Mechanizm produkcji anionorodnika ponadtlenkowego przez cytochrom $bc_{1}$ badany poprzez modyfikację poszczególnych etapów przepływu elektronów w łańcuchach kofaktorów

WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII

Praca doktorska

Arkadiusz Borek

Mechanizm produkcji anionorodnika ponadtlenkowego przez cytochrom bc

badany poprzez modyfikację poszczególnych

etapów przepływu elektronów w łańcuchach kofaktorów

Promotor: prof. dr hab. Artur Osyczka Recenzenci: prof. dr hab. Wojciech Froncisz

prof. dr hab. Wiesław Gruszecki

Kraków, 2014

Składam serdeczne podziękowania Panu prof. dr hab. Arturowi Osyczce

za pomoc oraz cenne uwagi przy realizacji tej pracy.

Pani dr Małgorzacie Dutce za dyskusję nad wyprowadzaniem równań.

Dr Marcinowi Sarewiczowi za wartościowe wskazówki.

Kolegom i koleżankom z laboratorium, za pomoc i cenne wskazówki metodyczne.

Mojej rodzinie, a w szczególności rodzicom i Dominice za wyrozumiałość i cierpliwość.

Spis treści

Wykaz skrótów ... 6

1. Streszczenie ... 7

2. Wprowadzenie ... 8

3. Wstęp teoretyczny ... 10

3.1. Cytochromy ... 10

3.2. Budowa i funkcja cytochromu bc1 ... 11

3.2.1. Cytochrom b ... 13

3.2.2. Cytochrom c1 ... 13

3.2.3. Białko ISP ... 14

3.2.4. Architektura kofaktorów i katalityczny cykl Q ... 15

3.2.5. Funkcja w kontekście łańcucha oddechowego ... 17

3.3. Koenzym Q ... 22

3.4. Kinetyczny opis mechanizmu działania enzymów ... 25

3.4.1. Model Michaelisa-Menten ... 26

3.4.1.1. Stan stacjonarny ... 26

3.4.1.2. Stan prestacjonarny... 28

3.4.2. Etapy kinetyki w obrębie cytochromu bc1 ... 33

3.4.2.1. Reakcja w miejscu Qo, tworzenie się kompleksu ISPb-cytochrom b ... 38

3.4.2.2. Opis ruchu białka ISP ... 38

3.4.2.3. Prawo Debye’a-Hückla i jego zastosowanie do opisu zależności aktywności cytochromu bc1 od siły jonowej ... 39

3.4.2.4. Reakcja w miejscu Qi ... 40

3.5. Kinetyczny opis mechanizmu inhibicji ... 41

3.5.1. Inhibicja slow binding ... 44

3.5.1.1. Inhibicja slow binding typu A ... 44

3.5.1.2. Inhibicja slow binding typu B ... 45

3.5.1.3. Inhibicja slow tight binding ... 46

3.5.2. Inhibicja przez syntetyczny inhibitor 5c ... 47

3.5.3. Podsumowanie rodzajów inhibicji... 49

3.6. Mechanizm produkcji anionorodnika ponadtlenkowego ... 50

3.6.1. Anionorodnik ponadtlenkowy ... 51

3.6.2. Semichinon ... 52

3.6.3. Cytochrom bc1 a rodniki ... 53

3.7. Mutacje mitochondrialne ... 54

3.7.1. Mitochondrialne DNA ... 54

3.7.2. Haplogrupy ... 55

3.7.3. Haplogrupy a cytochrom b ... 57

3.7.4. Choroby mitochondrialne ... 58

3.7.5. Mutacje chorobotwórcze na cytochromie b... 59

4. Cele ... 64

5. Materiały ... 66

5.1. Rodzaje wykorzystanych mutantów Rb. capsulatus ... 66

Spis treści

4

5.3. Bufory do izolacji błon i białka ... 68

5.4. Odczynniki używane do pomiaru widma optycznego cytochromu bc1 ... 69

5.5. Bufor do pomiarów aktywności enzymatycznej cytochromu bc1 ... 70

5.6. Aparatura ... 71

6. Metody ... 72

6.1. Hodowla komórek Rb. capsulatus ... 72

6.2. Izolacja błon Rb. capsulatus ... 72

6.3. Izolacja białka - chromatografia jonowymienna ... 73

6.4. Izolacja białka - chromatografia powinowactwa ... 73

6.5. Pomiar stężenia cytochromu bc1 ... 74

6.6. Pomiar aktywności enzymatycznej cytochromu bc1 ... 75

6.7. Pomiar produkcji anionorodnika ponadtlenkowego ... 77

6.8. Symulacja w programie XPP ... 78

6.9. Widma EPR klastra żelazowo-siarkowego... 79

7. Wyniki ... 80

7.1. Kinetyczny opis mechanizmu działania cytochromu bc1 ... 81

7.1.1. Ogólne modele opisujące dystrybucję białka ISP ... 81

7.1.2. Dystrybucja białka ISP od strony cytochromu b ... 83

7.1.3. Tworzenie się kompleksu cytochrom c1 – cytochrom c ... 86

7.1.4. Dystrybucja białka ISP od strony cytochromu c i opis reakcji transferu elektronu z cytochromu c1 na cytochrom c ... 88

7.1.5. Pełny model działania monomeru ... 96

7.2. Kinetyczny opis inhibicji cytochromu bc1 ... 101

7.2.1. Modele zaproponowane dla inhibicji cytochromu bc1 przez substrat miejsca Qo, DBH2 ... 102

7.2.2. Model działania antymycyny... 113

7.3. Mechanizm produkcji anionorodnika ponadtlenkowego ... 115

7.4. Mutacje mitochondrialne ... 120

7.4.1. Mutacja adaptacyjna I169T ... 120

7.4.2. Mutacja chorobotwórcza G275D; porównanie z mutacjami A189V, I49P 122 7.4.3. Mutacja chorobotwórcza G167P ... 127

8. Dyskusja i wnioski ... 129

8.1. Kinetyczny opis mechanizmu działania cytochromu bc1 ... 130

8.2. Inhibicja przez substrat ... 136

8.3. Mechanizm produkcji anionorodnika ponadtlenkowego ... 140

8.4. Mutacje mitochondrialne ... 146

9. Podsumowanie ... 149

10. Załączniki ... 151

Załącznik 1: Modele działania białka ISP ... 152

Załącznik 2: Tworzenie się kompleksu cytochrom c1 – cytochrom c ... 155

Załącznik 3: Modele przeniesienia elektronu z cytochromu c1 na cytochrom c ... 158

Załącznik 4: Model działania monomeru cytochromu bc1 ... 161

Załącznik 5: Model działania monomeru z uwzględnieniem powstawania kompleksu ISPc – cytochrom c1 ... 163

Załącznik 6: Model inhibicji „noncompetitive”, rozwiązanie analityczne... 165 Załącznik 7: Modyfikacja mechanizmu slow-binding A i B, rozwiązanie analityczne . 171 Załącznik 8: Model powstawania rodników w miejscu Qo (mechanizm sekwencyjny) 180

Załącznik 9: Model powstawania rodników w miejscu Qo (mechanizm jednoczesnego przekazu elektronu) ... 184 Załącznik 10: Ludzki cytochrom b ... 188 Załącznik 11: Porównanie sekwencji ludzkiego cytochromu b z cytochromem b z Rb.

capsulatus ... 189 11. Bibliografia ... 191

Spis treści

6

Wykaz skrótów

ADP adenozyno-5’-difosforan ATP adenozyno-5’-trifosforan

CCCP m-chlorokarbonylocyjanofenylohydrazon CoQ koenzym Q

DB 2,3-dimetoksy-5metylo-6-decyl-1,4-benzochinon DBH2 2,3-dimetoksy-5metylo-6-decyl-1,4-benzochinol

DDM n-Dodecyl β-D-maltozyd DMSO dimetylosulfotlenek

DNA kwas deoksyrybonukleinowy DNP 2,4-dinitrophenol

∆p siła protonomotoryczna

∆Ψ potencjał błonowy

EPR elektronowy rezonans paramagnetyczny

ETC (z ang. electron transport chain) łańcuch transportu elektronów FAD utleniona forma dinukleotydu flawinoadeninowego

FADH2 zredukowana forma dinukleotydu flawinoadeninowego FCCP fenylohydrazon trójfluorometoksykarbonylo-cyjanku

