Wpływ pH gleby na przeżywalność Streptomyces rochei

(1)

R O C Z N IK I G L E B O Z N A W C Z E TO M LV N R 1 W A R SZA W A 2 004: 2 7 5 - 2 8 3

DOROTA JABŁOŃSKA-GORZAŁA*, GRZEGORZ GORZAŁA*, JÓZEF CHOJNICKI**, STEFAN RUSSEL*

W P Ł Y W pH G L E B Y N A P R Z E Ż Y W A L N O ŚĆ

STREPTOMYCES ROCHEI

INFLUENCE OF SOIL pH ON THE SURVIVAL

OF

STREPTOMYCES ROCHEI

*Zakład Mikrobiologii Rolniczej i Zakład Gleboznawstwa, **Katedra Nauk o Środowisku Glebowym, SGGW, Warszawa

..A bstract: The effect o f soil pH on survival o f artificially introduced Streptomyces rochei in pot

experiments was studied. The soil samples collected from humus horizons o f six selected forest soil profiles situated in W hite Primeval Forest were dried, sterilized and subsequently inoculated with

S. rochei spores. The experiment was arranged in three replications and two treatments: no limed

soil and limed soil. Actinomycetales survival was measured after 0, 1, 8, 15, 29, 35 and 49 days

using the plate method. In all experimental treatments directly after soil inoculation the num ber o f alive Actinomycetales cells rapidly decreased and after adaptation period its gradually increased. In lim ed soils the num ber o f alive cells o f Streptomyces rochei was indeed higher than in no limed soils.

Słowa kluczow e: Streptomyces rochei, gleby leśne, pH gleby, doświadczenie wazonowe. K ey words: Streptomyces rochei, forest soils, soil pH, pot experiments.

WSTĘP

Gleba, a szczególnie jej poziom próchniczny, jest z reguły bardzo dobrym środo wiskiem do wzrostu drobnoustrojów. O rozwoju mikroorganizmów w glebie decyduje jej faza stała, zawierająca związki mineralne i substancje organiczne oraz powietrze glebowe i roztwór glebowy. Mikroorganizmy wpływają na strukturę gleby przez wytwarzane metabolity w postaci śluzu, powodujące sklejanie się bardzo drobnych cząsteczek w gruzełki i agregaty glebowe. W procesie tym znaczną rolę odgrywają promieniowce, a także grzyby, których strzępki przerastają glebę poprawiając jej strukturę [Alexander 1977; Libudzisz i in. 2000].

Promieniowce (Actinomycetales) stanowią obok bakterii właściwych drugą pod względem liczebności grupę mikroorganizmów zasiedlających glebę i prowadzących ważne przemiany złożonych związków węgla i azotu w tym środowisku [Chmiel 1994;

(2)

Libudzisz i in. 2000]. Promieniowce są organizmami powszechnie występującymi w różnych naturalnych środowiskach. Można je znaleźć w kompostach, oborniku, mułach rzek i jezior, w wodach i ściekach itp. Szczególnie dużo jest ich w glebach torfowych. M ogą występować również obficie w różnych typach gleb, nawet o kwaśnym odczynie, chociaż optymalne pH dla ich wzrostu i rozwoju wynosi około 7. Promieniowce przeważnie preferują środowiska obojętne lub lekko alkaliczne, chociaż istnieją gatunki charakterystyczne dla środowisk o niskich wartościach pH, np. Streptomyces scabies [Wellington i in. 1994; Wang i in. 1999; Libudzisz i in. 2000; Schlegel 2003].

Od 5 do 20% z ogólnej liczby mikroorganizmów izolowanych z gleby to promieniowce z rodzaju Streptomyces [Doumbou i in. 1998; Walter i in. 1998; Walter i in. 1999; Libudzisz i in. 2000; Ravel i in. 2000]. Badania nad przeżywalnościąpromieniowców z rodzaju Streptomyces sztucznie wprowadzonych do gleb naturalnych i jałowionych wykazały, że w tych warunkach mogą wykazywać aktywność życiową przez kilka tygodni [Wellington i in. 1990; Ravel i in. 2000].

Celem niniejszej pracy była ocena wpływu zmodyfikowanego pH kwaśnych gleb na przeżywalność komórek Streptomyces rochei w warunkach in vitro.

