Downstream processing: Opwerken van een produkt in de biotechnologie

I

L-

I

<c,

ll'5'5

(2.. _

_

013~'53

' " ; J i J , : : > K ! _L)

L.-Dow-nstreatn Processing

Opwerken van een Produkt in de Biotechnologie

8ffjHlIi/(ïl

Delft C 2137809

2356

724

Dow-nstreatn Processing

Opwerken van een Produkt in de Biotechnologie

J

A Wesselingh,

J

Krijgsman

en P Vonk

CIP-GEG~VENS .KONINKLUKE BIBLIOTHEEK, DEN HAAG Wesselingh, J.A.

DQwnstream processing : opwerken van een produkt in de biotechnologie / J.A. Wesselingh, J. Krijgsman en P. Vonk. - Delft: Delfische V.M. -lil.

Met lit. opg.

ISBN 90-6562-151-2 Trefw.: biotechnologie.

© VSSD Eerste druk 1994

Delftse Uitgevers Maatschappij b.v.

P.O. Box 2851, 2601 CW Delft, The Netherlands Telefooil 015-123725, telefax 015-143724

Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen, of op enige andere manier, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van de uitgever.

All rights reserved. No partofthis publication may be reproduced, stored in a retrieval system., or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photo-copying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the publisher.

Voorwoord

Dit is een slecht boekje. Het is ontstaan als .een onderdeel van cursussen bio-technologie bij de Technische Universiteit Delft, Gist-brocades en de Rijks-universiteit Groningen. Die cursussen gaan langs de hele biotechnologie; vanaf de wonderbaarlijke complexiteit van de levende cel tot aan de grove en grootschalige techniek van de· industrie.

Het 'volk' dat wij op die cursussen krijgen omvat zowel fijnbesnaarde biologen als botte technologen. Daarin zit de spannin&.in dit vak; die totaal verschil-lende mensen moeten samenwerken om processen te ontwikkelen en te be-drijven. De 'bioloog' en de 'biochemicus' leven in een uiterst complexe wereld. Theorie en rekenen helpen daar niet zo veel, maar experimenten des te meer. De technoloog daarentegen, kan nauwelijks experimenteren. Op grond van (meest onvolledige) laboratoriumgegevens en rekenmodellen, moet hij grote . installaties aan de praat zien te krijgen. Dat kan niet zonder theorie en

model-vorming.

Dit boekje begint daar waar de meeste mensen in de biotechnologie denken dat alles klaar is. De fermentatie met alles eromheen is gebeurd, het produkt is gemaakt, we hoeven alleen nog ... En dan komt het meest grove deel van de biotechnologie: de opwerking of zuivering van de produkten. Bij dit onderdeel is het belangrijk dat de technoloog goede gegevens krijgt uit het laboratorium. Daarom moet ook de bioloog iets van dit vakgebied begrijpen.

U begrijpt nu waarom dit boekje slecht is:

• het is te moeilijk, te droog en te theoretisch voor een bioloog en • het is te simpel en te onvolledig voor een technoloog.

Het is gelukkig ook niet dik!

Groningen/Delft, najaar 1994

J.

A. Wesselingh,

J.

Krijgsman en P. Vonk

Inhoud

Voorwoord ... 5

Inhoud ... 6

1 Inleiding ... , ... : ... 7

2 Celdisruptie ... ; ... 9

Indelîng van methoden ... ~ .. 9

De homogenisator ... 10 3 K1aren .... ~ ... 12 Bezinken ... , ... 12 Centrifugeren ... 14 Filtratie ... , ... 16 4 Concentreren ... 21 Indampen ... 21 Precipitatie ... , ... 24 Ultrafiltratie ... 28 Uitspoelen ... , ... 31 5 Zuiveren ... :~ ... : ... 33 Hulpfasen ... : ... 33 Kringlopen ... 37 . Extractie ... : ... 40 Kristallisatie ... ; ... 44 Antwoorden ... 46 6 ZeerZuiveren ... 47 Sorptie-processen ... : ... \ ... 47 Pieken en banden ... : ... 54 Gelfiltratie ... 59 Ionenwisseling ... , ... 62 Affiniteitsadsorptie ...•... ~ ... 65 7 Schakelen ... ; ... ~ ... ; ... 69

Een compleet proces ... : ... 69

Hoe kan het beter? ... ; ... : ... 72

Conclusie ... 74

8 Literatuur .. : ...•... 75

Symbolen ... : ... 77

1

Inleiding

Na al ons werk hebben micro-organismen een goed produkt gemaakt. Datkan zijn in een schudfIesje van 200 mI in het laboratorium. Het kan ook zijn in een industriële fer-mentor van 200 m3. Wij zijn klaar ... of toch niet? Nee! Wij moeten he( produkt nog ontsluiten, klaren, concentreren, zuiveren en verpakken. Het kan best zijn dat het groot-ste deel van het werk nog moet gebeuren . ..

\ water in .de cellen . ce/resten prOdukt--..,: 0.02

Figuur 1-1 Vo/umefracties in een fermentor

Het opwerken van het produkt na de fermentatie (dus 'benedenstrooms' van de fermentor) noemen wij met een goed Nederlands woord 'Downstream Processing' (DSP). Dat opwerken kent een aantal bijzondere problemen: • De fermentor bevat veel water (figuur 1-1). Dat loopt van 80 % bij de

produktie van ethanol tot 95 % bij sommige therapeutische eiwitten. • Het produkt kan in ~e micro-organismen zitten (intracellulair). Wij zullen

dan de cellen stuk moeten maken.

• De fermentatie':vloeistof is een uiterst ingewikkeld mengsel, dat dikwijls veel stoffen bevat die op het produkt lijken.

• Toch willen wij vaak een hoge eindzuiverheid van het produkt. Bij medische toepassingen misschien,wel 99.9999 %!

Deze problemen bepalen de opzet van de opwerking. Daarbij moeten wij dik-wijls de volgende stappen afwerken:

• de cellen stukmaken (alleen bij intracellulaire produkten), • . de cellen of celresten van de vloeistof scheiden ('klaren'). • het produkt ruw voorscheiden en concentreren,

• het produkt zuiveren (dikwijls in meerdere stappen) en

• het prç>dukt in een verkoopbare vorm brengen (bijvoorbeeld als een oplos-sing in een flesje, of als een poeder of in een capsule). Dit heet 'formuleren'.

7

Dit zijn ook de hoofdstukjes van deze syllabus. Het' formuleren zullen wij niet bespreken, ook al is het belangrijk.

Bij elke processtap hoort een apparaat. Daarvan willen wij weten, hoe het eruit ziet, en hoe groot of het is. Meestal willen wij ook weten hoeveel energie of hulpstoffen het apparaat verbruikt.

Dikwijls hebben wij veel processtappen nodig. Elke stap geeft verliezen en dat kan hard oplopen. Stel dat wij een twintigste van het produkt per stap ver-liezen. Dan hebben wij een opbrengst:

na één stap: 0.951 _{= 0.95} na twee stappen , 0.952

=

_0.90 na drie stappen 0.953 _{= 0.86} na tien stappen 0.9510 _{= 0.60}

Dit betekent dat een goede bedrijfsvoering heel belangrijk is.

Nog een probleem in de biotechnologie zijn de grote afvalstromen, vooral van verontreinigd water. Wij kunnen zowel de produktverliezen als de afval-stromen sterk verkleinen door een handige keuze van de processtappen en van de manier waarop wij ze schakelen. In het laatste hoofdstuk nemen wij daar een voorbeeld van door.

De eigenschappen van alle deelljes en stoffen in de fermentatie-vloeistof kennen wij maar slecht. Dat betekent dat wij een ontwerp van een

opwerkingsproces niet alleen vanuit een theorie kunnen opzetten. Wij moeten 'alle stappen

doormeten.

De voorbeelden met modellen en formules in deze

syllabus zijn daarom een beelje misleidend. Zij helpen wel om proeven te begrijpen en te extrapoleren, maar zij worden nooit alleen gebuikt zonder ondersteunende proeven. Wij doen dat hier alleen omdat wij geen tijd hebben '

voor proeven!

Tenslotte: in een inleiding als deze, moeten wij alles kort en overzichtelijk hou-den. Daarom hebben wij modellen en beschrijvingen gekozen die 'eenvoudig' zijn. Zij geven de hoofdtrekken van processen en apparaten, maar zij zijn niet altijd nauwkeurig.

2

Celdisruptie

Het liefst hebben wij dat cellen hun produkt uitscheiden. Wij hoeven dan de cellen niet stuk te maken; dat scheelt veel ellende bij het scheiden van de cellen van de vloeistof. Jammer genoeg lukt dat niet altijd. Zelfs met genetische m.mi-pulatie krijgen wij niet alle produkten buiten de cel. En als dat lukt, dan zijn zij niet altijd stabiel.

Indeling van methoden

Celwanden kunnen wij op veel manieren kapotmaken. Er worden dan ook veel verschillende technieken gebruikt. Die verdelen wij in twee hoofdgroepen: • de mechanische methoden en

• de niet-mechanische methodenl.