GDP guanozyno-5'-difosforan GTP guanozyno-5'-trifosforan

IF1 białko regulujące aktywność syntazy ATP ISP białko żelazowo-siarkowe

LHON (ang. Leber's hereditary optic neuropathy) dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera

MOPS kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy mtDNA mitochondrialny DNA

NAD⁺ utleniona forma dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego NADH zredukowana forma dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego PEWY sekwencja aminokwasów prolina - kwas glutaminowy - tryptofan -

tyrozyna

Pi anion fosforanowy

PMSF fluorek fenylometylosufonylu Q chinon

QH2 chinol

Qi centrum katalityczne, w którym redukowany jest chinon Qo centrum katalityczne, w którym utleniany jest chinol RC centrum reakcji

RFT reaktywnwe formy tlenu

ROS (z ang. reactive oxygen species) reaktywnwe formy tlenu Ru2D kompleks rutenu

SOD dysmutaza ponadtlenkowa SQ (QH•) semichinon

TCA kwas trójchlorooctowy

Tris tris(hydroksymetylo)aminometan UCP białko rozprzęgające

VIS (od ang. visible) światło widzialne WT dzika forma białka

1. Streszczenie

Cytochrom bc1 jest białkiem łańcucha transportu elektronów. Jego działanie związane jest z budowaniem siły protonomotorycznej służącej do produkcji ATP. Oprócz reakcji katalitycznych (które konserwują energię), w pewnych warunkach mogą zachodzić reakcje uboczne, które prowadzą do dyssypacji energii. W reakcjach katalitycznych energia reakcji utleniania chinolu jest wykorzystywana do translokacji protonów w obrębie cytochromu bc1. W tym przypadku, w miejscu katalitycznym Qo następuje rozdział dwóch elektronów dostarczanych przez chinol, które przepływają przez dwa odrębne łańcuchy kofaktorów.

W reakcjach ubocznych, w konsekwencji może nastąpić utrata części energii z utleniania chinolu. Może być ona „rozproszona” na skutek częściowej lub całkowitej utraty funkcji translokacji protonów przez cytochrom bc1. Są to reakcje, w których w miejscu katalitycznym Qo nie następuje wydajny rozdział elektronów na dwa łańcuchy kofaktorów. Jedną z reakcji ubocznych jest przekaz elektronu z semichinonu w miejscu Qo na tlen z wytworzeniem anionorodnika ponadtlenkowego. W wyniku tej reakcji oprócz spadku wydajności translokacji protonów, powstaje reaktywny rodnik, który może prowadzić do dużych uszkodzeń w komórce poprzez utlenianie różnych cząsteczek, takich jak lipidy i białka. Inną reakcją uboczną może być przekaz obydwu elektronów na jeden łańcuch kofaktorów (na łańcuch o wyższym potencjale redoks), co powoduje spadek wydajności fosforylacji oksydacyjnej.

W pracy doktorskiej badane były zarówno reakcje katalityczne jak i reakcje uboczne.

Praca doświadczalna nad poznaniem tych reakcji została wzbogacona pełnym teoretycznym modelem działania monomeru cytochromu bc1. Model ten umożliwia poznanie działania cytochromu bc1 oraz przewidzenie zachowania się badanego układu w różnych warunkach stężenia substratów i produktów, jak i efektu kinetycznego łączenia mutacji w obrębie tego białka. W pracy doktorskiej został też opisany efekt inhibicji cytochromu bc1 przez jeden z substratów – chinol. Inhibicja ta jest połączona ze znacznym spadkiem aktywności białka po czasie rzędu kilkunastu – kilkudziesięciu sekund i z produkcją anionorodnika ponadtlenkowego. Efekty kinetyczne mutacji punktowych i produkcja wolnych rodników są czynnikami, które leżą u podstaw chorób mitochondrialnych. Niektóre mutacje pojawiające się w obrębie ludzkiego cytochromu b zostały przebadane w tej pracy doktorskiej. W oparciu o zdobytą wiedzę zaproponowano sposób w jaki mutacje te wpływają na funkcjonowanie białka.

2. Wprowadzenie

8

2. Wprowadzenie

Cytochrom bc1 jako jeden z kluczowych białek bioenergetyki

Cytochrom bc1 (mitochondrialny kompleks III) obecny w prawie wszystkich komórkach prokariotycznych i eukariotycznych jest kluczowym białkiem łańcucha oddechowego.

Łańcuch ten jest istotnym elementem układów przekształcających energię w komórkach żywych [1]. Cytochrom bc1 jest łącznikiem między dwuelektronowym błonowym przenośnikiem elektronów, chinonem, a występującym w przestrzeni międzybłonowej u eukariontów lub peryplazmie bakteryjnej, jednoelektronowym przenośnikiem, cytochromem c. Funkcją tego białka jest również udział w budowaniu gradientu elektrochemicznego w poprzek błony poprzez translokację protonów podczas zachodzenia cyklu Q [2],[3],[4]. Wytworzona siła protonomotoryczna jest wykorzystywana przez syntazę ATP do wytwarzania adenozyno-5’-trifosforanu, uniwersalnego nośnika energii w komórkach żywych [5].

W skrócie reakcje cyklu Q oparte są na sprzężonym utlenianiu chinolu w miejscu katalitycznym Qo i redukcji chinonu w miejscu katalitycznym Qi. W miejscu Qo dochodzi do rozdziału elektronów, które przekazywane są przez dwa różne łańcuchy. W miejscu tym następuje też uwolnienie dwóch protonów do przestrzeni międzybłonowej (peryplazmy u bakterii). Natomiast w miejscu Qi następuje pobranie dwóch elektronów z łańcucha kofaktorów i dwóch protonów z matriks (cytoplazmy u bakterii) [6]. Reakcja rozdziału elektronów w miejscu Qo (określana jako bifurkacja) jest unikatową reakcją w świecie biologicznym. W pracy doktorskiej również poruszony został temat mechanizmu reakcji w miejscu Qo oraz wkład tych reakcji do aktywności cytochromu bc1.

Wolne rodniki w kompleksie III

Głównym źródłem reaktywnych form tlenu (RFT, ang. ROS) w organizmach eukariotycznych jest mitochondrialny łańcuch oddechowy [7]. Największym źródłem rodników w tym łańcuchu jest kompleks I, który produkuje rodniki od strony matriks i kompleks III, który produkuje rodniki od strony przestrzeni międzybłonowej. Źródłem reaktywnych form tlenu powstałych w wyniku działania cytochromu bc1 jest semichinon utworzony w miejscu Qo w wyniku przecieku elektronu z grupy prostetycznej na chinon znajdujący się w miejscu Qo [8],[9]. Semichinon powstały w tym miejscu jest bardzo niestabilny i szybko reaguje z tlenem tworząc anionorodnik ponadtlenkowy, który jest odpowiedzialny za uszkodzenia komórkowe, utlenianie różnych cząsteczek w komórce.

Reakcje prowadzące do powstawania rodników w cytochromie bc1 należą do reakcji ubocznych. Poznanie tych reakcji ubocznych, prowadzących zarówno do powstawania anionorodnika ponadtlenkowego jak i zabezpieczających przed produkcją rodników są tematem tej pracy doktorskiej.

Mutacje mitochondrialne

Kompleks III znajduje się w samym sercu łańcucha transportu elektronów (ETC), mutacje w tym białku mogą mieć katastrofalne skutki dla całego procesu oddychania komórkowego i prawidłowego funkcjonowania komórki. Przykładem mogą być mutacje mitochondrialne w obrębie podjednostki ludzkiego kompleksu III, w cytochromie b, powodujące ciężkie choroby mitochondrialne [10]. Pacjenci z mutacjami w tej podjednostce białkowej cierpią na nietolerancję na wysiłek, miopatię, kardiomiopatię przerostową, dysplazję przegrodowo- oczną, retinopatię barwnikową, mają też objawy podobne do choroby Parkinsona [11].

Czasami występują też objawy chorób wielosystemowych (multisystem disorder). Większość opisanych dotychczas mutacji na cytochromie b są mutacjami heteroplazmatycznymi, więc nasilenie objawów chorobowych zależy nie tylko od rodzaju występującej mutacji, ale również od stosunku ilościowego zmutowanego cytochromu b do całkowitej populacji cytochromu b (czyli do sumy ilości zmutowanego i prawidłowego cytochromu b).

