sala 8 Miejsce ćwiczenia: mgr inż. Jadwiga Zawisza-Puchałka ZASTOSOWANIE IMMOBILIZOWANEJ AMYLAZY Prowadzący: INSTRUKCJA

INSTRUKCJA

ZASTOSOWANIE IMMOBILIZOWANEJ AMYLAZY

Prowadzący: mgr inż. Jadwiga Zawisza-Puchałka

Miejsce ćwiczenia: sala 8

CE

EL L ĆW

WI IC CZ ZE EN N IA

A

Celem ćwiczenia jest otrzymanie produktów enzymatycznej hydrolizy skrobi w procesie przeprowadzanym w sposób ciągły.

PO

OD DS ST TA AW WY Y TE

EO OR RE ET TY YC C ZN

NE E

Głównymi surowcami w procesach biotechnologii są węglowodany (skrobia, sacharoza) oraz produkty uboczne przetwórstwa rolno-spożywczego (np. melasa).

Liczne drobnoustroje, reprezentowane przez bakterie, promieniowce i grzyby strzępkowe wytwarzają trzy rodzaje enzymów hydrolitycznych rozkładających skrobię, która składa się z amylozy i amylopektyny.

Enzymy te to:

 -amylaza zaliczana do endoamylaz;

 -amylaza zaliczana do egzoamylaz;

 glukoamylaza odcinająca kolejne reszty glukozowe.

Enzymy mogą być unieruchamiane (immobilizowane) na nierozpuszczalnych w wodzie nośnikach.

Duże zainteresowanie unieruchomionymi enzymami wynika głównie z możliwości praktycznego ich zastosowania do organizacji procesów ciągłych. Mogą one być łatwo oddzielane od mieszaniny reakcyjnej, wielokrotne używanie oraz pozwalają na stosowanie układów enzymatycznych i przeprowadzanie złożonych procesów syntezy. Dzięki temu znajdują coraz szersze zastosowanie w analityce, w różnych technologiach przemysłowych i w medycynie. Łatwość oddzielania unieruchomionych enzymów od układów reakcyjnych pozwala na ścisłą kontrolę przebiegu reakcji. Możliwość wielokrotnego użycia i przeprowadzania procesów w sposób ciągły zwiększa ekonomiczność ich stosowania.

Często zdarza się, że dzięki unieruchomieniu enzymy i komórki zwiększają swoją stabilność i aktywność. Zazwyczaj unieruchamianie enzymów zwiększa ich odporność na działanie mikroorganizmów i enzymów proteolitycznych. Połączenie drugo- i trzeciorzędowej struktury białka z nośnikiem może w znacznym stopniu zapobiegać zmniejszeniu jego aktywności enzymatycznej pod działaniem podwyższonej temperatury, ekstremalnych warunków pH, guanidyny i mocznika.

Unieruchamianie enzymów na nośnikach przestrzennych może zabezpieczać je przed wytrącaniem pod wpływem rozpuszczalników organicznych rozpuszczalnych w wodzie. Stosując unieruchomione czynniki biologiczne można przyspieszyć procesy biotechnologiczne, udoskonalając w ten sposób znane wcześniej technologie i tworzyć nowe np. dzięki zastosowaniu w ciągłym procesie produkcji etanolu unieruchomionych na porowatym nośniku drożdży uzyskano właściwą szybkość zużywania glukozy i właściwą szybkość wytwarzania etanolu.

Często stosowaną metodą analityczną pozwalającą kontrolować przebieg reakcji jest chromatografia cienkowarstwowa.

Chromatografia cienkowarstwowa jest metodą rozdzielania mieszanin prowadzonego na sproszkowanej fazie stałej w postaci warstwy nałożonej na gładką płytkę ze szkła, masy plastycznej lub aluminium. Warstwę pokrywającą może stanowić żel krzemionkowy lub sproszkowana celuloza. Kroplę badanej próbki nanosi się wobec wzorców na linię startową (około 0.5 cm od dolnej krawędzi płytki) po

czym płytkę umieszcza się w zamykanej komorze, tak aby dolna krawędź płytki była zanurzona w rozpuszczalniku. Rozpuszczalnik wznosi się ku górze płytki dzięki działaniu sił kapilarnych i następuje rozdział mieszaniny. Rozdział zostaje zatrzymany poprzez wyjęcie płytki z komory zanim rozpuszczalnik osiągnie jej górną granicę.

W celu detekcji składników mieszaniny stosuje się naświetlanie płytki promieniowaniem UV lub spryskiwanie odpowiednim dla danej grupy związków wywoływaczem.

Każda substancja charakteryzuje się inną wartością Rf. Wartość ta zależy od nośnika pokrywającego płytkę oraz od układu rozwijającego.

Proces rozdziału mieszaniny w chromatografii cienkowarstwowej odbywa się dzięki różnemu powinowactwu składników mieszaniny do fazy ruchomej i stacjonarnej. W trakcie rozwijania chromatogramu badany związek ulega wielokrotnemu podziałowi między fazą ruchomą a stacjonarną.