De tweede groep is op grote schaal minder belangrijk dan de eerste. Daarom besteden wij er maar een paar woorden aan. Niet-mechanische manieren om

celwanden doorlatend of kapot te krijgen zijn: .

• drogen (vries- of vacuÜilldrogen),

• veranderen van de zoutsterkte van de omgeving ('osmotische schok'), waardoor cellen zwellen en barsten,

• aanbrengen van een temperatuurschok en

• toevoegen van oppervlakte-aktieve stoffen, oplosmiddelen, antibiotica of enzymen (lysozym), die de celwanden degraderen of oplossen.

De mechanische methoden worden het meest gebruikt. Dat zijn er drie, met • ultrasone disruptors,

• kogelmolens en • 'homogenisators'.

In het laboratorium zijn cellen goed stuk te maken met ultrasone trillingen. Voor. produktie op grote schaal gebruikt deze methode echter te veel energie. Kogelmolens (figuur 2-1) bestaan uit een cilindrisch vat waar schijven snel in ronddraaien (met een omtreksnelheid van circa 10 mis). Zij zijn gevuld met kogeltjes van ongeveer een millimeter diameter, die intensief door de schijven worden geroerd. Cellen in de vloeistof tussen de kogeltjes worden fijngemalen; wij weten niet precies hoe dat gaat. Kogelmolens moeten gekoeld worden. Hoe groter ze zijn, hoe moeilijker dat wordt.

Op produktieschaal wordt de homogenisator het meest gebruikt.

1 Zo kun je alles indelen!

m=~j~~

slijtvaste schijven

kogeltjes 1 mm snelheid 10 mis Figuur 2-1 Een kogelmolen om cellen te malen

De homogenisator

De homogenisator (figuur 2-2) is verwant aan de kraan in de waterleiding. Hij is alleen veel steviger; hij moet drukverschillen tussen 20 en 100 MPa kunnen hebben (ongeveer honderd keer de druk in de waterleiding). De fermentatie-vloeistof wordt met een zeer grote snelheid door een spleet in de klep geperst. Achter de spleet ontstaan dampbellen ('cavitatie') die weer imploderen. Cellen worden door de drukfluctuaties kapot getrokken.

voeding met cellen zuiger-pomp homogenisator-. klep spleet gemalen cellen Ap:;:: 20 ... 100 MPa

Figuur 2-2 Een homogenisator om cellen stuk te maken

De homogenisator is een eenvoudig apparaat, dat populair is in de produktie. Hij heeft wel een paar bezwaren:

• hij is zeer lawaaierig,

• hij kan alleen grote doorzetten aan en is niet geschikt voor het laboratorium, • hij slijt snel en

• de pompen die erbij horen zijn niet goedkoop.

Wij gebruiken de homogenisator dikwijls om intracellulaire eiwitten vrij te maken. Of hij effectief is, hangt af van het rnicro-organisme. Bacteriën zijn makkelijk stuk te krijgen; gisten moeilijk. Niet alle gistcellen gaan in één keer stuk. De concentratie eiwit die bij gist vrijkomt voldoet aan de volgende verg~:­ lijking:

I

I1

Hierin is

cmax de concentratie als alles zou zijn vrijgemaakt

K een 'constante' die afhangt van de cel structuur en de temperatuur, N het aantal keren dat de suspensie door de klep wordt gepompt en

.1p de drukval over de klep

Wij zien dat de fractie die vrijkomt, oploopt naar één als het getal onder de exponent groot wordt. Dus bij meer passages of bij een grotere drukval. Door de hoge drukval wordt er veel warmte gevormd. De temperatuurstijging is met een energiebalans te berekenen:

.1T

=

.1p ,., 2.5.10-7 _.1p

pC_p .

Daarin is

p de vloeistofdichtheid en

cp de specifieke warmte

Als wij een thermolabiel eiwit hebben, dan kan dit betekenen dat wij de voeding en/ of produkt moeten koelen om denaturatie te voorkomen. Merk op dat de temperatuurstijging niet afhangt van de grootte van de doorzet. Dit is een voordeel van de homogenisator tegenover andere apparaten.

Opdracht 2-1:

Uit een laboratoriumproef is gebleken dat in een bepaald type homogenisator 40 % van een. eiwit vrij kwam bij een druk van 40 MPa (met één passage). Bepaal nu hoeveel passages er nodig .zijn om een omzetting van 95 % te halen bij drukvallen van 40, 60, 80 en 100 MPa.

3 Klaren

Voordat wij gaan concentreren en zuiveren, moeten wij meestal de cellen (of ' celresten) uit de fermentatie-vloeistof halen. Dat levert een heldere vloeistof, waarin het produkt is opgelost. Voor dat 'klaren' zijn de twee belangrijke tech-, nieken:

• centrifugeren en • filtreren.

Grote deelljes verwijderen wij uit de vloeistof door bezinken. In de biotechno-logie gebruiken wij deze techniek alleen voor precipitaten (waar fijn materiaal aan elkaar geklonterd is tot grotere deeltjes). Toch zullen wij bezinken eerst be-kijken, 9mdat de theorie een aa~oop geeft naar centrifugeren.

Bezinken

Op

een deellje in een vloeistof werken er drie krachten: • de zwaartekracht, die hetomfaag trekt,

• een drukkracht, die het omhoog duwt en

• een wrijvingskracht als het deeltje beweegt ten opzichte van de omgeving. Voor een klein, enkel, bolvormig deeltje zijn deze krachten:

Ir 3 Ir 3

"6

D gP. -"6_{D gp/-31rT1uD}

Meestal kunnen wij versnellingseffecten vergeten, zodat de som van de krachten nul is. Omwerken levert dan voor de bezink- of stijgsnelheid:

Hierin is:

g

Ps PI u= g(p._p/)D2 1811 de zwaartekrachtsversnelling de dichtheid van het deeltje de dichtheid van de vloeistof 11 de viscositeit van de vloeistof

D de diameter van het deeltje

Wij zien dat de bezinksnelheid evenredig is met het kwadraat.van de diameter van het deeltje. Een deeltje dat tien keer groter is, valt honderd keer sneller. In de biotechnologie zijn deeltjes klein:

precipitaten 10-4 < D < 10-3 _m

cellen 10-6 < D < 10-5 _m

celresten en virussen 10-7 _{< D < 10-6 m}

Daardoor zijn bezinksnelheden klein, en is het lastig om oplossingen te klaren.

12

Echte deeltjes zijn meestal niet bolvormig en ook niet alleen. Zij beïnvloeden elkaar en dit verlaagt hun bezinksnelheid. Die snelheid is dan niet goed te voorspellen. Wij kunnen wel een waarde meten met een proef in een maat-cylinder (figuur 3-1). Het grensvlak tussen de vloeistof en de suspensie is dikwijls vrij scherp, zodat hij goed is te volgen. Als er niet binnen een paar minuten een heldere laag is te zien, dan kunnen wij bezinken als scheidings-techniek meestal vergeten. .

suspensie vloeistof - 0 - - - -t ...

i

H

!

.

bezinksnelheid H u= -t 'koek'

. Figuur 3-1 Een proef om de bezinksnelheid te bepalen Het bezinken is niet anders in grote apparaten. Wel moeten wij daar voorkomen dat de vloeistof in de bak blijft wervelen door opwarmen of afkoelen. Bij grote doorzetten gebruiken wij 'continue' bezinkers (figuur 3-2 ).

L

Q

Figuur 3-2 Een bak met een bezinkend deeltje

Wij beschouwen een rechthoekige bezinkbak met breedte B, lengte L en hoogte H. Een vloeistofstroom Q loopt van links naar rechts door de bak; wij nemen aan dat de snelheid overal hetzelfde is. (In werkelijkheid is de stroming minder regelmatig. Daardoor werkt een bezinkbak minder goed dan wij hier voor-spellen). D~ snelheid heeft een waarde:

De verblijfujd in de bak is dan:

v=JL

BH L LBH = -v

Q

13

Bij de ingang komt een deeltje binnen, bovenin de bak. (Dit is de meest ongun-stige plaats). Het deeltje zinkt met een snelheid u. Het zal de bodem bereiken voor het einde van de bak, als de bezinktijd kleiner is dan de verblijftijd:

H <LBH

u -

Q

De grootste doorzet waarbij alle deeltjes worden verwijderd is:

Qmax

=

uLB

=

uA

Daarbij is A de oppervlakte ('area') van de bak. Wij zien dat de capaciteit van een bezinkbak niet afhangt van de hoogte, maar alleen van de oppervlakte. Bij een grotere hoogte is de vetblijftijd groter, maar moeten de deeltjes ook 'verder vallen. Wij kunnen de oppervlakte vergroten door extra platen parallel met de bodem van de bak te installeren, maar dat wordt al heel gauw on.haitdig. Opdracht 3-1

Wij brengen 1 m3 _{van een suspensie van een eiwit precipitaat in een bezinkbak met een} opper-vlakte van 2 m2_{• Wij beschouwen de precipitaat-deeltjes als afzonderlijke bollen met een} dia-meter van 0.1 mmo Hun dichtheid is 1200 kg/m3. De dichtheid en viscositeit van de vloeistof

zijn 1000 kg/m3 _{en 0.0012 Pa s. . '}

1. Bereken de bezinksnelheid van een enkel deeltje. 2. Schat de tijd nodig voor hei: klaren van de vloeistof.

Centrifugeren

De zwaartekracht is niet sterk genoeg om kleine deeltjes te scheiden in een redèlijke tijd. Wij gebruiken dan centrifuges, die deeltjes met een veel grotere kracht uitslingeren,

I

v=mR

E

____

!