Chorobotwórcze mutacje w obrębie cytochromu b głównie powodują zmniejszenie aktywności całego enzymu lub nieprawidłowe składanie się białka [12]. Niektóre mutacje mogą powodować zwiększenie ułamka reakcji ubocznych prowadzących w konsekwencji do powstawania znacznej ilości anionorodnika ponadtlenkowego. Jednak nie wszystkie mutacje na cytochromie b są szkodliwe, nie każda mutacja powodująca zamianę aminokwasu na inny jest niekorzystna dla komórki. Dlatego istnieje też wiele wariantów cytochromu b. Istnieje hipoteza, że niektóre mutacje pojawiły się jako mutacje adaptacyjne do chłodnego klimatu [13]. Tematem tej pracy jest również poznanie molekularnego podłoża chorób mitochondrialnych i poznanie szczegółów mechanizmu działania cytochromu bc1

niezbędnych do zrozumienia występowania mutacji adaptacyjnych.

W pracy doktorskiej wykorzystywałem cytochrom bc1 izolowany z bakterii Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus). Jest to dobry model do badania mutacji mitochondrialnych, ponieważ zbudowany jest z minimalnej liczby podjednostek niezbędnych do funkcjonowania białka oraz wykazuje dużą homologię z ludzkim cytochromem bc1. Ten tzw. „rdzeń katalityczny” zbudowany jest z trzech podjednostek białkowych: cytochromu b, cytochromu

3. Wstęp teoretyczny

10

3. Wstęp teoretyczny

3.1. Cytochromy

Cytochromy są to hemoproteiny, których główną funkcją jest przekaz elektronów w obrębie łańcucha oddechowego. Ze względu na rodzaj hemu (A, B, C) występującego w obrębie cytochromów można podzielić je na grupy cytochromów a, b i c, których maksima widma absorpcyjnego przypadają na około 600, 560 i 550 nm.

Cytochrom c

Cytochrom c jest małą hemoproteiną, która przekazuje elektrony między cytochromem bc1 a oksydazą cytochromową. Jest on luźno związany z wewnętrzną błona mitochondrialną, znajduje się w przestrzeni międzybłonowej mitochondrium. Cytochrom c tworzy kompleks przejściowy z cytochromem c1, będącym podjednostką cytochromu bc1. Czas życia utworzonego kompleksu silnie zależy od siły jonowej, zaś utworzone wiązanie ma charakter oddziaływania elektrostatycznego. W warunkach fizjologicznych czas życia kompleksu jest na tyle mały, że prawie cały cytochromu c występuje w stanie niezwiązanym [15]. Po utworzeniu kompleksu następuje transfer elektronów między hemami. Wówczas żelazo hemowe w cytochromie c ulega redukcji ze stopnia +3 na stopień +2, natomiast żelazo hemowe cytochromu c1 ulega utlenieniu ze stopnia +2 na +3. Oczywiście możliwa jest również reakcja odwrotna w zależności od stanu redoks w komórce. Zredukowany cytochrom c przekazuje z kolei elektron oksydazie cytochromowej. Cytochrom c wiąże się blisko centrum CuA/CuA. Wiązanie to również ma charakter oddziaływania elektrostatycznego[16].

Cytochrom c „pompuje” oksydazę cytochromową elektronami. Pierwszy elektron przechodzi przez centrum CuA/CuA → hem a → hem a3 i ostatecznie redukuje miedź (Cu²⁺ → Cu⁺) w centrum CuB. Drugi elektron dociera do hemu a3, gdzie redukuje żelazo hemowe (Fe³⁺ → Fe²⁺). Tak przygotowana oksydaza przez jon żelaza wiąże tlen cząsteczkowy, który usuwa po jednym elektronie z Cu⁺ i Fe²⁺ w wyniku czego powstaje nadtlenek. Przekazanie przez cytochrom c trzeciego elektronu i związanie dwóch protonów powoduje rozłożenie związanego nadtlenku. Jeden atom tlenu zostaje przyłączony w postaci -2 do żelaza i tworzy się stan ferryt +4, a drugi atom tlenu zostaje przyłączony w postaci H2O do Cu²⁺. Przekazanie czwartego elektronu przez cytochrom c i przyłączenie dwóch protonów pozwala na uwolnienie dwóch cząsteczek wody i powrót do stanu początkowego.

Cytochrom c2

Cytochrom c2 występuje u fotosyntetyzujących purpurowych bakterii niesiarkowych, m. in. w bakteriach Rb. capsulatus. Jest odpowiednikiem mitochondrialnego cytochromu c.

W tych bakteriach występują dwa rodzaje cytochromów c: cytochrom c2 i cytochrom cy, które pełnią tą samą funkcję w łańcuchu transportu elektronów [17]. W odróżnieniu od cytochromu cy, który jest zakotwiczony w błonie, cytochrom c2 swobodnie dyfunduje w peryplazmie. Cytochrom c2 jest zaangażowany zarówno w fotosyntezie jak i oddychaniu komórkowym.

W fotosyntezie jest przenośnikiem elektronów między cytochromem bc1, a centrum reakcji, gdzie następuje utlenianie cytochromu c2 i redukcja chinonu. W oddychaniu tlenowym jest przenośnikiem elektronów między cytochromem bc1 a oksydazą cytochromową, gdzie następuje utlenianie cytochromu c2 i redukcja tlenu do wody. Potencjał redoks bakteryjnego cytochromu c2 zmienia się w szerokim zakresie od +250 mV (dla Paracoccus denitrificans) do +450 mV (dla Rhodopila globiformis) [18], podczas gdy we wszystkich eukariotycznych cytochromach c wynosi około +260 mV [19]. Dla cytochromu c2 izolowanego z Rb. capsulatus potencjał redoks wynosi około +370 mV.

3.2. Budowa i funkcja cytochromu bc

Cytochrom bc1 (oksydoreduktaza ubihydrochinon: cytochrom c, mitochondrialny kompleks III) jest białkiem mitochondrialnego łańcucha oddechowego katalizującym przepływ elektronów z ubichinolu na cytochrom c. W organizmach eukariotycznych jest osadzony w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Jest białkiem dimerycznym, z którego każdy monomer składa się z 11 podjednostek. Rdzeń katalityczny, czyli minimalna liczba podjednostek niezbędna do funkcjonowania białka składa się z trzech podjednostek:

cytochromu b, białka ISP i cytochromu c1. Modelowym białkiem do badania mechanizmu działania kompleksu III jest cytochrom bc1 z Rb. capsulatus składający się tylko z rdzenia katalitycznego. Monomer tego białka składa się z 886 aminokwasów, przypada więc 1772 aa na dimer. Masa dimeru to około 190 kDa.

3. Wstęp teoretyczny

12

Rysunek 1 Monomer funkcjonalny cytochromu bc1. Kolorem zielonym oznaczony jest cytochrom b, kolorem fioletowym cytochrom c1, kolorem błękitnym białko ISP. Kofaktory oznaczone są kolorem czarnym. Białko ISP przedstawione jest w pozycji b, blisko cytochromu b. W obrębie tego białka, w sąsiedztwie cytochromu b oznaczony jest na czarno klaster [2Fe2S].

W obrębie cytochromu c1 na czarno oznaczony jest hem c1. Natomiast w cytochromie b na czarno oznaczony jest: na dole - hem bL, na górze - hem bH.

Rysunek 2 Struktura monomeru funkcjonalnego cytochromu bc1. Oznaczenia kolorów takie jak na rysunku 2.

