Wstêp
W ostatniej dekadzie typowanie DNA wysoce po-limorficznych loci STR (krótkich powtórzeñ tandemo-wych) sta³o siê najpotê¿niejszym narzêdziem rozró¿niania osób, poniewa¿ loci te s¹ stabilne na-wet w tkankach, w których zaszed³ rozk³ad. Du¿o za-stosowañ, nawet w przypadkach, w których dyspo-nowano bardzo niewielk¹ iloœci¹ DNA, znalaz³a przede wszystkim jednoczesna amplifikacja wielu markerów STR w tej samej PCR. W tych multiplekso-wych analizach PCR barwniki fluorescencyjne za-zwyczaj s¹ przy³¹czone do primera forward ró¿nych loci, aby umo¿liwiæ rozró¿nienie fragmentów o po-dobnych rozmiarach. Rozwój elektroforezy kapilar-nej umo¿liwia wykrywanie on-line tych oznaczonych amplikonów PCR i ma jednoczeœnie zaletê w posta-ci wysokiego przerobu, automatycznej obs³ugi i auto-matycznego zbierania danych. W wielu badaniach kryminalistycznych, w których wykorzystywany jest materia³ genetyczny (pobrany ze szcz¹tków szkiele-towych pogrzebanych w ziemi, cia³, które uleg³y roz-k³adowi, tkanek zatopionych w parafinie albo w³osów telogenowych), DNA jest wysoce zdegradowane z powodu jakoœci próbki albo warunków œrodowisko-wych.
Stopieñ rozk³adu DNA w znacznym stopniu zale¿y od w³asnoœci geochemicznych gleby, wp³ywu otocze-nia, populacji mikroorganizmów i temperatury. Szcze-gólnie niekorzystny wp³yw na powodzenie typowania DNA z koœci albo zêbów ma przede wszystkim wilgot-ne œrodowisko. Z drugiej strony, degradacja DNA jest wolniejsza w warunkach zmarzliny w regionach ark-tycznych, co umo¿liwia analizê szcz¹tków nawet sprzed 50 000 lat. Historyczne DNA ekstrahowane z koœci o wieku do 10 000 lat ma jednak œredni¹ wiel-koœæ od 100 do 150 bp, a procesy oksydacyjne i hydro-lityczne sprawiaj¹, ¿e amplifikacja PCR i typowanie DNA s¹ niezwykle trudne. W najgorszym razie DNA mo¿e byæ tak zdegradowane, ¿e nie da siê z niego otrzymaæ profili STR.
Przedstawiono wiele ró¿nych metod poprawienia ja-koœci profilowania zdegradowanego DNA. Badania te obejmuj¹ ewaluacjê ró¿nych metod ekstrakcji, usuwa-nia specyficznych inhibitorów PCR, a tak¿e oczyszcza-nia ekstraktów, metodê nested PCR i typowaoczyszcza-nia stan-daryzowanego zdegradowanego DNA. Ostatnio w lite-raturze przedmiotu pojawi³ siê obszerny przegl¹d za-stosowania amplikonów o zmniejszonych rozmiarach do wiarygodnego typowania zdegradowanego DNA. Te minipleksy PCR s¹ rekomendowane w przypadkach, w których dochodzi do wypadania alleli i zmniejszenia czu³oœci. Tego typu zjawiska s¹ obserwowane szczególnie w zakresie d³u¿szych alleli. Jak dot¹d kilka tych interesuj¹cych minipleksów PCR opisano (³¹cznie z badaniem w³osów w fazie telogenu) na potrzeby wie-lu ekspertyz kryminalistycznych.