_

35

R

.

.

-Figuur 3-3 Centrifugeren in het lab me! een uitzwaaicentrifuge In het laboratorium kunnen wij een 'uitzwaai-centrifuge' (figuur 3-3)

gebruiken. De vloeistof gaat in twee gelijke buisjes die wij rondslingeren. De versnelling waarmee de deeltjes worden uitgeslingerd, hangt af van de straal R in de buis:

m2

R

De versnelling is ook evenredig met het kwadraat van de 'hoeksnelheid': 14

w= 21m

waarin n het toerental is. De versnelling is al gauw enkele duizenden keren groter dan die van de zwaartekracht. Als wij binnen tien minuten bij 3000 geen

• goede scheiding krijgen in de uitzwaai-centrifuge, dan valt centrifugeren ook te overwegen in een grote installatie. (De verblijftijden in grote centrifuges zijn veel korter, maar de bezinkafstanden ook). .

Twee belangrijke produktie-centrifuges zijn:

• de buiscentrifuge, die veel op kleine schaal wordt gebruikt en • de schotelcentrifuge, die grotere doorzetten toelaat.

Wij kunnen beide apparaten zowel met een enkele lading ('batch') als continu bedrijven. R L

vt

I

2R .

I~u=u~

I

.

I

9 9 Q

Figuur 3-4 Een buiscentrifuge is een bezinkbak op zijn kant

De buiscentrifuge (figuur 3-4) is het eenvoudigst; wij zullen hem eerst bekijken. Als de cilinder een straal R en een lengte L heeft, dan is zijn oppervlakte:

A=2nRL

De verhouding van de centrifugale versnelling ten opzichte van de zwaartekracht is:

w2_R g

Daardoor gedraagt de centrifuge zich als een bezinkbak met een oppervlakte:

w

2

R 2

w

2

l:=2nRL·=2nR L

-g

g

Als wij de waarde van l: (de 'sigma') kennen, dan kunnen wij uit een sedimen-tatie of centrifugeer-proef de maximale doorzet van de centrifuge schatten. (Ook hier zijn de prestaties van een continu doorstroomd apparaat wat minder dan die van een 'batch' apparaat. Dit omdat de snelheid v niet overal gelijk is.)

Schotelcentrifuges, (figuur 3-5) bevatten een stapel konische platen (de 'schotels'). Die staan op een korte afstand van elkaar; dikwijls op minder dan een millimeter. De bezinkafstand is dus klein. Zij kunnen daardoor een grote effectieve oppervlakte hebben (tot l: '" 0.1 km2_{!). De voeding komt binnen door}

de as, in een ruimte onder de schotels. Het gaat dan eerst naar buiten voordat het door de schotels naar binnen loopt. De vaste stof wordt afgevoerd door openingen in de buitenwand; de vloeistof door een ringspleet langs de boven- '

as.

Opdracht 3-2:

Figuur 3-5 Een schote/centrifuge is een schuine bezinkbak met een groot oppervlak

Ons bedrijf Groningen Biotechnology BV (GBB) gaat het extracellulair enzym GSA produceren. Daarbij moet een celsuspensie worden geklaard. Bij een sedimentatieproefje met een maat-cilinder blijkt dat de suspensie na een dag nauwelijks gesedimenteerd is. In een batch-centrifuge bij 1000 g loopt het scheidingsfront tussen heldere en troebele vloeistof ongeveer 10 cm in een half uur.

De totale produktie aan GSA vereist dat er per dag 10 m3 _{wordt behandeld. Hiervoor heeft} GBB een centrifuge met een equivalente oppervlakte van 1000 m2. Bepaal of deze centrifuge de vereiste capaciteit heeft.

Filtratie

Een andere manier om deelljes uit een suspensie te halen is filtratie (figuur 3-6). De deelljes worden tegengehouden door een filterdoek (het 'medium'). Op het doek vormt zich een 'koek'. Vreemd genoeg, zijn de gaten in het doek meestal groter dan de deeltjes. Zeg drie maal groter dan de grootste deeltjes. Deze vormen 'bruggen' en daarna houdt de koek andere deeltjes tegen. De vloeistof loopt door de koek en het medium door een drukverschil.

16

voeding

+ +

e

+ +

ei

)

filterdoek

+ + + + +

(medium)

filtraat

Figuur 3-6 Bij filtratie houden de deeltjes elkaar tegen

In de praktijk filtreren wij op twee manieren:

• ladinggewijs met vlakke platenfilters en • continu met een roterend vacuümfilter.

De platenfilters (figuur 3-7) gebruiken een groot aantal holle platen die even-wijdig staan met tussenafstanden van een paar centimeter. Het filterdoek is over beide kanten van de platen gespannen. De vloeistof gaat van de buiten-kant naar de binnenbuiten-kant van de platen, door het filterdoek. De vaste stof blijft achter op het doek. Na een tijd is de ruimte tussen de platen gevuld met'koek. Wij halen dan het filter uit elkaar om de koek te verwijderen. (Dit kan ook automatisch).

ntn

~~

n n

'l..411

"

"

"

."

'I'

I~II ti 11 II~I ti 11

'

.... "

ti 11 11"" 11 11 I~II 11 I1 U U U u koek- koek-vorming verwijdering

Figuur 3-7 Een platen filter

Een roterend vacuümfilter (figuur 3-8) heeft een grote cilinder ('trommel') die draait om een horizontale as. Het filterdoek is gespannen over het cilindrisch deel van het oppervlak. In de cilinder heerst vacuüm. De cilinder draait lang-zaamdoor een trog met de voeding. Daar wordt vloeistof aangezogen, en vormt zich de kpek. Alleen het onderste deel van de trommel (ongeveer een derde) draait door de vloeistof. De rest van de trommelcoppervlakte gebruiken wij om de koek te 'wassen' en droog te trekken. De koek wordt van het doek geschraapt voordat de trommel weer de vloeistof indraait.

drogen

wassen

voeding- ......

filtraat vorming

Figuur 3-8- Een roterend vacuüm filter

Het ontwerpen van een filter begint met een proef in het laboratorium. Wij ge-bruiken hetzelfde doek als in de echte filter. De proef kan bijvoorbeeld op een

'Büchner trechter' (figuur 3-9). Daarbij trekken wij de voeding met een constant drukverschil.1.p door het filter. Aanvankelijk is het filterdoek schoon en gaat de

, filtratie snel. Er vormt zich echter een koek; daardoor loopt de permeatie-snelheid terug. Wij nemen de hoeveelheid filtraat op als functie van de tijd. Achteraf moeten wij ook het koekvolume meten~ Uit deze proef halen wij twee parameters:

• de verhouding C van het volume van koek ('cake') en filtraat en • een weerstand

r

per eenheid van hoogte van de koek.

voeding

~

koek

~~/terdoek

Op ';;~!' (medium)

cr

.

vakuum filtraat

t

Figuur 3-9 Filtratie op een Büchner trechter

De volumeverhouding C halen wij uit de koek- en filtraatvolumes na afloop van de proef: .

c=

~

(t

=

00)

VI

Deze waarde is groot als er veel vaste stof in de voeding is, of als de kO,ek veel water bevat.

• De weerstand

r

volgt uit het verloop van het filtraat-volume met de tijd. Dat verband leiden wij hier af. De volumeflux door het filter is evenredig met het

drukverschil /1p, en omgekeerd evenredig met de viscositeit 1] en de

koekweer-stand. Die laatste is weer een produkt van r en de koekhoogte H:

V=~

T]{rH)

d(V_{f /} A)

V = '

-dt

De koekhoogte neemt toe met het volume filtraat: H =

v;,

= CV,

A

A

Wij substitueren Vfin de fluxvergelijking: 1 dV_f A.ó.p

= -A dt T]rCv_f

De enige variabelen hierin zijn Vf en

t.

Integreren van de vergelijking geeft:

V2 _ 2/1pA 2t of V = 2/1pA 2t

f - f/rC f WC

Het filtraatvolume loopt op met de wortel uit de tijd; eerst snel, dan steeds langzamer. Wij kunnen

r

bepalen door

VI

uit te'zetten tegen

t

.

Dat moet een rechte lijn geven met een helling:

2.ó.pA 2 f/rC

Bij deze afleiding hebben wij de weerstand van het doek verwaarloosd. Die kan een rol spelen bij zeer doorlaatbare koeken.