3.2.1. Cytochrom b

Cytochrom b zbudowany jest z 437 reszt aminokwasowych, a jego masa wynosi około 47 kDa. Podjednostka ta składa się z ośmiu helis zanurzonych w błonie i czterech helis rozmieszczonych na powierzchni błony. Końce C i N znajdują się po stronie cytoplazmatycznej. Trzy helisy powierzchniowe cd1, cd2 i ef znajdują się po stronie peryplazmatycznej. Helisy A (46aa – 67aa), B (89aa – 118aa), C (125aa – 148aa) i D (188aa – 219aa) tworzą wiązkę czterech helis, w których umieszczone są dwa hemy b; hem o niskim potencjale redoks – hem bL (-90 mV) i o wysokim potencjale – hem bH (50 mV). Hem bL jest koordynowany przez resztę histydyny 97 na helisie B i 198 na helisie D, a hem bH przez resztę histydyny 111 na helisie B i 212 na helisie D. Środowiska białkowe tych dwóch cząsteczek hemu są na tyle różne, że ich potencjał i właściwości spektralne wyraźnie różnią się między sobą. W obrębie cytochromu b występują dwa miejsca, do których wiąże się chinol lub chinon: miejsce Qo i miejsce Qi. Miejsce Qi jest całkowicie zdefiniowane przez cytochrom b, który tworzy kieszeń złożoną z trans-błonowych helis A, D i E, z helisy powierzchniowej a i z hemu bH. Miejsce Qo zdefiniowane jest przez aminokwasy hydrofobowe w obrębie helis C, cd1, cd2, D, ef, F oraz pętli ef. Aby mogła zajść reakcja w miejscu Qo potrzebny jest nie tylko cytochrom b, ale również białko ISP. W miejscu wiązania chinolu w cytochromie b można zdefiniować dwa różne regiony. Pierwszy wiąże inhibitor myksotiazol i nazwano go niszą proksymalną względem hemu bL, drugi wiąże inhibitor stigmatelinę – nisza dystalna. Reszty aminokwasowe M140, Y147 są istotne w transferze elektronów z miejsca Qo na klaster [2Fe2S] i cytochrom b [20], natomiast reszty F144, G152 i G158 mają wpływ na wiązanie się chinonu/chinolu w miejscu Qo [21],[22].

Dwie poprzeczne helisy cd1 (która zawiera reszty G152 i G158) i cd2 oraz pętla ef są częścią miejsca Qo tworzonego przez cytochrom b. Również w obrębie tego regionu znajduje się motyw PEWY (P294-Y297), którego reszta E295 jest prawdopodobnie istotna w transferze elektronu na hem bL [23].

3.2.2. Cytochrom c

Cytochrom c1 składa się z 258 reszt aminokwasowych, a jego masa to około 27 kDa.

Zawiera on tylko jedną helisę trans-błonową, której C-koniec jest po stronie

3. Wstęp teoretyczny

14 globularny. Jego grupa prostetyczna (hem c1) jest kowalencyjnie związany do motywu: Cys- Xaa-Xaa-Cys-His (w przypadku Rb. capsulatus jest to Cys-Ser-Thr-Cys-His). Żelazo hemowe jest koordynowane przez resztę histydyny 38 tego motywu i przez metioninę 183.

Potencjał redoks hemu c1 w Rb. capsulatus wynosi około 310 mV [24]. Mutacja M183K powoduje spadek potencjału redoks do wartości około 60 mV, natomiast M183L do wartości -74 mV [24]. Cytochrom c1 oddziałuje z cytochromem c2 (lub cytochromem c u eukariontów). Jest to wiązanie o charakterze oddziaływania elektrostatycznego [25].

3.2.3. Białko ISP

Białko ISP składa się z 191 reszt aminokwasowych, jego masa to około 20 kDa. Podobnie jak cytochrom c1, białko ISP zawiera jedną helisę trans-błonową. N-koniec znajduje się po stronie cytoplazmatycznej. Helisa trans-błonowa działa jak kotwica, która utrzymuje przy powierzchni, po stronie peryplazmatycznej błony główkę białka ISP, która jest dużą, globularną domeną białka. Między helisą transbłonową, a główką białka ISP znajduje się sekwencja aminokwasowa (tzw. szyjka białka ISP lub region zawiasowy białka ISP), która wykazuje dużą elastyczność i umożliwia zmianę położenia główki białka ISP. Każde białko ISP jest „przyłączone” do dwóch monomerów cytochromu bc1, tzn. helisa trans-błonowa jest w kontakcie z pierwszym monomerem, a globularna domena bierze udział w reakcji katalitycznej w obrębie drugiego monomeru. Białko żelazowosiarkowe zawiera klaster typu [2Fe2S], który jest związany do białka przez dwa azotowe i dwa siarkowe ligandy.

Aminokwasy biorące udział w koordynacji klastra to Cys133, His135, Cys153, His156.

W pobliżu tych aminokwasów znajdują się jeszcze dwie cysteiny Cys138 i Cys155, które tworzą mostek dwusiarczkowy.

Cytochrom bc1 jest niezwykłym białkiem w świecie biologii ze względu na ruchomą podjednostkę białko ISP. Główka białka ISP wykonuje ruch między położeniem blisko cytochromu b (pozycja ISPb) a położeniem blisko cytochromu c1 (pozycja ISPc) [26]. Istnieje jeszcze pozycja pośrednia, która nie bierze udziału w reakcji w miejscu Qo, ani w reakcji przekazu elektronu na cytochrom c1, pozycja ISPx. Im większa jest wielkość frakcji ISPx, tym mniejsza wielkość pozostałych frakcji: ISPb i ISPc.

3.2.4. Architektura kofaktorów i katalityczny cykl Q

W cytochromie bc1 istnieją dwie drogi przekazu elektronów: łańcuch wysokopotencjałowy i łańcuch niskopotencjałowy. Łańcuch wysokopotencjałowy zbudowany jest z kofaktorów posiadających wysoki potencjał redoks: klaster [2Fe2S] na białku ISP oraz hem c1 na cytochromie c1. Natomiast łańcuch niskopotencjałowy zbudowany jest z kofaktorów w obrębie cytochromu b o niskim potencjale redoks: hem bL i hem bH. Dzięki istnieniu łańcucha w obrębie cytochromu b możliwe jest wydajne wykorzystanie energii do budowania gradientu protonów w poprzek błony.

Zgodnie z teorią Mitchell’a [6], reakcja w obrębie cytochromu bc1 zachodzi zgodnie ze schematem na rysunku 3:

Rysunek 3 Uproszczony schemat cyklu Q.

Cykl Q zaczyna się od utleniania chinolu do chinonu w miejscu Qo. Następnie dochodzi do rozdziału elektronów, jeden przekazywany jest na łańcuch wysokopotencjałowy, a drugi przekazywany jest na łańcuch niskopotencjałowy. Po pierwszej reakcji utleniania w miejscu Qo tylko jeden elektron dociera do miejsca Qi, co wiąże się z powstawaniem semichinonu w tym miejscu. Stabilny semichinon w miejscu Qi „czeka” na drugi elektron, który pochodzi z utlenienia drugiej cząsteczki chinolu w miejscu Qo. Po przyjęciu drugiego elektronu i protonu w miejscu Qi zostaje zamknięty cykl Q. Powstaje chinol, który może zostać

3. Wstęp teoretyczny

16 Podczas dwóch obrotów enzymu, czyli jednego pełnego cyklu:

• w miejscu Qo następuje utlenienie dwóch cząsteczek chinolu i uwolnienie 4 jonów H⁺ do peryplazmy

• w miejscu Qi następuje redukcja jednej cząsteczki chinonu i pobranie 2 jonów H⁺ z cytoplazmy

• zostają zredukowane dwie cząsteczki cytochromu c (lub c2) Pełne równanie reakcji przedstawia się zatem następująco:

2QH2(Qo) + Q(Qi) + 2Cytc(Fe³⁺) + 2H⁺→ 2Q(Qo) + QH2(Qi) +2Cytc(Fe²⁺) + 4H⁺ Czyli sumarycznie:

QH2 + 2Cytc (Fe³⁺) → Q + 2Cytc(Fe²⁺) + 2H⁺

Idea Mitchella o zwiększeniu wydajności cytochromu bc1 przez wewnętrzny cykl elektronów jest ogólnie przyjęta, jednak wciąż jeszcze nie wiadomo, czy obydwa elektrony jednocześnie rozdzielają się na łańcuch wysoko- i niskopotencjałowy, czy jest to mechanizm sekwencyjny. W pierwszym modelu nie powstaje semichinon w miejscu Qo z reakcji utleniania chinolu, a w drugim zakłada się powstawanie semichinonu z reakcji utleniania chinolu w miejscu Qo. Oba modele prezentują skrajne podejście na mechanizm w miejscu Qo. W mechanizmie sekwencyjnym powstaje niestabilny semichinonu, który tworzy się po transferze pierwszego elektronu z chinolu na białko ISP. W koncepcji mechanizmu sekwencyjnego przyjmuje się, że chinol wiąże się w pobliżu niszy dystalnej tworząc kompleks przejściowy z utlenionym białkiem ISP, następuje przekazanie elektronów na białko ISP, powstaje semichinon, który przed utlenieniem przez cytochrom b musi przejść do niszy proksymalnej.