MATERIAŁ I METODY

Szczep promieniowców wyizolowano z poziomu próchnicznego leśnej gleby glejobielicowej występującej w Puszczy Białej. Na podstawie testów API 20 E i API 50 CH oraz analizy morfologicznej i zawartości G+C mol% szczep ten zidentyfikowano jako

Streptomyces rochei. Szczep ten charakteryzował się wysoką aktywnością celulolityczną.

Doświadczenia związane z optymalizacja pożywki hodowlanej wykazały, że preferuje on podłoża o pH zbliżonym do 7,0.

Próbki gleb do analiz pobrano z poziomów próchnicznych sześciu różniących się profili glebowych występujących na terenie Puszczy Białej (tab. 1).

Pobrane próbki gleby po przywiezieniu do laboratorium doprowadzono do stanu powietrznie suchego i przesiano przez sito o średnicy oczek 1 mm. Następnie określano maksym alną pojemność wodną gleby (PWm) oraz ustalono dawkę CaO niezbędną do doprowadzenia pH tych gleb do wartości 7,0. Próbki gleby pobrane z poszczególnych profili glebowych wyjałowiono w autoklawie ze względu na konieczność wyeliminowania występującego w tego typu doświadczeniach wpływu rodzimej mikroflory. M etodę sterylizacji badanych gleb w parze wodnej pod ciśnieniem wybrano na podstawie analizy danych znalezionych w literaturze [England i in. 1993; Trevors 1996]. Każdą z prób gleby podzielono na dwie części. Jedną część pozostawiono bez zmian (tzw. gleba naturalna jałowiona), drugą natomiast potraktowano później CaO w celu doprowadzenia pH do wartości 7,0 (tzw. gleba wapnowana jałowiona).

Próbki gleb naważono po 50 g do jałowych, plastikowych wazonów. W celu wyjałowienia wazony przemywano 75% alkoholem i naświetlano promieniami UV. Część próbek glebowych dokładnie mieszano z odpowiednią ilością CaO. Wilgotność wszystkich próbek ustalano na poziomie 60% maksymalnej pojemności wodnej. Następnie gleby szczepiono 1 cm3 zawiesiny zawierającej 3,6 x 106 konidiów badanego szczepu prom ieniow ców w roztw orze soli fizjologicznej, a w przypadku prób

(3)

Wpływ p H gleby na przeżywalność Streptomyces rochei 277

TABELA 1. Charakterystyka poziomów próchnicznych badanych profili glebowych TABLE 1. Some physico-chemical properties of humus horizons of investigated soil profiles Nr profilu No. of profile Typ gleby Soil type Poziom Genet. Genetic horizon Głębokość Depth [cm] pH [g ' kgT1] C:N H20 KC1 С N 14 opado wo-glejowa pseudogley soil A 2-16 4,2 3,7 24,8 1,3 18,5 15 rdzawa właściwa rusty soil A 5-12 3,7 3,0 28,7 1 ,1 26,8 2 1a murszowa muck soil AM 5-10 5,1 4,6 365,0 20,9 17,4 33 glejobielicowa gley-podzol soil A 3,5-13 3,3 2 , 8 63,2 2 , 8 2 2 , 2 35 gruntowo- glejowa gley soil A 1-17 4,1 3,4 66,5 6,3 10,4 38 czarna ziemia black earth A 2,5-18 3,8 3,0 17,1 1 ,1 15,2

kontrolnych wprowadzano 1 cm3 jałowej wody. W tzw. terminie „0” 1 g gleby inokulowanej zawierał więc 75 x 103 konidiów promieniowca. Określoną wilgotność gleby utrzymywano do końca trwania doświadczenia. W celu ograniczenia parowania gleby wazony przykryto jałow ą, laboratoryjną folią aluminiową. Ilość kom órek promieniowców w 1 cm3 inokulum określano metodą płytkową na podłożu skrobiowym (skrobia - 20 g, K N 0 3- 1 g, K2H P 0 4- 0,5 g, M gS 04- 0,5 g, NaCl - 0,5 g, F e S 0 4- 0,01 g, agar - 20 g, woda wodociągowa - 1000 cm3). Odczyn pożywki doprowadzono do wartości pH 7,0.