Opdracht 3-3:

De klaring tijdens de produktie van BSB kan ook gebeuren door filtratie. Om dit te

onder-zoeken doet de researchafdeling een experiment met een kleine drukfilter (oppervlakte 0.00115 m2) bij een drukverschil van 300 kPa. (Dit is de;z:elfde drukverschil die gebruikt zal worden in een grote filter.) Daarbij worden de volgende hoeveelheden filtraat gemeten:

tijd (s) filtraat (mi)

5 40 24 60 60 160 130 240 228 320 .319 380

Het volume van de voeding is 500 mlo Op het moment dat de koek droogvalt, is het filtraat-volume 395 mlo De viscositeit van de vloeistof is 0.0012 Pa s.

De grote filter wordt een platenfilter. Daár duurt een filtratie 130 s. Wij hebben nog eens deze tijd nodig om de koek te verwijderen.

1. Bepaal de volumeverhouding koek/filtraat.

2. Bepaal de koekweerstand. (Deze is niet nodig voor de volgende vragen).

3. Bepaal hoeveel oppervlakte er nodig is om 10 m3 _{fermentatie-vloeistof te filtreren 8 uur.}

4. Hoe groot moet de afstand tussen de filterplaten minimaal zijn, om te zorgen dat de ruimte net niet volloopt met 'koek'?

'i.

Als wij iets van de deel~es in de koek afweten, dan kunnen wij de koekweerstand ruw schatten met de formule:

r"" 5I-

tP

S2

tP

2

Voor niet-te-kleine bolletjes is het deel van het volume van de koek dat open is ongeveer

tP "" 0.4. Bij fijne deeltjes zijn de koeken dikwijls meer open. Bolletjes

met een diameter D, hebben een oppervlak per volume koek:

.

6(I-tP)

s =

-D

De formule laat zien dat de weerstand erg groot wordt voor kleine waarden van de diameter van de deeltjes. Daarom zijn celresten alleen, nauwelijks te fil-treren. Dat lukt wel als wij grovere deeltjes (een 'filterhulpiniddel') toevoeg~n. Dat zijn poreuze, inerte materialen, met een gemiddelde deel~esgrootte in het gebied van 20 .. .50 j.l.m. Het volume aan filter-hulpmiddel moet groter zijn dan'

dat van de af te vangen deeltjes. De optimale hoeveelheid is alleen

experimenteel te bepalen. Meest""l voegen wij het hulpmiddel in twee delen toe: • het eerste (kleine) deel als een voorlaag of 'precoat' op het medium (voordat

de eigenlijke filtratie begint) en

• het grootste deel gemengd met de voeding (als 'body feed'). Filterhulpmiddelen veroorzaken twee problemen:

• niemand weet wat je er mee moet en • je raakt dikwijls vrij veel produkt erin kwijt.

De koekweerstand hangt ook sterk af van de volumefractie tP van de kanalen. Wij kunnen de koek soms ijler en doorlatender maken door 'flocculanten' aan de voeding toe te voegen, of door verandering van de pH of zoutsterkte.

20

4 Concentreren

Na het klaren, hebben wij nog altijd een vloeistof die veel water bevat. Voordat wij het produkt gaan zuiveren, is het meestal beter om eerst water te

verwijderen. Dit J concentreren' levert ook dikwijls enige zuivering op. Soms

is deze zuivering al voldoende voor het eindprodukt. Wij bespreken hier drie methoden om te concentreren:

• indampen, • precipitatie en • ultrafiltratie.

Indampen

Het oudste en eenvoudigste proces om te concentreren is indampen. Daarmee verwijderen wij water of oplosmiddelen uit een mengsel.

Produkten uit de biotechnologie zijn meestal niet erg stabiel. Daarom moeten wij bij het indampen:

• de temperatuur laag en • de verblijf tijd kort houden.

dampspanning, kPa 1000 I / UJO

7

I I 10

7

I

o

100 200 temperatuur, 0 C

Figuur 4-1 De dampspanning van water als functie van temperatuur

De temperatuur houden wij laag door onder vacuüm te werken. In figuur 4-1 staat de ~ampspanning van water uitgezet als functie van de temperatuur. (Let op de logaritmische schaal). Wij zien dat wij de druk moeten verlagen tot minder dan 10 kPa (0.1 atmosfeer) om water bij 40

oe

te verdampen. Bij een mengsel moet de druk nog iets lager zijn.

21

-voeding

n",\on,,[!2V A

verwarmings-bad produkt

Figuur 4-2 Een roterende vacuüm-indamper

Ook bij il).dampen begint het leven met een proefje in het laboratorium, bijvoorbeeld in een roterende vacuümindamper (figuur 4-2). Dit is een glazen bol, met een schuine cylindrische ~oerpijp. De bol is gedeeltelijk

gedompeld in de vloeistof van een opwarm-bad. Wij brengen

qe

voeding in de bol en sluiten de afvoer aan op een condensor en vacuum-systeem. Het apparaat is zo geconstrueerd dat de bol in de vloeistof kan draaien. Dit houdt het produkt op een homogene temperatuur en het vergroot de

warmteoverdracht. Tijdens de proef meten wij:

• de temperatuur van het bad en het produkt,

• de hoeveelheid condensaat als functie van de tijd, en eventueel ook • de activiteit van het produkt als functie van de tijd.

Wij kunnen daar waardevolle informatie uithalen:

• hoever of wij kunnen indikken,

• hoeveel deactivering of ontleding van het produkt optreedt, • of de vloeistof erg schuimt bij koken en

• een ruw idee van de warmteflux die wij door de wand van de verdamper kunnen sturen.

Als wij ver proberen in te dikken, dan wordt de vloeistof viskeus. De warmtestroom wordt dan steeds kleiner. Bovendien wil de vloeistof op een gegeven moment niet meer stromen.

Uit het verloop van de activiteit van het produkt tijdens het indampen, kunnen wij zien of er deactivering optreedt. Deactivering is meestal evenredig met de tijd; de snelheid ervan loopt dikwijls steil op met de temperatuur.

De warmteflux

q

door de wand (in W m·2

) is ongeveer evenredig met het temperatuurverschil tussen bad en produkt:

q=a6.T

De evenredigheidsfactor a heet de 'warmteoverdrachtscoefficient'. Hij heeft meestal een waarde tussen 300 en 3000 W m-2 _{°CI. Deze waarde loopt sterk} terug als wij ver indikken.

In technische warmtewisselaars, kunnen wij de v.oeding als een film langs de binnenkant van een verticale pijp laten lopen (figuur 4-3). Zo'n dunne film is veel sneller op te warmen dan bijvoorbeeld een ketel. De warmte voor het verdampen komt van stoom, dat aan de buitenkant ván de pijpen

condenseert. De druk aan de buitenkant is hoger dan aan de binnenkant, zodat ook de temperatuur daar hoger is.

voeding

100

0

CJ40

0

C

• vloeistof-film wand damp

+

concentraat

Figuur 4-3 Een pijp in een verdamper

Na de verdamper, scheiden we de damp en de vloeistof of concentraat (figuur 4-4). De damp wordt in een condensor gekoeld en vloeibaar gemaakt. De druk in de verdamper wordt bepaald door de temperatuur van de condensor. voeding ---+T---.-, stoom condens koelwater condensor ... .----condens scheider ' - - -.. concentraat

Figuur 4-4 Vallende film verdamper

Bij het condenseren geeft één kg stoom een warmte af van 2.2

MJ

(megajoule). Dit is slechts volc!J:>ende om één kg water (of enkele kg oplosmiddelen) te ver-dampen. Stoomverbruik is een grote kostenpost bij indampen. Daarom pro-beren wij de stoom meerdere keren te gebruiken. Een manier waarop dat kan staat in figuur 4-5. Die laat een tweetraps-verdamper zien. Daar wordt damp uit de eerste trap (in plaats van stoom) in de tweede trap ingezet. De

temperatuur (en dus de druk) van de tweede verdamper moet lager zijn dan van de.eerste verdamper: Met méer trappen kunnen wij het stoomverbruik

• verder drukken, echter wel ten koste van meer apparatuur.

Figuur 4-5 Tweetraps verdamper

Zoals wij in het laboratorium hebben gevonden, kunnen wij niet onbeperkt indampen; meestal niet verder dan tot ongeveer 60% 'vaste stof' in de

oplossing. Daarboven wordt dewarmteoverdracht te langzaam en worden de kosten voor de extra pijpen snel hoger.

Opdracht 4-1

Wij moeten een stroom van 0.2 kg/s van een gist-extract indampen. Daarbij moet het vaste stof gehalte omhoog van 20% naar 50%. In een proeffabriek zijn metingen gedaan onder de volgende condities:

. Voeding 0.05 kgf s; T voedin!? = 40 "C, vaste stof gehalte 20% Concentraat 0.02 kg/Si TcOIicentraat = 40 "C; vaste stof gehalte 50% Stoomtemperatuur 100 "C; stoom verbruik 0.03 kg/s

Oppervlakte van de verdamper Aproef= 0.5 ~2.

In de echte fabriek zullen wij met stoom van 140 "C werken. Schat het stoomverbruik en de oppervlakte van de benodigde verdamper in de fabriek. Neem daarbij aan dat de warmte-overdrélchtscoefficienten in beide apparaten gelijk zijn.

