WIERA MICHALCEWICZ, AGNIESZKA ŁAWRYNOWICZ
WPŁYW OLEJU NAPĘDOWEGO NA AKTYWNOŚĆ
ENZYMATYCZNĄ NIEKTÓRYCH GRZYBÓW
GLEBOWYCH
TH E EFFEC T OF D IESEL OIL
O N EN ZYM A TIC A C T IV IT Y OF SO M E SO IL FU N G I
Abstract: The influence o f diesel fuel on amylolytic and lipolytic properties o f soil saprophytic fungi was determined under laboratory conditions. Achieved results point indicate the signifi cant effect o f the xenobiotic on amylolytic and lipolytic activities o f tested fungi m anifesting with the decrease or complete disappearance o f starch and fat decomposition zone along with the increase o f diesel fuel dose. Only in a case o f Trichothecium roseum and Trichocladium asperum species, the enlargement o f decomposition zone and the increase o f starch hydrolysis index occurred with the diesel fuel rate increase.
Słowa kluczowe: grzyby glebowe, aktywność enzym atyczna, olej napędowy.
Key words: soil fungi, enzymatic activity, diesel fuel.
WSTĘP
Dostający się do gleby olej napędowy oraz inne substancje ropopochodne m ogą w różny sposób i z różnym nasileniem wpływać na bytującą tam mikroflorę, w tym sapro fityczne grzyby glebowe [Hong-Gyu, Bartha 1990, Górska 1984, Nowak i in. 1998, Kerry 1990, Reese i in. 1955]. Wykonywane dotychczas badania potwierdzają nie tylko hamujące, ale również stymulujące oddziaływanie tych związków na wzrost i rozwój różnych gatunków grzybów glebowych [Michalcewicz 1998, Michalcewicz, Ławrynowicz 2003]. Niewiele, jak dotąd prac, dotyczy wpływu substancji ropo pochodnych na zmiany we właściwościach fizjologicznych drobnoustrojów, w tym hydrolitycznych, związanych między innymi z przemianami skrobi, tłuszczu, kazeiny itp. [Górska 1984, Smreczak i in. 1998]. Obecność związków biologicznie czynnych może spowodować zakłócenia w przebiegu tych bardzo ważnych, z punktu widzenia zachow ania rów now agi biologicznej gleby procesów przeprow adzanych przez mikroorganizmy.
292 W. Michalcewicz, A. Ławrynowicz
Mając powyższe na względzie wykonano niniejsze badania, których celem było określenie, zachodzących pod wpływem dodawanego do pożywki oleju napędowego do silników Diesla, zmian właściwości amylolitycznych i lipolitycznych kilku glebowych grzybów saprofitycznych.
MATERIAŁ I METODYKA BADAŃ
Obiektem badań były czyste szczepy 5 gatunków grzybów pospolicie występujących w glebie. Wybrano te gatunki, które charakteryzowały się największą aktywnością enzymatyczną w procesach rozkładu skrobi oraz tłuszczu. Były to następujące gatunki grzybów : Trichoderma viride Persoon ex. Fries, Trichothecium roseum Link,
Trichocladium asperum Harz, Alternaria alternata (Fries) i Aspergillus niger Van
Tieghem. Badania wpływu oleju napędowego na aktywność amylolitycznąi lipolityczną testowanych grzybów prowadzono w warunkach laboratoryjnych, na standardowych podłożach. Do oznaczania właściwości amylolitycznych zastosowano pożywkę z dodatkiem 1,5% skrobi według Cooney i Emersona [1964], a właściwości lipolityczne oznaczano na podłożu zawierającym trójbutyrynę, według Burbianki i in. [1977]. Do sterylnych podłoży dodawano olej napędowy w ilości: 0,1 ; 0,5 i 2,5% i miksowano aż do otrzymania trwałej emulsji. Podłoża bez dodatku oleju napędowego stanowiły kombinację kontrolną. Po rozlaniu pożywek do szalek i zastygnięciu szczepiono je inokulum badanych grzybów. Inokulum stanowił krążek grzybni o średnicy ok. 3 mm wraz z pożywką pobranej z 3-tygodniowych hodowli testowanych grzybów. Odczyty wzrostu liniowego grzybni oraz średnicy strefy hydrolizy skrobi i tłuszczu prowadzono do 10 dma hodowli. W wynikach uwzględniono końcową średnicę 10-dniowej grzybni oraz średnice stref: hydrolizy skrobi i tłuszczu. Na podstawie tych obserwacji, wzorując się na pracy Ho i Foster [1972] oraz Iversona i Millisa [1974] obliczono tzw. indeksy hydrolizy skrobi i tłuszczu, które można przyjąć za miarę aktywności amylolitycznej i lipolitycznej badanych grzybów.
