PCR - ang. polymerase chain reaction

•Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii precyzyjnie wybranego fragmentu DNA (czyli jego amplifikację – zwielokrotnienie liczby kopii fragmentu DNA)

•Jest to reakcja powielania (replikacji) DNA w próbówce (in vitro), która zachodzi z użyciem określonej matrycy, starterów i polimerazy

•Częściowo uniezależnia nas od klonowania molekularnego

•PCR - ang. polymerase chain reaction

łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy

Metoda PCR naśladuje replikację DNA in vivo:

replikacja in vivo

1. powstają widełki replikacyjne (przy udziale odpowiednich białek następuje lokalne rozplecenie DNA) – zawsze w tym samym miejscu - ori

2. polimeraza DNA wymaga wolnych końców 3’, aby zapoczątkować

syntezę nowej nici w kierunku 5'  3 3. Wolne końce pochodzą ze

starterów RNA, które wiążą się specyficznie na zasadzie

komplementarności do określonych miejsc na obydwu niciach

4. polimeraza DNA wydłuża końce starterów syntetyzując jedną nić w sposób ciągły, a drugą jako tzw.

pasmo opóźnione

cykliczne powielanie DNA in vitro 1. ssDNA uzyskuje się ogrzewając DNA dwuniciowe (dsDNA) matrycowe do temperatury ok. 94-100C

2. polimeraza DNA wymaga wolnych końców 3’, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5'  3’, które są dostarczanie w postaci z syntetycznych oligonukleotydowych fragmentów DNA.

Dobiera się je tak, aby otaczały odcinek DNA, który ma być powielony (pozwala nam wybrać który fragment DNA ma się powielać in vitro). To oznacza że musimy częściowo znać sekwencję (kolejność nt) w powielanym fragmencie DNA) 3. Startery przyłączają się do ssDNA na zasadzie komplementarności pod

wpływem obniżenia temperatury.

4. Termostabilna polimeraza DNA wydłuża startery na końcach 3’ w sposób ciągły na obu niciach matrycowych

• W każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA jest

podwajana – uzyskane kopie stanowią matrycę w kolejnych rundach amplifikacji

• Dlatego efektem replikacji DNA w technice PCR jest więc amplifikacja (zwielokrotnienie) specyficznego fragmentu DNA

Pierwsze zamierzone produkty amplifikacji powstają w trzecim cyklu reakcji

Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem powtarzanych cykli złożonych z następujących kroków:

•denaturacji DNA (30 sek.-5 min.; 94-96C)

•przyłączania - hybrydyzacji (annealing) starterów (15 sek.-1 min.; 50-65C)

•wydłużania (elongacji) starterów (syntezy DNA) (68-75C)

Reakcję przeprowadza się w specjalnym aparacie zwanym termocyklerem (ang.

thermal cycler), w którym programuje się temperaturę i czas trwania poszczególnych etapów reakcji oraz liczbę cykli

Powodzenie reakcji PCR (skuteczność i specyficzność) wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

•doboru warunków fizycznych samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.)

•doboru odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji

•doboru właściwych warunków chemicznych: ilości i proporcji składników mieszaniny reakcyjnej tj.: wzajemnego stężenia dNTP, polimerazy,

starterów, magnezu

Warunki temperaturowe reakcji

Etap denaturacji

•Temperatura i czas trwania etapu denaturacji zależy od rodzaju matrycowego DNA używanego do reakcji

Temperatura przyłączania - hybrydyzacji starterów

•jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na skuteczność i specyficzność reakcji PCR

•temperatura przyłączania starterów powinna być o ok. 5C niższa niż obliczona teoretycznie tzw. temperatura topnienia starterów (

T

•Zastosowanie zbyt wysokiej temp. względem T_m sprawia, że startery nie mogą się przyłączyć do zdenaturowanej matrycy – reakcja PCR nie zachodzi

•Zastosowanie zbyt niskiej temp. względem T_m sprawia, że startery przyłączają się w niespecyficznych miejscach (na zasadzie niepełnej komplementarności) – reakcja zachodzi ale jest niespecyficzna tj. powielają się fragmenty, których wcale nie chcieliśmy uzyskać

Przykładowy wzór na obliczenie temperatury topnienia starterów T_m = [4(G + C) + 2(A + T)] (C)

Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji startera

•zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna temperatura wynosi 72-75C (teoretyczna szybkość przyłączania nukleotydów – syntezy DNA wynosi 100 nt/s)

•przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min

•obniżenie temperatury elongacji wpływa znacznie na szybkość syntezy np. już przy 70C ilość wstawianych nukleotydów wynosi ok. 60 nt/s.