Precipitatie

Bij precipitatie (figuur 4-6) verlagen wij de oplosbaarheid van eiwitten tot zij neerslaan. Wij scheiden dan de neerslag met een bezinkbak, centrifuge of filter. De neerslag is veel geconcentreerder dan de voeding. Wij kunnen dit

neerslaan ook stukje bij beetje doen ('gefractioneerd'). De fracties bevatten dikwijls verschillende verhoudingen van de eiwitten in de fermentatie-vloeistof; daarmee kunnen wij voorzuiveren.

snel roeren en precipitant inmengen bij roerder langzaam roeren om precipitaat te laten groeien precipitaat laten bezinken

Figuur 4-6 Precipiteren (neerslaan) van eiwitten

Wij verlagen de oplosbaarheid door een zout of door een organische oplos-middel (meestal aceton of een alcohol). Daarvan hebben wij grote hoeveel-. heden nodig. Precipitatie met zouten heeft als voordelen:

• de kans op denaturatie is klein,

• meestal kunnen wij bij kamertemperatuur werken,

• wij kUnnen dikwijls een redelijk zuiver preparaat krijgen met weinig be-werkingen.

Er zijn drie nadelen:

• wij moeten veel zouten lozen,

• het produkt bevat zouten, die wij moeten verwijderen (bijvoorbeeld met ultrafiltratie) en

• zouten zijn zeer corrosief.

Met een oplosmiddel is er meer kans op denaturatie. Daarom moeten wij bij lage temperaturen werken. Een voordeel van oplosmiddelen boven zouten is, dat wij ze makkelijker kunnen terugwinnen.

De oplosbaarheid van eiwitten kunnen wij niet goed voorspellen. Wel zijn de grote trekken van het gedrag redelijk te begrijpen. Eiwitten hebben zowel zwak-zure als zwak-basische groepen. Als het eiwit in water komt, ioniseren die; daardoor krijgt het eiwit een lading. Bij een hoge pH zijn vooral de zure groepen geïoniseerd, en is het eiwit negatief. Bij een lage pH is het eiwit posi-tief. Er is steeds één pH waarbij het eiwit geen nettolading heeft: het 'iso-elektrisch punt' of pI (figuur 4-7). In de buurt van de pI stoten eiwitten elkaar niet af en kunnen ze flocculeren en neerslaan. De oplosbaarheid gaat daar door een minimum.

lading + PI (isoelektrisch punt) 2

I

~

."'··.

-

~ oplosbaarheid

o

PH

2 4 6

Figuur 4-7 Lading en oplosbaarheid van eiwitten

Kleine ionen vormen een 'elektrische dubbellaag' om de eiwitten. Bij lage concentraties van de ionen, is die laag dik, zodat de eiwitten elkaar afstoten.

Als wij meer ionen toevoegen, dan wordt de afstoting kleiner, zodat de eiwitten kunnen precipiteren. De oplosbaarheid volgt dikwijls:

1~ 2

logCeiwit =Kt- K21 met 1=2LCjZj

(Zie figuur 4-8.) Daarin zijn de 'constantes' Kl en K₂ specifiek voor ieder eiwit/zout systeem. Kl hangt af van de pH en ook enigszins van de tem-peratuur. De grootheid I is de 'ionsterkte'. Hij bevat de concentraties Ci van de verschillende ionen, en hun ladingsgetallen Zio Een zout dat hoge ionsterktes kan geven is ammoniumsulfaat. Het is zeer oplosbaar, en het tweewaardig sulfaat ion helpt een handje mee~

Figuur 4-8 Oplosbaarheid van een eiwit als functie van de ion sterkte De oplosbaarheid van eiwitten is laag in organische oplosmiddelen. Dit komt door de lage dielectrische constante van: deze stoffen, die ionisatie

onderdrukt.

l

H=D

j

4 keerschotten W=O.1D turbine-roerder 6 bladen w= O.25d . h= O.20d Figuur 4-9 Standaard geroerd vat

Precipiteren doen wij in een geroerd vat (figuur 4-9). Het is goed mogelijk om met laboratoriumproeven in kleine vaten, de juiste condities uit te zoeken. Daarbij is het wel belangrijk dat het laboratorium-apparaat en het grote vat dezelfde vorm of 'geometrie' hebben. Dat kan bijvoorbeeld de standaard-geometrie met een turbineroerder zijn van figuur 4-9, maar andere geometrieën kunnen ook.

Een maat voor de roer-intensiteit is de dissipatie per kilogram vloeistof. Het vermogen dat een turbineroerder opneemt hangt af van het toerental n, de roerder-diameter d en de vloeistof dichtheid p:

P = 5pn3 d5

. De massa van de inhoud van het standaard-vat is:

Zodat

m

=

p!!..02H

=

p!!..03

4 4

.f=O.026n3₀2

m.

'Hard roeren' is bijvoorbeeld een dissipatie van 1 W kg-1; 'zachtjes roeren' een factor tien of honderd lager.

In het begin van de precipitatie roeren wij hard om de precipitant goed op te mengen. Om dezelfde reden voeren wij de precipitant in vlak bij de menger. De deelljes die dçln gevormd worden, zijn fijn; zij hebben weinig last van het roeren. Daarna moeten wij zachter roeren om ze te laten groeien. Als de deeltjes te klein blijven, kan het handig zijn om stukjes van een inert .

materiaal (bijvoorbeeld gips) toe te voegen. Het eiwit dat precipiteert hecht zich daaraan.

Bij de proeven op kleine en op grote schaal houden wij de volgende zaken hetzelfde:

• de dissipatie per kilogram vloeistof, • de toevoegtijd van het precipitant en ,

.de tijden van de verschillende mengstappèn.

Verder gebruiken wij dezelfde materialen. Merk op dat het roerder-toerental in een groot vat dan veel lager is dan in een klein vat.

Opdracht 4-2:

De GSA-oplossing uit de vorige opdracht bevat als verontreiniging het eiwit BSA. Bij preci-pitatie met ammoniumsulfaat vinden wij de volgende oplosbaarheden. De waarden zijn in gram/(liter van de oorspronkelijke vloeistof).

[NH4hS04 (%) 0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 GSA(g/l) 10.0 1.0 0.1 0.01 <0.01 BSA (gil) 2.0 1.0 0.5 . 0.25 '0.13

1) Bepaal hoeveel GSA wij neerslaan uit 10 m3 _{fermentatie-vloeistof met 25, 50 en 75 % zout.}

2) Bepaal de verhouding van de concentraties BSA en GSA in deze neerslagen. De percentages zijn fracties van de maximale oplosbaarheid; ongeveer 530 g

[NH4hS04/(loplossing). Dit is een oplossing met een dichtheid van 1230 kg/m3. Deze waarden heb je overigens niet nodig in de opdracht.

Ultrafiltratie

Bij het concentreren kunnen wij ook membranen gebruiken. Er zijn twee soorten' membranen die veel gebruikt worden in de biotechnologie: • microfiltratie (MF) membranen en

• ultrafiltratie (UF) membranen ..

Microfiltratie-membranen hebben poriën van 0.2 .. 0.5 f.lm. Zij kunnen'cellen tegenhouden. Microfiltratie lijkt veel op gewone filtratie; wij zullen het hier verder niet bespreken.

Een ultrafiltratie-membraan heeft poriën van ongeveer 10 nm. Dit is zo'n duizend keer kleiner dan de openingen in een filterdoek. Daardoor kan een ultrafiltratie-membraan eiwitten tegenhouden, terwijl het water en zouten doorlaat. Wij gebruiken meestal membranen in de vorm van poreuze buizen

van 1..5mm diameter. Een dun laagje op de buiswand vormt het membraan.

Dat membraan kan bestaan uit een poreuze (sponsachtige) polymeer, uit poreus koolstof of uit een laagje poreuze keramiek.

retentaat Or permeaat Op

/

membraan

111'

11

circulatie-pomp buis-module

Figuur 4-10 Concentreren met ultra filtra tie Wij gebruiken zo'n membraan op twee manieren:

• om te concentreren ('gewone' ultrafiltratie, figuur 4-10) en • om er zout mee uit een produkt te spoelen ('diafiltratie').

Een verschil tussen ultrafiltratie en gewone filtratie is dat er bij UP een belangrijke stroom langs het membraan is. UP is een vorm van

'kruisstroom-, filtratie'. .

Over het membraan staat een drukverschil van enkele honderden kPa. Daar-door wordt water (met opgeloste zouten) Daar-door het membraan geperst. De flux u door het membraan is klein; rond 10 Ilm/s. Bij een toenemend drukverschil loopt de flux eerst op (figuur 4-11). Het water voert eiwit mee, dat niet door het membraan kan. Daardoor krijgt het eiwit een hogere concentratie bij het membraan. Door diffusie en turbulentie in de langsstromende vloeistof wordt dit eiwit weer teruggemengd.

toenemende ,1p flux u

r

v.