W doświadczeniu stosowano olej napędowy do silników Diesla dostępny w stacjach CPN. Pod względem właściwości był on zbliżony do naturalnej ropy. Gęstość oleju wynosiła 0,841 g/cm3, a skład chemiczny przedstawiał się następująco: С - 86,88%, H -1 2 ,5 1 % , S - 0,5 do 1,2%.
Wyniki analizowano statystycznie przy zastosowaniu wieloczynnikowej analizy wariancji (ANOVA, P < 0,05).
WYNIKI I DYSKUSJA
Uzyskane wyniki badań przedstawiono w tabelach 1 i 2 oraz na rysunkach 1 i 2. A naliza uzyskanych w yników badań w skazuje na istotny w pływ (p<0,05) zastosowanego oleju napędowego w różnych stężeniach na wzrost grzybni badanych gatunków grzybów oraz na zmiany w szerokości stref rozkładu skrobi i trójbutyryny i indeksy hydrolizy tych związków (tab. 1).
TABELA 1 Analiza wariancji uzyskanych wyników - TABLE 1 Variance analyse of the results Czyn nik Fac tor Suma kwadra tów Sum of squares Stopnie swobo dy Degrees of freedom Średnia suma kwa dratów Mean sum of squares Suma kwadra tów błędu Sum of squares of error Stopnie swo body błędu Freedom degrees of error Średnia suma kwadra tów błędu Mean sum of squares of error Wartość F F value Wartość p P value 1 808,803 9 89,8670 1129,155 590 1,913822 46,95685 0,0 0 0 0 0 0* 2 1222,142 9 135,7935 3727,858 590 6,318404 21,49174 0,0 0 0 0 0 0* 3 66,388 9 7,3764 549,737 590 0,931758 7,91666 0,0 0 0 0 0 0*
Czynnik: 1 - gatunek grzyba, 2 - termin, 3 - dawka oleju, * - działanie czynnika istotne Factor: 1 - species of fungi, 2 - date, 3 - dose of diesel fuel, * - action of factor significant
Na podłożu Em ersona ze skrobią i olejem napędowym trzy spośród pięciu przetestowanych gatunków grzybów charakteryzowały się bardzo dobrym wzrostem grzybni. Były to następujące gatunki: Aspergillus niger, Alternaria alternata oraz
Trichoderma viride (tab. 1). Ponadto w miarę wzrostu stężenia oleju w podłożu średnice
kolonii grzybni tych szczepów zwiększały się istotnie. Nie zaobserwowano natomiast obecności stref hydrolizy skrobi wokół grzybni wymienionych gatunków. Wartości indeksu hydrolizy wynosiły od 0,07-0,15 w kombinacji kontrolnej do 0 w kombinacji z najwyższymi dawkami oleju (rys. 1). W przypadku dwóch pozostałych badanych gatunków grzybów: Trichothecium roseum i Trichocladium asperum zanotowano odmienną reakcję na wnoszony do podłoża olej napędowy. Obserwowano wprawdzie wzrost tych szczepów na podłożach zawierających olej we wszystkich dawkach, ale w miarę wzrostu stężenia oleju średnice kolonii ulegały zmniejszeniu. Wielkość grzybni tych gatunków, w 10 dniu pomiarów, na podłożu z najwyższym stężeniem oleju była od około 80 do 95% mniejsza od oznaczonych na pożywce bez oleju napędowego. Wokół grzybni tych gatunków zanotowano występowanie strefy rozkładu skrobi. Wielkość tej strefy stopniowo zwiększała się wraz ze wzrostem stężenia oleju w podłożu. Znalazło to swoje odzwierciedlenie w wartościach indeksu hydrolizy skrobi dla gatunków
Trichothecium roseum i Trichocladium asperum. Indeks wynosił odpowiednio od 0,13-
1,02 dla kontroli do 0,75-1,23 dla największego stężenia oleju (rys. 1).
