Engineering aspects of biocatalysts in industrial starch conversion technology

Engineering Aspects of Biocatalysts

in Industrial Starch Conversion Technolog:

R. van Tilburg

ENGINEERING ASPECTS OF

BIOCATALYSTS IN INDUSTRIAL STARCH

CONVERSION TECHNOLOGY

Proefschrift ter verkrijging van

de graad van doctor in de

technische wetenschappen

aan de Technische Hogeschool Delft,

op gezag van de rector magnificus

Prof.lr. B.P.Th. Veltman,

voor een commissie aangewezen

door het college van decanen

te verdedigen op

donderdag 24 februari 1983

te 14.00 uur door

Robbert van Tilburg,

scheikundig ingenieur,

geboren te Rijswijk.

J U

Delftse Universitaire Pers/1983

BIBLIOTHEEK TU Delft P 1725 4000

Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotor:

PROF.IR. J.A. ROELS

Aan mijn ouders,

Evelien,

DANKWOORD

A a n h e t t o t s t a n d k o m e n v a n d i t p r o e f s c h r i f t i s , b e h a l v e d o o r d e p r o m o v e n d u s , d o o r v e l e n b i j g e d r a g e n . M i j n d a n k g a a t o . a . u i t n a a r : . d e R & D - o r g a n i s a t i e v a n G i s t - B r o c a d e s N.V. d i e t o e s t e m m i n g h e e f t v e r l e e n d e e n g e d e e l t e v a n m i j n w e r k i n d i t p r o e f s c h r i f t s a m e n t e v a t t e n , . m i j n v r o u w E v e l i e n , d i e m i j n h u i s e l i j k e a f w e z i g h e i d ' m a n ' m o e d i g h e e f t g e -d r a g e n , . G e r a r d v a n B e y n u m e n T o n v a n V e l z e n , d i e d o o r t a l l o z e u r e n ' b r a i n s t o r m e n ' mede v a n i n v l o e d z i j n g e w e e s t o p h e t i n d i t p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n o n d e r -z o e k , . R i a n B r e k e l m a n s , S j e f v a n E g g e l e n , H a n s M u n n i k e n B e r t N o o r d a m v o o r h e t v e r -r i c h t e n v a n h e t l e e u w e d e e l v a n h e t ' h a n d ' w e -r k , . J a n W i l m s v o o r z i j n o p b o u w e n d e k r i t i e k o p h e t e e r s t e c o n c e p t , , H e n k M e i j e r v o o r h e t v e r z o r g e n v a n d e f i g u r e n , . H e n n y v a n d e r M e e r v o o r h e t v e l e t y p e w e r k . I k d a n k m i j n o u d e r s v o o r h e t f e i t , d a t z i j m i j i n de a e l e g e n h e i d h e b b e n g e -t e l d e e n v o o r o p l e i d i n g -t e v o l g e n , z o n d e r w e l k e d i -t p r o e f s c h r i f -t n i e -t -t o -t s t a n d z o u z i j n g e k o m e n .

CONTENTS

1 GENERAL INTRODUCTION 1 1.1 S t a r c h a n d s t a r c h e n z y m e s 1 1.2 E n z y m e n o m e n c l a t u r e 4 1.3 O r g a n i z a t i o n o f t h i s t h e s i s 5 1. 4 R e f e r e n c e s 8

2 L I T E R A T U R E SURVEY ON THE ENZYME GLUCOSE I S O M E R A S E 9

2.1 S o u r c e s a n d p r o p e r t i e s 9 2.1.1 T h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n 9

2.1.2 D i s c o v e r y o f t h e e n z y m e g l u c o s e i s o m e r a s e 10 2.1.3 D i f f e r e n t t y p e s o f g l u c o s e i s o m e r a s e 11

2.2 R e f e r e n c e s IV

3 L I T E R A T U R E SURVEY ON I M M O B I L I Z E D ENZYMES WITH S P E C I A L R E F E R E N C E

TO GLUCOSE I S O M E R A S E 19 3.1 I n t r o d u c t i o n 19 3.2 I m m o b i l i z a t i o n m e t h o d s 19 3.3 R e a c t o r t y p e s i n u s i n g i m m o b i l i z e d e n z y m e s 22 3.4 P r o d u c e r s o f i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e 24 3.5 Some f a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o f r u c t o s e i n p a c k e d b e d r e a c t o r s 29 3.5.1 P u r i t y o f t h e s u b s t r a t e 29 3.5.2 M e t a l i o n s 29 3.6 R e f e r e n c e s 30 V

4 HIGH FRUCTOSE CORN SYRUPS AND THEIR APPLICATIONS 33 4.1 H i g h F r u c t o s e C o r n S y r u p ; E n r i c h e d F r u c t o s e C o r n S y r u p and V e r y E n r i c h e d F r u c t o s e C o r n S y r u p 33 4.2 D e v e l o p m e n t s i n t h e a p p l i c a t i o n o f H i g h F r u c t o s e C o r n S y r u p 35 4 . 2 . 1 D e v e l o p m e n t s i n t h e USA m a r k e t 35 4 . 2 . 2 D e v e l o p m e n t s i n t h e EEC 37 4 . 2 . 3 A p p l i c a t i o n s i n t h e USA 37 4.3 C o s t d e v e l o p m e n t s 39 4 . 3 . 1 Enzyme c o s t s 39 4 . 3 . 2 H i g h F r u c t o s e C o r n S y r u p p r o d u c t i o n c o s t s 39 4.4 W o r l d o u t l o o k 40 4.5 R e f e r e n c e s 41

5 MATERIALS AND METHODS 43 5.1 G l u c o s e i s o m e r a s e d e r i v e d f r o m Actinoplanes missoupiensi-s 43 5.2 I m m o b i l i z a t i o n o f g l u c o s e i s o m e r a s e 43 5.3 G l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y a s s a y 44 5 . 3 . 1 B a t c h a c t i v i t y f r e e enzyme 44 5 . 3 . 2 B a t c h a c t i v i t y i m m o b i l i z e d enzyme 47 5 . 3 . 3 Column a c t i v i t y i m m o b i l i z e d enzyme 47 5.4 The enzyme a m y l o g l u c o s i d a s e 59 5 . 4 . 1 A m y l o g l u c o s i d a s e a c t i v i t y d e f i n i t i o n 59 5 . 4 . 2 I n c u b a t i o n s w i t h a m y l o g l u c o s i d a s e 60 5 . 4 . 3 A n a l y s i s methods 60 5.5 R e f e r e n c e s 61

6 K I N E T I C S AND THERMODYNAMICS OF THE GLUCOSE-ISOMERIZING REACTION 63

6.1 G e n e r a l 63 6.2 R e v e r s i b l e M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c s 63 6.3 E f f i c i e n c y f a c t o r f o r i m m o b i l i z e d enzymes 68 6.4 The e f f e c t o f t e m p e r a t u r e on k i n e t i c c o n s t a n t s 70 6.5 P r o d u c t i v i t y m o d e l f o r g l u c o s e i s o m e r a s e i n p a c k e d b e d r e a c t o r s 72 6 . 5 . 1 I n t r o d u c t i o n 72 6 . 5 . 2 D e r i v a t i o n o f p r o d u c t i v i t y f o r m u l a 72 6 . 6 R e f e r e n c e s 76 V I

7 S T U D I E S CONCERNING THE O P T I M I Z A T I O N OF P R O C E S S C O N D I T I O N S FOR

THE I S O M E R I Z A T I O N OF GLUCOSE I N A PACKED BED REACTOR 79

7.1 I n t r o d u c t i o n 79 7.2 F a c t o r s i n f l u e n c i n g p r o d u c t i v i t y o f a n i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e 84 7.2.1 T e m p e r a t u r e 84 7.2.1.1 T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f t h e e q u i l i b r i u m b e t w e e n g l u c o s e a n d f r u c t o s e 84 7 . 2 . 1 . 2 T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f t h e a c t i v i t y o f M a x a z y m e G I Immob 88 7 . 2 . 1 . 3 T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f t h e s t a b i l i t y o f M a x a z y m e G I Immob 89 7.2.2 P a r t i c l e r a d i u s 9 4 7 . 2 . 2 . 1 C a l c u l a t i o n p r o c e d u r e 9 4 7.2.2.2 D e t e r m i n a t i o n o f t h e i n f l u e n c e o f t h e p a r t i c l e r a d i u s o n t h e p r o d u c t i v i t y o f M a x a z y m e G I Immob 9 7 7.3 R e f e r e n c e s 102 8 DEVELOPMENT OF A P R O D U C T I V I T Y Q U I C K T E S T AT E L E V A T E D TEMPERATURES 103 8.1 I n t r o d u c t i o n 103 8.2 C a l c u l a t i o n o f q u i c k t e s t t e m p e r a t u r e 103 8.3 E x p e r i m e n t a l a n d r e s u l t s 105 8.4 C a l c u l a t i o n o f t h e r e s u l t s i n c a s e t h e t e m p e r a t u r e w o u l d h a v e b e e n 60°C 109 8.5 T e s t r e s u l t s a t 60°C 110 8.6 C o m p a r i s o n 60°C r e s u l t s a n d 70°C r e s u l t s 1 1 3 9 P R E S S U R E DROP C H A R A C T E R I S T I C S 117 9.1 I n t r o d u c t i o n 117 9.2 F a c t o r s i n f l u e n c i n g p r e s s u r e d r o p 1 1 7 9.3 P r e s s u r e d r o p m e a s u r e m e n t s a n d c a l c u l a t i o n s 1 1 8 9.3.1 T h e o r y 118 9.3.2 E x p e r i m e n t a l a n d r e s u l t s 124 9.3.3 C r i t i c a l p r e s s u r e d r o p 1 2 6 9.4 I m p a c t o f p r e s s u r e d r o p o n i m m o b i l i z e d e n z y m e f o r m u l a t i o n s 130 9.5 R e f e r e n c e s 132 V I I