•obniżenie temperatury elongacji kosztem wydłużenia czasu jej trwania jest korzystne np. wtedy, gdy wymagana jest większa dokładność w syntezie nowej nici np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania lub wówczas gdy amplifikowany fragment będzie sklonowany do wektorów ekspresyjnych. W takich przypadkach stosowane są temperatury 60-68C i odpowiednio wydłużony czas elongacji

•Przy wysokiej temperaturze przyłączania starterów możliwe jest ograniczenie etapów reakcji PCR do denaturacji i wspólnego etapu przyłączania i wydłużania starterów tzw. dwustopniowy PCR

Ilość cykli w reakcji PCR

•wynosi od 20 do 50 i zależy głównie od początkowej ilości matrycowego DNA.

Dla małej ilości docelowego DNA (ok. 50 cząsteczek) sugeruje się 40- 50 cykli

•teoretyczna wydajność reakcji po “n” cyklach wynosi 2ⁿ dwuniciowych, specyficznych cząsteczek DNA

•rzeczywista wydajność jest niższa (mniejsza wydajność reakcji np. przez spadek ilości dNTP, zmniejszenie aktywności polimerazy).

Składniki reakcji PCR (warunki chemiczne)

•matrycowe DNA

•startery

•termostabilna polimeraza DNA

•odpowiedni bufor reakcyjny

•jony magnezu

•mieszanina czterech dezoksyrybonukleotydów (dNTP)

Parametry dobrego startera

•powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji

Prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch identycznych starterów długości 20 nt wynosi 4²⁰czyli 1 099 511 627 776

Oznacza to, że sekwencja komplementarna dla danego startera występuje raz na 10¹² nukleotydów.

Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest występowanie dwóch takich samych miejsc przyłączenie starterów w dowolnym genomie

•długość starterów powinna wynosić około 20-30 zasad, a temp. ich topnienia, która zależy od rodzaju i ilości nukleotydów od 45-65C

•startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub wyższą niż matryca

•nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów

•nie powinny zawierać w części 3’ końcowej sekwencji komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera

•robocze stężenie każdego ze starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi od 0,2 - 0,4 M i powinno

stanowić molowy nadmiar

Startery c. d.

Bufor reakcyjny stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej i stwarza odpowiednie środowisko reakcji

•bufor reakcji PCR jest specyficzny dla danej polimerazy i zwykle jest dostarczany razem z polimerazą

•wszystkie polimerazy wymagają do działania dwuwartościowych kationów, zwykle są to jony

Mg

Mn

Kationy dwuwartościowe- niezbędne dla aktywności polimerazy DNA

•ilość cząsteczek Mg⁺² musi przewyższać ilość grup fosforanowych obecnych w mieszaninie reakcyjnej ponieważ zarówno wolne nukleotydy (dNTP) jak i startery wiążą jony Mg⁺²

•stosowany mix dNTP powinien zawierać równe ilości czterech nukleotydów dATP, dTTP, dCTP i dGTP

•Końcowe stężenie dNTP powinno zapewniać wystarczającą ilość substratów dla polimerazy do ostatniego cyklu reakcji

Deoksynukleotydy (dNTP) – substraty dla polimerazy DNA

Składniki reakcji PCR

•matrycowe DNA

•startery

•termostabilna polimeraza DNA

•odpowiedni bufor reakcyjny

•jony magnezu

•mieszanina czterech dezoksyrybonukleotydów (dNTP)

Pierwszym enzymem używanym w reakcji PCR był fragment Klenowa DNA polimerazy I E. coli. Nie jest to jednak enzym odporny na działanie wysokiej temperatury i w każdym cyklu reakcji zdenaturowane cząsteczki enzymu musiały być zastępowane nowymi.

Termostabilne Polimerazy DNA

•termostabilna polimeraza Taq wyizolowana z Thermus aquaticus (obecnie powszechnie dostępna jako rekombinowana)

•polimeraza Taq i jej pochodne nie posiadają aktywności egzonukleazy 3’5’ (tzw.

sprawdzającej) - ilość błędnie wstawianych nukleotydów jest dość wysoka (większa niż w procesie replikacji DNA) i wynosi 2 x 10^-4 do 2 x 10^-5.

•Produkty amplifikacji z użyciem polimerazy Taq mają charakterystyczne zakończenia

•Polimeraza Pfu ( Pyrococcus furiosus )

•charakteryzuje się bardzo niską częstością wstawiania błędnych nukleotydów (1.6x10^-6- 7x10^-7)

•ze względu na aktywność sprawdzającą wymaga ona dłuższego czasu działania (ok.