,

toenem8J1de langssnelheid drukval f1p

Figuur 4-11 De twee regimes bij ultra filtra tie 29

-Bij een bepaald drukverschil, wordt de concentratie eiwit bij het membraan zo hoog, dat eiwit precipiteert. Het vormt een gellaag, die niet erg permeabel is. Een verdere drukverhoging geeft niet meer flux, maar alleen een dikkere gellaag. De maximale flux voldoet aan:

Daarbij is

C u=kln-L

c

k de 'stofoverdrachtscoefficient' die toeneemt met de langsstroming,

Cg de concentratie waarbij het eiwit een gel vormt,

C de eiwitconcentratie in de 'bulk' van de vloeistof.

Wij zien dat de maximale flux afneemt bij een toenemende bulkconcentratie. Bij C = Cg wordt hij nul.

enkele buis

flux u

Cg

-+---_~~ In(~)

Figuur 4-12· Batch proef met een enkele buis in het laboratorium

Het verloop van de flux met de concentratie kunnen wij met een

laboratorium-proef met één membraanbuis opmeten (figuur 4~12). Daar is maar een enkele batch proef voor nodig: de concentratie doorloopt tijdens de proef. het hele gebied waarin wij geïnteresseerd zijn. Met deze resultaten kunnen wij grote installaties ontwerpen, ook bijvoorbeeld meertraps continue installaties.

In het gebied van gellaagvorming. kunnen wij de flux wel vergroten door de vloeistof sneller langs het membraan te pompen. Dat verhoogt de

stofoverruachtscoefficient en de terugmengiI'g van het eiwit. Wij gebruiken langssnelheden van 1 ... 3 mi s. De stofoverdrachtscoefficient is dan ruw te schatteri met:

t t H

I

•

, •. , .I.W!IIWIIW IJ ,""" .'111 r1 ~ _ _ ' . . . .

'.,·1

Het membraan splitst de voedingstroom in twee delen: een permeaat- en een concentraatstroom.

Qf =Qp+Qc

De verhouding van de permeaatstroom en de voedingstroom heeft een eigen naam: de 'permeaatopbrengst'. ,

Bij een grote concentrering heeft die een waarde dicht bij één.

Omdat wij de vloeistof aan de hogedrukkant van het membraan moeten rondpompen, is de bulksamenstelling Cc (van 'concentraat') daar overal

dezelfde. Daarom heeft ook het permeaat overal dezelfde samenstelling cp'

Wij beschrijven de scheiding van een stof door het membraan door zijn 'retentie'. Deze bevat een verhouding van die twee concentraties:

R = 1- cp

Cc

Voor een eiwitmolecuul gaat cp ~ 0 en R ~ 1. Voor een klein molecuul zoals een zout, is er weinig verschil tussen de twee concentraties.

cp ~ Cc en R,~O.

Uit de permeaat-opbrengst en de retentie kunnen wij berekenen welk deel van een stof in het concentraat blijft:

I-A

q,=I-RA

Als A ~ ldan moet ook R ~ I, anders komt er teveel produkt in het permeaat terecht.

Opdracht 4-3

Wij concentreren een enzymoplossing met ultrafiltratie. De concentratie van het enzym is 100 'units/mI'. (Eigenlijk is dit een maat voor de activiteit.) De flux neemt af terwijl de concentratie oploopt, volgens:

flux u, 10-5 _mis concentrering en (-) 1.4 1.0 1.15 1.5 0.77 3.0 0.49 5.0 0.23 8.0

Maak hieruit

een

schatting van de stofoverdrachtscoefficient naar het membraan en van de waarde van de concentratie waarbij het enzym precipiteert. Neem daarbij aan dat de retentie van het enzym de waarde R = 1 heeft. (Aanwijzing: zet u uit tegen ln(en). Wat is de waarde van de helling? Wanneer wordt de flux nul?)

Uitspoelen

Zouten en andere laagmoleculaire stoffen spoelen wij uit een eiwitoplossing met 'diafiltratie' (figuur 4-13). Het water met zout voeren wij af door een ultrafiltratiemembraani wij vullen dat aan met even veel schoon water. Wij kiezen een membraan met een bijna volledige retentie voor het eiwit. De

31

retentie voor het zout moet laag zijn. Bij diafiltratie lopen de concentraties exponentieel terug metde toegevoegde hoeveelheid water:

.

c~c.e+

~

(l-R)]

Daarbij is V w het volume van het toegevoegde water en VI dat van de voeding.

zoet

water _water zout

Figuur 4-13 Dia filtra tie

=

zout uitspoelen

Opdracht 4-4

Bij de precipitatie van GSA, krijgen wij een suspensie van 0.5 m3 met daarin 99 kg GSA. Daarin zit veel ammoniumsulfaat. Wij willen 99 % van dit zout verwijderen met diafiltratie. Tijdens het diafiltreren lost het precipitaat weer op; voor de eenvoud nemen wij aan dat dit meteen gebeurt. Wij gebruiken een membraan met een retentie van 0.99 voor het eiwit en 0.10 voor het zout. Verder is gegeven dat de stofoverdrachts-coëfficiënt een -Waarde heeft k =

l(} IJlll/s en dat de gelconcentratie van het eiwit Cg = 600 gil bedraagt. 1) Hoeveel water hebben wij nodig?

2) Wat zijn de verliezen aan GSA?

3) Welke oppervlakte aan membranen is er nodig om de lading

m

een uur te verwerken?

5 Zuiveren

Hulpfasen

Wij hebben nu ons produkt uit de cellen gekregen, het produkt geklaard en misschien ook geconcentreerd. Erg zuiver zal het nog niet zijn, en er is alle kans dat wij daar wat aan moeten doen. In de 'downstream processing' zijn

daarvoor twee grote groepen van zuiveringsprocessen:

• die voor bulk-produkten zoals citroenzuur, enzymen en penicilline en • die voor medische toepassingen.

In dit hoofdstuk bespreken wij alleen de bulk-scheidingen; de andere komen in het volgend hoofdstuk aan bod. Bij bulk-scheidingen zijn grote zuiverheden meestal niet nodig; dikwijls mag er wel een paar procent aan reststoffen bij iitten. Twee belangrijke technieken hier zijn vloeistof / vloeistof extractie en kristallisatie. Dit zijn allebei processen met een 'hulpfase' - een fase die bepaalde stoffen selectief uit het mengsel haalt. Wij zullen eerst kijken hoe die processen in het laboratorium gaan.

Extractie water met citroenzuur

o

oplosmiddel (amine) erbij schudden scheiden: citroenzuur zit in het amine

Figuur 5-1 Een eenvoudige extractie-proef

Bij extractie (figuur 5-1) maken wij een 'dispersie' van twee vloeistoffen, die niet met elkaar mengen. Wij schudden of roeren ze door elkaar. Het produkt gaat naar de ene vloeistof (het oplosmiddel), en de verontreinigingen naar de andere. Wij scheiden dan de twee vloeistoffen. Alswij daarna produkt en oplosmiddel uit elkaar halen, dan hebben wij een zuiver produkt gekregen. Dit gaat meestal niet goed genoeg in één keer; wij zullen straks zien wat daaraan te doen is. Voor de extractie van kleine moleculen zoals penicilline en citroenzuur,

33

• 'I

_.

[

gebruiken wij organische oplosmiddelen zoals butyl-acetaat of een hogere amine. Het is ook mogelijk om twee niet-mengende waterige fasen te maken. Een voorbeeld daarvan geven geconcentreerde waterige oplossingen van kalium fosfaat en polyethyleen glycol (PEG). Die vallen uit elkaar in twee lagen: een dichte onderlaag die vooral fosfaat bevat en een bovenla<J.g met vooral PEG. Met dergelijke mengsels kunnen wij .ook grote molekulen (zoals eiwitten, DNA of celresten) scheiden. Deze techniek van 'waterige tweefasen exqactie' heeft echter nog geen grote toepassingen gevonden; wij behandelen hem hier niet.

~

~

_{en lof}

----..

kristallen

indampen

Figuur 5-2 Twee technieken voor kristallisatie

Kristallisatie

Bij kristallisatie (figuur 5-2) zorgen wij dat de vloeistof oververzadigd raakt aan het produkt. Dat slaat dan neer als vaste kristallen uit de vloeistof. De kristallen scheiden wij van de vloeistof door filtreren of centrifugeren en daarmee hebben wij een zuiver produkt. Een enkele kristallisatie-stap is dikwijls voldoende voor een behoorlijke zuivering, maar er kan veel produkt achterblijven in de vloeistof. Twee belangrijke manieren om de vloeistof te verzadigen zijn: • koelen, zodat het produkt minder oplosbaar wordt of

• verdampen van water, zodat de concentratie van het produkt toeneemt. (Dikwijls doen wij beide dingen tegelijk. Verdampen zorgt dan tegelijk voor afkoeling) .

. Kristallisatie lijkt veel op het precipitatie-proces, dat wij in het vorig hoofdstuk hebben gezien. Het verschil is dat wij bij precipitatie extra stoffen (preci-pitanten) toevoegen om te zorgen dat de oplossing oververzadigd raakt. Bij kristallisatie voegen wij niets toe. (In de biotechnologie gebruikt men de twee woorden overigens door elkaar; je komt daar ook 'reactieve kristallisatie' tegen.)

