Fabricage Levan

I ALe DEST1!.lATIE

MED~lr

j

Jfi

r

1

RIOCL i

L

~

AN BFREIOING. ?7 APR IL '/SG

J

, ..

/ '

/ '

J. vnE"}1SKEhCK v, EEEST, SCHAAL 1: 25

...

\

PROCESSCHN~A VAN DE BEREIDING VAN LEVAN

J. van Heemskerck van Beest

Oude Delft 37a

•

PROCESSCHEMA VAN DE BEREIDING V&~ LEVAN

Inleiding

1. Argumentatie:

Daar mijn belangstelling in het bizonder uitgaat naar de tech-nische uitvoering van microbiologische processen, heb ik aan U, Professor Dr. Ir. P.M. Heertjes, gevraagd om een scriptie te mogen maken over de technische bereiding van een microbiologisch proces.

Op mijn verzoek is toen als microbiologisch proces de technische bereiding van levanen gekozen, daar deze scriptie dan zou aanslui-ten op mijn afstudeerwerk, dat als titel draagt: "De verdeling van de moleculair gewichten van in cultures van micro-organismen ge -produceerde levanen". Zoals verderop in het verslag zal blijken, is het vooral de medische wereld, die grote belangstelling heeft voor hoogmoleculaire polymeren van zeer bepaald moleculair gewicht.

De technische bereiding van levanen als zodanig is een zeer veel omvattend begrip. Dat wil zeggen, de levanen die door

micro-orga-nismen gel)roduceerd worden, hebben zeer ui teenlopende moleculair gewichten. De winning van levan, zoals het door de micro-organismen geproduceerd wordt, heeft geen zin, daar er aan dit product geen behoefte is. Wordt er echter naar gestreefd, zowel bij de

produc-tie door bacteriën, als naderhand bij de winning, levanan te

ver-krijgen van een zeer bepaald moleculair gewicht, dan is er een doel voor het product. Het aldus ge'Nonnen levan zal dan gebruikt

kunnen worden ê:Lls "b.lood volume expander".

Voor de bereiding van levan als blood volume expander is dan ook dit processchema opgesteld.

2. Blood volume expander:

Onder een blood volume expander wordt verstaan een stof, die in staat is de taak van plasma over te ne~en. Hierbij wordt direct aangetekend, dat met plasma niet bedoeld wordt, het plasma zoals

het bij een be zond mens aanwezig is, doch het plasma, dat bij be

-paalde ziekteverschijnselen bij de mens geinjiceerd wordt. Dat de productie van "blood volume ex:panders" geen overbodige zaal~ is, heeft de volsenide oorzaken:

12 De hoeveelheid bloed~1&3ma die door donors geschonken wordt, is verre van voldoende om aan de vraag te voldoen. 22 Het vvinnen VEill. plasma moet snel ;;eschierlen.

3~ De houdbaarheid is niet groot.

4~ Het bloed kan een viru3 bev&tten, dat geelzucht

veroor-zaal~t. Door de incubatietijd van bO toF-1-50 cfa~en, o}?en-baart deze ziekte zich dan bij de p&tient, die het plas-ma heeft ontvanLen.

5~ Bij het o'pwer~-cen VEln het plasma worden meerdere IIpints" te samen opeewerkt en één route pint bederft dus de hele

•

•

Vand&&r dat er uitgebreide onderzoe~inoen zijn ve~Ticht, om voor het plasma een effectieve ve~vanC8r te vinden. ~et waren vooral de macromoleculen en colloïdale stoffen, waarop de 2andacht in hst bizonder cericht was. De eeTste succesvoll~ poging om een colloid te e~0ruiken, werd gedaan door Hogan 1) in 1915, die een

gelatine-sali~e n~].nssjne [ebruikte. Maar he~ gelijktijdige werk

van Hurwi tz 2} in 'San ]!"ranc1sco en J3ayliss 3) in Londen, met ara

-bisch gom, maakte dat dit product voor de komende 20 jaar g epre-fs:::--csrd ·\·~erd. i~.rabi.3ch ..:.,Otr. 'Ie::ru door de .2ran.3en en Enbelsen zeer

veel gebruikt in de laatste fasen van de eerste wereldoorlog. ~edurende \)18t bebin van de tweede ~8re~doorlog ontwikkelde de Duitsers 4 het polyvinylpyrrolidon (PTP) , een synthetisch water

-oplosb8.ar polymeer, voor het ,se'ur1...1.ik als "plasma expander" .

PVP kwam in Dui tslend "l.Ü t onder iio. nee.m van Kollidon en Peris±on,

in I tali ë (; .. l s Sr .. oto 8 an "'!n in ;~nGeland s.ls Flasmos an. In Amerika

is dit product ~efroduceerd door Je General Aniline und Film.