Wykorzystuj¹c doœwiadczenia zwi¹zane z degrada-cj¹ DNA zachodz¹c¹ nawet w ci¹gu d³ugiego czasu, autorzy opracowali multipleks PCR, w którym ¿aden z wykrywalnych alleli nie ma wiêcej ni¿ 150 bp d³ugo-œci. W artykule zaprezentowano metodê krótkiego pen-tapleksu PCR (ShoP-PCR), która umo¿liwia uzyskanie doskona³ych wyników nawet w przypadkach, w których typowanie DNA nie powiod³o siê z u¿yciem zestawów dostêpnych na rynku.
Materia³y i metody Opracowanie primerów
Sekwencje primerów opracowano za pomoc¹ opro-gramowania Primer3 i GeneFisher (http://bibiser.tech- fak.uni-bielefeld.de/cgi-in/gf_submit?mode=STAR-TUP&sample=dna). Primery forward zosta³y oznaczo-ne barwnikami fluorescencyjnymi (tab. 1).
Amplifikacja PCR
Pentaplex zastosowano w mieszaninie reakcyjnej 10 μl zawieraj¹cej 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, po 200 μM ka¿dego dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dUTP), C. Meissner, P. Bruse, E. Mueller, M. Oehmichen
Nowy czuły krótki pentapleks (ShoP) PCR
do typowania zdegradowanego DNA
2,2 mM MgCl2, 500 μg/ml albuminy surowicy wo³owej, 1% Tween 20, po 200 nM z ka¿dego primera ameloge-niny, po 600 nM ka¿dego z primerów D8S1179, po 1000 nM ka¿dego z primerów vWA, po 75 nM ka¿dego z pri-merów TH01, 150 nM ka¿dego z pripri-merów D3S1358, 1 U Platinum Taq DNA Polimerazy (Invitrogen, Karlsru-he, Niemcy), 0,1 U UNG (MBI Fermentas, Leon-Rot, Niemcy) i zmienne iloœci matrycy DNA. Aby unikn¹æ kon-taminacji, próbki produktów PCR wytrawiano enzymem UNG (Uracil-DNA Glikosylase) przed amplifikacj¹ po-przez inkubacjê w temperaturze 7oC przez 5 min. Profil cykli ShoP-PCR w systemie PCR GeneAmp 2400 (Ap-plied Biosystems, Darmstadt, Niemcy) by³ nastêpuj¹cy: 95oC przez 11 min (wstêpna inkubacja), 96oC przez 2 min, a po niej 10 cykli denaturacji przez 30 s w 94oC, przy³¹czanie primerów przez 30 s w temp. 60oC i ich wy-d³u¿anie przez 45 s w temp. 70oC, a nastêpnie przez 18–22 cykle denaturacji przez 30 s w temp. 90oC, przy-³¹czanie primerów przez 30 s w temp. 60oC i wyd³u¿anie primerów przez 45 s w temp. 70oC. Po tym nastêpowa³ etap ostatecznego wyd³u¿ania przez 90 min w temp. 60oC. Pod koniec reakcji PCR utrzymywano temperatu-rê 4oC. Prêdkoœæ zmiany temperatury (ramping) miêdzy przy³¹czaniem i wyd³u¿aniem starannie ustawiono w przedziale miêdzy 0,3oa 0,5oC/s.
Wykrywanie sygnału
Od jednego do dwóch mikrosatelitów ka¿dego pro-duktu PCR mieszano z 0,5 μl standardu wewnêtrznego GeneScan-400HD (ROX) i 14,5 μl dejonizowanego for-mamidu (Sigma, Tufkirchen, Niemcy). Mieszanina zo-sta³a poddana denaturacji w termocyklerze PCR przez 3 min w temp. 96oC. Po ch³odzeniu na lodzie próbki na-strzykiwano elektrokinetycznie przez 5 s. Ujawnianie wykonywano na analizatorze 310 ABI Prism Genetic zgodnie z zaleceniami producenta (Applied Biosys-tems, Darmstadt, Niemcy). Wielkoœæ fragmentów i iloœæ produktów PCR ustalono automatycznie, pos³uguj¹c siê oprogramowaniem Gene Scan Analysis 3.1 (Ap-plied Biosystems, Darmstadt, Niemcy).