Istnieje również teoria, że dwie cząsteczki z puli Q/QH2 mogą wiązać się w różnych miejscach Qo [27]. Określono również, że jedno miejsce ma silne powinowactwo do Q/QH2 i oznaczono je Qos (strong), natomiast drugie ma słabe powinowactwo do Q/QH2 i oznaczono je Qow (weak). Na podstawie tej hipotezy, został zaproponowany model, w którym dla jednego pełnego obrotu cytochromu bc1 wymagana jest tylko wymiana chinonu w miejscu Qow.

3.2.5. Funkcja w kontekście łańcucha oddechowego

Główną funkcją oksydoreduktazy ubihydrochinon: cytochrom c jest translokacja protonów w poprzek błony z wytworzeniem tzw. siły protonomotorycznej (∆p), której składowymi są potencjał błonowy (∆Ψ) i gradient pH (∆pH). Wytworzona w ten sposób siła protonomotoryczna napędza syntezę ATP przez syntazę ATP.

W obrębie cytochromu bc1 są trzy miejsca katalityczne. Substratem dla miejsca Qo jest ubichinol, natomiast w miejscu Qi substratem jest produkt z miejsca Qo, czyli ubichinon.

W trzecim miejscu katalitycznym substratem jest utleniony cytochrom c.

Ubichinol pochodzi z dwóch białek łańcucha transportu elektronów: z kompleksu I (oksydoreduktaza NADH-ubichinon) i kompleksu II (oksydoreduktaza bursztynian- ubichinon). Elektrony z kompleksu I pochodzą z utleniania NADH, natomiast z kompleksu II z utleniania bursztynianu. Istnieje jeszcze jedno źródło zredukowanego CoQ, oksydoreduktaza flawoproteina przenosząca elektron-ubichinon. U ssaków enzym ten odgrywa ważną rolę w β-oksydacji kwasów tłuszczowych, katabolizmie aminokwasów i choliny, spełniając funkcję akceptora elektronów dehydrogenazy acylo-CoA.

Pierwszym źródłem NADH jest glikoliza. Glikoliza zachodzi w pozamitochondrialnej frakcji komórkowej, cytoplazmie. Pirogronian, otrzymany w wyniku glikolizy pobierany jest przez mitochondria, w których po przekształceniu do acetylo-CoA zostaje utleniony do dwutlenku węgla w cyklu Krebsa. Przekształceniu pirogronianu do acetylo-CoA towarzyszy powstanie jednej cząsteczki NADH. Acetylo-CoA bierze udział w sekwencji reakcji w cyklu kwasu cytrynowego, gdzie wytwarzane są 3 cząsteczki NADH.

Sumarycznie, ogólnie przyjęty bilans spalania jednej cząsteczki glukozy do dwutlenku węgla przedstawia się następująco:

glukoza + 2Pi + 2ADP + 2NAD⁺ → 2cząst. pirogronianu + 2ATP + 2NADH + 2H⁺ + 2H2O pirogronian + NAD⁺ + CoA → acetylo-CoA + NADH + H⁺ + CO2

acetylo-CoA + 3NAD⁺ + FAD + GDP + Pi + 2H2O→2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H⁺ + CoA

Czyli w wyniku reakcji powstaje:

2ATP + 2GTP (=2ATP) + 10NADH + 2FADH2

Przyjmuje się, że w kompleksie V na wytworzenie 1 cząsteczki ATP przypadają 3 – 4 protony. Zakłada się, że z 1 cząsteczki NADH powstają 3 cząsteczki ATP, a z 1 cząsteczki

3. Wstęp teoretyczny

18 W wyniku przedstawionych reakcji powstaje 38 cząsteczek ATP. Jednak 2 cząsteczki ATP zostają zużyte podczas transportu NADH (powstałego w glikolizie) do mitochondrium.

Sumarycznie podczas spalania 1 cząsteczki glukozy powstaje więc 36 cząsteczek ATP.

Z produkowanych 38 cząsteczek ATP, 34 cząsteczki wytwarzane są w łańcuchu transportu elektronów, co stanowi 89 % energii. Zdecydowana większość energii produkowana przez komórkę pochodzi z łańcucha transportu elektronów.

Rysunek 4 Białka łańcucha oddechowego; od lewej strony kompleksy: I, II, III, IV i V.

Czerwona, przerywana linia przedstawia wędrówkę elektronów w obrębie białek. Strzałki w poprzek błony oznaczają transport jonów H⁺ na zasadzie pompy protonowej. W kompleksie III nie ma strzałki w poprzek błony, ponieważ w białku tym transport protonów odbywa się na zasadzie translokacji protonów.

Na rysunku 4 przedstawiono schemat łańcucha oddechowego. Spośród białek łańcucha oddechowego, tylko kompleks II nie przenosi bezpośrednio protonów w poprzek błony.

Powoduje on jedynie „uwięzienie” protonów w błonie podczas redukcji chinonu. Ciekawą rolę w łańcuchu odgrywa kompleks III, w którym następuje uwolnienie protonów do przestrzeni międzybłonowej i rozdział elektronów w miejscu Qo. Następnie poprzez reakcję w miejscu Qi dochodzi do pobrania protonów z matriks i „uwięzienie” ich w błonie w postaci chinolu, który z kolei jest substratem miejsca Qo.

Rysunek 5 Schemat zmiany ilości protonów jakie wprowadzają poszczególne białka łańcucha oddechowego przypadające na dwa elektrony dostarczane przez NADH w kompleksie pierwszym, w stanie stacjonarnym. Po stronie matriks ubywa 11H⁺/1NADH, natomiast w przestrzeni międzybłonowej przybywa 12H⁺/1NADH.

Łańcuch oddechowy działa w sposób ciągły, nie można rozpatrywać jego funkcjonowania jako pojedynczej reakcji. Można to porównać do kinetyki enzymatycznej, gdzie białko działa w sposób ciągły i znajduje się w stanie stacjonarnym. Tak samo w łańcuchu oddechowym działającym w sposób ciągły można powiedzieć, że białka łańcucha oddechowego znajdują się w stanie stacjonarnym. Na rysunku 5 przedstawiono zmiany ilości protonów po stronie matriks i w przestrzeni międzybłonowej przypadające na 1 cząsteczkę NADH, która dostarcza 2 elektrony do łańcucha w stanie stacjonarnym.

Patrząc na jeden pełny cykl w łańcuchu oddechowym, na reakcję redukcji 1 cząsteczki tlenu w stanie stacjonarnym potrzebne są dwie cząsteczki NADH. W trakcie tego cyklu zostaje przetransportowanych przez kompleks I (z matriks do przestrzeni międzybłonowej) 8 jonów H⁺, 4 jony H⁺ zostają „uwięzione” w błonie w postaci chinolu, a w matriks 2 protony powstają z utleniania NADH. Czyli sumarycznie po stronie matriks ubywa 10 protonów, a w przestrzeni międzybłonowej przybywa 8 protonów. Następnie w kompleksie III zostaje uwolnionych w miejscu Qo 4 jony H⁺, a kolejne 4 zostają przeniesione z matriks do przestrzeni międzybłonowej w wyniku działania cyklu Q. Sumarycznie dzięki cytochromowi bc1 po stronie matriks ubywa 4 protony, a w przestrzeni międzybłonowej przybywa 8 protonów. W kompleksie IV, 4 protony zostają przetransportowane z matriks do przestrzeni międzybłonowej, a kolejne cztery z matriks zostają wykorzystane do reakcji z tlenem.

Sumarycznie w matriks ubywa 8 protonów, a przestrzeni międzybłonowej przybywa 4 protony. Ostatecznie na 2 NADH, do przestrzeni międzybłonowej zostaje przetransportowanych 24 protony, podczas gdy w matriks ubywają 22 protony. Czyli na 1 NADH po stronie przestrzeni międzybłonowej przybywa 12 protonów, a 11 protonów ubywa po stronie matriks (rysunek 5).

Rysunek 6 Schemat zmiany ilości protonów jakie wprowadzają poszczególne białka łańcucha oddechowego przypadające na dwa elektrony dostarczane przez bursztynian (za pośrednictwem FADH2) w kompleksie drugim, w stanie stacjonarnym. Po stronie matriks ubywa 6H⁺/1 FADH2, natomiast w przestrzeni międzybłonowej przybywa 6H⁺/1 FADH2.