~e2.~wijl in :Oui tsland de E,andbcl:.t cericht bleef op h~:t "fYP, onder-zochten de Zweedse [Bleerden GrorriVflll en Inselmann ..J), G} dextran,

een polysacc}),-,lr.:'cle, det gej,JroQuceerd rvordt door enzymen van

Leu-conos~oc mesenteroîè.es, iç.dien s8.ccl-:s.rose sanwe<;>,ig :h.s. Ae.n hen w~rd 1n 1948 een patent 7) verstrekt.

Eeden ten da~e neemt dextran ~el ~e belancrijkste plaats in als pla.sma eX~8,nc1er, étlhoewel in Amerü;:a d.e r~ó.tional Besearch Council naast dextran ook het P- 20 Gelatine heeft aanb3volen.

DS8.r er, zoals verdero.p zal blijken, 2rinci1,ieel v\'einig verschil bestaat tussen de ~roductiewijze van dextran en l evan, is het goed om w~t)l~nger stil te staan bij het werk van Granwall en In~el­

man 1, b), sn om en~g~~~an0acht te besteden aan de technische pro-ductie van dextran ö, }';;) .'rl., I~\ .

Dextran is. ~en polymeer van <:lu?opyranose groepe?-,. dieO<' (1 .... 6) ?I.. óebonden Zl J n, m ct iA (1.:... 4) bltlChnè,en op de vertan:klnóspun ten 10l/.

Het percentageO<-1,b bindinGen is uiter~8te belangrijk, daar deze bindingen veel minder .3nel aanget8.st worden door de lichaamsenzy

-men dan de~-1, 4 bindingen. Eet is duidelijk, dat een stof, die snel dooY' de lichaamsenzymen i'Jordt afgebroken tot laag moleculaire verbindingen, geen goede plasma 9x~ander is.

De door de meeste fabriel\:en gebruikte stam is Leuconostoc mesen

-teroîdes NRRL. B- 512, die dextran produceert met ongeveer 95

%

rJ.... - 1, b bindigen. )

Gronwall en Ingelman ~ hebben zich allereerst bezig gehouden met de physische en chemische eigenschapllen van het natieve dextran; di t is het dextran zoals het door de "bacteriën wordt gef,roduceerd.

Vooral de zuivering van het ~e;roduceerde dextran, totdat dit stikstofvrij (eiwitten!) was, vormde een deel van hun onderzoek. Vervolgens werd het ald~$ zuiver verkregen dextran geinjiceerd bij honden en konijnen }. Hiertoe werd eerst een bepaalde hoe

-veelheid bloed afgetapt en deze werd vervangen door een overeen-komsti g volume 6

%

natieve dextran oplossing. Het bleek, dat het hoogmoleculaire dextran schadelijk was voor de lever en de nie

-ren van de proefdieren. Daarom werd het dextran g edeel telijk g e-hydrolyseeY'd, zodat dextranen met een moleculair gewicht van 50.000-100.000 werden verkre~en. Inspuiten van deze dextran op -lossing leverde geen schadelijke bevolgen voor de proefd:ia:'en op.

•

Het bleek, dat een oplossing van gehydrolyseerd dextran door in-traveneus toedienen een goede invloed had op proefdieren, bij wie een experimentele shock was verwekt. Voortgezette proeven hadden tot resultaat, dat in 1948 een p~tent werd aangevraagd voor de productie van clinisch dextran 7).

In Zweden werd door Pharmacia Ltd. als eerste toen clinisch dex-tran geproduceerd. In Amerika, Engeland, Zuid-Afrika en Nederland, voor zover mij bekend is, verrezen in de loop der tijd ook fa-brieken voor de productie van clinisch dextran. Principiele ver-schillen zijn er tussen deze fabrieken niet.

Het clinisch dextran wordt op de volgende wijze geproduceerd: Een gesteriliseerd medium, dat naast een bepaald percentage saccha-rose, zouten en vitaminen bevat, wordt geint met Leuconostoc me-senterotdes. Het essentiile ia nu, dat het dextran geproduceerd wordt in een groeiende cultuur, d.w.z. terwijl de bacteriin zich vermenigvuldigen, produceren de enzymen het dextran.

Nadat de productie beeindigd is, wordt het natieve dextran aller-eerst gescheiden van de bacteriin, opgeloste eiwitten, zouten, etc., door een precipitatie met alcohol. Hierdoor slaan baoteriän, eiwitten en dextran neer en blijven zouten en dergelijken in op-lossing. Door het neerslag weer te behandelen met water, gaat het dextran in oplossing en blijven de gedenatureerde eiwitten en baoteriin onopgelost. Dit prooes wordt nogmaals herhaald, wa~na

het weer opgeloste dextran door toevoegen van geconcentreerd zuur en temperatuursverhoging gehydrolyseerd wotdt. Na neutralisatie van het zuur wordt de oplossing gefiltreerd. Vervolgens wordt het gehydrolyseerde levan onderworpen aan een gefraotionneerde preci-pitatie, waardoor de clinisohe fraotie gesoheiden wOrdt van de te hoge moleculaire en de te lage mo~ulaire dextranen.