Hodowle prowadzono przez 49 dni w temperaturze pokojowej. Przeżywalność promieniowców w glebie inkubowanej w wazonach określano m etodą płytkow ą na pożywce skrobiowej po 1, 8, 15, 29, 35, i 49 dniach trwania doświadczenia. W odpowiednim dniu do analizy pobierano z każdego obiektu doświadczalnego 3 wazoniki, z których odważano po 10 g gleby. Z naważek gleby sporządzano zawiesinę w 100 cm3 jałowej wody wodociągowej, a następnie przygotowywano rozcieńczenia z prób zawiesin glebowych w zakresie od 10-3 do 10~9. Po przygotowaniu naważki wazoniki z resztą gleby niszczono. Następnie 1 cm3 poszczególnych rozcieńczeń zawiesiny glebowej wnoszono do płytek Petriego i zalewano podłożem skrobiowym. Hodowle inkubowano przez 14 dni w temperaturze 28°C. Uzyskane wyniki opracowano statystycznie metodą analizy wariancji wykorzystując program komputerowy Statgraphics. Wyznaczono grupy homogeniczne korzystając z testu Tukeya przy poziomie istotności a = 0,05.

(4)

WYNIKI I DYSKUSJA

Przeżywalność, szybkość wzrostu oraz aktywność metaboliczna drobnoustrojów uwarunkowane są zarówno ich fizjologią, jak również zależą od wielu różnorodnych środowiskowych czynników fizycznych i chemicznych. Te same gatunki drobnoustrojów m ogą występować często w drastycznie różniących się warunkach środowiskowych [Alexander 1977; Libudzisz i in. 2000]. Z dostępnej literatury wiadomo, że do najważniejszych czynników wpływających na wzrost drobnoustrojów w glebie należy jej odczyn [Widmer i in. 1989; Amato i in. 1994; Libudzisz i in. 2000].

Szczep Streptomyces rochei został wyizolowany z poziomu próchnicznego kwaśnej gleby leśnej wykazującej pH 3,3. Szczep ten tworzył na pożywce z krążkiem bibuły filtracyjnej charakterystyczne pomarańczowe kolonie. Charakterystyka cech fizjolo- giczno-biochemicznych wykazała, że najw yższą intensywność wzrostu S. rochei uzyskano na pożywce skrobiowej o pH 7,0.. Wynika z tego, że wyizolowany szczep należy do organizmów neutrofilnych. Z dostępnej literatury wiadomo, że promieniowce występują w środowiskach naturalnych o zakresie pH 4-10. Stwierdzono, że w glebach, o pH<5 stanowią tylko 1% populacji mikroorganizmów [Burges i in. 1971; Ziemięcka 1974; Szember 1995; Libudzisz i in. 2000]. W przyrodzie istnieje niewielka ilość form promieniowców acidofilnych [Wellington i in. 1994]. Promieniowce acidofilne są izolowane z kwaśnych gleb leśnych (pH od 3,3 do 5,1). Drobnoustroje acidofilne przystosowały się w drodze ewolucji do życia w środowisku kwaśnym.

W glebach naturalnych występują organizmy o różnych właściwościach fizjo logicznych, często niekorespondujących z właściwościami fizyko-chemicznymi tych gleb. S. rochei jako organizm neutrofilny z punktu widzenia wymagań co do pH środowiska był izolowany ze znaczną częstotliwością z bardzo kwaśnych gleb Puszczy Białej.

O naturalne pH, natural pH Ж zmodyfikowane pH, modified pH

Czas inkubacji (dni), Time of incubation (days)

RYSUNEK 1. Wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rochei w poziomie próchnicznym gleby opadowo-glejowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnic)

FIGURE 1. Influence of pH modification on survival Streptomyces rochei in humus horizons ,jf pseudo- gley soil (*mcan significant differences are marked with different letters)

(5)

Wpływ p H gleby na przeżywalność Sireptomyces rochei 279

□ naturalne pH, natural рНШ zmodyfikowane pH, modified pH

RYSUNEK 2. Wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rocheiw poziomie próchnicznym gleby razawej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)

FIGURE 2. Influence of pH modification on survival Streptomyces rocheiip humus horizons of rusty soil (*mean significant differences are marked with different letters)