10 PROBLEMS RELATED TO THE USE OF IMMOBILIZED AMYLOGLUCOSIDASE

I N GLUCOSE FORMATION FROM L I Q U E F I E D STARCH 133

10.1 I n t r o d u c t i o n 133 1 0 . 2 S a c c h a r i f i c a t i o n e x p e r i m e n t s w i t h i m m o b i l i z e d a m y l o g l u c o -s i d a -s e 134 1 0 . 3 E q u i l i b r i u m r e l a t i o n s h i p s i n t h e d e g r a d a t i o n o f d e x t r i n s b y a n a m y l o g l u c o s i d a s e 135 1 0 . 3 . 1 T h e o r y 135 1 0 . 3 . 2 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 138 1 0 . 4 K i n e t i c s o f t h e f o r m a t i o n o f m a l t o s e a n d i s o m a l t o s e o n i n c u b a t i o n o f t h e e n z y m e a m y l o g l u c o s i d a s e w i t h g l u c o s e s o l u t i o n s 141 1 0 . 5 K i n e t i c s o f t h e d e g r a d a t i o n o f DE-15 d e x t r i n s b y t h e e n z y m e a m y l o g l u c o s i d a s e 144 10.6 R e f e r e n c e s 153

11 GENERAL CONCLUSIONS AND DISCUSSION 155

A P P E N D I X 1 C a l c u l a t i o n o f t h e f l o w v e l o c i t y a t 45.0% c o n v e r s i o n 161 2 C a l c u l a t i o n o f t h e g l u c o s e / f r u c t o s e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t 162 3 D e r i v a t i o n o f e q n s . ( 1 0 . 1 0 ) and ( 1 0 . 1 1 ) 167 NOMENCLATURE 171 SUMMARY 177 S A M E N V A T T I N G 181 C U R R I C U L U M V I T A E 184 V I I I

1. G E N E R A L INTRODUCTION

1.1 S t a r c h and S t a r c h Enzymes C e l l u l o s e a n d s t a r c h , i n t h i s o r d e r , a r e t h e w o r l d ' s m o s t a b u n d a n t s o u r c e s o f c a r b o h y d r a t e s . B e c a u s e s t a r c h i s much m o r e r e a d i l y a c c e s s i b l e t h a n c e l l u l o s e i t h a s a l o n g h i s t o r y , b o t h a s a f o o d - s t u f f a n d a s a n i n d u s t r i a l r a w m a t e r i a l . I n p a r t s o f i t s a p p l i c a t i o n s t h e p o l y m e r i c s t a r c h i s d e p o l y m e r i z e d l a r g e l y t o m o n o m e r i c g l u c o s e u n i t s . H i s t o r i c a l l y , h y d r o c h l o r i c a c i d h a s b e e n u s e d t o c a t a l y z e t h i s d e p o l y m e r i z a t i o n p r o c e s s . The o v e r a l l g l u c o s e y i e l d , h o w e v e r , was r e l a t i v e l y l o w d u e t o t h e f o r m a t i o n o f b y - p r o d u c t s . T h i s s i t u a t i o n c h a n g e d ( 1 , 2 ) t h e m o m e n t e n z y m a t i c c o n v e r s i o n p r o c e s s e s w e r e i n t r o d u c e d ' T h i s t h e s i s d e a l s w i t h some o f t h e e n z y m e s w h i c h a r e u s e d i n t h e d e p o l y m e r i -z a t i o n o f s t a r c h t o m o n o m e r i c g l u c o s e a n d t h e s u b s e q u e n t i s o m e r i -z a t i o n t o f r u c t o s e . I t e m p h a s i z e s t e c h n o l o g i c a l a s p e c t s o f t h e a p p l i c a t i o n o f t h e s e e n z y m e s . N a t i v e s t a r c h i s k n o w n t o c o n t a i n t w o t y p e s o f m a c r o m o l e c u l e s c o m p o s e d o f g l u c o s e u n i t s . One o f t h e m o l e c u l e s , a m y l o s e , i s l i n e a r a n d c o n s i s t s e x c l u -( 3 ) s i v e l y o f a ,1-4 l i n k e d g l u c o s e u n i t s . S t a r c h c o n t a i n s a b o u t 25% o f a m y l o s e T h e s e c o n d t y p e o f m o l e c u l e s , a m y l o p e c t i n , i s h i g h l y b r a n c h e d a n d c o n t a i n s a , 1 - 4 as w e l l as a , 1 - 6 l i n k e d g l u c o s e u n i t s . The o v e r a l l c o n t e n t o f a , 1 - 6 l i n k a g e s i s g e n e r a l l y l e s s t h a n 5%. I n m o d e r n i n d u s t r i a l s t a r c h d e g r a d a t i o n t w o t y p e s o f e n z y m e s a r e i n common u s e . T h e e n z y m e a - a m y l a s e i s u s e d f o r t h e l i q u e f a c t i o n ( o r t h i n n i n g ) o f s t a r c h i n t o d e x t r i n s h a v i n g a n a v e r a g e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n o f a b o u t 7-10, and t h e e n z y m e a m y l o g l u c o s i d a s e i s u s e d f o r t h e s a c c h a r i f i c a t i o n , r e s u l t i n g i n a s y r u p o f h i g h g l u c o s e c o n t e n t (92-96%). The c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e two e n z y m e s d i f f e r i n t w o i m p o r t a n t a s p e c t s . F i r s t l y a - a m y l a s e , a s o - c a l l e d endo-e n z y m endo-e , a t t a c k s m a c r o m o l endo-e c u l endo-e s a t r a n d o m ( s endo-e endo-e F i g . 1 . 1 ) . 1

000000 A M V L O S E A M Y L O P E C T I N 0 R E D U C I N G G L U C O S E U N I T F i g . 1.1. A c t i o n p a t t e r n o f b a c t e r i a l a - a m y l a s e A s s h o w n , a , 1-6 l i n k a g e s - t h e b r a n c h e d p o i n t s - a r e n o t a t t a c k e d b y t h e e n z y m e . H y d r o l y s i s o f a , 1 - 4 l i n k a g e s i n b o t h a m y l o s e a n d a m y l o p e c t i n i s i n d i c a t e d b y a n a r r o w . A m y l o g l u c o s i d a s e , o n t h e o t h e r h a n d , i s a n e x o - e n z y m e a n d i t s p l i t s g l u c o s e u n i t s f r o m t h e n o n - r e d u c i n g e n d o f t h e d e x t r i n m o l e c u l e . S e c o n d l y , a - a m y l a s e e x c l u s i v e l y a t t a c k s a,1-4 l i n k a g e s w h e r e a s a m y l o g l u c o s i d a s e s p l i t s a , 1 - 6 ( 3 ) l i n k a g e s a s w e l l The g l u c o s e o b t a i n e d b y t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f s t a r c h c a n e i t h e r b e c r y s -t a l l i z e d o r s o l d a s a s y r u p . H o w e v e r , s i n c e i -t w a s r e c o g n i z e d -t h a -t g l u c o s e c o u l d b e c o n v e r t e d t o t h e much s w e e t e r i s o m e r f r u c t o s e b y a l k a l i n e t r e a t m e n t a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s t h e i s o m e r i z a t i o n p r o c e s s o f g l u c o s e t o f r u c t o s e o b -t a i n e d -t h e a -t -t e n -t i o n o f many s c i e n -t i s -t s . T h i s i s o m e r i z a t i o n p r o c e s s b e c a m e a r e a l t o p i c t h e moment i t was d i s c o v e r e d t h a t t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n c o u l d b e c a t a l y z e d b y e n z y m e s s i n c e t h e e n z y m e -c a t a l y z e d r e a -c t i o n t u r n e d o u t t o b e m o r e s p e -c i f i -c t h a n t h e a l k a l i n e - -c a t a l y z e d r e a c t i o n w h i c h p r o d u c e d u n f a v o u r a b l e b y - p r o d u c t s . The r e a s o n b e h i n d t h e f a c t t h a t f r u c t o s e i s s w e e t e r t h a n g l u c o s e i s n o t k n o w n y e t . H e y n s 11 a i v e s some e x p l a n a t i o n : t h e s w e e t n e s s o f s u g a r s i s r e l a t e d t o c e r t a i n c o n f i g u r a t i o n s o f v i c i n a l h y d r o x y l g r o u p s a n d , p r o b a b l y , t h e p r e s e n c e o f h y d r o g e n b r i d g e s . The r e l a t i v e s w e e t n e s s o f f r u c t o s e , i n v e r t s u g a r , g l u c o s e a n d some o t h e r s u g a r s a n d r e l a t e d c o m p o u n d s a s c o m p a r e d t o s a c c h a r o s e i s p r e s e n t e d i n t a b l e 1.1 (5,617) 2

T A B L E 1. I RELATIVE SWEETNESS*4 OF SOME CARBOHYDRATES AND R E L A T E D COMPOUNDS ( 5'6'7' L a c t o s e 39 M a n n i t o 1 69 G l u c o s e s y r u p DE-42 41 D e x t r o s e ( g l u c o s e ) 72 M a l t o s e 46 G l y c e r o l 79 S o r b i t o l 51 I n v e r t s u g a r 95 G l u c o s e s y r u p DE-6 4 59 S a c c h a r o s e 100 Mannose 59 H i g h F r u c t o s e C o r n S y r u p 100 G a l a c t o s e 63 F r u c t o s e 114 X y l o s e 67 The s w e e t n e s s o f a 10% (w/v) s a c c h a r o s e s o l u t i o n i n d i s t i l l e d w a t e r h a s a r b i t r a r i l y b e e n g i v e n t h e v a l u e o f 100. H e n c e , i t f o l l o w s t h a t t h e r e l a t i v s w e e t n e s s o f a c e r t a i n c o m p o u n d o f w h i c h c g r a m s h a v e t o b e d i s s o l v e d i n 100 m l o f d i s t i l l e d w a t e r i n o r d e r t o o b t a i n a s w e e t n e s s v a l u e o f 100 i s c a l c u l a t e d a t 10 . 100 . c "1. F o r some r e a s o n s c o m p a r i n g r e l a t i v e s w e e t n e s s i s r a t h e r d i f f i c u l t . O n e r e a s o n i s t h e f a c t t h a t t h e r e s u l t s a r e o b t a i n e d b y p a n e l t a s t e t e s t s , anothe; r e a s o n i s t h e f a c t t h a t t h e r e l a t i v e s w e e t n e s s o f a s u g a r i s - s o m e t i m e s s t r o n g l y - d e p e n d i n g o n t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t h e c o n f i g u r a t i o n o f t h e s u g a r . M o r e o v e r , s y n e r g i s t i c s w e e t n e s s e f f e c t s h a v e b e e n o b s e r v e d i n c a s e m i x t u r e s c ( 7 ) s u g a r s w e r e t e s t e d . D e s p i t e t h e f a c t t h a t r e l a t i v e s w e e t n e s s i s h a r d t o d e t e r m i n e t h e p a s t d e c a d e h a s p r o v e n t h a t i t i s e c o n o m i c t o i s o m e r i z e g l u c o s e p a r t l y t o f r u c t o s e . The i s o m e r i z a t i o n o f g l u c o s e t o f r u c t o s e c a t a l y z e d b y t h e e n z y m e g l u c o s e i s o -m e r a s e b e c a -m e e v e n -m o r e i n t e r e s t i n g t h e -mo-ment e n z y -m e p r o d u c e r s s u c c e e d e d i n t h e i m m o b i l i z a t i o n o f g l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y c o n t a i n i n g m i c r o - o r g a n i s m s b e c a u s e t h i s made c o n t i n u o u s p r o c e s s i n g p o s s i b l e . The r e s u l t o f t h e i s o m e r i z a t i o n p r o c e s s i s a s y r u p t h a t c o n t a i n s a b o u t 4 2 % ot f r u c t o s e . The r e l a t i v e s w e e t n e s s o f t h i s s y r u p i s m o r e o r l e s s c o m p a r a b l e t o t h a t o f i r v e r t s u g a r o r s a c c h a r o s e . T h e n e e d f o r e v e n s w e e t e r s y r u p s h a s l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f l a r g e s c a l e c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s f o r t h e s e p a r a t i o n o f f r u c t o s e f r o m g l u c o s e r e s u l t i n g i n t h e p r o d u c t i o n o f 5 5 % a n d 90% f r u c t o s e s y r u p s .