Bij de Amerikaanse processen wordt de clinische fractie nu door een ionenwisselaar gevoerd en vervolgens wordt de oplossing inge-dampt, om tenslotte in een spray-dryer gedroogd te worden.

De Europese fabrieken voeren de oplossing niet dOOr een ionen-wisselaar en drogen meestal in vacuum droogkasten.

Het dextran komt als een ó

%

oplossing in physiologisch zout (0.9

%

NaCl) in flessen van 500 ml. in de bandel. Doch deze be-werking behoort niet tot het eigenlijke processohema, daar dez. bewerking vaak in heel andere fabrieken gesohiedt.

) 111

Een principieel andere methode 9 J,-..:J die enige tij d geleden in

Amerika uitgebreid onderzocht is, laat eerst de baoteriän groeien in een medium, dat weinig of geen saoeharose bevat, maar gluoose als koolstof-bron heeft. Ba beeindiging van de groei, worden de bacteriän gescheiden van de cultuurvloeistof. Deze laatste bevat

L .. \ de enzymen, d ie verantwoordelijk zijn voor, de dextranproductie.

\1'I'V Aan de cultuurvloeistof wordt nu saccharose toegevoegd en de

dex-~( \' tranproductie kan beginnen. De winning en zuivering van het dex-tran vertoont geen prinoipiele versohillen.

, , r. t;;~,;< I _~ ~ ,....,

{; Ir!, ,'! l

•

3.

Afstudeerwerk:

Zoals reeds bij 1. vermeld is, sluit deze soriptie aan op het werd, dat ik het afgelopen jaar onder leiding van Professor T.O.

Wik~n verrioht heb. Het processchema is gebaseerd op de resultaten

die in het afgelopen jaar verkregen zijn, zodat het noodzajelijk is, 03 enkele resultaten van het afstudeerwerk te bespreken, al-vorens tot de beschrijving van het prooessohema over te gaan.

1\

Levan is een polymeer van fruoto-furanose groepen, die Ij (2~ 6) met

elkaar verbonden zijn. Op de vertakkingspunten treden ~(2·~ 1)

bin-dingen op. Onderstaande struotuur formule geeft schem~tisch een

deel van een levan molecuäl weer: ~~~.C'IH

.

o

.

J<\~ '?'C.~-o/

<?I·h/ OH t-I

~

o

J-{

tLt:c~l

oJ

ti - 0 /

~ fc~--c Jl.~J('C'\lcO/

2.. H ;-

1~

H

Levan en ook dextran zijn de belangrijkste homoglycans van bacte-rille oorsprong. Zij worden door bepaalde baoteriln in een saooha-rose.;.houdend medium geproduoeerd. Het is dan ook niet verwonder-lijk, dat er vroeger uit de suikerindustrie klachten kwamen over het optreden van slijmerig materiaal. Naar aanleiding vandèze klaohten zijn een groot aant)al onderzoekingen verricht, o.a. door

Beyerinok 11) en Perquin 12 in Nederland, enerzijds om de

struc-tuur van het slijmerig materiaal op te helderen, anderzijds om de bacteriän, die dit slijmerig materiaal veroorzaken, te identifi-oeren~ Door Fuohs 13) is aangetoond, dat vele baoteriän in staat zijn om in een saocharose-houdend medium levan te synthetiseren.

Een aàntal van de bacteriestammen, waarvan Fuche 13~ heeft

aange-toond, dat zij in staat zijn om levan te produce~en, zijn door mij

onderzooht t.a.v. de moleoulair gewichtsverdeling der geproduoeer-de levanan. Door geproduoeer-de levan producerengeproduoeer-de bacteriän ,,!orgeproduoeer-den levanèn van zeer uiteenlopende moleculair gewiohten geproduceerd, d.w.z.

op een willekeurig tijdstip zijn in een groeiende cultuur levanen aanwezig, die het moleculair gewicht-gebied van 180 (m.g. van saccharose) tot een paar millioen bestrijken.

In een standaardproef wordt nu als volgt gehandeld: Een saooharose-houdend medium wordt geänt met de te onderzoeken baoterie. Na b.v.

12 uur wordt begonnen met het steriel nemen van een monster.