Przeprowadzone doświadczenie wykazało znaczną dynamikę zmian liczebności wprowadzonych do gleby promieniowców w badanych obiektach doświadczalnych. Po zaszczepieniu gleby konidiami promieniowców bez względu na wartość począt kowego pH nastąpiło gwałtowne zmniejszenie liczby żywych komórek promieniowców. Reakcja ta prawdopodobnie wynika z konieczności adaptacji tych organizmów do

O naturalne pH, natural p H ■ zmodyfikowane pH, modified pH

RYSUNEK 3. Wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rocheiw poziomie próchnicznym gleby murszowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)

FIGURE 3. Influence of pH modification on survival Streptomyces rocheiin humus horizons o f muck soil (*mean signif; :ant differences are marked with different letters)

(6)

□ naturalne pH, natural pH «zm odyfikow ane pH, modified pH

300 250

1 8 15 29 35 49

RYSUNEK 4. Wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rocheiw poziomie próchnicznym gleby glejobielicowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)

FIGURE 4. Influence of pH modification on survival Streptomyces rocheiin humus horizon of gley- podzol soil (*mean significant differences are marked with different letters)

O naturalne pH, natural pH « zmodyfikowane pH, modified pH

8 15 29 35 49

RYSUNEK 5. Wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rochei w poziomie próchnicznym gleby gnintowo-glejowej (*różnymi literami oznaczono różniące sią średnie)

FIGURE 5. Influence of pFI modification on survival Streptomyces rocheiin humus horizon of gley soil (*mean significant differences are marked with different letters)

(7)

O naturalne pH, natural pH « zmodyfikowane pH, modified pH

-RYSUNEK 6. Wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rochei w poziomie

próchnicznym gleby czarnej ziemi (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)

FIGURE 6. Influence of pH modification on survival Streptomyces rochei in humus horizons o f black

earth soil (*mean significant differences are marked with different letters)

nowych warunków środowiska. Natomiast po upływie około dwóch tygodni odnotowano znaczny wzrost ich liczebności. Przeprowadzona analiza statystyczna wykazała w większości przypadków istotny wpływ pH na przeżywalność badanego szczepu promieniowców. Pod koniec trwania doświadczenia liczba promieniowców w glebach bez dodatku CaO była niższa niż w glebach o pH 7,0. W dostępnej literaturze nie znaleziono danych dotyczących wpływu pH na przeżywalność promieniowców w glebie.

Analiza wariancji wykazała istotny wpływ zmodyfikowanego pH na przeżywalność badanego szczepu po 1, 8, 15 i 29 dniach trw ania dośw iadczenia w poziom ie próchnicznym gleby opadowo-glejowej (rys. 1). W ostatnich dwóch terminach nie stwierdzono istotnych różnic w ilości promieniowców w glebach o pH naturalnym, jak i zmodyfikowanym.

W poziomie próchnicznym gleby rdzawej (rys. 2) analiza statystyczna wykazała istotny wpływ pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rochei po 1, 8, 29, 35 i 49 dniach trwania doświadczenia.

W poziomie próchnicznym gleby murszowej (rys. 3) analiza ta wykazała istotny wpływ zmodyfikowanego pH na przeżywalność badanych drobnoustrojów po 1, 8 i 29 dniach trwania doświadczenia.

Analiza wariancji wykazała istotny wpływ pH na przeżywalność badanego szczepu po 8, 15 i 35 dniach trw ania dośw iadczenia w poziom ie próchnicznym gleby glejobielicowej (rys. 4).

W poziomie próchnicznym gleby gruntowo-glejowej (rys. 5) analiza statystyczna wykazała istotny wpływ modyfikacji pH na przeżywalność szczepu Streptomyces rochei po 8, 29, 35 i 49 dniach trwania doświadczenia.

(8)

Analiza wariancji wykazała istotny wpływ pH na przeżywalność badanego szczepu po 1, 8, 29, 35 i 49 dniach trwania doświadczenia w poziomie próchnicznym czarnej ziemi (rys. 6).

Przeżywalność mikroorganizmów wprowadzanych do gleby ma związek z różnymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak: zasobność gleby w składniki pokarmowe, temperatura, odczyn, zasolenie oraz różne biologiczne interakcje [Kermen 1981 ; England i in. 1993]. Niniejsza praca wykazała, że liczebność komórek wprowadzonego sztucznie do gleby szczepu S. rochei w początkowym okresie inkubacji gwałtownie się zmniejszała, niezależnie od typu gleby, jak i jej pH. Odbudowa populacji promieniowców glebowych jest procesem wymagającym czasu i przebiegającym sprawniej przy pH gleby zbliżonym

do optymalnego.