A s a s t a r c h s o u r c e m a i n l y c o r n ( m a i z e ) i s u s e d . A l t h o u g h i t h a s b e e n men-I s ) t i o n e d t h a t o t h e r s t a r c h s o u r c e s c a n b e u s e d v e r y w e l l f o r g l u c o s e / f r u c -t o s e p r o d u c -t i o n , c o r n i s -t h e w o r l d ' s m o s -t a b u n d a n -t s -t a r c h s o u r c e . M o r e o v e r , i -t s h o u l d b e b o r n e i n m i n d t h a t i n o r d e r t o f u l l y a p p r e c i a t e t h e e c o n o m i c s o f f r u c t o s e b e a r i n g c o r n s y r u p s o n e m u s t u n d e r s t a n d t h a t t h e c o r n r e f i n i n g p r o -c e s s e x t r a -c t s s e v e r a l v a l u a b l e -c o - p r o d u -c t s s u -c h a s e . g . -c o r n o i l a n d -c o r n f e e d . Due t o t h e n a t u r e o f t h e p r o c e s s t h e p r o d u c t i o n o f t h e s e p r o d u c t s i s i n t e r r e -l a t e d , a n d t h e m a r k e t v a -l u e o f c o r n o i -l a n d c o r n f e e d s h a s a d i r e c t b e a r i n g o n t h e c o s t s t r u c t u r e o f t h e f r u c t o s e c o n t a i n i n g c o r n s y r u p s . 1.2 Enzyme N o m e n c l a t u r e I n t h e p a s t many m i s u n d e r s t a n d i n g s h a v e b e e n c r e a t e d b y t h e f a c t t h a t e n z y m e s t h a t c a t a l y z e d t h e same r e a c t i o n h a v e b e e n g i v e n d i f f e r e n t n a m e s a n d e n z y m e s t h a t c a t a l y z e d d i f f e r e n t r e a c t i o n s h a v e b e e n g i v e n t h e same name. I n o r d e r t o make c l e a r w h a t t y p e o f r e a c t i o n i s c a t a l y z e d b y w h i c h e n z y m e m e n t i o n e d i n t h i s t h e s i s , t a b l e l . I I h a s b e e n c o n s t r u c t e d i n w h i c h t h e r e c o m -m e n d e d n a -m e , t h e E n z y -m e C o -m -m i t t e e n u -m b e r , t h e s y s t e -m a t i c na-me a n d ' o t h e r ' ( 9 ) n a m e s h a v e b e e n i n c l u d e d T A B L E l . I I ENZYME NOMENCLATURE ( 9 ) Name used i n t h i s t h e s i s Recommended name E.C. number S y s t e m a t i c name Other names a-amylase a-amylase a m y l o g l u c o s i d a s e exo-1,4-a-D - g l u c o s i d a s e t r a n s g l u c o s i d a s e d e x t r i n d e x t r a n a s e g l u c o s e i s o m e r a s e x y l o s e isomerase 3.2.1.1 1,4-a-D-Glucan g l u c a n o h y d r o l a s e 3.2.1.3 1,4-a-D-Glucan g l u c o h y d r o l a s e 2.4.1.2 1,4-a-D-glucan: 1,6-a-D-glucan 6-Ct-D-glucosyl-t r a n s f e r a s e 5.3.1.5 D-xylose k e t o l isomerase D i a s t a s e P t y a l i n Glycogenase Glucoamylase *y-amylase Lysomal a-g l u c o s i d a s e A c i d m a l t a s e g l u c o s y l t r a n s -f e r a s e D e x t r i n 6 g l u c o s y l t r a n s -f e r a s e 4

1.3 O r g a n i z a t i o n o f t h i s T h e s i s R e s e a r c h a s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s o r i g i n a t e d f r o m q u e s t i o n s w h i c h a r o s e i n t h e d e v e l o p m e n t o f e n z y m a t i c c a t a l y s t s s u i t a b l e t o a p p l i c a t i o n i n i n d u s t r i a l s t a r c h c o n v e r s i o n t e c h n o l o g y . A s s u c h , i t e m p h a s i z e s d e v e l o p m e n t s i n b o t h t h e p r o d u c t i o n a n d t h e a p p l i c a t i o n o f G i s t - B r o c a d e s ' i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e (R) M a x a z y m e G I Immob a n d w i t h e x p l o r a t o r y s t u d i e s c o n c e r n i n g t h e c h a r a c -t e r i s -t i c s o f -t h e e n z y m e a m y l o g l u c o s i d a s e . I n c h e m i c a l r e a c t i o n e n g i n e e r i n g a d e f i n i t e s t r a t e g y c a n b e d e v i s e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a c h e m i c a l r e a c t o r a n d c a t a l y s t s y s t e m f o r t h e i n d u s t r i a l e x -p l o i t a t i o n o f a g i v e n c h e m i c a l r e a c t i o n . S u c h a s t r a t e g y c o n s i s t s o f t h e s t u d y o f t h e k i n e t i c s o f a c h e m i c a l r e a c t i o n a n d t h e c o m b i n a t i o n o f t h i s i n f o r m a t i o n w i t h t h e r e s u l t s o f s t u d i e s o n t h e t r a n s p o r t p h e n o m e n a i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s u n d e r c o n s i d e r a t i o n . T h e a p p r o a c h u s e d i s m a i n l y b a s e d o n s t r u c t u r i n g t h e i n f o r m a t i o n w h i c h i s o b t a i n e d f r o m e x p e r i m e n t s w i t h t h e u s e o f a p r e f e r a b l y s i m p l e m a t h e m a t i c a l d e s -c r i p t i o n o f t h e p r o -c e s s i n r e l a t i o n t o t h e r e a -c t o r -c o n f i g u r a t i o n u s e d . T h e m o d e l t h u s o b t a i n e d c a n r e s u l t i n c o n s i d e r a b l e s a v i n g s o f e x p e r i m e n t a l w o r k , i f , o f c o u r s e , t h e m o d e l g i v e s a s u f f i c i e n t l y r e l i a b l e p i c t u r e o f r e a l i t y a n d , l e s s e v i d e n t l y , i s s u f f i c i e n t l y s i m p l e . T h e b a s i c a p p r o a c h i s s c h e m a t i c a l l y p r e s e n t e d i n F i g . 1.2 '1 0' . T h e o r g a n i z a t i o n o f t h i s t h e s i s i s a s f o l l o w s : I n t h e s e c o n d c h a p t e r a l i t e r a t u r e s u r v e y o n t h e d i s c o v e r y a n d p r o p e r t i e s o f t h e e n z y m e g l u c o s e i s o m e r a s e i s p r e s e n t e d . C h a p t e r 3 t r e a t s i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e g e n e r a l a s p e c t s o f t h e i m m o b i l i z a -t i o n o f e n z y m e s a n d some f a c -t o r s -t h a -t i n f l u e n c e -t h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e -t o f r u c t o s e c a t a l y z e d b y i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e i n p a c k e d b e d r e a c t o r s . I n c h a p t e r 4 i t i s shown f r o m a c o m m e r c i a l p o i n t o f v i e w w h a t i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e i s a l l a b o u t . M a r k e t f i g u r e s a n d d i f f e r e n t t y p e s o f a p p l i -c a t i o n o f t h e f r u -c t o s e -c o n t a i n i n g -c o r n s y r u p s , a s w e l l a s f u t u r e e x p e -c t a t i o n s a r e g i v e n . C h a p t e r 5 t r e a t s t h e m e t h o d o l o g i c a l a s p e c t s o f t h e e x p e r i m e n t a l w o r k . I n c h a p t e r 6 t h e s t r a t e g y o u t l i n e d i n F i g . 1.2 i s a p p l i e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a p r o d u c t i v i t y m o d e l f o r M a x a z y m e GI Immob. r e g i s t e r e d t r a d e m a r k o f G i s t - B r o c a d e s N.V. 5

I n c h a p t e r 7 t h e e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l r e g a r d i n g t e m p e r a t u r e a n d i m m o b i l i z e d e n z y m e p a r t i c l e s i z e d e p e n d e n c e o f p r o d u c t i v i t y a n d s t a b i l i t y a r e i n t e r p r e t e d i n t e r m s o f t h e m o d e l d e v e l o p e d i n c h a p t e r 6. I n c h a p t e r 8 a p r o d u c t i v i t y q u i c k t e s t i s d e v e l o p e d u s i n g t h e m a t e r i a l p r e s e n -t e d i n c h a p -t e r s 6 a n d 7. I n c h a p t e r 9 p r e s s u r e d r o p c h a r a c t e r i s t i c s o f i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e i n p a c k e d b e d r e a c t o r s a r e s t u d i e d a n d t h e c o n s e q u e n c e s f o r i n d u s t r i a l a p p l i c a -t i o n a r e e v a l u a -t e d .