Hier-na wordtt om de 2 uur een monster genomen. De monsters worden op

ie volgende wijze behandeld: Nadat eerst in een Homefcentrifuge de baoteriën zijn afgeoentrifugeerd, wordt de bovenstaande oplossing onderworpen aan een gefraotioneerde preoipitatie met alcohol. De-ze gefractioneerde preoipitatie berust op het feit, dat bij een

bepaald alooholperoentage (b.v. 60

%)

levanan neerslaan met een

moleoulair gewioht van 100.000 en hoger. Levanen met een

moleou-lair gewioht, dat lager is dan 100.000 blijven in oplossing. Aan

een monster waarvan de baoteriän dus afgeoentrifugeerd zijn, wordt

aloohol toegevoegd, totdat het alcohol peroentage 60

%

bedraagt.

Het ontstane neerslag wordt afgeoentrifugeerd,

3

x uitgewassen en

•

Dit is fraotie I. In de bovenstaande vloeistof van fraotie I. wordt het aloohol percentage opgevoerd tot

71.4

~. Het ontstane neerslag (fraotie II.) wordt afgecentrifugeerd, uitgewassen, ete. In de bovenstaande vloeistof van fraotie II. wordt het alcohol peroentage opgevoerd tot 77.8%. Het ontstane neerslag is fraotie lIl. en wordt op analoge wijze behandeld als fraotie I. en II. In de maatkolven wordt nu de hoeveelheid levan bepaald met behplp van de colorimetrisohe kleurreaotie op fructose volgens Roe

14>.

Alle gevonden waarden worden teruggerekend op 1 ml. oorspronkelijk medium en grafisch wordt het verloop van de diverse fracties als functie van de tijd in grafieken uitgezet.

Voor Pseudomonas aureofaoiens var.non-liquefaciens en voor Pseu-domonas carlophylli zijn hieronder de grafieken weergegeven:

ie

"'llwo...

/

trJ

8

t

1i

~

i

/-i.~J

It./

?~

'

e~)

eo,

"tfrll

~

lt

L .' _~

tf

₄

'"

.u

;10 ik, -:)-c ~'11

;0

- +U'1t:;,...v

Pseudomonas caryophylli is in het bezit v~ een levanase, een en-zym dat levan weer afbreekt. Door Fuchs 131 is een mogelijke ver-klaring gegeven woor het feit, dat de levanase pas na ongeveer 26 uur begint te werken, zodat de ourve van fractie II. een maximum vertoont. Bovenstaande waarnemingen zijn gevonden in een medium, dat 4 ~ saooharose bevatte.

Met behulp van de boven besohreven routine methode zijn nu twee soorten waarnemingen gedaan:

1. Van een aantal bacteriän werd de moleculair gewichtsverdeling der geproduoeerde leianen onderzocht in een

4

~ saooharose-houdend mEdum.

2. Bij een aantal bacteriän werd onderzocht wat de invloed op de moleculair gewiohtsverdeling was, indien de saccharose concentra-tie veranderd werd.

I

!

~

I

Het bleek, dat bij verhoging van de saooharose conoentratie een

\.'\:

~'lj verschuiving van de geprOduceerde levanen naar de laag moleculaire

~.' \:" kant optrad • . , I - '

, I' .'{

Met bovenstaande methode ia nu wel bekend, hoe de verdeling van de levanen over de diverse fraoties is, maar over de moleculair

ge-"

aan de winning van levan op een semi-technische schaal. Aan de fractionering van het geproduceerde levan en aan de zuivering van de diverse fracties werd de nodige aandacht besteed, zodat het nu mogelijk is om leven te maken van tamelijk homogeen mo-leculair gewicht, dat voor

98-99

~ uit fructose bestaat.

Met het aldus gewonnen levan kan nu een mar9culair gewichtsbe-paling worden uitgevoerd,

Een afgewogen hoeveelheid zuiver leven wordt opgelost in MeIll-vain's citraat-fosfaatbuffer pH

3.4

Gedurende 1 uur wordt bij'

600 _{C. gehydrolyseerd. Daarna wordt de oplossing geneutraliseerd.}

De aldus verkregen oplossing wordt nu onderworpen aan een ge-fractioneerde precipitatie, zoals reeda eerder werd besohreven, alleen met dit verschil, dat nu met veel kleinere stapjes het alooholgehalte wordt opgevoerd. Alle neerslagen worden opgelost in 50 ml. water en in deze oplossingen worden twee bepalingen gedaan:

1. 2.

De totale hoeveelh~id levan per ml. wordt bepaald met de methode van Roe

14).

Het aantal reducerende grapen per mI. wordt bepaald met de titratiemethode van Somogyi

15J.

Een levan molecuul, zoals het door de bacteri8n geproduoeerd wordt, vertoont geen reducerend vermogen, daar alle reducerende groepen gebonden zijn. Door de hydrolyse met zuur worden nu op willekeurige plaatsen levan moleculen doorbroken en komen re-duoerende groepen vrij.

