).
Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature 441, 1162–1166. doi:10.1038/nature04779.
Coulom, H., i Birman, S. (2004). Chronic Exposure to Rotenone Models Sporadic Parkinson’s Disease in Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 24, 10993–10998.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2993-04.2004.
Cyran, S. A., Buchsbaum, A. M., Reddy, K. L., Lin, M.-C., Glossop, N. R. J., Hardin, P. E., i wsp. (2003). vrille, Pdp1, and dClock form a second feedback loop in the Drosophila
circadian clock. Cell 112, 329–41. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12581523 [Accessed May 15, 2018].
Darlington, T. K., Wager-Smith, K., Ceriani, M. F., Staknis, D., Gekakis, N., Steeves, T. D., i wsp. (1998). Closing the circadian loop: CLOCK-induced transcription of its own inhibitors per and tim. Science 280, 1599–603. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9616122 [Accessed December 10, 2018].
Day, M., Wang, Z., Ding, J., An, X., Ingham, C. A., Shering, A. F., i wsp. (2006). Selective elimination of glutamatergic synapses on striatopallidal neurons in Parkinson disease models. Nat. Neurosci. 9, 251–259. doi:10.1038/nn1632.
Deas, E., Plun-Favreau, H., Gandhi, S., Desmond, H., Kjaer, S., Loh, S. H. Y., i wsp. (2011).
PINK1 cleavage at position A103 by the mitochondrial protease PARL. Hum. Mol.
Genet. 20, 867–879. doi:10.1093/hmg/ddq526.
Degli Esposti, M. (1998). Inhibitors of NADH–ubiquinone reductase: an overview. Biochim.
Biophys. Acta - Bioenerg. 1364, 222–235. doi:10.1016/S0005-2728(98)00029-2.
Del Tredici, K., i Braak, H. (2012). Lewy pathology and neurodegeneration in premotor Parkinson’s disease. Mov. Disord. 27, 597–607. doi:10.1002/mds.24921.
34 DeMaagd, G., i Philip, A. (2015). Parkinson’s Disease and Its Management: Part 1: Disease Entity, Risk Factors, Pathophysiology, Clinical Presentation, and Diagnosis. P T 40, 504–32. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26236139 [Accessed December 4, 2018].
Dhanalakshmi, C., Janakiraman, U., Manivasagam, T., Justin Thenmozhi, A., Essa, M. M., Kalandar, A., i wsp. (2016). Vanillin Attenuated Behavioural Impairments, Neurochemical Deficts, Oxidative Stress and Apoptosis Against Rotenone Induced Rat Model of Parkinson’s Disease. Neurochem. Res. 41, 1899–1910. doi:10.1007/s11064- 016-1901-5.
Dorval, V., i Fraser, P. E. (2006). Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) Modification of Natively Unfolded Proteins Tau and α-Synuclein. J. Biol. Chem. 281, 9919–9924.
doi:10.1074/jbc.M510127200.
Driver, J. A., Logroscino, G., Gaziano, J. M., i Kurth, T. (2009). Incidence and remaining lifetime risk of Parkinson disease in advanced age. Neurology 72, 432–438.
doi:10.1212/01.wnl.0000341769.50075.bb.
Edery, I., Rutila, J. E., i Rosbash, M. (1994). Phase shifting of the circadian clock by induction of the Drosophila period protein. Science 263, 237–40. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8284676 [Accessed December 10, 2018].
Eggers, C., Fink, G. R., i Nowak, D. A. (2010). Theta burst stimulation over the primary motor cortex does not induce cortical plasticity in Parkinson’s disease. J. Neurol. 257, 1669–1674. doi:10.1007/s00415-010-5597-1.
Eiyama, A., i Okamoto, K. (2015). PINK1/Parkin-mediated mitophagy in mammalian cells.
Curr. Opin. Cell Biol. 33, 95–101. doi:10.1016/j.ceb.2015.01.002.
Feany, M. B., i Bender, W. W. (2000). A Drosophila model of Parkinson ’ s disease. 404.
Geiss-Friedlander, R., i Melchior, F. (2007). Concepts in sumoylation: a decade on. Nat. Rev.
Mol. Cell Biol. 8, 947–956. doi:10.1038/nrm2293.
Gekakis, N., Saez, L., Delahaye-Brown, A. M., Myers, M. P., Sehgal, A., Young, M. W., i wsp. (1995). Isolation of timeless by PER protein interaction: defective interaction between timeless protein and long-period mutant PERL. Science 270, 811–5. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7481773 [Accessed December 10, 2018].
Geppert, M., Goda, Y., Hammer, R. E., Li, C., Rosahl, T. W., Stevens, C. F., i wsp. (1994).
Synaptotagmin I: a major Ca2+ sensor for transmitter release at a central synapse. Cell 79, 717–27. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7954835 [Accessed September 12, 2018].
35 Giorgino, F., de Robertis, O., Laviola, L., Montrone, C., Perrini, S., McCowen, K. C., i wsp.
(2000). The sentrin-conjugating enzyme mUbc9 interacts with GLUT4 and GLUT1 glucose transporters and regulates transporter levels in skeletal muscle cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 97, 1125–30. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10655495 [Accessed May 15, 2018].