Procedury walidacji Specyficznoœæ primerów
Wymazy z jamy ustnej pobrano od 200 niespokrew-nionych, zdrowych ochotników. DNA natychmiast eks-trahowano z u¿yciem Cheleksu 100. Porównano 200 ludzkich profili DNA otrzymanych za pomoc¹ ShoP--PCR z profilami tych samych osób otrzymanymi z za-stosowaniem systemu SGM i PowerPlex 16.
Aby sprawdziæ specyficznoœæ metody dla materia³u ludzkiego, pobrano DNA od ró¿nych zwierz¹t (kot, pies,
œwinia, koñ, krowa, mysz, szczur, ¿aba, ryba, owca, za-j¹c, œwinka morska, koza, jeleñ, czarny jeleñ, lis, go³¹b i œledŸ) i wyizolowano trzy najbardziej spokrewnione naczelne (goryl, orangutan, szympans). Izolacjê DNA przeprowadzono za pomoc¹ QIAmp, pakietu Mini DNA (Qiagen, Niemcy). Ekstrakty przechowywano w tempe-raturze -20oC. Aby udowodniæ specyficznoœæ wyd³u¿a-nia primerów dla cz³owieka, dodatkowo wykorzystano zestaw ró¿nych ekstraktów DNA z bakterii i grzybów. Po jednym nanogramie DNA z ka¿dego ekstraktu pod-dano PCR zgodnie z powy¿szym opisem.
Czułość a mieszaniny DNA
Przygotowano dziesiêæ ró¿nych rozcieñczeñ eks-traktów DNA z krwi odpowiednio z iloœci¹ matrycy 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 pg. Iloœæ DNA matrycowego w mie-szaninie ustalono, stosuj¹c zestaw do kwantyfikacji Pi-coGreen dsDNA (MoBiTec, Goettingen, Niemcy) w sys-temie VersaFluor™ Fluorometer (Bio-Rad, Monachium, Niemcy) do iloœci 0,025 ng, a nastêpnie rozcieñczono do 0,0125 i 0,00625 ng. Przygotowano próbki miesza-nin (1:0, 19:1, 9:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:9, 1:19 i 0:1) z dwóch ró¿nych ekstraktów DNA z ca³kowitym wk³a-dem DNA – 1 ng i przeprowadzono pomiar iloœci zgod-nie z powy¿szym opisem.
Test DNase I
Aby przeœledziæ, czy powiod³o siê typowanie zde-gradowanego DNA, wykonano test DNase I. DNA o wy-sokiej masie cz¹steczkowej ekstrahowano z wykorzy-staniem zestawu MasterPure™ do puryfikacji DNA (Epicentre, Madison, WI, USA). Osiemdziesi¹t mikrogra-mów ekstraktów trawiono za pomoc¹ 8 U DNAse I w 200 μl mieszaniny reakcyjnej z wykorzystaniem pakietu DNA-free (Ambion, Huntingdon, W. Brytania). Nastêp-nie pobierano po 20 μl ekstraktu, odpowiednio po 0,5, 1, 2, 3, 4, 8, 15 i 30 min, i zatrzymywano reakcjê przez dodanie 4 μl odczynnika dezaktywuj¹cego (DNase Inactivation Reagent). Pobierano po 0,2 μl zdegrado-wanego DNA i poddawano PCR w objêtoœci 10 μl – zgodnie z opisem zamieszczonym powy¿ej.
Badania kryminalistyczne
Zbadano osiem przyk³adowych próbek DNA niskiej jakoœci, wœród których by³ znaczek z listu w sprawie o szanta¿, pieluszka, pow³oczka zawiniêta w plastiko-w¹ torebkê i dywan ze sprawy zwi¹zanej z napastowa-niem na tle seksualnym, szcz¹tki szkieletu pogrzebane w ziemi, zatopione w parafinie tkanki mózgowe dwóch ofiar morderstwa, jeden w³os w fazie telogenu – dowód w sprawie napaœci w supermarkecie oraz niedopa³ek
papierosa znaleziony na przystanku autobusowym i wykorzystany w sprawie dotycz¹cej identyfikacji.