Door de waarde, gevonden bij

1.,

te delen door die van 2. en de verkregen waarde te vermenigvuldigen met

0,9

x

180,

wordt

het gemidd~td moleculair gewicht van die fractie verkregen.

Dedonder 1b heeft de bovenbeschreven methode vergeleken met de moleculair gewichtsbepaling met behulp van de ultracentri-fuge en diffusie. Alle drie de methodes gaven gelijkluidende

~i;~o::!;~;mingen

en de resultaten van Dedonder 16)

samenv~t­

tend, kan worden gezegd:

Bij een alcoholpercentage van 60 ~ (fraotie I.) slaan levanen neer met een moleculair gewicht van 100.000 en hoger.

In fractie II. (ale. perc. van 60 ~ -

71.4

%)

komen levanen terecht met een moleculair gewicht van 100.000-30.000.

In fractie 111. (alc.perc. van 71.4 ~ - 77.8~) zitten de le-vanen met een moleculair gewicht van 30.000 - 4.000.

Doel van het prOduct:

In de inleiding is steeds over clinisoh dextran gesprOken, zonder over' het moleculair gewicht te spreken. Voorgesohreven wordt een gemiddeld moleculair gewicht van 75.000 ~ 25.000. Nu heb ik bij het opstellen van het prooessohema aangenomen,

dat levan met een gemiddeld moleoulair gewioht van 75.000 ~

25.000 eveneens het goede moleculair gewicht zou bezitten, om als blood volume expander te dienen.

Gezien hetgene, wat er over dextran en andere producten, die als plasma expander dienen, gezegd is, is het om de volgende redenen Koor een bedrijf interessant om na te gaan of het mogelijk 1s,

om leven als plasma expander te gebruiken en om daarna de pro-ductie ter hand te nemen:

1. Het grootste percentage van de levanen, geproduceerd door bacteriän (voor zover door mij onderzocht) hebben een

mole-culair gewicht, dat direct clinisch toegepast kan worden. Hierdoor behoeft de hydrolyse met zuur van de hoogmolecu-lairen, zoals bij dextran, niet toegepast te worden.

2. In medische kringen worden nog steeds onderzoekingen

ver-richt oV'er de carcinogene werking van dextran. Een pos~ tiet',

noch een negatief uitsluitsel is over dese 'onderzoekingen te geven.

3.

De productie van dextran moet steeds geschieden in licensie

van een Zweeds patent. Door de productie van levan, zou de-ze gebondenheid vervallen.

Er wordt hier echter duidelijk vooropgesteld, dat met het maken van dit prooessohema op de feiten vooruit gelopen wordt, daar

zonder meer aangenomen is, dat levan met een moleoulair gewioht

van 75.000 + 25.000 de taak van dextran kan overnemen.

Bij de dextranproductie is gesproken over de sne.lheid, waarmee

de (J.. (1~ ó)bindingen worden af~ebroken. En het is dus zeker nog geen vaststaaad feit, dat de . (2.;> 6) bindingen dezelfde

stand-vastigheid t.o.v. de lichaams nzymen vertonen als deo<' (1~ 6)

bindingen bij dextren. .

Uitgebreide proeven op dieren moeten allereerst verricht worden om het levan te testen en dan zal nog eerst bepaald moeten wor-den, of het toedienen van leven geen nadelige invloed heeft op de mens. Pas als deze proeven positief uitvallen, kan overge-gaan worden tot de productie van levan als "blood volum.e ex-pander".

Daar het onmogelijk is, om,als voorbereidende proeven voor het opstellen van een prooessohema voor de produotie van levan, te bepalen of het olinisoh verantwoordelijk ia, Om leven als blood volume expander toe te passen, is bij het opstellen van het

processchema aangenomen, dat het clinisch verantwoord is, om

leven van een moleculair gewicht van 75.000 + 25.000 in 6 ~

saline oplossing, aan patienten toe te dienen. Plaats en grootte van het bedrijf:

Wat betreft het produc~, is er geen gebondenheid am een plaats.

De aanvoer van stoffen zal geen grote problemen opleveren, daar de hoeveelheden, die aangevoerd moeten worden, niet extravagant

groot zijn. .

Wat de grootte van de productie betreft, zijn enige gegevens

be-sohikbaar over de hoeveelheden dextran, die in 1953 in Amerika

geproduceerd werden. De grootste fabriek produceert 1.000.000 eenheden per jaar, de kleinste 360.000 eenheden per jaar.

Een eenheid is 500 ml. van een 6

%

dextran oplossing.

Het processohema is opgesteld voor een produotie van 500.000 eenheden per jaar. Dit betekent, dat er in één jaar 15.000 kg. clinisoh leven geproduoeerd moet worden.