Physics Biochemistry, Microbiology, Chemistry

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(0 thermodynamics of irreversible processes - conservation of matter, energy momentum - generalized transport dynamics balance equations accumulation = conversion + transport residence time &

phase transfer models

empirical transport dynamics reactor type stability productivity & selectivity

micro - kinetic models

mathematical models of macro - kinetics bioreactor and process design optimization equilibrium thermodynamics stoicheiometry of bioreactions (conservation of elements) mechanism of kinetic behaviour of organism, organelles, enzymes scale up stationary behaviour automation

I n c h a p t e r 10 t h e m e t h o d o l o g y d e v e l o p e d f o r g l u c o s e i s o m e r a s e i s a p p l i e d t o a p r e l i m i n a r y s t u d y o f t h e e n z y m e a m y l o g l u c o s i d a s e . S p e c i a l r e f e r e n c e i s made t o t h e r e l a t i o n b e t w e e n t h e k i n e t i c a n d t h e r m o d y n a m i c c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e e n z y m e - c a t a l y z e d r e a c t i o n a n d i t s c o n s e q u e n c e s f o r a p p l y i n g t h e e n z y m e i n t h e i m m o b i l i z e d f o r m . F i n a l l y , c h a p t e r 1 1 , p r e s e n t s g e n e r a l c o n c l u s i o n s a n d d i s c u s s i o n . 1.4 R e f e r e n c e s 1. U n d e r k o f l e r , C A . , D e n a u l t , L . J . a n d H o u , E . F . Die Stärke _17 ( 1 9 6 5 ) 1 7 9 - 1 8 4

2. B a r f o e d , H . c . Cereal Foods World 21_ ( 1 9 7 6 ) 5 8 8 - 5 9 3 3. S o l o m o n , B. Adv. in Biochem. Engin, 10_ ( 1 9 7 8 ) 1 3 1 - 1 7 7 4. H e y n s , K. Die Starke 30_ (19 78) 3 4 5 - 3 5 1

5. W a l t o n , C . F . J r . International Critical Tables. E d . b y E.W. W a s h b u r n , M c G r a w - H i l l , New Y o r k J_ ( 1 9 2 6 ) 3 5 7

6. S h a l l e n b e r g e r , R.S. a n d A c r e e , T . E . Handbook of Sensory Physiology. E d . b y L.M. B e i d l e r , S p r i n g e r - V e r l a g , H e i d e l b e r g , 1 9 7 2

7. Glucose: Biologisch Scharnier - B r o c h u r e V o o r l i c h t i n g s d i e n s t v a n d e V e r e n i g d e N e d e r l a n d s e G l u c o s e f a b r i e k e n , 1 9 7 8

8. A s c h e n g r e e n , N.H., H e l w i i g N i e l s e n , B . , R o s e n d a l , P. a n d ( Z i s t e r g a a r d , J .

Die Stärke 31 ( 1 9 7 9 ) 6 4 - 6 6

9. 'Enzyme Nomenclature' p u b l i s h e d b y I U B . A c a d e m i c P r e s s , 1979 10. R o e l s , J . A . J. Chem. Tech. Biotechnol. 32 ( 1 9 8 2 ) 5 9 - 7 2 .

2. LITERATURE SURVEY ON T H E ENZYME

G L U C O S E ISOMERASE

2.1 S o u r c e s a n d P r o p e r t i e s

2.1.1 The Isomerization Reaction

T h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o f r u c t o s e i s o n e o f a g r o u p o f r e a c t i o n s c o l l e c t i v e l y k n o w n a s t h e L o b r e y d e B r u y n - A l b e r d a v a n E k e n s t e i n t r a n s f o r m a t i o n 1 S u c h r e a c t i o n s , s e e F i g . 2 . 1 , a r e f a v o u r e d b y a l k a l i n e c o n d i t i o n s a n d h i g h t e m p e r a t u r e s . C I H-C-OH H O - C - H +0H-H-C-OH I H-C-OH I CHjOH D-glucose H OH N / C

KP

c I H O - C - H C-OH I H O - C - H +OH' H O - C - H H-C-OH H-C-OH I CH,OH ene-diol 1,2 H-C-OH I H - C - O H I CH,OH D-mannose glucose isomerase H O - C - H +OH" H—C-OH I H - C - O H CHsOH D-fructose C H . O H I C-OH HO-C I H - C - O H I H - C - O H I CHjOH ene-diol 2,3 +0H~ CH,OH I C = 0 I H - C - O H I H - C - O H I H - C - O H I CH2OH D-psicose F i g . 2.1 I s o m e r i z a t i o n s o f g l u c o s e a n d f r u c t o s e

T h e a l k a l i n e i s o m e r i z a t i o n o f g l u c o s e h a s b e e n s t u d i e d i n some d e t a i l a s a ( 2 - 7 ) p o s s i b l e m e a n s o f p r o d u c i n g f r u c t o s e c o m m e r c i a l l y b y v a r i o u s a u t h o r s H o w e v e r , l a c k o f s e l e c t i v i t y o f t h e a l k a l i n e i s o m e r i z a t i o n a l l o w s t h e p r o d u c t i o n o f n o n m e t a b o l i z a b l e m a t e r i a l s s u c h a s p s i c o s e ( F i g . 2.1) a n d o b j e c t i o n -( 8 ) a b l e , c o l o u r e d m a t e r i a l s w h i c h a r e c o s t l y t o r e m o v e C o n s e q u e n t l y , c h e m i c a l i s o m e r i z a t i o n o f g l u c o s e h a s n o t b e e n e m p l o y e d commer-c i a l l y , b u t , a s w i l l b e s h o w n i n t h i s t h e s i s , t h e e n z y m a t i commer-c i s o m e r i z a t i o n o f g l u c o s e t o f r u c t o s e h a s c o n q u e r e d t h e s w e e t e n e r s ' w o r l d '9'1 0' ,

2.1.2 Discovery of the Enzyme Glucose Isomerase (Xylose Isomerase)

G l u c o s e i s o m e r a s e t e c h n o l o g y b e g a n w i t h t h e d i s c o v e r y o f R i c h a r d 0 . M a r s h a l l i n t h e m i d 1 9 5 0 ' s t h a t x y l o s e i s o m e r a s e f r o m Pseudomonas hydrophila c o u l d i s o -m e r i z e D - g l u c o s e t o D - f r u c t o s e 1 1 . T h i s d i s c o v e r y was q u i t e a n o v e l t y b e c a u s e t h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o f r u c -t o s e r e q u i r e d -t h e i s o m e r i z a -t i o n o f -t h e p h o s p h o r y l a -t e d s u g a r by -t h e enzyme g l u c o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e ( E . C . 5 . 3 . 1 . 9 ; D g l u c o s e 6 p h o s p h a t e k e t o l i s o m e -r a s e ) i n t h e m a j o -r i t y o f o -r g a n i s m s i n v e s t i g a t e d . The a f f i n i t y o f t h e enzyme f o r g l u c o s e was a b o u t 170 t i m e s s m a l l e r t h a n t h a t f o r x y l o s e b u t i t was s u f -f i c i e n t -f o r t h e enzyme t o be c o m m e r c i a l l y a t t r a c t i v e . ( 1 2 ) A p a t e n t b a s e d on t h i s w o r k was g r a n t e d i n 1960 . T h i s p a t e n t was l a t e r f o u n d t o b e i n v a l i d as a r e s u l t o f c i v i l a c t i o n s u i t b e t w e e n CPC I n t e r n a t i o n a l ( 1 3 ) I n c . and S t a n d a r d B r a n d s I n c . i n 1975 . W i t h t h e d e m i s e o f t h i s p a t e n t , t h e r e was no b a s i c c o v e r a g e f o r i s o m e r i z i n g g l u c o s e t o f r u c t o s e by e n z y m a t i c means, and enzyme m a n u f a c t u r e r s and p r o d u c e r s o f f r u c t o s e s y r u p s were a b l e t o d e v e l o p a l t e r n a t i v e methods f o r t h e p r o d u c t i o n and t h e u s e o f g l u c o s e i s o m e -r a s e . M a r s h a l l ' s work was n o t a c t i v e l y p u r s u e d i n t h e l a t e 1 9 5 0 ' s b e c a u s e t h e o r g a -n i s m a -n d p r o c e s s i -n g c o -n d i t i o -n s r e q u i r e d w e r e -n o t s u i t a b l e f o r c o m m e r c i a l u s e . F o r t h e n e x t decade w o r k was a p p a r e n t l y l a r g e l y c o n f i n e d t o J a p a n . By 1965 t h e r e w e r e i n d i c a t i o n s t h a t J a p a n e s e r e s e a r c h e r s s u c h as T s u m u r a , S a t o and T a k a s a k i h a d f o u n d a s u i t a b l e o r g a n i s m and enzyme s y s t e m f o r p o s s i b l e use i n a c o m m e r c i a l p r o c e s s t o i s o m e r i z e g l u c o s e t o f r u c t o s e :^ '1" . C l i n t o n C o m P r o c e s s i n g Company, a D i v i s i o n o f S t a n d a r d B r a n d s I n c . , r e c o g n i z e d t h e c o m m e r c i a l s i g n i f i c a n c e o f t h e J a p a n e s e S t r e p t o m y c e s s t r a i n f o r p r o -d u c i n g t h e enzyme g l u c o s e i s o m e r a s e a n -d e n t e r e -d i n t o an a g r e e m e n t w i t h t h e J a p a n e s e g o v e r n m e n t i n 1966 t o d e v e l o p t h i s t e c h n o l o g y c o m m e r c i a l l y i n t h e U n i t e d S t a t e s . 10

T h e f i r s t c o m m e r c i a l s h i p m e n t o f e n z y m a t i c a l l y p r o d u c e d f r u c t o s e c o r n s y r u p i n t h e U n i t e d S t a t e s was made b y C l i n t o n C o r n P r o c e s s i n g C o m p a n y e a r l y i n 1 9 6 7 . B u t b e f o r e m o r e a t t e n t i o n w i l l b e p a i d t o t h e l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n o f f r u c -t o s e c o n -t a i n i n g s y r u p s a l i -t e r a -t u r e r e v i e w o n -t h e d i f f e r e n -t -t y p e s o f g l u c o s e i s o m e r a s e w i l l b e p r e s e n t e d .