Podobnie można zanalizować łańcuch oddechowy, gdy substratem jest bursztynianu (za

3. Wstęp teoretyczny

20 kompleksu II). W tym przypadku również na reakcję redukcji 1 cząsteczki tlenu w stanie stacjonarnym potrzebne są dwie zredukowane cząsteczki, FADH2 (w dalszej części FADH2

traktuję jako ekwiwalent bursztynianu). W trakcie tego cyklu kompleks II nie zmienia ilości protonów po obu stronach błony, ponieważ 4 protony powstałe w matriks podczas reakcji utleniania dwóch cząsteczek bursztynianu do dwóch cząsteczek fumaranu zostają wykorzystane do reakcji redukcji dwóch cząsteczek chinonu do dwóch cząsteczek chinolu.

Następne kompleksy zmieniają rozkład protonów w poprzek błony podobnie jak w przypadku bilansu dla 2 cząsteczek NADH. Sumarycznie na 2 FADH2, do przestrzeni międzybłonowej zostaje przetransportowanych 12 protonów, a w matriks ubywa 12 protonów. Czyli na 1 FADH2 po stronie przestrzeni międzybłonowej przybywa 6 protonów, a 6 protonów ubywa po stronie matriks (rysunek 6).

Dla uproszczenia, biorąc pod uwagę tylko NADH jako substrat w łańcuchu transportu elektronów (NADH jest głównym substratem; podczas spalania glukozy na 1 FADH2

przypada 5 NADH), 40 % protonów w przestrzeni międzybłonowej pochodzi z reakcji w obrębie cytochromu bc1, z czego połowa (czyli 20 % z ogólnej liczby protonów) zostaje przeniesiona dzięki reakcji zachodzącej w miejscu Qi, gdzie pobierane są protony i redukowany jest chinon do chinolu, który z kolei zostaje utleniony w miejscu Qo. Z uwagi na dużą produkcję energii w mitochondriach, mutacje w którymkolwiek z białek łańcucha transportu elektronów prowadzą do ciężkich chorób.

Biorąc pod uwagę zmianę standardowej energii swobodnej pomiędzy substratami a produktami oszacowano całkową wydajność oddychania komórkowego na 40 % (czyli 60 % przypada na produkcję ciepła). Jednak wiele komórek może (w jakiś sposób) regulować enzymy w łańcuchu oddechowym i podnieść wydajność do 60 %, a nawet i więcej.

Zwiększenie produkcji ciepła odbywa się przez rozprzężenie łańcucha transportu elektronów (np. przez białko rozprzęgające UCP1). Postuluje się również, że mutacje mitochondrialne w obrębie kompleksu I, III i V są odpowiedzialne za rozprzężenie łańcucha, mniejszą wydajność oddychania komórkowego i większą produkcję ciepła. Mutacje te teoretycznie mogą przyczynić się do adaptacji organizmów do chłodnego klimatu.

Jeżeli cytochrom bc1 utraciłby możliwość translokacji protonów z udziałem miejsca Qi, wtedy 20 % mniej protonów transportowanych byłoby do przestrzeni międzybłonowej i wydajność całego oddychania spadłaby z 40 % do 32 %. Spadek wydajności spowoduje wzrost produkcji ciepła. W mutacjach powodujących rozprzężenie w obrębie cytochromu bc1

spodziewalibyśmy się spadku całkowitej wydajności maksymalnie o 8 % (w przypadku gdy ostatecznie obydwa elektrony z chinolu przekazywane są na białko ISP).

Ilość protonów uwalnianych do przestrzeni międzybłonowej, przypadających na n cząsteczek NADH można opisać wzorem:

2 2 2 2 1

2 2 2 1

4

2 2

log

log 1 1











 



 

 + 

 +



 

 +  +

=

∑ ∑

=

n i

i n

i

i n n

n n

n x gdzie:

n – liczba NADH (dla uproszczenia n będzie liczbą 2 do potęgi z liczby naturalnej) x – liczba protonów

Natomiast ilość protonów, których ubyło w matriks, na n cząsteczek NADH wynosi:











 



 

 + 

 +



 

 +  +

=

∑ ∑

=

=

n i n i

i

i

n n

n n

n

x ^{2 log2}

1 log

1

2 2 2 1

2 5 1

Człony tych równań oznaczają kolejno:

- pierwszy: działanie kompleksu I

- drugi: działanie miejsca Qo kompleksu III

- trzeci: poprawka, która uwzględnia działanie miejsca Qi, - czwarty: działanie kompleksu IV.

Ostatni człon nie jest do końca dokładnie opisany. Aby równania te były dokładniejsze, należałoby przeliczyć je na cały jeden cykl w łańcuchu oddechowym, czyli na zużytą jedną cząsteczkę tlenu (lub 2 cząsteczki NADH).

Równania opisujące ilość protonów przypadających na FADH2 różnią się tylko tym, że nie mają członu pierwszego.

Inną budowę łańcucha transportu elektronów mają purpurowe, niesiarkowe, bakterie fotosyntetyzujące. Bakterie te mają zdolność do zmiany sposobu odżywiania w zależności od warunków. W środowisku beztlenowym, na świetle odżywiają się w sposób autotroficzny, natomiast w obecności tlenu, w ciemności odżywiają się w sposób heterotroficzny. Do tej grupy bakterii purpurowych niesiarkowych zalicza się bakterie Rb. capsulatus. U tych bakterii cytochrom bc1 jest elementem niezbędnym do podtrzymania wzrostu w beztlenowych warunkach fotosyntetycznych. Głównymi białkami fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów jest centrum reakcji i cytochrom bc1. Łącznikami między tymi białkami jest pula chinonów (Q/QH2) oraz cytochrom c2. Gradient protonów wytworzony podczas działania tego systemu zostaje wykorzystany przez syntazę ATP do syntezy ATP (rysunek 7).

3. Wstęp teoretyczny

22

Rysunek 7 Białka fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów; czerwona, przerywana linia przedstawia wędrówkę elektronów w obrębie białek.

Elektrony w fotosyntetycznym łańcuchu transportu elektronów przechodzą w obrębie dwóch białek błonowych: centrum reakcji i cytochromu bc1. W stanie stacjonarnym na jeden chinol powstały w centrum reakcji przypadają cztery protony przetransportowane z cytoplazmy do peryplazmy. Wytwarza się więc mniej więcej jedna cząsteczka ATP na jedną cząsteczkę chinolu powstałego w centrum reakcji RC.

3.3. Koenzym Q

Koenzym Q (ubichinon) jest organicznym związkiem chemicznym z grupy chinonów.

Z kolei chinon jest związkiem organicznym, pochodną związków aromatycznych, zawierającą dwie grupy karbonylowe (C=O), których atomy węgla wchodzą w skład pierścienia.

Wiązania te są sprzężone z dwoma wiązaniami podwójnymi w pierścieniu. Grupy karbonylowe mogą być w pozycji 1,2 lub 1,4. Chinony występujące w błonie (ubichinony) posiadają grupy karbonylowe w pozycji 1,4 i hydrofobowy łańcuch izoprenowy.

Ubichinon jest obecny we wszystkich komórkach i błonach. W nazwie koenzymu podaje się liczbę jednostek izoprenowych. Przykładowo, koenzym Q10 (CoQ10) oznacza, że koenzym Q zawiera 10 jednostek izoprenowych w łańcuchu bocznym. Dla większości gatunków organizmów, łańcuch boczny składa się z 6 do 10 jednostek izoprenowych. Koenzym Q ssaków zawiera 9 (CoQ9) lub 10 (CoQ10) jednostek izoprenowych. U myszy i szczurów blisko 90 % ubichinonu to CoQ9, podczas gdy u ludzi dominuje CoQ10.