Poszczególne związki na chromatogramie można zidentyfikować poprzez porównanie położenia plamy badanego związku z położeniem plamy związku wzorcowego lub określenie wartości R_f badanego związku w różnych układach rozwijających i porównaniu z tablicami.

WY

YK KO ON NA AN NI IE E ĆW

WI IC CZ ZE EN NI IA A

Zadanie 1. Otrzymanie unieruchomionej -amylazy na DEAE- celulozie.

Sprzęt:

 kuchenka elektryczna

 kolbka miarowa z korkiem na 500 ml

 lejki: zwykły i do sączenia pod próżnią

 kolbka ssawkowa na 100 ml

 sączki

 zlewki na 100 ml

 kolbka stożkowa na 25 ml

 bagietka

 kolumna chromatograficzna

Materiał i odczynniki:

 NaH2PO4

 Na2HPO4·12 H2O

 skrobia rozpuszczalna

a b

start koniec

Rf = a

b

 0.5M roztwór HCl

 1M roztwór NaOH

 DEAE-celuloza

 Roztwór -amylazy

 Woda destylowana

Wykonanie ćwiczenia:

1. Przygotowanie buforu fosforanowego.

Do kolby miarowej na 500 ml wsypać przez suchy lejek 27.8 g NaH2PO4 oraz 71.7 g Na2HPO4·12 H2O, po czym po dodaniu 300 ml wody destylowanej ogrzać w łaźni wodnej do rozpuszczenia soli. Następnie zawartość kolby dopełniamy wodą destylowaną do kreski.

Przygotowanie roztworu skrobi.

Do kolbki stożkowej o pojemności 25 ml z naważką 0.5 g skrobi rozpuszczalnej dodać 10 ml buforu fosforanowego i ogrzewać na kuchence elektrycznej do całkowitego rozpuszczenia skrobi. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej roztwór powinien pozostać klarowny.

2. Przygotowanie kolumny z DEAE-celulozą.

2 g DEAE-celulozy wsypać do zlewki z 30 ml 1M roztworu NaOH i po dokładnym wymieszaniu pozostawić na 10 minut. Po tym czasie odsączyć żel na lejku ze spiekiem i przemyć wodą. Następnie przenieść żel ponownie do zlewki i dodać do niego 30 ml 0.5 M roztworu HCl i po dokładnym wymieszaniu pozostawić na kolejne 10 minut. Ponownie odsączyć żel na lejku ze spiekiem, przemyć go wodą i przenieść do zlewki. Do żelu dodać 30 ml 1M roztworu NaOH, dokładnie wymieszać i odsączyć na lejku ze spiekiem, a następnie odmyć żel wodą do odczynu obojętnego. Tak spreparowany żel przenieść do zlewki, dodać do niego 25 ml buforu fosforanowego i dokładnie wymieszać w celu odpowietrzenia żelu. Tak przygotowany jonowymieniacz nanieść na kolumnę.

3. Przygotowanie unieruchomionej na żelu -amylazy.

Na przygotowaną kolumnę nanieść 2 ml preparatu enzymatycznego, poczekać aż w całości zwiąże się z żelem, a następnie rozprowadzić równomiernie preparat na żelu przez przemycie 20 ml buforu fosforanowego.

Zadanie 2. Sprawdzenie aktywności kolumny z unieruchomioną - amylazą.

Sprzęt:

 kolumna chromatograficzna z naniesionym enzymem

 komora i płytki do chromatografii cienkowarstwowej

 spryskiwacze do chromatogramów

 fiolki na 20 ml do odbioru frakcji z kolumny

Materiał i odczynniki:

 roztwór skrobi w buforze fosforanowym

 bufor fosforanowy o pH=6.7

 metanol

 chloroform

 płytki TLC

 10% kwas siarkowy w etanolu

 2% roztwór glukozy

Wykonanie ćwiczenia:

W celu sprawdzenia, czy -amylaza naniesiona na kolumnę jest aktywna nanieść na szczyt kolumny 8 ml 0.5% roztworu skrobi w buforze fosforanowym, a następnie wymywać go z kolumny 50 ml buforu fosforanowego. Zbierać wyciek z kolumny w postaci frakcji po 15 ml i analizować go metodą chromatografii cienkowarstwowej.

Chromatografia cienkowarstwowa:

Na 2 płytki (42 cm) pokryte żelem krzemionkowym nanieść punktowo za pomocą kapilar roztwory wzorcowe glukozy, skrobi oraz frakcje otrzymane z kolumny.

Chromatogramy rozwinąć w układzie chloroform:metanol: (1:2). Po wyschnięciu płytki wywołać ją przez spryskanie 10% etanolowym roztworem kwasu siarkowego i ogrzanie na kuchence elektrycznej.