2.1.3 Different Types of Glucose Isomerase

H i s t o r i c a l l y , f o u r d i f f e r e n t e n z y m e s h a v e b e e n n a m e d g l u c o s e i s o m e r a s e . T h e f i r s t r e p o r t o f a g l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y a p p e a r e d i n a n a r t i c l e b y

M a r s h a l l a n d K o o i s h o w i n g t h a t D - x y l o s e i s o m e r a s e f r o m P. hydrophila, c o n t r a r y t o p r e v i o u s r e p o r t s , c o u l d c o n v e r t g l u c o s e t o f r u c t o s e . X y l o s e i s o -m e r a s e , a r e l a t i v e l y new e n z y -m e a t t h a t t i -m e , w a s s h o w n t o b e p r e s e n t i n t h e e x t r a c t s o f P. hydrophila '16,17'j Lactobacillus pentosus '1 8' a n d Pasteurella

( 1 9 ) pestis . M a r s h a l l a n d K o o i f u r t h e r p o i n t e d o u t t h a t t h e p r e s e n c e o f a r s e n a t e i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e s s e n t i a l f o r o b t a i n i n g a p r o p e r c o n -v e r s i o n . T h i s f a c t , a n d t h e f a c t t h a t t h e f o r m a t i o n o f x y l o s e i s o m e r a s e was a b s o l u t e l y d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f x y l o s e i n t h e g r o w t h m e d i u m m e a n t t h a t M a r s h a l l a n d K o o i1s e n z y m e c o u l d n o t b e e x p l o i t e d c o m m e r c i a l l y . T h e same w a s t r u e o f t h e n e x t f e w e n z y m e s t o b e d i s c o v e r e d . T s u m u r a a n d S a t o '20'21' demon-s t r a t e d t h a t e x t r a c t demon-s o f t h e c e l l demon-s o f t h e demon-s o i l b a c t e r i u m Aerobacter cloacae g r o w n i n a s y n t h e t i c m e d i u m c o n t a i n i n g x y l o s e , c o n t a i n e d a n e n z y m e w i t h p r o -p e r t i e s s i m i l a r t o t h o s e o f t h e P. hydro-phila e n z y m e . ( 2 2 ) N a t a k e a n d Y o s h i m u r a r e p o r t e d t h e e x i s t e n c e o f a s e c o n d g l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y w h i c h d i d n o t h a v e a n a s s o c i a t e d x y l o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y , w h e n c e l l s o f Aerobacter aerogenes, s t r a i n HN-56 w e r e g r o w n i n m e d i a c o n t a i n i n g e i t h e r m a n n o s e o r m a n n i t o l , t h e l a t t e r b e i n g m o s t e f f e c t i v e . I n c a s e t h i s o r g a n i s m w a s c u l t u r e d i n t h e p r e s e n c e o f x y l o s e b o t h g l u c o s e a n d x y l o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y was o b t a i n e d . S i m i l a r p r o p e r t i e s w e r e o b s e r v e d i n c a s e Escherichia freundii HN-70 w a s g r o w n o n m e d i a c o n t a i n i n g e i t h e r m a n n i t o l o r m a n n o s e . B e c a u s e o f t h e f a c t t h a t a s u s p e n s i o n o f w a s h e d c e l l s o b t a i n e d f r o m a f e r m e n t a t i o n w i t h o u t x y l o s e d i d n o t show x y l o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y t h e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t t h i s g l u c o s e i s o m e r a s e was n o t a x y l o s e i s o m e r a s e . B o t h e n z y m e s r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f a r s e n a t e f o r f r u c t o s e a c c u m u l a t i o n . N e x t , N a t a k e a n d Y o s h i m u r a '2 3' t r a n s f e r r e d t h e i r a t t e n t i o n t o Escherichia intermedia H N - 5 0 0 , w h i c h p r o d u c e d g l u c o s e i s o m e r a s e w h e n g r o w n o n a v e r y w i d e r a n g e o f c a r b o n s o u r c e s . 11

H o w e v e r , x y l o s e i s o m e r i z i n g a c t i v i t y w a s o n l y d e t e c t a b l e i n c a s e x y l o s e w a s u s e d i n t h e g r o w t h m e d i a . O n c e a g a i n i t was e s s e n t i a l t o i n c l u d e a r s e n a t e i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e i f f r u c t o s e was t o b e a c c u m u l a t e d . T h e y s h o w e d t h a t a r s e n a t e w a s e s s e n t i a l f o r t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e i t s e l f a n d d i d n o t a c t b y e i t h e r i n h i b i t i n g r e a c t i o n s w h i c h c o m p e t e w i t h g l u c o s e i s o m e r a s e f o r g l u -c o s e o r m e t a b o l i z e f r u -c t o s e a s i t was f o r m e d '2 1* . • i • i • ( 2 5 ) A f t e r p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e f r o m Escherichia intermedia HN-500 N a t a k e r e v e a l e d t h a t t h e e n z y m e c o u l d i s o m e r i z e g l u c o s e 6 p h o s p h a t e t o f r u c t o s e 6 -p h o s -p h a t e i n the a b s e n c e o f a r s e n a t e . T h e e n z y m e was -p r o b a b l y i d e n t i c a l w i t h g l u c o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e . < 2 G ) F i n a l l y , N a t a k e s h o w e d t h a t t h e r a t i o o f g l u c o s e 6 p h o s p h a t e i s o m e r i z a t i o n t o a r s e n a t e d e p e n d e n t g l u c o s e i s o m e r i z a t i o n r e m a i n e d c o n s t a n t a s t h e e n -zyme was p u r i f i e d . B y k i n e t i c e x p e r i m e n t s i t w a s s h o w n t h a t a g l u c o s e - a r s e n a t e c o m p l e x was f o r m e d , a n d t h i s c o m p l e x w a s i s o m e r i z e d . I t w a s c o n c l u d e d t h a t t h e a r s e n a t e i n d e p e n d e n t i s o m e r i z a t i o n o f g l u c o s e 6 p h o s p h a t e a n d t h e a r s e n a t e -r e q u i -r i n g i s o m e -r i z a t i o n o f g l u c o s e w a s c a t a l y z e d b y t h e same e n z y m e . A t h i r d t y p e o f e n z y m a t i c a c t i v i t y w h i c h c o u l d b e a p p l i e d t o t h e i s o m e r i z a t i o n o f g l u c o s e was d e s c r i b e d b y Y a m a n a k a w h e n h e d i s c o v e r e d t h a t h e t e r o l a c t i c a c i d b a c t e r i a c o u l d p r o d u c e g l u c o s e i s o m e r a s e . He h a d b u i l t up c o n s i d e r a b l e e x p e r -t i s e i n -t h e s -t u d y o f p e n -t o s e i s o m e r a s e s i n -t h e s e b a c -t e r i a w i -t h o u -t b e i n g a b l e t o d e t e c t a n y g l u c o s e - i s o m e r i z i n g a b i l i t y a s s o c i a t e d w i t h x y l o s e o r a r a b i n o s e ( 2 7 - 2 9 ) i s o m e r a s e I n l a t e r w o r k Y a m a n a k a '30'31' d e s c r i b e d t h a t Lactobacillus brevis p r o d u c e d h i g h e s t g l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y w h e n c o m p a r e d w i t h Lactobacillus

pentoace-ticus, L. fermenti, L. mannitopoeus, L. gayonii, L. lycopersici a n d

Leuconos-toa mesenteroides. T h e e n z y m e w a s c l e a r l y d i f f e r e n t f r o m t h e ' o t h e r g l u c o s e i s o m e r a s e s ' k n o w n a t t h a t t i m e a s i t d i d n o t r e q u i r e a r s e n a t e f o r a c t i v i t y a n d i t s a c t i v i t y w a s e n h a n c e d b y m a n g a n e s e a n d c o b a l t i o n s . A f t e r p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e u s i n g m a n g a n e s e c h l o r i d e , ammonium s u l p h a t e , h e a t t r e a t m e n t a n d D E A E - S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y t h e M i c h a e l i s - M e n t e n c o n s t a n t s ( K ) f o r g l u c o s e a n d x y l o s e w e r e d e t e r m i n e d a t 0.52 M a n d 1.3 . 10 ^ M r e s p e c t i v e l y a t t h e o p t i m u m pH f o r b o t h a c t i v i t i e s o f 6.0 - 7.0. I t i s n o t c l e a r how Y a m a n a k a m i s s e d g l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y i n h i s e a r l i e r w o r k b e c a u s e g l u c o s e w a s t e s t e d a s a s u b s t r a t e f o r x y l o s e i s o m e r a s e f r o m Lactobacillus brevis c e l l s g r o w n i n a m e d i u m c o n t a i n i n g x y l o s e i n c o n d i t i o n s ( 9 ) u s e d l a t e r t o p r o d u c e g l u c o s e i s o m e r a s e f r o m t h e same s p e c i e s 12

The x y l o s e i s o m e r a s e f r o m Lactobacillus brevis was p u r i f i e d a n d c r y s t a l -f a , ) l i z e d . T h e p u r e e n z y m e s h o w e d r i b o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y i n a d d i t i o n t o x y l o s e a n d g l u c o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y . A t s u b s t r a t e s a t u r a t i o n c o n c e n t r a t i o n s t h e m o l a r r a t i o o f a c t i v i t i e s w a s 100 : 108 : 16.5 r e s p e c t i v e l y f o r x y l o s e , g l u c o s e a n d r i b o s e . M a n g a n e s e i o n s w e r e e s s e n t i a l f o r x y l o s e i s o m e r a s e a c t i v i t y , a n d b o t h m a n g a -n e s e a -n d c o b a l t i o -n s w e r e i -n c l u d e d i -n t h e a s s a y m i x t u r e s f o r g l u c o s e a -n d r i b o s e i s o m e r a s e . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e e n z y m e w a s f o u n d t o b e 1 9 5 , 0 0 0 . B e c a u s e o f i t s l o w pH o p t i m u m '30'32' t h e e n z y m e was c o m m e r c i a l l y a t t r a c t i v e ( 3 3 ) b u t b e c a u s e o f l a c k o f s u f f i c i e n t t h e r m o s t a b i l i t y t h e g l u c o s e i s o m e r a s e d e r i v e d f r o m Lactobacillus brevis h a s n e v e r b e e n e m p l o y e d i n a n i n d u s t r i a l p r o c e s s . T h e f o u r t h a n d l a s t g r o u p o f g l u c o s e i s o m e r a s e s c o n c e r n s t h e t h e r m o s t a b l e e n -z y m e s , p r e p a r a t i o n s s h o w i n g c o n s i d e r a b l e a c t i v i t y a f t e r e . g . 10 m i n u t e s a t 80 9 0 ° C . The e n z y m e p r o d u c i n g m i c r o o r g a n i s m s b e l o n g t o t h e g e n e r a : S t r e p t o -m y c e s , A c t i n o -m y c e s a n d B a c i l l u s '3 I ('3 5' _ S t r e p t o m y c e s s p e c i e s h a v e b e e n m o s t e x t e n s i v e l y s t u d i e d a n d u s e d a s a s o u r c e o f t h e e n z y m e . T h e f i r s t o r g a n i s m d i s c o v e r e d i n t h i s g e n u s , t h a t was c a p a b l e o f p r o d u c i n g g l u c o s e i s o m e r a s e , was Streptomyces phaeochromogev.es s t r a i n