.RHQ]\P4GLPHWRNV\PHW\ORSROLL]RSUHQ\OREHQ]RFKLQRQ



:SRPLDUDFKDNW\ZQRĞFLF\WRFKURPXEFVWRVXMHVLĊDQDORJXELFKLQRQXGHF\OXELFKLQRQ

GLPHWRNV\PHW\ORGHF\OEHQ]RFKLQRQ NWyU\ ]DPLDVW áDĔFXFKD L]RSUHQRZHJR

SRVLDGD JUXSĊ GHF\ORZą JUXSD DONLORZD F]\OL QDV\FRQ\ QLHUR]JDáĊ]LRQ\ áDĔFXFK

DOLIDW\F]Q\]áRĪRQ\]G]LHVLĊFLXDWRPyZZĊJOD





GLPHWRNV\PHW\ORGHF\OEHQ]RFKLQRQ'%



3R]D QDWXUDOQLH Z\VWĊSXMąF\PL NRHQ]\PDPL 4 LVWQLHMą UyZQLHĪ NRHQ]\P\ 4 4 4

NWyUHRWU]\PXMHVLĊQDGURG]HV\QWH]\RUJDQLF]QHM



 .RHQ]\P4



*áyZQą IXQNFMą NRHQ]\PX 4 MHVW SU]HQRV]HQLH HOHNWURQyZ L SURWRQyZ PLĊG]\

NRPSOHNVDPL,,,,RUD],,,,,3URWRQ\]PDWULNVZFKRG]ąGRSXOLFKLQRQyZZEáRQLH]RVWDMą

ÄXZLĊ]LRQH´ Z EáRQLH Z SRVWDFL ]UHGXNRZDQHM IRUP\ NRHQ]\PX 4 XELFKLQROX 5HDNFMD WD

]DFKRG]L Z NRPSOHNVLH , ,, L ,,, Ä8ZROQLHQLH´ SURWRQyZ SRGF]DV UHDNFML XWOHQLDQLD

XELFKLQROX GR XELFKLQRQX QDVWĊSXMH GR SU]HVWU]HQL PLĊG]\EáRQRZHM 5HDNFMD WD ]DFKRG]L

W\ONRZNRPSOHNVLH ,,, 8ELFKLQROSHáQLZLĊFIXQNFMĊEXIRUDNWyU\F]DVRZRÄSU]HFKRZXMH´

SURWRQ\ Z EáRQLH 3U]HQRV]HQLH SURWRQyZ Z SRSU]HN EáRQ\ EH]SRĞUHGQLR ]D SRPRFą

NRHQ]\PX4LELDáHNáDĔFXFKDRGGHFKRZHJRQD]\ZDVLĊWUDQVORNDFMąSURWRQyZ

:VWĊSWHRUHW\F]Q\

 



5HDNFMD5HDNFMDUHGXNFMLNRHQ]\PX4



3R]DIXQNFMąSU]HQRĞQLNDZEáRQLHPLWRFKRQGULDOQHMZáDĔFXFKXRGGHFKRZ\PNRHQ]\P

4 SHáQL V]HUHJ LQQ\FK IXQNFML &LHNDZą IXQNFMą NRHQ]\PX 4 MHVW ]DDQJDĪRZDQLH

Z IXQNFMRQRZDQLH WHUPRJHQLQ\ ELDáNR 8&3 UR]SU]ĊJDV] SURWRQyZ >@ %LDáNR WR MHVW

]ORNDOL]RZDQH Z ZHZQĊWU]QHM EáRQLH PLWRFKRQGULDOQHM D MHJR JáyZQą IXQNFMą MHVW

WUDQVORNDFMD SURWRQyZ ] SU]HVWU]HQL PLĊG]\EáRQRZHM GR PDWULNV F]\OL SU]HSá\Z SURWRQyZ

]DFKRG]L Z RGZURWQ\P NLHUXQNX QLĪ SRGF]DV EXGRZDQLD JUDGLHQWX SURWRQyZ SU]H] ELDáND

áDĔFXFKD RGGHFKRZHJR 6SDGHN JUDGLHQWX SURWRQyZ SRSU]H] WUDQVORNDFMĊ ]DFKRG]ąFą

Z ELDáNX 8&3 SRZRGXMH PQLHMV]ą SURGXNFMĊ $73 SU]H] NRPSOHNV 9 =PQLHMV]D VLĊ ZWHG\

Z\GDMQRĞüIRVIRU\ODFMLRNV\GDF\MQHMDF]ĊĞüHQHUJLLNWyUDSRZLQQD]RVWDü]XĪ\WNRZDQDQD

XWZRU]HQLH$73]RVWDMHZ\NRU]\VWDQDQDSURGXNFMĊFLHSáD>@=QDQ\FKMHVWELDáHN8&3

R]QDF]RQH X F]áRZLHND MDNR 8&38&3 ] NWyU\FK QDMEDUG]LHM SR]QDQ\P MHVW ELDáNR

8&3 REHFQH Z EáRQLH PLWRFKRQGULyZ EUXQDWQHM WNDQNL WáXV]F]RZHM JG]LH ELHU]H XG]LDá

Z WHUPRJHQH]LH >@>@>@ 3R]D IXQNFMą WHUPRUHJXODFML WHUPRJHQLQD PRĪH E\ü

]DDQJDĪRZDQD Z ]PQLHMV]DQLX SURGXNFML URGQLNyZ WOHQRZ\FK >@>@ 3URGXNFMD

DQLRQRURGQLND SRQDGWOHQNRZHJR MHVW EDUG]R ZUDĪOLZD QD ZDUWRĞü VLá\ SURWRQRPRWRU\F]QHM

QDZHWQLHZLHONLHUR]SU]ĊĪHQLHSRZRGXMHV]\ENLVSDGHNSURGXNFMLURGQLNyZ1DSRGVWDZLHWHM

REVHUZDFML SRZVWDáD KLSRWH]D ĪH WHUPRJHQLQD SRZRGXMąF UR]SU]ĊĪHQLH IRVIRU\ODFML

RNV\GDF\MQHM ]DSRELHJD SURGXNFML URGQLNyZ L Z NRQVHNZHQFML ]DSRELHJD VWUHVRZL

RNV\GDF\MQHPX >@ %LDáNR 8&3 ]DEH]SLHF]D NRPyUNĊ SU]HG XV]NRG]HQLDPL SU]H] URGQLNL

WOHQRZH SRSU]H] QLHZLHONą XWUDWĊ HQHUJLL F]\OL UyZQLHĪ SRSU]H] VSDGHN Z\GDMQRĞFL

IRVIRU\ODFMLRNV\GDF\MQHM

8WOHQLRQ\ NRHQ]\P 4 MHVW QLH]EĊGQ\P NRIDNWRUHP GOD IXQNFMRQRZDQLD WHUPRJHQLQ\

>@>@ $NW\ZQRĞü VW\PXORZDQD NRHQ]\PHP 4 PRĪH E\ü LQKLERZDQD SU]H] $73

Zaproponowano model, w którym koenzym Q oddziałuje z białkiem UCP wewnątrz błony, ponieważ maksymalną aktywność termogenina wykazywała z hydrofobowym koenzymem Q10, natomiast z hydrofilowymi koenzymami Q bez łańcucha bocznego lub o krótkim łańcuchu izoprenowy (0 – 2) termogenina nie wykazywała aktywności [36].

Warto jeszcze wspomnieć o antyoksydacyjnym działaniu koenzymu Q. Antyoksydanty (przeciwutleniacze) mogą być białkowe i niebiałkowe. Niebiałkowe przeciwutleniacze, to np.

proste związki chemiczne: witamina A, witamina C, karotenoidy, glutation, kwas limonowy, flawonoidy oraz zredukowana forma koenzymu Q. CoQH2 zapobiega peroksydacji lipidów w większości subkomórkowych błon [37]. Zredukowany CoQ (ubichinol) podczas peroksydacji lipidów zostaje utleniony do ubichinonu, który jest łatwo redukowany do ubichinolu i w ten sposób odtworzony zostaje antyoksydant. Szczególnie wydajnie odtwarzanie ubichinolu zachodzi w błonie mitochondrialnej, w której ubichinol powstaje podczas oddychania komórkowego i jest utrzymywany w formie zredukowanej [38]. CoQH2

jest też niezbędny dla działania innego przeciwutleniacza, α-tokoferolu. Natomiast antyutleniające działanie ubichinolu nie jest zależne od obecności tokoferolu [39]. Działania ubichinolu na α-tokoferol polega na regeneracji witaminy E, czyli przekształceniu rodnika tokoferolowego z powrotem do tokoferolu. Jeszcze jedną funkcją koenzymu Q jest zapobieganie wypływowi jonów (Mg²⁺, Ca²⁺, K⁺) z komórki.