1.5-2 min/kpz). Optymalna temperatura działania to ok. 75C. Polimeraza Pfu

zachowuje 95% aktywności po godzinnej inkubacji w 98C

•produkt PCR amplifikowany polimerazą Pfu posiada tępe końce

(obecnie powszechnie dostępna jako rekombinowana)

•Polimeraza Tth ( Thermus thermophilus )

•posiada zdolność odwrotnej transkrypcji tj. przepisywania cząsteczek RNA o długości do 1000 nukleotydów na DNA, w obecności jonów Mn

. W

obecności jonów Mg

jest polimerazą DNA i amplifikuje cząsteczki DNA w reakcji PCR.

•Aktywność odwrotnej transkryptazy (RT) w podwyższonej

temperaturze jest bardzo pożyteczna, gdyż pozwala uniknąć problemów związanych ze skomplikowaną budową przestrzenną cząsteczek np. RNA

•Obecnie dostępna w postaci rTth (rekombinowanej)

Polimeraza Deep Vent ( Pyrococcus species GB-D)

• Deep Vent jest wyjątkowo stabilnym enzymem zarówno w

wysokiej (480 min. w temp. 100C) jak i niskiej temperaturze.

• Ma bardzo dużą procesywność zdolność do amplifikowania długich fragmentów DNA (do 14 kpz)

• Posiada aktywność sprawdzającą egzonukleazy

•ilość matrycowego DNA potrzebna do PCR jest stosunkowo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA).

„Czułość” reakcji PCR

• Reakcja PCR jest bardzo podatna na kontaminację

Jak uniknąć zanieczyszczeń w reakcji PCR

•Główną zasadą jaka powinna być spełniona to fizyczne rozdzielenie etapów procedury przygotowania próbki i reakcji PCR

•Zestaw plastików (końcówki pipet, próbówki) pipety automatyczne powinny być używane tylko do określonego przeznaczenia (izolacja lub PCR)

Podstawowe zastosowania

Biologia molekularna:

•uzyskiwanie dużych ilości DNA in vitro (powielone DNA może być wykorzystane np. do klonowania molekularnego)

•znakowanie fragmentów DNA (sondy molekularne)

•cykliczne sekwencjonowanie

•analizy ekspresji genów (transkryptomu komórki)

Medycyna

•diagnostyka np. chorób, polimorfizmu

Kryminalistyka i paleobiologia

•powielanie DNA ze śladowych ilości materiału będącego matrycą do badań

•identyfikacja organizmów – genotypowanie Wiele innych ...

Wybrane modyfikacje i odmiany techniki PCR

 w reakcji PCR temperatura jest głównym czynnikiem warunkującym specyficzność reakcji. W reakcji Hot-Start PCR przynajmniej jeden z substratów (Polimeraza, Mg⁺², lub dNTP) jest nieobecny w mieszaninie reakcyjnej i dopiero po osiągnięciu wysokiej temperatury brak ten jest uzupełniany.

 Opóźnienie reakcji można osiągnąć różnymi drogami. np. przez dodanie polimerazy do reakcji pod koniec początkowej denaturacji

•Modyfikacja typu Hot-Start PCR – poprawia specyficzność amplifikacji fragmentu DNA

 Polimerazy Hot-Start: mają zablokowane centrum aktywne za pomocą przeciwciała lub innego termolabilnego ligandu. Ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w czasie wstępnej denaturacji powoduje denaturację

termolabilnych substancji (przeciwciał, ligandów) i uwolnienie centrum aktywnego polimerazy

• Odmiana: asymetryczny PCR – powielanie tylko jednej nici DNA

 w reakcji używany jest jeden starter lub dwa w nierównych stężeniach

 amplifikacji ulega tylko jedna nić

 Stosowany np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania DNA

• Odmiany: multipleksowy PCR –powielanie wielu fragmentów DNA w jednej reakcji

 Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w czasie jednej reakcji PCR.

Reakcja ta wymaga użycia kilku par starterów o podobnej temperaturze topnienia tak by można było użyć jeden profil temperaturowy reakcji.

 Multipleksowy PCR jest wykorzystywany np. do identyfikacji osobników, gatunków czy diagnostyki chorób genetycznych.

•qPCR (ilościowy PCR, Real-Time PCR)

Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym, pozwala zmierzyć wydajność amplifikacji w układzie „on line”

•Direct PCR (bezpośredni PCR) – matrycowe DNA pochodzi bezpośrednio z kolonii bakterii (kolonijny PCR), tkanki, gleby (bez etapu izolacji DNA)

•Problem w reakcji bezpośredniego PCR: zanieczyszczona matryca

•Rozwiązanie: specjalne modyfikacje polimerazy DNA