Regulacja transkrypcji genów

(1)

Regulacja transkrypcji genów

eukariotycznych

(2)

Klasyczne wyobrażenie genu – fragment

DNA, który koduje mRNA

(3)

Definicja genu - klasyczna

GEN- podstawowa jednostka dziedziczenia

Region DNA, który określa charakterystyczną dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA.

Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami.

Molecular Biology of the Cell Forth Edition

(4)

Współczesne definicje odnoszą się do produktu, jakim jest funkcjonalny transkrypt i nie biorą pod

uwagę białka

• Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki.

• Trans-splicing: Istnieją geny ‘ w kawałkach’. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA.

• Geny nakładające się: Niektóre ‘geny’ nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów.

• Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość

informacyjna ‘genu’ jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych ‘genów’

(5)

• Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów

• Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne

• Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie

• Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji

(alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

Geny eukariotyczne

(6)

Etapy ekspresji/poziomy regulacji

• struktura chromatyny

• transkrypcja

• obróbka i kontrola jakości RNA

• transport RNA

• degradacja RNA

• translacja

• modyfikacje post-translacyjne

• degradacja białka

(7)

Transkrypcja

• Kluczowym etapem regulacyjnym większości genów jest transkrypcja

• Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji

• Czynniki cis – sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy)

• Czynniki trans – białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis)

(8)

Czynniki cis

(9)

Czynniki trans

(10)

Rozmieszczenie sekwencji regulatorowych

Ekson - odcinek genu, który koduje sekwencje aminokwasów w białku Intron - niekodujący odcinek genu, rozdziela eksony

UAS – ang. upstream activating sequence

(11)

Podstawowe elementy cis

Promotor rdzeniowy (podstawowy) – wiąże ogólne czynniki transkrypcyjne

Elementy bliskiego promotora (proksymalnego) – wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów, które zapewniają podstawowy poziom transkrypcji

• element CAAT –czynniki NF-1 i NF-Y

• element GC – czynnik Sp1

• oktamer – czynnik Oct1

(12)

3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota

• Polimeraza mitochondrialna

polimeraza produkty

wrażliwość na α-amanitynę Polimeraza I geny rRNA (18S;

28S; 5,8S)

nie wrażliwa

Polimeraza II

hn/mRNA,

większość snRNA (U1, U2, U4, U5), miRNA

bardzo wrażliwa

Polimeraza III

małe RNA: tRNA, snoRNA, 5S rRNA, U6 snRNA

umiarkowanie wrażliwa

(13)

CTD- C końcowa domena Pol II, o krytycznym znaczeniu dla transkrypcji

Skład podjednostkowy 3 głównych polimeraz RNA Eukaryota

Polimeraza

RNA E.coli Eukariotyczne polimerazy RNA

Podjednostki typu β i β’

Podjednostki typu α

Podjednostki wspólne

Podjednostki specyficzne dla danej polimerazy

(14)

Polimeraza II

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres.

Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA.

Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji.

Do tego celu niezbędna jest obecność OGÓLNYCH CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH

• U prokariontów geny są najczęściej ciągłe, tj. kolinearne z ich mRNA.

• U wyższych eukariontów geny są nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mRNA.

• Części genu ulegające ekspresji noszą nazwę eksonów, zaś sekwencje przedzielające eksony – intronów.

(15)

Inicjacja transkrypcji

• Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w

rdzeniowej części promotora

GTF – ang. general transcription factor

TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH

(16)

(17)

(18)

Promotor podstawowy

BRE - TFIIB recognition element INR – initiator motif

DPE – downstream promoter element

(19)

TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie ‘TATA-box’

TBP- składnik ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID

Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Pierwszy etap inicjacji transkrypcji

przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID

(20)

Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC – preinitiation complex)

Aktywność transkrypcyjna na poziomie podstawowym, jeszcze nie regulatorowym

TFII A, B, D, E, H, F – Ogólne Czynniki Transkrypcyjne

(GTF)

Czynniki TAF – składowe TFIID (ang. TBP Associated Factors) TATA – TATA box –

sekwencja TATAAA rozpoznawana przez białko TBP

Inr – sekwencja inicjatorowa rozpoznawana przez białka TAF

-30 +1 TATA Inr

IIB polimeraza II

TFIID

}

TBP

TAFs

IIB

IIE Pol IIa

IIA IIF

helicase CTD protein kinase IIH

TATA IIA Inr _{Pol IIa} IIE IIF

Kompleks preinicjacyjny

TATA IIA Inr

IIB ^{Pol IIa}

IIE IIF ATP - hydroliza

Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony IIH

IIH

Polimeryzacja pierwszych kilku nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia promotora.

(21)

Transkrypcja

(22)

Regulacja inicjacji transkrypcji -

czynniki transkrypcyjne i koaktywatory

• Podstawowe – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

• Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej

części promotora i w enhancerach

(23)

Specyficzne elementy cis promotorów i enhancerów

• Moduły odpowiedzi na sygnał

– np. moduł CRE – odpowiedź na cAMP (czynnik transkrypcyjny CREB)

• Moduły specyficzne dla komórek i tkanek

– np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik MyoD; moduł limfoblastoidalny – czynnik NF-κB

• Moduły rozwojowe

– np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster

Moduł - sekwencja regulatorowa

(24)

• W sekwencjach regulatorowych występują różne

kombinacje elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale

stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka

Promotor ludzkiego genu insuliny

Modularna organizacja elementów cis

(25)

Yuh et al. (1998) Science 279, 1896-1902. Endo16 regulatory system of the sea urchin.