Na podłożu z trójbutyryną i olejem napędowym intensywność wzrostu większości badanych grzybów zm niejszała się wraz ze wzrostem dawki oleju i pod koniec doświadczenia średnice grzybni były mniejsze, średnio o 30 do 50% w porównaniu z wielkością grzybni na podłożu bez oleju napędowego (tab. 2) Jedynie w przypadku gatunku Trichoderma viride zanotowano zwiększenie przyrostu liniowego grzybni na pożywce z olejem. Wniesienie oleju napędowego do podłoża w dawkach 0,5 i 2,5% spowodowało zahamowanie rozkładu trójbutyryny przez większość testowanych
2 94 W. Michalcewicz, A. Ławrynowicz
gg A spergillus niger g A llernaria a lternata щ T rich o d erm a virid e fg T rich o th eciu m roscum jg T richocladium asperum
RYSUNEK 1. Wpływ oleju napędowego na średni indeks hydrolizy skrobi badanych grzybów, dawki oleju: 1 - 0%, 2 - 0,1%, 3 - 0,5%, 4 - 2,5%
FIGURE 1. Effect of diesel fuel on average index of starch hydrolysis of investigated fungi, dose of fuel: 1 - 0%, 2 - 0,1 %, 3 - 0,5%, 4 - 2,5%
grzybów. Jedynie w przypadku Aspergillus niger zaobserwowano wystąpienie strefy hydrolizy tłuszczu w kombinacji z dawką oleju 0,5%. Natomiast wszystkie szczepy grzybów wykazywały dobrą aktywność lipolityczną w obecności oleju w stężeniu 0,1%, ale była ona w odniesieniu do większości gatunków grzybów, mniejsza w porównaniu z kontrolą. Średni indeks hydrolizy wahał się od 1,027 do 1,57 dla kombinacji kontrolnych do 1,09-1,15 dla kombinacji z substancją ropopochodną (rys. 2).
Analiza uzyskanych wyników badań wskazuje na zróżnicowaną reakcję badanych grzybów na wprowadzony do podłoża hodowlanego olej napędowy. Pomimo że wszystkie szczepy wykazywały dobry wzrost w obecności tej substancji zastosowanej we wszystkich stężeniach, to strefy rozkładu skrobi i trójbutyryny wystąpiły tylko w niektórych kombinacjach, z małymi dawkami oleju i w odniesieniu do kilku gatunków grzybów ( Trichothecium roseum, Aspergillus niger, Trichocladium asperum). Fakt ten może świadczyć o toksycznym oddziaływaniu substancji ropopochodnej na procesy fizjologiczne związane z właściwościami hydrolitycznymi charakteryzującymi badane gatunki grzybów. Zakłócenia w przebiegu niektórych procesów m etabolicznych stwierdzili również w swoich badaniach z różnymi związkami ropopochodnymi: Górska [1984], Smerczak i in. [1998], Zabłocka-Godlewska i in. [1997]. Obserwowana w niniejszym doświadczeniu duża aktywność enzymatyczna Trichothecium roseum i
Trichocladium aspenim na podłożach z większymi dawkami oleju może być wynikiem
reakcji stresowej tych drobnoustrojów, o czym pisali już wcześniej Lilly i Bamett [1959] w odniesieniu do różnych związków chemicznych.