~ifl

r-f

;~\'

\

, ,

y

..

.y/

I •

1

Microbiologische aspecten van het bedrijf:

De keuze van de levan producerende bacterie is gevallen op Pseudomonas caryophylli, daar deze bacterie het theoretisch

ren-dement, berekent t.o.v. saccharose in een medium met 4 ~

saccha-rose, tot 85 ~ haalt. Alhoewel deze bacterie een levanase bezit,

is dit geen groot bezwaar, daar,door het nemen van monsters, de productie zeer gemakkelijk vervolgd kan worden.

Bij het opstellen van het processchema is er van uitgegaan, dat

het bedrijf continu 24 uur werkt. Het gedeelte van de fabriek,

waarin het geproduceerde levan gewonnen wordt, is in duplo uit-gevoerd, daar, gezien de eisen die aan het product gesteld wor-den, na iedere behandeling de apparatuur goed schoongemaakt moet

worden. Een cyclus is bepaald op 12 uur, zodat iedere 6 uur dan

een fermentor geledigd moet worden.

Uit de grafiek over de verdeling der levanen bij Ps. caryophylli

blijkt, dat na ongeveer 26 uur het maximum bereikt wordt. Hierin

kunnen echter best fluctuaties optreden. De fermentor moet ge-vuld worden en, na beeindiging van de groei afgelaten worden; na iedere groeiperiode moet de fermentor schoongemaakt en

geste-rilizeerd worden, zodat voor een totale cyclus

36

uur nodig is.

Daar er iedere 6 uur een fermentor afgelaten moet worden, zijn

er 6 fermentors nOdig.

Daar de productie op 15.000 kg. c]Disch leven per jaar gesteld

is, komt dit neer op ongeveer 46 kg. levan per 24 uur. In deze

24 uur worden 4 fermentors afgelaten, zodat iedere fermentor

11,5 kg. clinisch levan moet opbrengen.

Indien er met jonge cellen gewerkt wordt, mag op een totale

leven-productie van 18,5 kg per 1.000 1. gerekend worden,

ko-mend uit een medium, dat 4 ~ saccharose bevat. Na 26 uur, als

de cultuur wordt afgebroken is de,verdeling der levanen over de fracties I., 11., en 111. geliJk aan 1:65:1.

Echter kan fractie 11. niet in zijn geheel genomen worden, daar er dan te hoge en te lage moleculaire levanen bij de clinische

frac-tie terecht komen. Van fracfrac-tie 11. worden di~ levanen genomen,

die neerslaan bij een alcoholpercentage dat ligt tussen 61 en

68

~. Wordt een gelijkmatige verdeling van de levanen over de

gehele fractie 11. aangenomen, dan is van fractie 11. 7/11 deel

geschikt als clinisch levan. Zodat, indien een medium, groot 1.000 liter, geänt wordt met Ps. caryophylli, hieruit te winnen

is: ~x 7/11 x 18.5 kg.

=

11.5 kg. clinisch leven.

Beschrijving van het proces:

De eerste stap van het proces is de bereiding van het medium. In de slurry tank (1500 liter) wordt iedere 6 uur een medium ge-maakt door:

40

kg. saccharose 15 kg. pepton 5 kg. NaCI 1 kg. Na HPO op te lossen in 1000 2 4

liter leidingw~ter, onder voortdurend roeren en verwarmen tot

600 C. Nadat alles opgelost is, wordt de pH op 7.0-7.2 gebracht

door toevoegen van vast

KOH

en voortdurende controle, door het

nemen van monsters. - --~,

I • , \ L ' I-',. ', 1,1--' 'sJ rr '11· " f ,rJ ''-.' ~',

Met behulp van een tandradpompje wordt het medium naar een conti-nue sterilizator gepompt, waar in de eerste sectie het medium van bO tot 1420 C. verhit wordt en dus gesterilizeerd wordt. In de tweede sectie wordt het medium gekoeld tot een temperatuur van

300 _{C. Door hetzelfde tand~adpompje wordt het nu gesterilizeerde}

medium gepomptlïiir- a:ë 'ellttäiik'-en "cre fermentor. Van de 1000 1.

gaan er 50 liter naar de enttank en 950 liter naar de fermentor.

Het enten is een proces, dat in enkele stappen wordt uitgevoerd. In het laboratorium wordt eerst vanuit de schuine agarbuis

over-geänt in een kolf met 500 mI. medium. Na 24 uur wordt de 500 ml.

steriel overgeschonken in een kolf, die 5 liter medium bevat.

Door middel van steriele perslucht wordt na 24 uur deze 5 liter

overgeperst in de enttank. Na weer

24

uur groei kan nu de

in-houd van de enttank, door middel van steriele lucht, overgebla-zen worden in de fermentor.

