Miejsce ćwiczenia: sala 102 Prowadzący: dr inż. Gabriela PASTUCH Oznaczanie aktywności enzymów Ć WICZENIE 1

Ćwiczenie 1

Ć WICZENIE 1

Oznaczanie aktywności enzymów

Prowadzący: dr inż. Gabriela PASTUCH

Miejsce ćwiczenia: sala 102

Ćwiczenie 1

CE C EL L ĆW Ć WI IC CZ ZE EN NI IA A

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności -amylazy w ślinie oraz badanie wpływu na aktywność amylazy różnych czynników, takich jak: temperatura, obecność jonów chlorkowych, silnych kwasów i zasad.

PO P OD DS ST TA AW WY Y TE T EO OR RE ET TY YC CZ ZN NE E

Hydrolazy glikozydowe to grupa enzymów powodujących hydrolizę wiązań glikozydowych. Do najpowszechniej występujących enzymów w tej podgrupie należą amylazy. Przeprowadzają one hydrolizę skrobi, wielocukru złożonego z jednostek D- glukozy, połączonych wiązaniem glikozydowym. -amylazy rozrywają wiązania położone wewnątrz cząsteczki.

Przebieg procesu degradacji skrobi można śledzić obserwując zmianę barwy roztworu skrobi traktowanego jodem od niebieskiej (kompleks ze skrobią), poprzez fiołkową, czerwoną (kompleks z erytrodekstrynami) do bezbarwnej (utworzenie cukrów o niskim ciężarze cząsteczkowym). W czasie procesu rośnie zawartość cukrów redukujących, produktów hydrolizy skrobi i określając ich zawartość można śledzić przebieg reakcji.

Obecność cukrów redukujących można również stwierdzić wobec odczynnika Benedicta. Próba Benedicta należy do najbardziej swoistych i czułych prób redukcyjnych na cukry. Już 0,1% stężenie cukru redukującego powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. W zależności od ilości glukozy powstaje albo tylko zielone zabarwienie, albo osad żółty, pomarańczowy czy czerwony.

U człowieka enzym -amylaza występuje w ślinie, trzustce, surowicy krwi i moczu. Amylaza śliny i trzustki wykazuje aktywność w roztworach lekko zasadowych, obojętnych i słabo kwasowych. Optymalne pH działania: 6,6. Bardzo duży wpływ na działanie amylazy śliny wywierają elektrolity (Cl^-, Br^-).

WY W YK KO ON N AN A NI IE E ĆW Ć WI IC CZ ZE EN NI IA A

Sprzęt:

 statyw z probówkami,

 pipety,

 łaźnie wodne o temperaturze 0^oC, 18 ^oC, 37 ^oC, 45 ^oC, 60 ^oC.

Materiał i odczynniki:

 0,5% roztwór skrobi,

 bufor fosforanowy pH 6,6,

 1% roztwór NaCl,

 odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI)

 1M HCl,

 1M NaOH.

Ćwiczenie 1

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności -amylazy w ślinie.

Przygotować statyw z probówkami zawierającymi po 0,5 ml odczynnika Lugola i 0,5 ml 1M HCl.

W kalibrowanej probówce (1) zebrać około 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, wymieszać i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37^oC.

Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC na 5 minut.

Po 5 minutach do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać, zanotować czas i ponownie wstawić do łaźni wodnej. W krótkich odstępach czasu (od 30s do 3 min) do probówek w statywie, zawierających płyn Lugola, wprowadzać pipetą próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy jodu- punkt achromowy.

Podać aktywność amylazy w ślinie w jednostkach / ml. W tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjmujemy taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37^oC, w pH 6,6 w obecności jonów chlorkowych do produktów nie dających barwy z jodem – punkt achromowy.

Przykład obliczenia:

Jeśli do oznaczenie pobrano 1 ml stokrotnie rozcieńczonej śliny, a punkt achromowy osiągnięto po 8 minutach to aktywność amylazy wynosi: 10/8 x 100 = 125 jednostek / ml.

Zadanie 2. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność -amylazy.

Jon chlorkowy jest aktywatorem -amylazy. Oznaczyć punkt achromowy jak w zadaniu 1 zastępując w probówce (2) chlorek sodu wodą destylowaną.

Zadanie 3. Wpływ temperatury na aktywność -amylazy.

Do czterech probówek odmierzyć po 5 ml skrobi, 2 ml buforu i 2 ml NaCl. Każdą probówkę umieścić w innej łaźni i po 5 minutach dodać do każdej po 1 ml roztworu śliny, zamieszać i oznaczyć punkty achromowe analogicznie jak w zadaniu 1.

Podać optymalna temperaturę dla -amylazy.

Zadanie 4. Wpływ silnych kwasów i zasad na aktywność -amylazy.

Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworu śliny. Do pierwszej dodać 1 ml wody, do drugiej 1 ml 1M HCl, do trzeciej 1 ml 1M NaOH, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 ^oC. Po 15 minutach zawartość probówek zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego (odpowiednio zasadą sodową lub kwasem solnym) i uzupełnić objętość buforem do 5 ml. Do trzech następnych probówek odmierzyć po 2 ml skrobi, 1 ml NaCl, 1 ml buforu pH 6,6. Do pierwszej probówki dodać 1 ml śliny rozcieńczonej wodą, do drugiej 1 ml śliny traktowanej kwasem, a do trzeciej 1 ml śliny traktowanej zasadą. Probówki ponownie umieścić w łaźni wodnej i oznaczyć aktywność -amylazy.