Wyniki
W tworzeniu nowego systemu multipleksowego bar-dzo istotne znaczenie ma ustalenie solidnego i wiary-godnego systemu typowania DNA dla wszystkich ro-dzajów próbek. ShoP-PCR zosta³ opracowany tak, aby umo¿liwiæ amplifikacjê nawet znacznie zdegradowane-go DNA. Ta multipleksowa metoda obejmuje loci ame-logeniny, TH01, VWA, D3S1358 i D8S1179. D³ugoœæ alleli opisanych w literaturze nie przekracza 150 bp (al-lele wraz z przedzia³ami rozmiarów dla ka¿dego locus wyszczególniono w tabeli 1).
Primery amelogeniny s¹ ukierunkowane na region inny ni¿ para primerów powszechnie u¿ywanych przez kryminalistyków. Otrzymane primery amelogeniny ró¿-ni¹ siê o 1077 bp od regionu u¿ywanego w pakietach komercyjnych (pierwszy raz opisane przez H. Haasa--Rochholza i G. Weilera). Jak przedstawiono w tabeli 1, ten nowy docelowy region wykazuje ró¿nicê 3 bp miê-dzy allelem X i Y. Warunki PCR i koncentracje primerów uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ShoP-PCR zosta³y starannie dopasowane, tak aby otrzymaæ optymalne wyniki. Wa¿nym krokiem by³o dostosowanie prêdkoœci zmiany temperatury (ramping), nie tylko dla klera GeneAmp 2400, lecz tak¿e dla innych termocy-klerów (GeneAmp 9600, Applied Biosystems, Darm-stadt, Niemcy; PCR Express, Thermo Electron/Hybaid,
Tabela 1 Opis, liczba powtórzeń składników drabiny alleli, przedział wielkości alleli i sekwencje primerów loci ShoP-PCR
Sekwencje D8S1179 primera forward ju¿ by³y publikowane (M.D. Barber, B.H. Parkin: Sequence analysis and allelic designation of the two short tandem repeat loci D18S51 and D8S1179, „Int. J. Legal Med.” 1996, nr 109, s. 62–65).
Tabela 2 Wysokość pików podprążków (%) z uwzględnieniem standardowego błędu (S.E.)
n to liczba zaobserwowanych i wykrywalnych pików stutter (pików podpr¹¿ków) w allelach; wartoœci w nawiasach odpowiadaj¹ liczbie obserwacji dla ka¿-dego produktu
Dreieich, Niemcy) albo PowerPlex 16 System™ (Pro-mega, Mannheim, Niemcy). Aby wykluczyæ mutacje w obrêbie sekwencji przy³¹czania siê primera, zbadano 200 zdrowych osób z wykorzystaniem ShoP-PCR oraz zestawu SGMplus™ albo Powerplex 16 System. Oprócz przypadku, w którym allel 16 nie by³ wykrywal-ny w genotypie 16/17 locus VWA za pomoc¹ systemu SGMplus™, nie zaobserwowano ró¿nic miêdzy wyni-kami typowania z u¿yciem komercyjnie dostêpnych zestawów albo ShoP-PCR. Czêstotliwoœci dla 200 nie-spokrewionych osób by³y zgodne z oczekiwaniami wy-nikaj¹cymi z zastosowania prawa Hardy’ego-Weinber-ga. Przy zastosowaniu 200 pg matrycy DNA cztery au-tosomalne loci wykazywa³y ró¿nice w zakresie hetero-zygotycznego niezbalansowania. Wartoœæ najni¿sz¹ zaobserwowano dla uk³adu TH01:4,07 ±11,30%, zaœ najwy¿sz¹ dla D8S1179:13,38 ±13,29%. D3S1358 wy-kazuje heterozygotyczne niezbalansowanie 9,35 ±9,40%, VWA 7,23 ±10,64%. Wystêpowanie specyficz-nych dla alleli podpr¹¿ków opisano w tabeli 2.