WNIOSKI

1. Po wprowadzeniu do gleb jałowych liczebność Streptomyces rochei przez pierwsze dwa tygodnie gwałtownie spadała, a następnie obserwowano stopniową odbudowę populacji badanej grupy drobnoustrojów.

2. Liczba żywych komórek Streptomyces rochei zależała istotnie od pH i była wyższa w glebach o pH zbliżonym do pH optymalnego z punktu widzenia fizjologii badane go szczepu.

LITERATURA

ALEXA N DER M. 1977: Introduction to soil microbiology. Wiley J., New York.

AMATO M., LADD J. N. 1994: Application o f the ninhydrin-reactive N assay for microbial bio mass in acid soils. Soil B io l Biochem . 26: 1109-1115.

BURGES A , RAW F. 1971: Biologia gleby. PWRiL, Warszawa.

CHM IEL A. 1994: Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. Wydaw. PWN, Warszawa.

DOUM BOU C. L., AKIMOV V., BEAILIEU C. 1998: Selection and Characterization o f M icroor ganisms Utilizing Thaxtomin A, a Phytotoxin Produced by Streptomyces scabies. Appl. Envi

ron. M icrobiol. 64(11): 4313-4316.

DROZDOW ICZ A. 1968: Elementy mikrobiologii. Dział Wydawnictw SGGW, Warszawa. ENGLAND L. S., LEE H., TREVORS J. T. 1993: Bacterial survival in soil: effect o f clays and

protozoa. Soil Biol. Biochem. 25: 525-531.

KERMEN J. 1981 : Dynamiczna równowaga mikroorganizmów w glebie. Post. Microbiol. 20: 201-211. LIBUDZISZ Z., KOWAL K. 2000: Mikrobiologia techniczna. Wydaw. Politechniki Łódzkiej: 36-43. RAVEL J., WELLINGTON E., HILLR. 2000: Interspecific Transfer o f Streptomyces Giant: Linear

Plasmids in Sterile Amended Soil Microcosms. Appl. Environ. M icrobiol 66(2): 529-534. SCHLEGEL H. G. 2003: Mikrobiologia ogólna. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa.

SZEM BER A. 1995: Zarys mikrobiologii rolniczej. Wyd. AR w Lublinie.

TREVORS J.T. 1996: Sterilization and inhibition o f microbial activity in soil. J. Microbiol. M e

thods 26: 53-59.

WALTER S., W ELLM ANN E., SCHREMPF H. 1998: The Cell Wall-Anchored Streptomyces re-

ticuli Avicel-Binding Protein (AbpS) and Its Gene. J. Bacteriol. 180(7): 1647-1654.

WANG Y., ZHANG Z. S., RUAN J. S., WANG Y. M., ALI S. M. 1999: Investigation o f actinomy- cete diversity in the tropical rainforests o f Singapore. J. Ind. M icrobiol Biotech. 23: 178-187.

(9)

WELLINGTON E. M. H., CRESS WELL N., SAUNDERS V. A. 1990: Growth and survival o f streptomycete inoculants and extent o f plasmid transfer in sterile and nonsterile soil. Appl. E nvi

ron. Microbiol. 56: 1413-1419.

W ELLINGTON E. M. H., TOTH I. K. 1994: Actinomycetes. W: Weaver R. W. (red.): M ethods o f soil analysis, part 2: M icrobiological and Biochemical properties. SSSA Book Series, SSSA, M adison, WI. 5: 269-290.

W IDM ER R, BROOKES R C., PARRY L. C. 1989: Microbial biomass nitrogen measurem ents in soils containing large amounts o f inorganic nitrogen. Soil Biol. Biochem. 21: 865-867. ZIEM IĘCKA J. 1974: Mikrobiologia gleby i nawozów organicznych. PWRiL Warszawa.

d r inż. D orota Jabloński-G orzala

Z a kła d M ikrobiologii Rolniczej, K a ted r a N a u k o Środow isku Glebowym , Szkoła G łów na G ospodarstw a Wiejskiego,

(10)