Modularna organizacja elementów cis

(26)

Alternatywny start transkrypcji

• Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele

alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo

• Dzięki temu z jednego genu powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach

Gen dystrofiny człowieka

móżdżek

mięśnie siatkówka kom. Schwanna pozostałe tkanki

kora

(27)

Sekwencje wzmacniające i wyciszające

„Enhancery” i „Silencery”

• Enhancery stsymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję .

• Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj. odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt.

• Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie.

– Mogą działać na odległość w stosunku do promotora – Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie

• Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specyficznych czynników transkrypcyjnych.

(28)

Specyficzne czynniki transkrypcyjne

(29)

Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji

domena wiążąca

DNA

domena odpowiedzialna

za dimeryzację

domena aktywująca

domena regulatorowa

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics.

(30)

Domeny obecne w czynnikach transkrypcyjnych

• Palce cynkowe

• Helisa-skręt-helisa (H-T-H) – np. homeodomena, domena HMG, domena PAU

• Suwak leucynowy

• Helisa-pętla-helisa (H-L-H)

• i wiele innych

(31)

Domeny wiążące DNA

Homeodomena

zawiera domenę HTH (helisa-skręt-helisa)

Palec cynkowy

atlasgeneticsoncology.org/Deep/Images/TFfig2.jpg

Czynnik transkrypcyjny SP1

(32)

Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych

• Suwak leucynowy

• Np. protoonkogeny rodziny c-Fos i c-Jun

• Rodzina CREB –

(cAMP response element binding protein)

(33)

Represory

(34)

Regulacja inicjacji transkrypcji

Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory

• Podstawowe – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

• Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

• Koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z

białkami kompleksu transkrypcyjnego

– Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II

(35)

Mediator – kompleks białkowy

Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961

(36)

Polimeraza II RNA wraz z Mediatorem

Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961

• niezbędny do regulowanej transkrypcji

• absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych

• oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA

• ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji

(37)

Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Elongacja transkrypcji genów eukariotycznych jest ściśle związana z obróbką RNA

(38)

Domena CTD polimerazy II RNA

Nature 430, 223-226(8 July 2004)

Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS)

(39)

Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne

RNA Biology, 2012, Volume 9, Issue 9, Pages 1144 - 1146

Hiperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II RNA i zaznacza kolejne etapy transkrypcji.

(40)

Terminacja i poliadenylacja

CPSF- kompleks białkowy, czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji

(41)

Terminacja i poliadenylacja

(42)

Poliadenylacja

• Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA

• Dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące histony u zwierząt

• Pełni funkcję w procesie translacji

(43)

Chromatyna - ważny element regulacji transkrypcji genów eukariotycznych

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/nucleosome.html

(44)

Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961

Transkrypcja genów eukariotycznych zachodzi w chromatynie

(45)

http://www.us.elsevierhealth.com/SIMON/Pollard/favoritefigs/W_Earnshaw_favorite_figures.htm l

KOLEJNE STOPNIE KONDENSACJI CHROMATYNY

(46)

Heterochromatyna

konstytutywna – jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów)

fakultatywna – ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w

czasie niektórych faz cyklu komórkowego,

Euchromatyna – to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne

transkrypcyjnie

Dwa podstawowe stany chromatyny

(47)

Domeny funkcjonalne i izolatory

• Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie

• Białka wiążące się z

izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów)

Izolator

(48)

Obszary kontrolujące loci

• LCR (locus control regions) – utrzymują domeny

funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie

(49)

Chromatyna – preparaty mikroskopowe

•http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus2.htm

(50)

Struktura chromatyny

DNA + związane białka

1. Histony (małe, zasadowe białka) 2. Niehistonowe białka regulatorowe

We wszystkich stanach chromatyny białka są związane z DNA, a różnice strukturalne wynikają z różnego

stopnia upakowania chromatyny

(51)

PODSTAWOWE BIAŁKA BUDUJĄCE CHROMATYNĘ TO HISTONY –

najbardziej konserwowane ewolucyjnie białka u Eucariota

Histony H3 i H4 : bogate w argininy, najbardziej konserwowane ewolucyjnie sekwencje białkowe

Histony H2A i H2B : wzbogacone w lizyny, sekwencje konserwowane ewolucyjnie

Histon H1 : bardzo bogaty w lizyny, sekwencja

białkowa słabiej konserwowana ewolucyjnie,

związany z nukleosomem poza jego rdzeniem

(52)

Struktura Krystaliczna Nukleosomu

Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ.

Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60

(53)

Nukleosom zbudowany jest z rdzenia białkowego, z około 147 bp DNA owiniętego wokół rdzenia oraz z 50 bp DNA

łącznikowego

Rdzeń składa się z dwóch kopii każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4

Poza rdzeniem nukleosomu dołączony jest histon H1 DNA

histon H1 histon H2A histon H2B histon H3 histon H4

http://fermat-2.cer.jhu.edu/~as410610/lecture_pdf/What_is_the_organization_of_a_eukaryote_.PDF

(54)

Regulacja dostępności chromatyny

Struktura chromatyny utrudnia zachodzenie transkrypcji

(55)

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji

1. Metylacja DNA

(56)

Metylacja DNA: przyłączenie grupy metylowej do cytozyny

H

O

NH

1 2

3 5

6

O

NH

1 2

3 5

6

CH SAM-CH

SAM

DNMT

Cytozyna

5-Metylocytozyna

(57)

Metylacja DNA

(u ssaków metylacji podlegają głównie sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków )

•powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny

•może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych

•może powstawać de novo

metylacja DNA a struktura chromatyny podtrzymywanie wzoru metylacji DNA

(58)

Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegające na

wprowadzaniu zmian we wzorze ekspresji genów i ich dziedziczeniu, bez zmian w sekwencji DNA

Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym

Metylacja DNA ważna w inaktywacji chromosomu X u samic ssaków.

Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy większość grup metylowych jest usuwana

Metylacja DNA decyduje o prawidłowym utrzymaniu rodzicielskiego piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten jest niezbędny do

utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 – koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny). Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju.

(59)

Przykład epimutacji

(zmiana we wzorze metylacji DNA)

Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161

Gen kontrolujący symetrię kwiatu góra-dół :

u mutanta jest nieaktywny powód – silna i dziedziczona metylacja

(60)

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu

transkrypcji

2. Kowalencyjne modyfikacje histonów rdzeniowych

(61)

Nukleosom

Zasadowe N- i C-końce histonowe wystają na zewnątrz nukleosomu, ponad DNA owinięty na oktamerze białkowym. Są miejscem wielu

potranslacyjnych modyfikacji

Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 809-814 (October 2003)

Timeline: Chromatin history: our view from the bridge Donald E. Olins¹ & Ada L. Olins

(62)

S/T P S/T

kinazy

fosfatazy

fosforylacja

K Ac

K

acetylacja

Acetylotransferazy histonowe (HAT)

Deacetylazy histonowe (HDAC)

K/R K/R

Me

metylacja

metylazy

demetylazy

Enzymy modyfikujące histony rdzeniowe mogą być

aktywatorami bądź represorami transkrypcji

(63)

Po-translacyjne modyfikacje histonów

wg. B.Turner, Cell 2002

(64)

Ponad 100 miejsc modyfikowanych

Możliwość mono-, di-, trimetylacji podnosi poziom skomplikowania systemu

Nierównomierne rozmieszczenie na obszarze chromatyny

Zależne od stanu komórki

TEORIA KODU HISTONOWEGO

(65)

Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych

białek histonowych

(66)

Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny

Zmiana dostępności chromatyny dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz

(67)

Modyfikowane histony rekrutują specyficzne białka rozpoznające określone modyfikacje

Tony Kozaurides, Cell 128 (2007) 693-705

(68)

Saunders et al.Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981

Typowy wzór modyfikacji histonowych na aktywnym transkrypcyjnie genie

(69)

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu

transkrypcji

3. Remodeling (przebudowa) struktury chromatyny

(70)

Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny

przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych

(71)

Kompleksy remodelujące chromatynę

- są zbudowane zazwyczaj z kilkunastu podjednostek - aktywność zależna od ATP

- w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA

Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację

jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji)

(72)

przesunięcie oktameru histonowego

usunięcie oktameru histonowego ATP-zależna przebudowa

chromatyny (remodeling)

nukleosom histony

rdzeniowe

zmiana konformacji

wymiana histonów w oktamerze

Mohrmann & Verrijzer, Biochimica et Biophysica Acta 1681 (2005) 59-73

Przebudowa (remodeling) chromatyny

(73)

Regulacja inicjacji oraz elongacji transkrypcji

Udział w rekombinacji homologicznej, naprawie DNA Regulacja cyklu komórkowego

Regulacja procesów rozwojowych

Udział w szlakach sygnalizacyjnych uruchamianych przez hormony

Konserwowane funkcje biologiczne kompleksów SWI/SNF:

(74)

Metylacja DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów rdzeniowych współzależą od siebie i mogą się wzajemnie indukować.

Kompleksy remodelujące chromatynę zazwyczaj zawierają białka rozpoznające modyfikacje histonów oraz metylację DNA.

Współzależność różnych typów modyfikacji chromatyny

Nieprawidłowe funkcjonowanie systemu modyfikacji chromatyny jest charakterystyczne dla większości nowotworów

(75)

Podstawowe modyfikacje

zmieniające strukturę chromatyny ważną dla procesu transkrypcji

• Metylacja DNA (zamykanie obszarów chromatyny)

• Kowalencyjne modyfikacje histonów, np. acetylacja lub metylacja (kod histonowy)

• ATP-zależna przebudowa

(remodeling) chromatyny- zmiana konformacji nukleosomów lub ich pozycji względem DNA