( 3 G ) SK . A f t e r p u r i f i c a t i o n i t t u r n e d o u t t h a t t h e e n z y m e i s o m e r i z e d o n l y g l u -c o s e a n d x y l o s e a n d r e q u i r e d m a g n e s i u m i o n s f o r maximum a -c t i v i t y , t h e K f o r m a g n e s i u m i o n s b e i n g 2 . 3 . 10 ^ M. C o b a l t i o n s a c t i v a t e d g l u c o s e i s o m e r a s e i n t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m i o n s a n d , a t c o n c e n t r a t i o n s o f 10 ^ M and h i g h e r , p r o t e c t e d t h e e n z y m e a g a i n s t h e a t d e n a t u r a t i o n s o t h a t o n l y v e r y l i t t l e a c t i -v i t y was l o s t d u r i n g 10 m i n u t e s a t 8 0 ° C . The t e m p e r a t u r e o p t i m u m was h i g h , and a t 60°C, r e l a t i v e l y l a r g e amounts o f f r u c t o s e c o u l d be p r o d u c e d . T h e s e c h a r a c t e r i s t i c s f a v o u r e d c o m m e r c i a l e x p l o i t a t i o n . H o w e v e r , t h e p H o p t i m u m w a s u n -d e s i r a b l y h i g h , pH 9 . 3 - 9 . 5 , s i n c e u n d e r s u c h a l k a l i n e c o n d i t i o n s , a p a r t f r o m t h e f o r m a t i o n o f c o l o u r e d b y - p r o d u c t s , a n o n - m e t a b o l i z a b l e s u g a r ( D - p s i c o s e ) ( B ) i s p r o d u c e d i n h o t g l u c o s e a n d f r u c t o s e s o l u t i o n s . T h e s e a r c h w a s t h e n o n ( 3 7 ) f o r e v e n m o r e a t t r a c t i v e s t r a i n s o f S t r e p t o m y c e s . T s u m u r a , H a g i a n d S a t o p e r s i s t e d w i t h S. phaeochromogen.es s t r a i n SK. T h e y s h o w e d t h a t i f c o b a l t i o n s a t 10 ^ M were i n c l u d e d i n de f e r m e n t a t i o n medium t h e pH r a n g e f o r enzyme a c t i v i t y w a s b r o a d e n e d s o t h a t t h e a c t i v i t y a t pH 7.5 was s i m i l a r t o t h a t a t pH 9 . 0 . S i n c e t h e n a t l e a s t 26 o t h e r s p e c i e s h a v e b e e n r e p o r t e d t o h a v e t h e c a p a b i l i t y o f p r o d u c i n g g l u c o s e i s o m e r a s e .

C o t t e r , L l o y d a n d H i n m a n 38 h a v e s h o w n Streptomyces aTbus Y T - 4 a n d Y T - 5 t o ( 3 9 ) b e e f f i c i e n t p r o d u c e r s o f t h e e n z y m e . S t a n d a r d B r a n d s I n c . p a t e n t e d t h e u s e o f S t r e p t o m y c e s s p e c i e s ATCC 2 1 1 7 5 a n d ATCC 2 1 1 7 6 w h i c h p r o d u c e g l u c o s e i s o m e r a s e w i t h p r o p e r t i e s s i m i l a r t o t h o s e o f t h e o t h e r S t r e p t o m y c e s s p e c i e s 'I*0' . s t r a i n ATCC 2 1 1 7 5 w a s i d e n t i f i e d b y D w o r s c h a c k a n d Lamm a s Streptomyces wedmorensis. T h i s w a s t h e s o u r c e o f g l u c o s e i s o m e r a s e o f w h i c h (1*2) S c h n y d e r r e p o r t e d t h e u s e f o r t h e p r o d u c t i o n o f 5 0 0 , 0 0 0 t o n s o f h i g h f r u c t o s e c o r n s y r u p b y 1 9 7 4 .

M e a n w h i l e , 5. Venezuelae ATCC 2 1 1 1 3 a n d S. olivochromogen.es ATCC 2 1 1 1 4 w e r e s t u d i e d b y J a p a n e s e w o r k e r s ''*3' . M i l e s L a b o r a t o r i e s I n c . p r o d u c e d g l u -c o s e i s o m e r a s e u s i n g S. oliva-ceus NRRL B - 3 5 8 8 . T h i s e n z y m e o p e r a t e d a t p H 8.5 a n d a t 6 0 - 7 0 ° C a n d r e q u i r e d b o t h m a g n e s i u m a n d c o b a l t i o n s . A m u t a n t o f t h i s s p e c i e s , NRRL B - 3 9 1 6 , i s t h e s o u r c e o f t h e e n z y m e u s e d o n a n i n d u s t r i a l s c a l e b y M i l e s - C a r g i l l . W e b e r ''*5' i s o l a t e d a s t r a i n o f a S. glauaesaens, E T H 2 2 7 9 4 , w h i c h i s d i s t i n g u i s h e d b y i t s a b i l i t y t o p r o d u c e c o m p a r a t i v e l y l a r g e a m o u n t s o f e x t r a c e l l u -l a r g -l u c o s e i s o m e r a s e . M o r e r e c e n t -l y , C P C I n t e r n a t i o n a -l I n c . '1*6 l*8' h a v e d e s c r i b e d t h e p r o d u c t i o n o f a s e r i e s o f m u t a n t s o f S. olivochromogenes ATCC 2 1 1 1 4 w h i c h a r e c a p a b l e o f p r o d u c i n g i n c r e a s e d y i e l d s o f g l u c o s e i s o m e -r a s e w h e n g -r o w n i n m e d i a c o n t a i n i n g n e i t h e -r x y l o s e n o -r c o b a l t i o n s . A m u t a n t o f t h i s s t r a i n w a s t h e e n z y m e s o u r c e u s e d i n t h e p r o d u c t i o n o f C o r n P r o d u c t ' s h i g h f r u c t o s e c o r n s y r u p (' i n v e r t o s e ') '1*9' . I n t h e s a m e p e r i o d A n h e u s e r B u s c h I n c . s t u d i e d v a r i o u s m i c r o - o r g a n i s m s a s s o u r c e s o f g l u c o s e i s o m e r a s e a n d p a t e n t e d t h e u s e o f t h e e n z y m e f r o m Aerobacter levanicum '5 0' . T h i s e n z y m e w a s p r o d u c e d o n l y i n c a s e t h e f e r m e n -t a -t i o n m e d i u m w a s b e -t w e e n 6.5 a n d 7.5 a n d -t h e -t e m p e r a -t u r e w a s m a i n -t a i n e d a -t o -4 50 - 60 C. C o b a l t a n d m a g n e s i u m i o n s w e r e b o t h u s e d a t 6 . 10 M. D e s p i t e t h e s e r a t h e r f a v o u r a b l e c h a r a c t e r i s t i c s a s f a r a s t h e c o n v e r s i o n r e a c t i o n i s c o n c e r n e d , A n h e u s e r B u s c h I n c . d i v e r t e d t h e i r a t t e n t i o n t o g l u c o s e i s o m e r a s e p r o d u c e d b y A c t i n o p l a n e s s p e c i e s . T h e s e s p e c i e s a r e c a p a b l e o f p r o d u c i n g t h e e n z y m e i n t h e a b s e n c e o f x y l o s e o r x y l a n '51'52' a n d i n m e d i a c o n t a i n i n g r e l a t i v e l y c h e a p s o u r c e s o f n i t r o g e n . A l l t h e A c t i n o p l a n e s s p e c i e s t e s t e d p r o d u c e d g l u c o s e i s o m e r a s e b u t Actinoplanes missouriensis N R K L - B - 3 3 4 2 w a s t h e b e s t . T h e p H o p t i m u m w a s 7.0. T h i s e n z y m e h a s b e e n d e s c r i b e d a s t h e m o s t t h e r m o s t a b l e o f a l l k n o w n g l u c o s e i s o m e r a s e s b e c a u s e i t r e t a i n e d a c t i v i t y a t 9 0 ° C , a l t h o u g h i n c u b a t i o n s l a s t e d f o r o n l y 25 m i n u t e s . 14

F o r h i g h e s t a c t i v i t y b o t h c o b a l t and magnesium i o n s , 3 . 10 and 3 . 10 M

r e s p e c t i v e l y , were r e q u i r e d . R i b o s e and x y l o s e were i s o m e r i z e d as w e l l b u t t o

a l o w e r e x t e n t t h a n g l u c o s e .

A r t h r o b a c t e r s p e c i e s , n o t a b l y NRRL-B-3724, 3725, 3726, 3727 and 3728 have been

s t u d i e d f o r g l u c o s e i s o m e r a s e p r o d u c t i o n '

5 3 , 5 l 4

' _ -phe l a s t t h r e e s t r a i n s

men-t i o n e d p r o d u c e d g l u c o s e i s o m e r a s e when c u l men-t u r e d i n men-t h e absence o f x y l o s e o r

x y l a n and gave y i e l d s o f enzyme s i m i l a r t o t h o s e p r o d u c e d by s t r a i n s B-3724

and 3725 c u l t u r e d i n media c o n t a i n i n g x y l o s e o r x y l a n . The pH optimum o f t h e

enzyme was 8.0 and t h e t e m p e r a t u r e range was 50 90°C. An i m p o r t a n t c h a r a c

-t e r i s -t i c i s -t h a -t -t h i s enzyme does n o -t r e g u i r e c o b a l -t i o n s f o r a c -t i v i -t y and

s t a b i l i t y .