TABELA 2. Wpływ oleju napędowego na wzrost grzybni i rozkład skrobi oraz trójbutyryny w 10 dniu inkubacji
TABLE 2. Effect of diesel fuel on growth of fungi and hydrolysis of starch and tributirin in 10 day of incubation Źródło węgla Source of carbon Gatunek grzyba Species of fungi 0% oleju of diesel fuel 0,1% oleju of diesel fuel 0,5% oleju of diesel fuel 2,5% oleju of diesel fuel Średn. kolonii Diame ter of colony Szer. strefy hydrol. Zone of hydro lysis Średn. kolonii Diame ter of colony Szer. strefy hydrol Zone of hydro lysis Średn. kolonii Diame ter of colony Szer. strefy hydroL Zone of hydro lysis Średn kolonii Diame ter of colony Szer. strefy hydrol. Zone of hydro lysis Skrobia Starch Aspergillus niger 28 2 24 0 36 0 38 0 Alternaria alternata 39 6 57 0 59 0 59 0 Trichoderma viride 87 6 90 0 90 0 90 0 Trichothe- cium roseum 47 6 27 8 17 9 1 2 9 Trichocla- dium asperum 57 1 42 1 19 3 13 3 Ttrój- buty-Aspergillus niger 35 2 34 5 33 1 28 0 ryna Tribu Alternaria alternata 30 1 25 1 2 2 0 27 0 tirin Trichoderma viride 73 2 90 1 90 0 90 0 Trichothe- cium roseum 3 4 42 2 33 0 18 0 Trichocla- dium asperum 33 2 2 2 1 32 0 18 0
Aktywność enzymatyczna mikroorganizmów wykazuje dużą wrażliwość na wszelkie stresy związane z zanieczyszczeniami przemysłowymi. Zmiany we właściwościach hydrolitycznych drobnoustrojów, w tym pospolitych grzybów saprofitycznych, zachodzące pod wpływem obecności w środowisku glebowym substancji biologicznie czynnych i przejawiające się bądź to w zmniejszeniu wydzielania różnych egzoenzymów, bądź ich całkowitym zaniku mogą w pierwszym rzędzie prowadzić do niekorzystnych modyfikacji w agrobiocenozie, których przejawem będzie zahamowania biodegradacji substancji organicznej, co jest faktem znanym i oczywistym. Ale aktywność metaboliczna drobnoustrojów glebowych i ich zdolności adaptacyjne do obecności substancji ropopochodnych w środowisku może w znacznym stopniu decydować również o stopniu
2 9 6 W. Michalcewicz, A. Ławrynowicz
RYSUNEK 2. Wpływ oleju napędowego na średni indeks hydrolizy trójbutyryny badanych grzybów, dawki oleju: 1 - 0%, 2 - 0,1%, 3 - 0,5%, 4 - 2,5%
FIGURE 2. Effect of diesel fuel on average index of tributirin hydrolysis of investigated fungi, dose of fuel: 1 - 0%, 2 - 0,1%, 3 - 0,5%, 4 - 2,5%
bioremediacji gleby [Benka-Coocer, Ekudayo 1997]. Zakłócenia w przebiegu tych procesów mogą niekorzystnie wpłynąć na rozkład związków ropopochodnych w glebie. W badaniach laboratoryjnych Mergesin i in. [1999] nad wykorzystaniem aktywności lipolitycznej drobnoustrojów jako wskaźnika biodegradacji oleju napędowego uzyskano wyniki wskazujące na ujem ną korelację między zawartością związków tłuszczowych a aktywnością lipaz i liczebnością drobnoustrojów rozkładających tłuszcz.
Bardzo częste w ostatnim czasie przypadki skażenia gleby związkami ropo pochodnymi i czynione próby oczyszczania jej przy pomocy metod biologicznych skłaniają do intensywniejszych prac nad badaniem reakcji mikroorganizmów na te substancje zwłaszcza wobec małej ilości danych dotyczących tych zagadnień. Niewiele informacji dotyczy zwłaszcza potencjalnej aktywności enzymatycznej mikroorganizmów, którą m ożna by przyjąć jako w skaźnik biodegradacji różnych substancji ropo pochodnych, w tym między innymi węglowodorów aromatycznych. W dalszych pracach należałoby skoncentrować się na zbadaniu zmian we właściwościach hydrolitycznych zachodzących pod wpływem różnych związków ropopochodnych nie tylko w odniesieniu do mykoflory, ale również bakterii i promieniowców glebowych.
WNIOSKI
1. Zastosowany olej napędowy wpłynął na zmiany wielkości kolonii grzybni testowa nych gatunków Aspergillus niger, Alternaria alternata i Trichoderma viride po wodując ich wzrost wraz ze zwiększeniem stężenia oleju.
2. Dodatek oleju napędowego do podłoża spowodował zmiany w aktywności amyloli- tycznej i lipolitycznej Aspergillus niger oraz Alternaria alternata przejawiające się zmniejszeniem bądź całkowitym zanikiem strefy rozkładu skrobi i tłuszczu wraz ze wzrostem dawki substancji olejowej.