Podczas gdy wysokoœæ pików podpr¹¿ków dla locus TH01 jest podobna dla ka¿dego allela bez wzglêdu na je-go wielkoœæ i wysokoœæ piku dla VWA, a szczególnie dla D3S1358, to D8S1179 nie wykazuje ¿adnej tendencji.
Przy badaniu zestawu próbek DNA ró¿nych zwie-rz¹t, bakterii i grzybów wykryto jedynie sygna³y u oran-gutana i goryla. DNA szympansa da³o profil z primera-mi amelogeniny, TH01, D3S1358 i VWA, choæ specy-ficzne sygna³y dla VWA by³y poza zakresem drabiny al-leli dla cz³owieka (danych nie przedstawiono).
Zbadano ró¿ne koncentracje matrycy i ujawniono gra-nicê wykrywalnoœci 12,5 pg DNA matrycowego
ekstraho-wanego z tkanki post mortem niewykazuj¹cej ¿adnych oznak rozk³adu. Jest to równe iloœci mniej wiêcej dwóch komórek diploidalnych. Przy iloœci 6,25 pg, jak siê spo-dziewano, zaobserwowano wypadanie alleli (ryc. 1).
Domieszki 50 pg w ca³kowitej iloœci 1000 pg DNA (1:19) by³y wyraŸnie wykrywalne (danych nie przedsta-wiono). Kiedy wykonano test DNase I, otrzymano ca³y profil DNA po trawieniu trwaj¹cym 3 minuty (SGM-plus™ wykazuje tylko sygna³y dla loci amelogeniny, D3S1358 i D8S1179). Przy trawieniu trwaj¹cym 4 minu-ty wyraŸnie widoczne by³y cztery z piêciu loci ShoP – w przeciwieñstwie do SGMplus™, gdzie wykrywalne by³o tylko locus D19S433 (ryc. 2A i B).
Jak przedstawia tabela 3, analiza ShoP-PCR w daniach kryminalistycznych dla wszystkich oœmiu ba-danych próbek da³a wynik lepszy ni¿ zestawy komer-cyjne. Przyk³ady profili ShoP-PCR zaprezentowano dla pow³oczki (ryc. 3A) i pieluszki (ryc. 3B) w sprawie na-pastowania na tle seksualnym. W piêciu z przypadków otrzymano wykrywalny pe³ny profil DNA dla loci ShoP, w przypadkach 6 i 8 cztery z piêciu loci by³y wyraŸnie widoczne. Nawet dla próbki koœci pogrzebanej w ziemi
Ryc. 1. Wyniki oznaczania DNA ShoP-PCR z wykorzystaniem 100 pg (a), 25 pg (c) i 12,5 pg (c) i 6,25 (d) DNA matrycowego. Zauwa¿my wypada-nie alleli na dole (d) odpowiednio w loci amelogeniny, TH01 i VWA.
Ryc. 2. DNA sztucznie zdegradowane drog¹ trawienia DNase I przez 2 min (a i d), 3 min (b i e) i 4 min (c i f). Profile DNA otrzymane z u¿yciem zestawu SGMplus™ (A) i ShoP-PCR (B). Pe³ny profil piêciu loci ShoP otrzymano po 3 min, a cztery z piêciu loci by³y wyraŸnie widoczne po 4 min.
przez 7 lat otrzymano trzy pe³ne loci. Dla porównania – SGMplus™ i/albo PowerPlex 16™ da³o mniej albo wrêcz nie da³o wyników.