34

V

m

3 oplosmiddel

L

m

3 water citroenzuur verdelingscoefficient

Figuur 5-3 Hoe citroenzuur zich over twee fasen verdeelt in een schei-trechter

Een schei-trechter

Of een extractie goed werkt is al redelijk te bekijken met een eenvoudige labo-ratoriumproef. Daarbij gebruiken wij een 'schei-trechter' (figuur 5-3): een konisch glazen vat met een vulopening boven en een aftappunt met kraantje beneden. Ons voorbeeld is de extractie van citroenzuur met een amine-oplossing. Wij brengen een volume L van de geklaarde fermentor-vloeistof in de trechter; de concentratie van het citroenzuur daarin is Co kg m-3• Vervolgens doen daar een volume V van het schone oplosmiddel bij, sluiten de trechter en schudden hem flink. Citroenzuur gaat nu naar het oplosmiddel. De concen-tratie in het oplosmiddel stijgt, die in het water daalt en op een gegeven moment gaat er evenveel citroenzuur heen als terug. De oplossingen zijn dan op evenwicht. Dat kan bijvoorbeeld een minuut duren.

Wij stoppen met schudden, en de vloeistoffen scheiden in twee lagen. De onderste laag tappen wij voorzichtig af met het kraantje, en wij analyseren een van de lagen (of alle twee) om de concentraties citroenzuur daarin te bepalen. Die in de waterfase heeft een waarde c, die in de oplosmiddel een waarde C (allebei in kg m-3

). De verhouding van de deze twee is de verdelingscoëfficiënt: C

m=-c

Dit is een belangrijke grootheid. Hij mag niet te klein zijn voor een behoorlijke extractie; hij moet bijvoorbeeld een waarde van één of groter hebben. Voor verontreinigingen, moet de verdelingscoëfficiënt juist een kleine waarde hebben. De verdelingscoëfficiënt kan van een heleboel dingen afhangen: • van het soort en de concentratie van het produkt in de waterfase, • van de zuurgraad en zoutsterkte van de waterfase,

• van het soort oplosmiddel en de bijmengsels en • van de temperatuur.

In deze inleiding zullen wij de verdelingscoëfficiënt dikwijls als een constante beschouwen. Dat maakt het rekenen aan extractieprocessen eenvoudig en overzichtelijk, maar'het is niet nauwkeurig.

35

-Als wij de v.erdelingscoëfficiënt kennen, is het niet moeilijk om te berekenen in welke verhouding een stot zich over de twee vloeistoffen verdeelt:

stofin'hulpfase'V VC V

---"---- = - =

m-stofin'voedingsfase'L Lc L Deze verhouding staat bekend als de 'extractie-faktor':

.

V

E=m-L Opdracht 5-1

Wij doen twee gelijke volumes voeding en oplosmiddel in de scheitrechter:

L=V=lQ--4 m3

Citroenzuur heeft een concentratie in de voeding en een verdelingscoëfficiënt: c1

=50kgm-3

m1=3 De waarden voor een verontreiniging zijn:

C2 = 2kgm-3 m2 = 0.2

Hoe groot is de extractiefaktor voor citroenzuur? En voor de verontreiniging?

Welk deel van het citroenzuur blijft er achter in de waterfase? En van de verontreiniging? Hoeveel citroenzuur verliezen wij? Hoeveel verontreiniging komt er in het produkt? Bij dit soort berekeningen is het handig om te bedenken dat een stof zich ver-deelt volgens:

stof inhulpfase E = stof in voedingfase 1·

Dus als er een hoeveelheid w (weet ik niet) in de voedingfase achterblijft, dat er Ew in het oplosmiddel zit. In de voeding moet er dus (E + l)w hebben gezeten. Opdracht 5-2

Wij doen nu. dezelfde extractie in twee stappen. In de eerste gebruiken wij de helft van het oplosmiddel; na het schudden tappen wij die af. Dan doen wij het tweede deel erbij, schudden en tappen weer af.

(a) Wat is de extractiefaktor in de beide stappen?

(b) Welk deel w van het citroenzuur blijft er nu achter in de waterfase na de tweede trap? Oe kunt in figuur 5-4 alle hoeveelheden van rechts naar links in termen van winvullen.)

L

Figuur 5-4 Bij opdracht 5-2

Zoals je ziet, is het gunstiger om het oplosmiddel in twee (of meer) delen te gebruiken. Wij zullen straks zien dat er nog betere manieren zijn om het oplosmiddel in te zetten. Daarbij kunnen wij vrijwel alle citroenzuur extraheren

met een beperkte hoeveelheid oplosmiddel. .

Uit proeven meteen scheitrechter zijn nog meer gegevens te halen: • Door proeven met verschillende schudtijden, kunnen wij ons een idee

vormen hoeveel tijd er nodig is om evenwicht te bereiken. 'Gewoon' oplos~

sen gaat meestal snel, maar als er een chemische reaktie plaatsvindt (zoals hier) dan kan het langer duren. Deze tijd bepaalt hoe groot of de extractie-vaten in de echte fabriek moeten zijn.

• Wij kunnen kijken of de vloeistoffen makkelijR scheiden en hoe lang of dat duurt. Deze tijd bepaalt de grootte van het oppervlak van de scheidings-vaten in de echte fabriek.

De gegevens uit schudproeven zijn te ruw om er een fabriek goed mee te ontwerpen, maar zij zijn beter dan niets!

Kringlopen

Maken van citroenzuur

Wij zullen in dit hoofdstuk één industrieel proces doornemen: de produktie

van citroenzuur (figuur 5~5). Dit is een proces, waarbij zowel extractie als

kristallisatie worden gebruikt. Het citroenzuur wordt extracellulair

geprodu-ceerd door Aspergillus niger in een fermentor, met een concentratie van onge~

veer 50 kg m'3. Wij klaren de fermentor-vloeistof met een roterend vacufun-filter. De vloeistof bevat veel opgeloste verontreinigingen naast het produkt.

Daarom extraheren wij het citroenzuur met een niet~in~water-oplosbare

tertiaire amine. Het citroenzuur reageert (reversibel) met het amine, daardoor lost het goed op:

25°e ) R NCiH

· 3 3

De meeste verontreinigingen doen dat niet. Omdat de twee vloeistoffen (de 'fasen') niet mengen, vallen ze uit elkaar in twee lagen als wij ophouden met roeren. Wij brengen vervolgens de aminefase in kontakt met een schone water,. stroom bij een hoge temperatuur. De reaktie loopt bij deze temperatuur de andere kant op, zodat het citroenzuur weer vrijkomt in het water:

CiH3 +R3N (lOaDe R3NCiH3

Het water uit de terugextractie, bevat nog sporen van verontreinigingen en resten van het oplosmiddel. Daarom verdampen wij het water, zodat de vloei-stof oververzadigd raakt en citroenzuur neerslaat. De kristallen filtreren wij op een vacufunfilter. De waterdamp uit de kristallisator gaat via een vacuümpomp en een koeler terug naar de extractie.

_ vakuum-pomp

Figuur 5-5 De produktie van citroenzuur

In ons proces zijn er minstens drie kringlopen te zien. Het oplosmiddel met amines loopt rond van terugextractie naar extractie naar terugextractie. Water uit de kristallisatie-sektie loopt van de kristallisator naar de terugextractie naar de kristallisator. Er is ook een water kringloop over het tweede filter. Een vierde kringloop is niet zo duidelijk. Sporen van het oplosmiddel komen terecht in de kristallisator. Daar verdampen zij en gaan weer naat de terug-extractie. De scheidingsfugenieur zou ook graag het water uit de eerste filter terugvoeren naar de fermentor. Het is echter de vraag of de fermentatie-mensen daarmee akkoord zullen gaan: het vergroot de kansen op infecties aanzienlijk.

Al deze kringlopen zijn nodig omdat wij anders het milieu teveel belasten met processtoffen. Dikwijls zijn de processtromen ook te duur om te lozen! De kringlopen maken het ontwerpen en bedrijven van processen ingewikkeld, maar in een moderne installatie kunnen wij niet zonder.

Evenwichten

Om kringlopen goed te bedrijven hebben wij processen nodig die heen en weer kunnen. Een voorbeeld is het opnemen van citroenzuur door ons oplosmiddel. Dat wordt opgenomen door de chemische reaktie:

CiH 3 + R3N 25°C ) R3N.CiH 3

Dit is een fwee-fasenreaktie. Om hem te begrijpen moeten wij iets weten over de oplosbaarheden van de deelnemende stoffen. De waterfase bestaat natuur-lijk voornamenatuur-lijk uit water, met daarin opgelost citroenzuur. (Dit is een zwak zuur en het is maar voor een klein deel gedissocieerd). De andere fase bestaat voornamelijk uit een 'verdunner/~ een laagviskeuze koolwaterstof die nauwe-lijks in water oplost. In de verdunner zit de amine: een stof met een paar apolaire staarten die zorgen dat hij evenmin in water oplost. (De zuivere amines zijn t@viskeus om een goed oplosmiddel te vormen.) Citroenzuur zelf is

vrij polair, en het gaat nauwelijks het oplosmiddel in. In het fasengrensvlak kan het echter reageren met de amine tot een verbinding die wel naar het

oplosmiddel toegaat. 60 40 20

o

C, in oplosmiddel kg

m-3

25

oe

1000

e

m""O.03

dit hangt ook af van het type amine, de verdunner, de pH. ..