The l a s t g l u c o s e i s o m e r a s e - p r o d u c i n g m i c r o - o r g a n i s m t h a t i s d i s c u s s e d i n t h i s

c h a p t e r i s Bacillus coagulans. Y o s h i m u r a , Danno and Natake '

5 5

' s c r e e n e d o v e r

300 m i c r o o r g a n i s m s on media c o n t a i n i n g x y l o s e a t 45°C. T h i s s c r e e n i n g r e

-s u l t e d i n t h e -s e l e c t i o n f o r e x t e n -s i v e -s t u d y o f a -s t r a i n (HN-68) o f Bacillu-s

coagulans. T h i s m i c r o - o r g a n i s m p r o d u c e d g l u c o s e i s o m e r a s e o n l y when c u l t u r e d

i n the p r e s e n c e o f x y l o s e . The y i e l d o f t h e enzyme was i m p r o v e d i n c a s e

manganese i o n s were added t o the growth medium. The p r o p e r t i e s o f t h e g l u c o s e i s o

-merase were e n c o u r a g i n g f o r f u r t h e r i n d u s t r i a l development: pH optimum was

7.0 and t h e optimum t e m p e r a t u r e f o r f r u c t o s e p r o d u c t i o n was 60°C. I n

promo-t i n g promo-t h e enzyme's a c promo-t i v i promo-t y c o b a l promo-t i o n s were f o u n d promo-t o be more e f f e c promo-t i v e promo-t h a n

magnesium i o n s . A f t e r p u r i f i c a t i o n '

5 6

' t h e optimum t e m p e r a t u r e h a d i n c r e a s e d

t o 75°C. The m o l e c u l a r w e i g h t , d e t e r m i n e d a f t e r c r y s t a l l i z a t i o n was 175,000

( s e d i m e n t a t i o n ) o r 160,000 ( g e l f i l t r a t i o n ) '

5 7

' .

The i s o e l e c t r i c p o i n t was e s t i m a t e d a t 4.9. L i k e t h e g l u c o s e i s o m e r a s e from

( 3 ? )

Lactobacillus brevis the enzyme r e q u i r e d c o b a l t i o n s t o i s o m e r i z e g l u c o s e

(5 e)

and r i b o s e b u t manganese i o n s t o i s o m e r i z e x y l o s e . The t h e r m o s t a b i l i t y

o f t h e g l u c o s e i s o m e r a s e d e r i v e d from Bacillus coagulans was as good as t h a t

o f the enzyme from Streptomyces albus '"*

0

' b u t t h e enzyme was l e s s s t a b l e a t

h i g h pH v a l u e s . A l l t h r e e i s o m e r a s e a c t i v i t i e s were c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t e d

by x y l i t o l , s o r b i t o l , m a n n i t o l and T r i s b u f f e r w h i c h may v e r y w e l l i m p l y t h a t

g l u c o s e , x y l o s e and r i b o s e a r e a l l i s o m e r i z e d a t t h e same a c t i v e c e n t r e o f

t h e enzyme. Danno '

5 9

' s t u d i e d t h e r o l e o f t h e m e t a l i o n s i n t h e i s o m e r i z i n g

r e a c t i o n i n more d e t a i l . He c o n c l u d e d t h a t f o u r c o b a l t i o n s were bound p e r

enzyme m o l e c u l e and t h a t the a c t i v e form o f t h e enzyme was the one w h i c h

con-t a i n e d con-t h e c o b a l con-t ( o r manganese) i o n s . A c con-t i v a con-t i o n o f con-t h e enzyme by m e con-t a l i o n s

was h i g h e s t a t pH 6.0 and d e c r e a s e d r a p i d l y w i t h i n c r e a s i n g pH.

B e c a u s e o f t h e f a c t t h a t t h e b i n d i n g o f t h e s u b s t r a t e t o t h e e n z y m e w a s i n d e -p e n d e n t o f t h e -p r e s e n c e o f m e t a l i o n s i t s e e m e d u n l i k e l y t h a t t h e c o b a l t o r m a n g a n e s e i o n s c a t a l y z e d t h e r e a c t i o n . T h e c o b a l t a n d m a n g a n e s e i o n s w e r e b o u n d a t d i f f e r e n t s i t e s a n d D a n n o p r o p o s e d a s c h e m e f o r t h e r o l e s o f t h e t w o m e t a l i o n s w h i c h i s g i v e n i n F i g . 2 . 2 . F i g . 2 . 2 : P r o p o s e d m e c h a n i s m f o r t h e a c t i v a t i o n o f x y l o s e ( g l u c o s e ) i s o m e r a s e f r o m Bacillus coagulans b y c o b a l t a n d m a g n e s i u m i o n s (5 9' F i g . 2 . 2 . h a s b e e n c o n s t r u c t e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e a c t i v e c e n t r e o f t h e e n z y m e p r o t e i n h a s t h r e e b i n d i n g s i t e s : ( J ) , ( 5 ) a n d Q) f o r s u b s t r a t e , 2 + 2 + Co a n d Mn , r e s p e c t i v e l y . On s i t e (T) D - g l u c o s e , D - r i b o s e o r D - x y l o s e may b i n d t o t h e e n z y m e w i t h a f f i n i t y w h i c h i s n o t a f f e c t e d b y m e t a l i o n s .

When C o ^ b i n d s s i t e (2) t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e enzyme m o l e c u l e may o c c u r t o g i v e a n a c t i v e f o r m ( f o r m A) s h o w i n g h i g h a c t i v i t y f o r D g l u c o s e i s o -2+ m e r i z a t i o n . When Mn b i n d s t o s i t e (3) a n o t h e r a c t i v e f o r m ( f o r m B) h a v i n g h i g h a c t i v i t y f o r D - x y l o s e i s o m e r i z a t i o n i s i n d u c e d . Q u i t e o b v i o u s l y , t h e g l u c o s e i s o m e r a s e s h a v i n g f i n e t h e r m o s t a b i l i t y , p r o p e r p H o p t i m u m a n d n o n - e x c e s s i v e m e t a l i o n d e m a n d a r e the p r e p a r a t i o n s s u i t a b l e f o r c o m m e r c i a l e x p l o i t a t i o n , f o r i n d u s t r i a l u s e . 16

A s f a r a s now t w o e n z y m e m a n u f a c t u r e r s h a v e s u c c e e d e d i n p r o d u c i n g i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e a t a r e a l l y l a r g e s c a l e f o r t h e i s o m e r i z a t i o n o f s t a r c h b a s e d g l u c o s e s y r u p s :

NOVO I n d u s t r i A / S , D e n m a r k , u s i n g Bacillus coagulons

G i s t - B r o c a d e s N . v . , T h e N e t h e r l a n d s , u s i n g Actinoplanes missouriensis.

2.2 R e f e r e n c e s

1. S p e c k , J . C . J r . Adv. Carbohyd. Chem. J_3 ( 1 9 5 8 ) 6 3 - 1 0 3

2. S c a l l e t , B . L . a n d E h r e n t h a l , I . ( t o A n h e u s e r B u s c h I n c . ) 1 9 6 7 U.S. P a t e n t 3 , 3 0 5 , 3 9 5 3. S c a l l e t , B . L . a n d E h r e n t h a l , I . ( t o A n h e u s e r B u s c h I n c . ) 1 9 6 8 U.S. P a t e n t 3 , 3 8 3 , 2 4 5 4. T s a o , G.T., R e i d , T.H., H i l l e r , F . L . a n d H u b b a r d , L . H . 1 9 6 9 U.S. P a t e n t 3 , 4 3 2 , 3 4 5 5. B a r k e r , S.A., S o m e r s , P . J . a n d H a t t , B.W. ( t o B o e h r i n g e r M a n n h e i m GmbH) 1975 U.S. P a t e n t 3 , 8 7 5 , 1 4 0

6. B a r k e r , S.A. Process Biochem. }A_ ( 1 9 7 6 ) 2 0 - 2 5

7. V i e t h , W.R., V e n k a t a s u b r a m a n i a n , K., C o n s t a n t i n i d e s , A. a n d D a v i d s o n , B . ( 1 9 7 6 ) i n 'Applied Biochemistry Bioengineering' ( L . B . W i n g a r d , J r . ,

E. K a t c h a l s k i - K a t z i r a n d L . G o l d s t e i n e d s . ) V o l . I , p p . 2 2 2 - 2 3 2 , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k

8. M a c A l l i s t e r , R.V., L l o y d , N . E . , D w o r s c h a c k , R.G. a n d N e l s o n , W.J. ( t o S t a n d a r d B r a n d s I n c . ) 1 9 7 1 B r i t i s h P a t e n t 1 , 2 6 7 , 1 1 9

9. B u c k e , c . i n "Topics Enzyme Fermentation Biotechnology' 1 ( 1 9 7 7 ) 1 4 7 - 1 7 1 , E d . b y A. W i s e m a n , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k

10. A n t r i m , R . L . , C o l i l l a , W. a n d S c h n y d e r , B . J . , I n 'Appl. Biochem.

Bio-engin. ' 2_ ( 1 9 7 9 ) 9 7 - 1 5 4 . E d s . L . B . W i n g a r d J r . , E . K a t c h a l s k i - K a t z i r a n d

L. G o l d s t e i n , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k

1 1 . M a r s h a l l , R.O., K o o i , E.R. Science 1 2 5 ( 1 9 5 7 ) 6 4 8 - 6 4 9

12. M a r s h a l l , R.O., ( t o C o r n P r o d u c t s C o . ) 1 9 6 0 U.S. P a t e n t 2 , 9 5 0 , 2 2 8 1 3 . C P C I n t e r n a t i o n a l I n c . v s . S t a n d a r d B r a n d s I n c . 1 9 7 5 1 8 4 - U S P Q 3 3 2 14. T s u m u r a , N. a n d S a t o , T. ( 1 9 6 6 ) J a p a n e s e P a t e n t 1 7 6 4 0

15. T a k a s a k i , Y. Agric. Biol. Chem. 30 (1966) 1247-1253

16. H ö c h s t e r , R.M. a n d W a t s o n , R.W. J. Am. Chem. Soc. 75_ ( 1 9 5 3 ) 3 2 8 4 - 3 2 8 5 17. H ö c h s t e r , R.M. a n d W a t s o n , R.W. Archiv. Biochem. (Biophys.) 4 8 ( 1 9 5 4