3. Wzrost strefy rozkładu skrobi i zwiększenie aktywności amylolitycznej wraz ze zwięk szeniem dawki oleju napędowego zaobserwowano u szczepów: Trichothecium ro
seum oraz Trichocladium asperum. Nie odnotowano tego zjawiska w odniesieniu
do aktywności lipolitycznej tych gatunków grzybów.
LITERATURA
BURBIANKA M., PLISZKA A., JANCZURA E., TEISSEYRA T., ZALĘSKA H. 1971: M ikro biologia żywności, PZWL, Warszawa.
BENKA-COOCER M.O., EKUDAYO JA . 1997: Applicability o f evaluating the ability o f m icro
bes isolated from and spill site to degrade oil. Environmental Monitoring and Assessment,
45, 259-272.
COONEY D.G., EMERSON R. 1964: Thermophilic fungi. Freeman and Co. London.
GÓRSKA В. 1984: Wpływ węglowodorów aromatycznych na mikroorganizmy glebowe. Acta
Biol. Silesiana 15: 139-153.
HONG-GYU, BARTHA R. 1990: Effects o f jet fuel spills on the microbial com munity o f soil.
Appl. Environ. Microb. 56, 3: 646-651.
HO H. H., FOSTER B. 1972: Starch utilisation by Phytophthorassp. Mycophat. et My col. Appl.
4 6 ,4 :3 3 5 -3 3 9 .
IVERSON W.G., MILLIS N. F. 1974: A method for the detection o f starch hydrolysis by bacteria.
J. Appl. Bact. 37, 3: 443-446.
KERRY E. 1990: Microorganisms colonizing plants and soil subjected to different degrees o f human activity, including petroleum contamination in the Vestfald Hills and M acRoberston
Land Antractica. Polar Biology 10, 6: 423-430.
LILLY V. G., BARNETT H. L. 1959: Fizjologia grzybów. PWRiL, Warszawa.
MARGESIN R., ZIM M ERBAUER A., SCHINNER F. 1999: Soil lipase activity - a useful indica
tor o f oil biodégradation. Biotechnology Techniques13: 859-863.
M ICHALCEW ICZ W. 1998: Porównanie w warunkach in vitrowpływu oleju na wzrost niektó
rych grzybów glebowych. W: Mat. Ogólnopol. Symp. „Ekologiczne aspekty m ikrobiologii gle by”, Poznań-Kiekrz 4 -6. IX. 1998: 205-215.
M ICHALCEW ICZ W., ŁAWRYNOWICZ A. 2003: Wpływ oleju napędowego na wzrost i m orfo
logię niektórych grzybów glebowych. Rocz. Glebozn. 54, 1-2: 107-115.
REESE E., CRAVETZ H., MANDELS G. 1955: Activity o f fungi on oils. Farlovia 4: 409-421.
NOWAK A., HAWROT M., FOLTA K. 1998: Zmiany liczebności mikroorganizmów zdolnych do rozkładu substancji ropopochodnych w profilu glebowym i ich'w ym agania temperaturowe. W: Ogólnopolskie Sympozjum Naukowo-Techniczne. „Bioremediacja gruntów”, Wisła-Bu- kowa, 8-11.XII. 1998: 55-58.
2 9 8 W. Michalcewicz, A. Ławrynowicz
SM RECZAK B., MALISZEW SKA-KORDYBACH B. 1998: Wpływ WWA na aktywność dehy drogenaz w glebie zanieczyszczonej związkami cynku, ołowiu i kadmu. W: Ogólnopolskie Sympozjum Naukowo-Techniczne. „Bioremediacja gruntów”, Wisła-Bukowa, 8-11.XII. 1998: 55-58.
ZABŁOCKA-GODLEW SKA E., M ROZOW SKA J. 1997. W pływ WWA na aktywność mikro biologiczną gleby w zm odyfikowanych układach modelowych. W: Mater. 5 Ogólnopol. Symp. „ Biotechnologia środowiskowa”, Ustroń-Jaszowiec 10-12.12.1997: 61-72.
dr hab. inż. Wiera Michalcewicz
Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Środowiska Akademii Rolniczej 71-434 Szczecin, ul. Słowackiego 17