Dyskusja
Krótki pentapleks PCR obejmuje loci amelogeniny, TH01, VWA, D3S1358 i D8S1179. Zosta³ opracowany w celu umo¿liwienia typowania DNA nawet w przypad-kach, w których DNA jest wysoce zdegradowane albo wystêpuje w niewielkiej iloœci. Poniewa¿ nawet z DNA o bardzo z³ej jakoœci otrzymuje siê fragmenty o rozmia-rach 100–150 bp, ¿aden z powszechnie spotykanych alleli w tych piêciu loci nie przekracza d³ugoœci frag-mentu 150 bp. W celu unikniêcia nak³adania siê alleli dwóch ró¿nych loci oznaczonych tym samym barwni-kiem fluorescencyjnym dobrano primery tak, aby miê-dzy najmniejszym powszechnie spotykanym allelem jednego locus i najwiêkszym drugiego wystêpowa³a od-leg³oœæ co najmniej 10 bp. W niektórych próbkach stwierdzono obecnoœæ nietypowych pików, które wygl¹-daj¹ na szersze, wiêc ³atwo je odró¿niæ od specyficz-nych, znakowanych barwnikiem fluoroscencyjnym pro-duktów PCR. W innych przypadkach wykryto kilka pi-ków albo kleksów barwnika. Pojawienie siê artefaktów nie utrudnia³o jednak interpretacji wyników, poniewa¿ wiêkszoœæ z tych pików wyst¹pi³a poza d³ugoœciami fragmentów w³aœciwych alleli danego locus albo poni-¿ej limitu wykrywalnoœci 50 RFU. Przy projektowaniu primerów do amplifikacji PCR procedury dopasowania sekwencji alleli musz¹ wykluczaæ miejsca przy³¹czenia primerów, niele¿¹ce poza obszarem zainteresowania. Polimorfizmy w regionach przy³¹czania primerów mog¹ prowadziæ do pojawienia siê alleli zerowych, co z kolei mo¿e sprawiæ, ¿e pojawi¹ siê fa³szywe homozygoty, tak jak opisano ostatnio dla locus D5S818, gdzie w allelu 10 wystêpuje mutacja w miejscu przy³¹czania primera.
W PCR o krótkich docelowych amplikonach najbli¿-sza pozycja primerów w stosunku do interesuj¹cych nas STR-ów nie zawsze jest t¹ wybran¹, poniewa¿ re-giony flankowania primerów czêsto zawieraj¹ struktury albo sekwencje powtórzeñ mog¹ce utrudniæ PCR
po-przez niedopuszczenie do przy³¹czania siê primera al-bo powstania artefaktów PCR. Z tego powodu ka¿d¹ z projektowanych reakcji PCR powinno siê starannie przetestowaæ w zakresie wystêpowania artefaktów i wiarygodnoœci w du¿ej grupie próbek DNA ludzkiego i zwierzêcego oraz œladów kryminalistycznych.
Zjawisko wypadania alleli w piêciu loci sprawdzono, porównuj¹c profile DNA 200 osób z wynikami dla dwóch dostêpnych na rynku zestawów PowerPlex 16 System™ (Promega, Madison, USA) i SGMplus™ (Ap-plied Biosystems, Darmstadt, Niemcy). We wszystkich przypadkach otrzymano identyczne profile i nie stwier-dzono preferencyjnej amplifikacji, wypadania alleli ani loci. Utrata allela 16 zaobserwowana w locus VWA przy zastosowaniu zestawu SGMplus™ ma byæ wynikiem mutacji w obszarze przy³¹czania primera, tak jak zaob-serwowano te¿ dla allela 19, poniewa¿ profile Power-Plex 16 System™ i ShoP-PCR by³y identyczne. Specy-ficznoœæ primerów testowano na próbie DNA zwierz¹t, bakterii i grzybów. Tylko dla DNA naczelnych otrzyma-no wykrywalne sygna³y – czêœciowo allele poza drabi-n¹ – które ju¿ zaobserwowano w ramach innych badañ ludzkich loci STR przy sprawdzaniu DNA naczelnych.