3.4. Kinetyczny opis mechanizmu działania enzymów

Dla enzymów o prostej budowie wystarczającym opisem kinetycznym jest model Michaelisa-Menten [40]. Jest to typowe podejście głównie dla białek z jednym centrum aktywnym. Dla bardziej skomplikowanych białek, posiadających więcej niż jedno centrum aktywne opis kinetyczny jest już bardziej skomplikowany. Można wtedy wyznaczać jedynie przybliżone wartości stałych kinetycznych. Działanie cytochromu bc1 zawierającego trzy miejsca aktywne, można upraszczać do interesujących nas centrów katalitycznych. W ten sposób można wyznaczać stałą Michaelisa dla cytochromu c przy stałej, konkretnej wartości DBH2, lub wyznaczać stałą Michaelisa dla DBH2 przy stałej wartości cytochromu c. Takie podejście pozwala uzyskać tylko pozorne wartości stałych Michaelisa, ponieważ w warunkach fizjologicznych można oczekiwać, że ograniczenie reakcji katalizowanej przez cytochrom bc1 występuje na kilku etapach: miejsce Qo, dystrybucja białka ISP

3. Wstęp teoretyczny

26 miejsce Qi, ponieważ w warunkach fizjologicznych, prawdopodobnie nie jest ograniczeniem dla aktywności cytochromu bc1 (nie jest ograniczeniem dla początkowej aktywności tego białka). Poniżej przedstawię opis matematyczny dla prostych schematów reakcji, ponieważ sposób wyprowadzania tych równań jest analogiczny do bardziej zaawansowanych wyprowadzeń umieszczonych w załączniku na końcu pracy doktorskiej.

3.4.1. Model Michaelisa-Menten

W klasycznym podejściu zakłada się, że enzym E i substrat S tworzą kompleks przejściowy ES ze stałą szybkości k1. Utworzony kompleks ES może rozpaść się z powrotem do enzymu i substratu ze stałą szybkości k-1 lub przereagować i rozpaść się na enzym E i produkt P z szybkością k2. Model zakłada również, że reakcja jest nieodwracalna i produkt nie tworzy kompleksu z enzymem [40].

Schemat 1 Schemat klasycznej reakcji enzymatycznej opisywanej przez Michaelisa i Menten.

3.4.1.1.Stan stacjonarny

W stanie stacjonarnym stężenia wolnego i związanego enzymu nie zmieniają się w czasie:

[ ]

[ ]

[ ] [ ][ ]

E d

[ ]

[ ][ ]

[ ]

[ ]

ES d

Czyli z pierwszego lub drugiego równania mamy zależność:

[ ][ ] [ ] [ ] [ ][ ]

(

) [ ]

ES k ES k S E k

2 1 1

2 1

1

+

=

+

=

−

−

Całkowite stężenie enzymu jest sumą enzymu wolnego i związanego z substratem.

[ ] [ ] [ ]

[ ]

T T

−

= +

=

Podstawiając za E:

[ ]

( ) [ ] ( ) [ ]

( )

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ]

T T T

S E k k k

S ES k

S ES S k k E k

k

ES k S ES

k E k

k

ES k k S ES E

k

1 2 1

1 1 2 1 1

2 1 1 1

2 1 1

+

= +



 



 + +

= + +

=

+

=

−

−

−

−

−

Szybkość u z jaką działa enzym i z jaką powstaje produkt jest równa szybkości rozpadu kompleksu ES oraz szybkości tworzenia produktu:

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

T

E k S

k k k S u

S E k k k

S k ES k

dt k P u d

+ +

=

+

= +

=

=

−

−

1 2 1

2

1 2 1

2 2 1

Podstawiając za stałe

1 2 1

k k

k +₋ stałą Km otrzymujemy:

[ ] [ ]

m

S E K

S u k

= ²+

Jednostką tak wyrażonej aktywności jest M s^-1.

Jeżeli chcemy wyrazić aktywność jako ilość cząsteczek produktu przypadających na cząsteczkę enzymu w czasie 1 sekundy należy podzielić obydwie strony równania przez stężenie enzymu ET.

[ ] [ ]

S k E

v u

m

T = +

= ²

Jednostką tak wyrażonej aktywności jest s^-1.

Równanie szybkości reakcji enzymatycznej, identyczne z powyższym równaniem wyprowadzili w 1913 roku Michaelis i Menten [40], a następnie w 1925 roku Briggs i Haldane [41] przy różnych założeniach początkowych.

3. Wstęp teoretyczny

28 Jeżeli zmiana stężenia S w czasie jest bardzo niewielka, to można założyć, że nie zależy ona od czasu, wtedy zależność stężenia produktu w czasie przedstawia się następująco:

[ ] [ ]

[ ]

[ ] [ ]

[ ]

k k

S k P k

d

S E k k k

S k k dt

P d

T T

1 2 1

2 1

1 2 1

2 1

+

= +

+

= +

−

−

[ ] [ ]

[ ]

E S k

P k ^T

1 2 1

2 1

+

= +

−

3.4.1.2.Stan prestacjonarny

Stan prestacjonarny opisuje zmianę stężeń różnych form enzymu w czasie do momentu osiągnięcia stanu stacjonarnego. W tym przypadku zmiana stężenia form enzymu w czasie jest różna od zera

[ ]

ES ≠t d

d (rozważając później opis inhibicji „slow binding” również trzeba przyjąć założenie, że układ jest w stanie prestacjonarnym). W dalszej części rozważań zakładamy, że substrat jest w dużym nadmiarze i w stanie przedstacjonarnym, do osiągnięcia stanu stacjonarnego, zmiana jego stężenia jest na tyle mała, że jego stężenie jest równe w przybliżeniu stężeniowi początkowemu

[ ] [ ]

[ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ][ ] ( ) [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

ES S

E ES

ES S

t E ES

T T

2 1 1

2 1

1

−

= +

=

+

−

=

−

−

=k k₋ k k k₋ k

d d

Podstawiając za E i S, otrzymujemy:

[ ] [ ][ ]

( [ ]

) [ ]

ES k1 T 0 k1 0 k 1 k2

d

d = − + ₋ +

[ ] [ ]

[ ] [ ]

dt k d dt d

dt k v d

ES P

P ES

2 2 2

2

=

=

=

[ ] [ ]

[ ] ( [ ][ ] ( [ ] ) [ ] ) [ ] [ ] [ ] ( ) [ ][ ] [ ] [ ] [ ]

(

) [ ][ ]

0 S E S

P ES

0 ES S

S P E

ES 0 P

0 T 2 1 2 1 0 2 1

2

0 T 2 1 2 1 0 1 2 2

2

2 1 0 1 0 T 1 2 2

2 2 2 2

=

− + + +

=

− + + +

= +

+

−

−

=

−

−

−

−

k k k k dt k

d dt d

k k k k k

dt k d

k k k

k dt k

d

dt k d dt d

Wprowadzając stałe:

A=k₁

[ ]

[ ][ ]

[ ]

[ ]

2

2 + −B=

dt Ad dt d

Jest to równanie różniczkowe liniowe niejednorodne drugiego rzędu.

Rozwiązując takie równie należy najpierw rozwiązać równanie jednorodne:

[ ]

[ ]

2

2 + =

dt Ad dt d

Rozwiązując to równanie należy podstawić:

[ ] [ ]

[ ]

e dt r

d

e dt r

d e

2 2 2 P

P P

=

⋅

=

=

Otrzymujemy równanie kwadratowe:

0

2e^rt + A⋅r⋅e^rt = r

3. Wstęp teoretyczny

30

( )

0

2

= +

=

⋅ +

A r r

r A r

którego pierwiastki wynoszą:

r1=0 r2=-A

równanie ma dwa różne pierwiastki, więc równanie jednorodne ma rozwiązanie postaci:

[ ]

Następnie przewidujemy jako całkę szczególną równania wielomian stopnia pierwszego, ponieważ w równaniu jednorodnym nie występuje [P], tylko

[ ]

dt

d P , a po prawej stronie równania różniczkowego mamy stałą.

[ ] [ ]

[ ]

2

2 =

= +

=

dt d

dt a d

b ax

Podstawiając do równia różniczkowego:

[ ] [ ]

dt Ad dt

d P + P =

2 2

otrzymujemy:

A a B

B a A

=

=

⋅ 0+

więc:

[ ]

2 = P