Górska-Andrzejak, J., Makuch, R., Stefan, J., Görlich, A., Semik, D., i Pyza, E. (2013).
Circadian expression of the presynaptic active zone protein bruchpilot in the lamina of Drosophila melanogaster. Dev. Neurobiol. 73, 14–26. doi:10.1002/dneu.22032.
Graybiel, A. M. (1990). Neurotransmitters and neuromodulators in the basal ganglia. Trends Neurosci. 13, 244–54. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1695398 [Accessed December 11, 2018].
Greene, A. W., Grenier, K., Aguileta, M. a, Muise, S., Farazifard, R., Haque, M. E., i wsp.
(2012). Mitochondrial processing peptidase regulates PINK1 processing, import and Parkin recruitment. EMBO Rep. 13, 378–385. doi:10.1038/embor.2012.14.
Grima, B., Lamouroux, A., Chélot, E., Papin, C., Limbourg-Bouchon, B., i Rouyer, F. (2002).
The F-box protein Slimb controls the levels of clock proteins Period and Timeless.
Nature 420, 178–182. doi:10.1038/nature01122.
Guo, L., Xiong, H., Kim, J.-I., Wu, Y.-W., Lalchandani, R. R., Cui, Y., i wsp. (2015).
Dynamic rewiring of neural circuits in the motor cortex in mouse models of Parkinson’s disease. Nat. Neurosci. 18, 1299–1309. doi:10.1038/nn.4082.
Harder, Z., Zunino, R., i McBride, H. (2004). Sumo1 conjugates mitochondrial substrates and participates in mitochondrial fission. Curr. Biol. 14, 340–345. doi:10.1016/S0960- 9822(04)00084-3.
Hardin, P. E. (2005). The Circadian Timekeeping System of Drosophila. Curr. Biol. 15, R714–R722. doi:10.1016/j.cub.2005.08.019.
Hardin, P. E., Hall, J. C., i Rosbash, M. (1990). Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature 343, 536–540.
doi:10.1038/343536a0.
Helfrich-Förster, C. (1998). Robust circadian rhythmicity of Drosophila melanogaster requires the presence of lateral neurons: a brain-behavioral study of disconnected mutants. J. Comp. Physiol. A Sensory, Neural, Behav. Physiol. 182, 435–453.
doi:10.1007/s003590050192.
Henchcliffe, C., i Beal, M. F. (2008). Mitochondrial biology and oxidative stress in Parkinson disease pathogenesis. Nat. Clin. Pract. Neurol. 4, 600–609. doi:10.1038/ncpneuro0924.
36 Hughes, J. R. (1958). Post-Tetanic Potentiation. Physiol. Rev. 38, 91–113.
doi:10.1152/physrev.1958.38.1.91.
Hunter-Ensor, M., Ousley, A., i Sehgal, A. (1996). Regulation of the Drosophila protein timeless suggests a mechanism for resetting the circadian clock by light. Cell 84, 677–
85. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8625406 [Accessed December 10, 2018].
Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., i Hodge, J. J. L. (2017). Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes.
Neurobiol. Dis. 104, 15–23. doi:10.1016/j.nbd.2017.04.014.
Kamat, P. K., Kalani, A., Rai, S., Swarnkar, S., Tota, S., Nath, C., i wsp. (2016). Mechanism of Oxidative Stress and Synapse Dysfunction in the Pathogenesis of Alzheimer’s Disease: Understanding the Therapeutics Strategies. Mol. Neurobiol. 53, 648–661.
doi:10.1007/s12035-014-9053-6.
Kaneko, M., Helfrich-Förster, C., i Hall, J. C. (1997). Spatial and temporal expression of the period and timeless genes in the developing nervous system of Drosophila: newly identified pacemaker candidates and novel features of clock gene product cycling. J.
Neurosci. 17, 6745–60. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9254686 [Accessed December 10, 2018].
Kim, S. T., Ahn, S.-Y., Swat, W., i Miner, J. H. (2014). DLG1 influences distal ureter maturation via a non-epithelial cell autonomous mechanism involving reduced retinoic acid signaling, Ret expression, and apoptosis. Dev. Biol. 390, 160–9.
doi:10.1016/j.ydbio.2014.03.014.
Kim, Y. S., i Joh, T. H. (2006). Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333–347.
doi:10.1038/emm.2006.40.
Kitada, T., Asakawa, S., Hattori, N., Matsumine, H., Yamamura, Y., Minoshima, S., i wsp.
(1998). Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism.
Nature 392, 605–608. doi:10.1038/33416.
Kloss, B., Price, J. L., Saez, L., Blau, J., Rothenfluh, A., Wesley, C. S., i wsp. (1998). The Drosophila clock gene double-time encodes a protein closely related to human casein
kinase Iepsilon. Cell 94, 97–107. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9674431 [Accessed May 15, 2018].
Kreitzer, A. C., i Malenka, R. C. (2007). Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson’s disease models. Nature 445, 643–647.