1 2 0 - 1 2 9

18. M i t s u h a s h i , S. a n d L a m p e n , J . O . J. Biol. Chem. 2 0 4 ( 1 9 5 3 ) 1 0 1 1 - 1 0 1 4 19. S l e i n , M.W. J. Am. Chem. Soc. T7_ ( 1 9 5 5 ) 1 6 6 3 - 1 6 6 7

2 0 . T s u m u r a , N. , S a t o , T. Bull. Agric. Chem. Soc. Japan Z4 ( 1 9 6 0 ) 3 2 6 - 3 2 7 2 1 . T s u m u r a , N. S a t o , T. Agric. Biol. Chem. 2 5 ( 1 9 6 1 ) 6 1 6 - 6 1 9

2 2 . N a t a k e , M. , Y o s h i m u r a , S. Agric. Biol. Chem. 2 7 ( 1 9 6 3 ) 3 4 2 - 3 4 8 2 3 . N a t a k e , M. , Y o s h i m u r a , S. Agric. Biol. Chem. 28 (1964) 505-509 2 4 . N a t a k e , M. , Y o s h i m u r a , S. Agric. Biol. Chem. 2 8 ( 1 9 6 4 ) 5 1 0 - 5 1 6 2 5 . N a t a k e , M. Agric. Biol. Chem. 30 ( 1 9 6 6 ) 8 8 7 - 8 9 5

2 6 . N a t a k e , M. Agric. Biol. Chem. 32. ( 1 9 6 8 ) 3 0 3 - 3 1 2

2 7 . Y a m a n a k a , K. a n d H i g a s h i h a r a , T. Agric. Biol. Chem. 2 6 ( 1 9 6 2 ) 1 6 2 - 1 6 6 2 8 . Y a m a n a k a , K. Agric. Biol. Chem. 2_6 ( 1 9 6 2 ) 1 6 7 - 1 7 4

2 9 . Y a m a n a k a , K. Agric. Biol. Chem. _26 ( 1 9 6 2 ) 1 7 5 - 1 7 9 3 0 . Y a m a n a k a , K. Agric. Biol. Chem. 21_ ( 1 9 6 3 ) 2 6 5 - 2 7 0 3 1 . Y a m a n a k a , K. Agric. Biol. Chem. 2_7 ( 1 9 6 3 ) 2 7 1 - 2 7 8

32. Yamanaka, K. Bio ahem. Biophys. Acta 151 (1968) 6 7 0 - 6 8 0

33. K e n t , C A . a n d Emery, A.N. J. Appl. Chem. Biotechnol. 2_3_ (1973) 6 8 0 - 7 0 3 34. Chen, w.P. Process Biochem. ( J u n e / J u l y 1980) 30-35

35. C h e n , W.P. Process Biochem. ( A u g / S e p t 1980) 3 6 - 4 1

36. Tsumura, N. a n d S a t o , T. Agric. Biol. Chem. 29_ (1965) 1123-1128

37. Tsumura, N., H a g i , M. a n d S a t o , T. Agric. Biol. Chem. 31 (1967) 9 0 2 - 9 0 7 38. C o t t e r , W.P., L l o y d , N.E. a n d Hinman, C.W. ( t o S t a n d a r d ~ B r a n d s I n c . )

1971 U.S. P a t e n t 3 , 6 2 3 , 9 5 3

39. S t a n d a r d B r a n d s I n c . (1972) B r i t i s h P a t e n t 1 , 2 6 7 , 4 9 6

4 0 . T a k a s a k i , Y. , K o s u g i , Y. a n d K a n b a y a s h i , A. Agric. Biol. Chem. 33_ (1969) 1527-1534

40. T a k a s a k i , Y., K o s u g i , Y. a n d K a n b a y a s h i , A. Agric. Biol. Chem. 33. 4 1 . D w o r s c h a c k , R.G. a n d Lamm, W.R. ( t o S t a n d a r d B r a n d s I n c . ) 1972

B r i t i s h P a t e n t 1 , 2 7 4 , 6 4 0

42. S c h n y d e r , B . J . die Starke 26 (1974) 4 0 9 - 4 1 2

4 3 . I i s u k a , H., Ayukawa, Y., Suekane, N. a n d Kanno, M. ( t o CPC I n t e r n a t i o n a l I n c . ) 1972 B r i t i s h P a t e n t 1 , 2 7 3 , 0 0 3 44. M i l e s L a b o r a t o r i e s I n c . 1974 B r i t i s h P a t e n t 1 , 3 7 6 , 9 8 3 4 5 . Weber, P. ( t o L. G i v a u d a n ) 1 9 7 5 . B r i t i s h P a t e n t 1 , 4 1 0 , 5 7 9 46. CPC I n t e r n a t i o n a l I n c . 1975 B r i t i s h P a t e n t 1 , 4 1 1 , 7 6 3 47. CPC I n t e r n a t i o n a l I n c . 1975 B r i t i s h P a t e n t 1 , 4 1 1 , 7 6 4 48. CPC I n t e r n a t i o n a l I n c . 1975 B r i t i s h P a t e n t 1 , 4 1 1 , 7 6 5 49. G o d z i c k i , M.M. Food Eng. £ 7 (1975) E.F. 1 1 - 1 7

50. S h i e h , K.K., D o n n e l l y , B . J . a n d L e e , H.A. ( t o A n h e u s e r B u s c h I n c . ) 1974 U.S. P a t e n t 3 , 8 1 3 , 3 2 0 5 1 . S c a l l e t , B.L., S h i e h , K.K. , E h r e n t h a l , I . a n d S l a p s h a k , L . Die Stärke _26_ (1974) 4 0 5 - 4 0 8 52. A n h e u s e r B u s c h I n c . 1975 B r i t i s h P a t e n t 1 , 3 9 9 , 4 0 8 5 3 . L e e , C.K., H a y e s , L . E . a n d L o n g , M.E. 1972 ( t o R e y n o l d s T o b a c c o Corp.) U.S. P a t e n t 3 , 6 4 5 , 8 4 8 54. R . J . R e y n o l d s T o b a c c o C o r p . (1973) B r i t i s h P a t e n t 1 , 3 2 8 , 9 7 0

55. Y o s h i m u r a , S-, Danno, G. a n d N a t a k e , M. Agric. Biol. Chem. 3J3 (1966) 1015-1023

56. Danno, G. , Y o s h i m u r a , S. a n d N a t a k e , M. Agric. Biol. Chem. 3J_ (1967) 2 8 4 - 2 9 2

57. Danno, G. Agric. Biol. Chem. _34 (1970) 1795-1804 58. Danno, G. Agric. Biol. Chem. U (1970) 1 8 0 5 - 1 8 1 4 59. Danno, G. Agric. Biol. Chem. 3!3 (1971) 9 9 7 - 1 0 0 6

3. LITERATURE SURVEY ON IMMOBILIZED

ENZYMES WITH SPECIAL R E F E R E N C E TO

G L U C O S E ISOMERASE

3.1 I n t r o d u c t i o n F o r t h e p r o d u c t i o n o f h i g h f r u c t o s e c o r n s y r u p o n a n i n d u s t r i a l s c a l e t h e e n zyme g l u c o s e i s o m e r a s e h a s b e e n u s e d i n a n o n i m m o b i l i z e d f o r m i n b a t c h p r o -c e s s e s . S i n c e a l m o s t e v e r y k n o w n g l u c o s e i s o m e r a s e i s a n i n t r a c e l l u l a r o r m y c e l i u m a t t a c h e d e n z y m e , i n many c a s e s w h o l e c e l l s h a v e b e e n u s e d t o i s o m e r i z e g l u -( 1 - 3 ) c o s e A n h e u s e r B u s c h I n c . u s e d s p r a y - d r i e d c e l l s o f Aatinoplanes missouriensts i n a n i n d u s t r i a l p r o c e s s ' ' ; Lamm s h o w e d t h a t g l u c o s e i s o m e r a s e c a n e a s i l y be i m m o b i l i z e d w i t h i n t h e c e l l s o f S t r e p t o m y c e s s p e c i e s b y t r e a t m e n t w i t h a q u e o u s s o l u t i o n s o f i n o r g a n i c s a l t s . The d e v e l o p m e n t o f c o m m e r c i a l l y a t t r a c t i v e g l u c o s e i s o m e r a s e s a n d t h e d e v e l o p m e n t s i n i m m o b i l i z e d e n z y m e t e c h n o l o g y w e r e m e r e l y p a r a l l e l . A l l t h e i n g r e d i e n t s w e r e t h e r e : g l u c o s e i s o m e r a s e i s a r e l a t i v e l y e x p e n s i v e e n z y m e -t h e s u b s -t r a -t e i s a r e l a -t i v e l y s m a l l m o l e c u l e - -t h e c o n v e r s i o n r e a c -t i o n o f g l u c o s e t o f r u c t o s e i s a s i m p l e i s o m e r i z a t i o n : i t d o e s n o t c h a n g e t h e p H -t h e r e i s n o s u b s -t r a -t e i n h i b i -t i o n - -t h e r e a r e n o c o f a c -t o r s r e q u i r e d - i n s h o r -t : a l l p a r a m e t e r s l e a d t o t h e c o n t i n u o u s u s e o f i m m o b i l i z e d g l u c o s e i s o m e r a s e i n c o l u m n r e a c t o r s . I n t h e n e x t p a r a g r a p h s i m m o b i l i z a t i o n m e t h o d s w i l l b e d e s c r i b e d i n g e n e r a l , a n d s p e c i f i c a t t e n t i o n w i l l b e p a i d t o b o t h t h e i m m o b i l i z a t i o n o f g l u c o s e i s o -m e r a s e a n d t h e -m a n u f a c t u r e r s o f i -m -m o b i l i z e d g l u c o s e i s o -m e r a s e . 3.2 I m m o b i l i z a t i o n M e t h o d s I n t h e f i r s t p l a c e a t t e n t i o n s h o u l d b e p a i d t o t h e q u e s t i o n "Why i m m o b i l i z e e n z y m e s ? " Some a d v a n t a g e s o f i m m o b i l i z e d e n z y m e s o v e r f r e e e n z y m e s a r e o b v i o u s :