W eksperymentach z rozcieñczeniami wiarygodne wyniki otrzymywano dla co najmniej 12,5 pg ludzkiego DNA, aczkolwiek w niektórych przypadkach zaobser-wowano niezbalansowan¹ heterozygotê. Wiadomo, ¿e w warunkach, w których dostêpna jest tylko niewielka iloœæ DNA, wystêpuje tendencja do amplifikacji prefe-rencyjnej. Nale¿y mieæ równie¿ na uwadze niezbalan-sowanie i wypadanie alleli. Krótkie fragmenty ShoP--PCR przyczyni³y siê do zwiêkszenia czu³oœci ze wzglêdu na wy¿sz¹ wydajnoœæ amplifikacji. Nawet przy iloœci DNA 12,5 pg otrzymano pe³ny profil. Kiedy prze-prowadzano PCR 6,25 pg DNA matrycowego, zaobser-wowano wypadanie alleli, poniewa¿ spodziewano siê efektów stochastycznych podczas przy³¹czania prime-rów i amplifikacji PCR. W innych multipleksowych reakcjach PCR zjawiska te s¹ obserwowane przy bada-niu iloœci DNA 200 pg.
Inne istotne zagadnienie, któremu nale¿a³o siê przyjrzeæ w procedurze walidacji, to kwestia
wiarygod-Ryc. 3. Wynik oznaczania DNA z u¿yciem ShoP-PCR ze œladów z pow³oczki (A) i pieluszki (B) w wypadku podejrzenia napastowania na tle seksualnym dziecka. Po zastosowaniu komercyjnych zestawów nie otrzymano ¿adnych sygna³ów.
noœci i czu³oœci przy analizie mieszanin, poniewa¿ gra-nica wykrywalnoœci mniejszoœciowego sk³adnika w ich ekstraktach zale¿y od iloœci owego sk³adnika. Dla ca³-kowitej iloœci DNA 1000 pg mo¿liwe by³o otrzymanie pe³nego profilu w iloœci 50 pg. Wykrywalny limit 1:19 mniejszoœciowego sk³adnika jest podobny do limitu, który obserwuje siê w przypadkach, gdy stosowane s¹ inne metody wykorzystuj¹ce multipleks.
Dziêki analizie zdegradowanego materia³u ujawni-³a siê najwa¿niejsza zaleta opisanego systemu. Zde-gradowane DNA przygotowano drog¹ trawienia DNase I w kontrolowanych warunkach. Nawet po tra-wieniu trwaj¹cym 4 minuty wyraŸnie widoczne by³y cztery z piêciu loci. Nie jest zaskoczeniem, ¿e najpierw zachodzi³o wypadanie alleli najwiêkszego locus, D3S1358. Stwierdzono tak¿e brak wykrywalnego sy-gna³u dla locus FGA, kiedy to wykorzystano zestaw do amplifikacji AmpFISTR™ Blue PCR i wykrywalne by³y dwa z trzech loci.
Omawiana metoda umo¿liwia typowanie zdegrado-wanego DNA ze wzglêdu na ma³e rozmiary docelowych fragmentów, poniewa¿ ¿aden z wykrywalnych alleli nie przekracza d³ugoœci 150 bp. Wad¹ ShoP-PCR jest sto-sunkowo niewielka si³a dyskryminacji – 1:3,16 x 104, poniewa¿ widoczne s¹ tylko 4 autosomalne loci. Dla porównania, si³y dyskryminacji dla systemu SGMplus™ (1:3,3 x 1012) i systemu PowerPlex 16 (1:1.83 x 1017) s¹ o rz¹d wielkoœci wy¿sze. Tak wiêc zestawy komer-cyjne okazuj¹ siê lepsze, kiedy dysponuje siê wystar-czaj¹c¹ iloœci¹ niezdegradowanego DNA.