60

c, in water

kg

m-3

Figuur 5-6 De evenwichtsverdeling van citroenzuur over water en oplosmiddel bij 25

oe

en bij 100

oe

De details van het oplosgedrag hangen af van het type amine en andere zaken. Wij zullen hier rekenen met de 'isothermen' die in figuur 5-6 staan. De

isotherm bij 25

oe

loopt eerst schuin omhoog met een helling m =

Cf

c "" 3. Bij hogere concentraties in de waterfase, raakt echter al het amine op, en vlakt de isotherm af. De hoogte van het plateau kunnen wij instellen met de amine-concentratie. Een hoge concentratie geeft een hoog plateau, maar ook een viskeus oplosmiddel met een langzame opname van het átroenzuur. Wij zullen in onze verdere berekeningen, geen rekening houden met het plateau.

De reaktie tussen átroenzuur en amine produceert warmte. Daardoor loopt de reaktie terug bij hogere temperatuur. De verdelingscoëfficiënt vermindert tot m "" 0.03 bij 100

oe.

Wij maken daar gebruik van om átroenzuur terug te extraheren in water.

Opdracht 5-3

Soms wordt de extractie bepaald door het optreden van een reaktie in de waterfase. De extractie van Penicilline (Pen) in butyl-acetaat (BA) is daarvan een voorbeeld. Pen is een tamelijk sterk zuur, dat grotendeels is gedissocieerd:

PenH -) Pen -+ H+

Alleen het niet-gedissocieerde deel lost op in BA. Wij kunnen bij deze reaktie de

oplosbaarheden dus sturen met de pH. Zouden wij voor de extractie een hoge, of een lage pH kiezen. En voor de terugextractie?

Extractie

Menger en bezinkbak

Voor extractie worden verschillende soorten apparatuur gebruikt. Wij zullen hier alleen het eenvoudigste type bespreken. Die bestaat uit mengers en bezinkbakken (figuur 5-7). Mengers en bezinkbakken hebben wij al eerder gezien. Deze zijn niet echt anders. Het enige verschil is dat de menger hier continu wordt doorstroomd door beide fasen, die weer worden gescheiden in de bezinkbak. Bij extractie moeten wij voldoende hard roeren om beide fasen

. door elkaar te slaan, maar niet veel harder. Als wij te hard roeren, wordt de dispersie te fijn, zodat de bezinkbakken het niet meer goed doen. Hoe hard wij moeten roeren kunnen wij zien in een laboratorium-model van het vat. Als die goed werkt, dan zal een grotere uitvoering met dezelfde vorm het ook doen als wij hetzelfde roervermogen per kilogram vloeistof installeren. .

schématish, als een - . .[ ] : : . tegenstroom- 'trap'

...-

...-..

Figuur 5-7 Eenextractietrap bestaand uit een menger en een bezinkbak Wij zullen de menger-met-bezinkbak als één apparaat beschouwen, waar twee stromen ingaan en twee stromen uitkomen. Zo'n combi-apparaat heet een 'trap' en wij tekenen hem als een blokje. Wij tekenen de stromen zó dat water en '

oplosmiddel tegen elkaar ingaan. Waarom dat moet, wordt zo meteen duidelijk.

In figuur 5-8 staat trap no. 1 afgebeeld. De stromen die de trap uitgaan hebben

het nummer van de trap: LI en VI. De concentraties citroenzuur daarin zijn Cl

en Cl. Van links komt er de waterige voeding Lo met concentratie co' van rechts (uit de 2e trap) een oplosmiddelstroom V₂ met concentratie C₂• (De L' s en

V' s zijn hier dus stromen, in m3 S'I, en niet hoeveelheden.)

'0'

~~L'2'

V

Á·L..Jr?2

_

--

----~

I

wij nemen aan dat dèie stromen op evenwicht zijn

Evenwichtstrap

de verhouding van hun transportcapaciteiten is:

extractie-faktor

Figuur 5-8 De eerste evenwichtstrap

Om verder te gaan, moeten wij een paar aannames invoeren. De eerste is, dat de vloeistoffen lang genoeg in de trap blijven om met elkaar in evenwicht te komen:

Wij beschouwen dus een 'evenwichts-trap'. De tweede aanname is, dat de twee vloeistofstromen niet veel veranderen in de trap:

L=Lo ""LI ""L2 etc

V =

V; .""

V2 "" V3 etc

De verhouding van de uitgaande stromen van citroenzuur in de twee fasen is dan:

VC =m V =E

Le ' L

Daar is weer onze extractiefaktor! Met wat wij hebben aangenomen, heeft deze dezelfde waarde in elke trap. Wij kunnen nu op dezelfde manier als bij de scheitrechter, de stromen die de trappen in- en uitgaan berekenen.

m

= 3 1 kgs-1 _{w? '} V=13Is-1

-=11

~_L=20IS-1

CD

extractief actor: V 13 E=m-=3-=2 L 20

®

massabalans: w+2w

=

1 kgs-1

?

0

Figuur 5-9 Doorrekenen van één trap

Wij zullen eerst een voorbeeld met één trap bekijken (figuur 5-9). Wij nemen de stromen zoals die zouden zijn voor een tab riek met een produktie van 1 kg S·1

(30000 ton per jaar): Verder is van deze trap gegeven:.

• citroenzuur komt alleen de trap in via de voeding: Lc_o = 1kgs-I , • het binnenkomende oplosmiddel bevat geen citroenzuur:

C:

2 = 0,

• de stromen hebben waarden L = 20 Is-I, V = 13lÇl en • de verdelingscoëfficiënt

is rn

= 3 .

De extractie-faktor heeft dan een waarde: E = m V = 2 L

Wij beginnen met de citroenzuur-stromen aan de rechterkant van de trap: de onbekende stroom

w

die de trap uitgaat en de stroom 0 die binnenkomt. De stromen aan de linkerkant berekenen wij dan in twee stappen:

• de uitgaande stroom in het oplosmiddel is Ew en

• de som van de inkomende stromen moet gelijk zijn aan wat er in totaal uitgaat

1+0=W+EW~W=_1_=0.33kgs-1

l+E

De stroom die met het oplosmiddel meegaat is uiteraard Ew = 0.67 kg S-I . Daarmee liggen alle stromen vast.

25°G extractie

terug-extractie

tOooG

L

Figuur 5~ 10 De twee secties met hun stromen en trappen

bij de extractie van citroenzuur

Serie van trappen

De fabriek bevat drie trappen in de extractie- en twee trappen in de

terug-, extractie-eenheid (figuur 5-10). Als er meer trappen in serie staan, dan

beginnen wij net als in de vorige paragraaf met de meest rechtse trap (figuur S-11). Ook hier drukken wij alle stromen uit in de onbekende w. In de figuur is dat gedaan voor de eerste trap; maak zelf de laatste twee af. Je kunt de uitkomsten controleren aan het eind van dit hoofstuk. Doe de berekening echter eerst zelf; het IS belangrijk dat je hem doorhebt voordat wij verder gaan.

Figuur 5-11 Het begin van het doorrekenen van een serie trappen met E

=

2 Om nog een keer te oefenen, staat er in figuur 5-12 een drietraps-systeem met een extractiefaktor E

=

1. Druk ook hier alle stromen uit in

w,

en bereken hun waarden. Zoals je ziet, wordt nu een stuk minder citroenzuur geëxtraheer .... Wij zouden dat kunnen verbeteren door meer trappen toe te voegen, maar het effect is bij E

=

1 niet groot. Deze extractie-faktor geeft ongeveer de minimale stroom van oplosmiddel die nodig is voor een goede extractie.

Figuur 5-12 Het begin van het doorrekenen van een serie trappen met E = 1

Waarom tegenstroom?

Misschien is de vraag al opgekomen waarom of wij de twee stromen tegen elkaar in laten gaan. Die vraag kunnen wij nu beantwoorden. In figuur 5·13 staat een meestroom-systeem met twee trappen. Wij hebben al één wingevuld; zoek zelf de andere stromen in termen van w. Kijk dan weer naar achteren om te zien of je hetzelfde resultaat hebt.

E=2

1k~

.

2 ~?

:

o

-

~

?

deze stromen zijn op evenwicht

Figuur 5-13 Een tweetraps meestroom systeem

Zoals je ziet, doet de tweede trap helemaal·niets. De twee vloeistoffen die erin komen zijn op evenwicht, en dat blijven ze. Meestroom is dus geen goede manier om extractie te bedrijven. Wij kunnen de stromen in een extractie op nog andere manieren door de apparatuur sturen. Het blijkt echter steeds, dat tegenstroom het beste resultaat geeft.

TerugextTactie

Bij de terugextractie zijn er een paar kleine veranderingen. De hulpstroom is nu de waterstroom L' , die wij krijgen bij het condenseren van het waterdamp uit de kristallisator. Deze stroom heeft een grootte L'

=

41s·1 • Bij het berekenen