Deze behandeling is noodzakelijk om verzekerd te zijn van een steviie ent, waardoor de productie van levan het hoogste rende-ment haalt.

Als de levanproduotie zijn maximum bereikt heeft, worqt de

cul-tuur afgebroken, door het culcul-tuur-medium

af

te laten met behulp

van de zwaartekracht in de precipitatietank. Onder voortdurend roeren wordt aan het medium alcohol toegevoegd tot het

alcohol-gehalte 75 ~ bedraagt. Nu slaan levan, baoteriän en grote

ei-wilmoleculen neer. Zouten, lagere eiwitten en dergelijken blij-ven in oplossing.

Het neergeslagen Ie van slaat neer als een stroperige massa en kan, daar de tank van onderen oonisoh toeloopt, afgetapt en afgelaten worden in de kleine oplostank, die zich onder de

preoipitatie-tank bevindt. De alcoholoplossing in de precipitatie~ •• -tank

wordt weggepompt naar de alcohol-destillatie afdeling.

In de oplostank wordt aan het leven ongeveer 370 liter pyrOiee~

vrij water toegevoegd, zodat een

5

%

oplossing ontstaat. Deze

oplossing wordt door middel van een tandradpomp weer terugge-pompt naar de precipitatietank, waar nogmaals het levan

gepre-oipiteerd wordt door toevoegen van 1500 liter alcohol.

Op dezelfde wijze wordt het leven weer gescheiden van de boven-staande alooholoplossing en afgelaten in de precipitatietank.

Weer wordt 370 liter pyrogeen-vrij water toegevoegd en bovendien

2 kg. diatomeänaarde.

Deze oplossing wordt nu via een persfilter gepompt naar de eerste fractioneertank. In de leiding naar deze tank is een volumemeter

opgenomen, zodat het volume kan worden afgelezen. In

aè

eerst&

-fractioneertank wordt nu zoveel aloohol toegevoegd, tot het

al-cohol percentage 61

%

bedraagt. Nu slaan de hoogmoleculaire

le-vanen neer; dit neerslag kan op analoge wijze afgetapt worden als bij de precipitatietank. Het wordt eohter afgevoerd naar het riool.

In de fractioneertank wordt onder roeren het alcohol percentage

op

68

%

gebraoht. De alinische fractie slaat nu neer en na

be-zinking wordt deze afgelaten in de fractioneertank No. 11. De vuile alcohol wordt naar de alooholdestillatie afdeling gepompt.

In de fractioneertank No. 11. wordt, nadat het leven opgelost

is tot een 5 ~ oplossing, dezelfde behandeling nogmaals herhaald.

Dus eerst alcohol percentaie op 61

%,

ontstane neerslag aflaten

in riool. Daarna alcohol peroentage op

68

%.

Het ontstane

neer-slag, afgelaten in de oplostank, en de vuile aloohol, wegpompen naar de alooholdestillatie afdeling.

~

~~\;t.ly:'

;.

~~

het clinisch

lev~I::

de oplostank wordt nu water toegevoegd

)ij \~I tot een.I0 o,t oplossing wordt verkregen. en daarna wordt I. 5 kg

f

diatomeenaarde toegevoegd,om de laatste verontreinigingen te absorberen.

Deze oplossing wordt door een persfilter in de voedingstank voor de spray-dryer gepompt.

In de lJpra.y.,dryer Wv~·u" het leve.n gedroogd met behulp van ::n:

steriele warme lucht van I40oC. .

Tenslotte wordt het gedroogde levan gescheiden van de lucht, door middel van twee cyclonen.

Onderaan de cyclonen kan het levan dan opgevangen worden in vaten, die na afsluiten voor transport gereed zijn.

De apparatuur.

Alle apparaten,leidingen en pompen zijn gemaakt van roestvrij staal.

Leidingen.

In verband met de hoge eisen die er aan het product gesteld wor-den, moeten alle leidingen gemakkelijk demonteerbaar zijn, om na iedere b~ schoongemaakt en gedroogd te kunnen worden.

Slurry tank.

De slurry tank heeft een inhoud van 1500 liter en is voorzien van een roerder,een aanvoer leiding voor water,en van een mangat om de vaste stoffen in de tank te brengen.Om de tank zijn vijf halve buizen ( =50 mm) gelast,die als verwarming buizen dienst doen en het mediUh~ in één uur op 600_{C kunnen brengen.Dit geschiedt}

met stoom,die een temperatuur heeft van 150oC. Pomp.

De pomp die het medium via de sterilizator naar de fermentor pompt,is een Viking pomp type EHX2 met een diameter van 120 mm. De snelheid van pompen is 60 I/minuut.

sterilizator.