Poniewa¿ celem badañ by³o zaprezentowanie PCR przydatnego dla zdegradowanego materia³u w œladach kryminalistycznych, przetestowano ShoP-PCR na ze-stawie próbek kryminalistycznych, takich jak w³osy w fazie telogenu, koœci pogrzebane w ziemi albo tkanki
przechowywane w formalinie, dla których z wykorzysta-niem zestawu SGMplus™ albo PowerPlex 16 Sys-tem™ otrzymywano tylko do dwóch loci. W³osy w fazie telogenu to materia³ czêsto zabezpieczany na miej-scach przestêpstw. DNA znajduj¹ce siê w keratynie w³osa jest znacznie zdegradowane, a analiza DNA ze zgubionych w³osów bez cebulek czêsto nie daje ¿ad-nych wyników. Z pojedynczego w³osa telegonowego zabezpieczonego na odzie¿y ofiary autorzy otrzymali pe³ny profil (tab. 3).
DNA ekstrahowane z ludzkich koœci pogrzebanych w glebie albo znalezionych w wilgotnym œrodowisku jest zazwyczaj w du¿ym stopniu zdegradowane. Przy badaniu DNA ekstrahowanego z koœci ofiar katastrof lotniczych zaobserwowano, ¿e wypadanie alleli albo lo-ci zachodzi wówczas, gdy allele s¹ d³u¿sze ni¿ 200 bp. Jak wykazano dla koœci pogrzebanych w ziemi (przypa-dek 2), metoda ShoP-PCR daje dobre wyniki ze wzglê-du na niewielkie rozmiary docelowych fragmentów. Za-bezpieczenie formalin¹ indukuje degradacjê DNA, na-wet je¿eli proces utrwalania trwa³ tylko 3 godziny. Ruty-nowo czas dzia³ania formaliny to co najmniej 2 dni w zbuforowanej albo niezbuforowanej formalinie, przed zatopieniem w parafinie. Z tkanki przechowywanej przez 15 lat, utrwalonej formalin¹ i zatopionej w parafi-nie (przypadek 8), otrzymano pe³ny profil DNA, dlatego ta technika PCR jest u¿yteczna wtedy, gdy dostêpny jest wy³¹cznie materia³ zatopiony w formalinie, czêsto przechowywany przez dziesi¹tki lat.
Wnioski
Omawiany system umo¿liwia sku-teczne przeprowadzenie analizy DNA w przypadkach, w których dysponuje siê iloœci¹ DNA wiêksz¹ ni¿ 12,5 pg albo gdy materia³ jest znacznie zde-gradowany. ShoP-PCR jest bardzo u¿yteczny w typowaniu w³osów w fa-zie telogenu, tkanki w znacznym stopniu rozk³adu albo tkanki, która przez d³u¿szy czas by³a pod dzia³a-niem formaliny. Opracowanie nowych par primerów i ich po³¹czenie w mul-tipleksie PCR daje lepsze wyniki, kie-dy zachodzi wypadanie alleli z powo-du degradacji DNA albo mutacji miejsc przy³¹czania primerów. Dla dobra badañ krymi-nalistycznych warto dysponowaæ wieloma ró¿nymi loci multipleksowych miniSTR.
oprac. Ewa Nogacka
Próbka Materia³ Wiek ShoP Systemy komercyjne 1. W³osy w fazie telogenu 2 lata 5/5 0/5
2. KoϾ 7 lat 3/5 0/5
3. Pow³oczka 2 lata 3/5 1/5 4. Pieluszka 7 dni 5/5 0/5 5. Dywan nieznany 5/5 0/5 6. Znaczek 6 miesiêcy 4/5 0/5 7. Niedopa³ek papierosa nieznany 5/5 2/5 8. Tkanka zatopiona w parafinie 15 lat 4/5 2/5
Tabela 3 Wyniki oznaczania DNA dla ośmiu różnych śladów kryminalistycznych