Dit is een z.g. continue plaatsterilizator.Langs de ene kant van de plaat stroomt volgens een bepaald profiel het medium,en aan de andere kant het verwarmingswater.

Bij een uitwisselingsoppervlak van 0.20 m2 (grootte der platen 500 x 500 mm),een begintemperatuur van het verw§rmingswater

van 150oC,een doorvoersnelheid van het water van 60 I/min., een aanvangstemperatuur van het medium van 60oC,een doorvoer-snelheid van 60 l/min.,zijn voor de verwarming van het medium tot 1420C,80 platen nodig.

Voor het koelergedeelte,waar gekoeld wordt met water van 150_C zijn 50 platen nodig,om het medium af te koelen tot 300C, indien de doorvoersnelheid van het koelwater I60 I/min. is.

Enttank.

De inhoud van de enttank bedraagt 100 liter.

Deze tank is voorzien van een roerder en een ronde buis met gaatjes waardoor het medium geaereerd kan worden.De doorvoer-snelheid van de steriele lucht bedraagt ongeveer 15 I/min ••

'i

I

te blazen in de fermentor.

De deksel is volledig demonteerbaar om schoonmaken mogelijk

te maken.

De tank is omgeven door een verwarmingsmantel om de temperatuur

van het medium op 300

e

te houden.

De Fermentor.

De inhoud van de :fermentor hedraagt 2000 liter.Dit is

nood-zakelijk vanwege de schuimvorming.

Deze tank is eveneens voorzien van een roerder en een aeratie-mechanisme,waardoor 300 I/miK. steriele lucht/min. i~ het medium geblazen kan worden.De lucht verlaat via steriele filters de tank weer.

De tank is ook voorzien van een verwarmingsmantel,om de

tempe-ratuur van het medium op 300C te houden.

De precipitatie tank.

Via een volumemeter wordt de oplossing uit de fermentor door middel van de zwaartekracht in de precipitatie tank gelaten. Deze tank is groot 5000 liter,en is voorzien van een roerder. Onderaan bij de uitloop zit een kijkglas zodat scherp het neergeslagen levan gescheiden kan worden van de bove~staande

vloeistof.

Een mangat is in de tank aangebracht,om de tank gemakkelijk te kunnen schoonmaken.

Oplostank.

Deze tank mee:ft een inhoud van 500 liter,en is voorzien van een roerder,een mangat om diatomeënaarde toe te voegen,en een aanvoer voor pyrogeen vrij water.

pom!.

Deevanoplossing uit de oplostank wordt m.b.v.een

tandrad-pomp met een diameter van 120 mm,6:f naar de precipitatie t~k,

6f door het persfilter naar de fractioneertank gepompt.

Persfilter.

Dit is een SparkIer 18-S-15 pers:filter,met een ditpleter van 750 mm en een hoogte van 1300 mm.Onderaan de buitenkant

stroomt de te :filtreren oplossing naar binnen,en door openingen boven de diverse filters kan de oplossing de filter opper.

vlakken bereiken en kan ze gefiltreerd worden.

Door de centrale afvoerpijp wordt de gefiltreerde oplossing a afgevoerd.

Het schoonmaken gaat zeer eenvoudig, door kRX de deksel van het apparaat af te lichten,en de gehele filtereenheid eruit

te halen. Deze kan dan direct door een schone eenheid vervangen

worden.

Fractioneertanks.

De eerste fractioneertank hee:ft een volume van 1500 liter.

en heeft volledig dezelfde uitvoering als de precipitatie-tank.Alleen is om de tank nog een verwarmingsmantel aan§e-bracht om de temperatuur tijdens het fractioneren op

25

e

te houden.

•

O~ostank.

Doplostank is groot 200 liter,en is voorzien van een mangat om diatomeënaarde te kunnen toevoegen.

Om het oplossen te vergemakkelijken is een~roerder aangebracht.

Pomp.

Dit is een tandradpomp met een diameter van 85 mm,die 10 I/min.

verpompt. Filter.

Deze is reeds beschreven.

VOedin~ankS spray-dryer.

Deze t s hebben een inhoud van 200 liter.Hiervan zijn vier

stuks nOdig,n.l. één om te vullen,één om schoon te maken,één

om de spray-dryer te voeden, één in reserve.

De opbrengsten van de diverse batches mogen namelijk in dit

stadium nog niet met elkaar in contact komen.

Spray-dryer.

De spray-äryer wordt gevoed vanuit de voedingstanks.

Door middel van een tandradpomp met een diameter van 50 mm,

die 24 I/min. verpompt,wordt de atomizer gevoed,waardoor de oplos

sing fijn verdeeld in de warme lucht wordt verstoven •

De capaciteit is zodanig dat één keer in de 24 uur de

spray-dryer schoongemaakt kan worden.

Luchtzuiverings installatie.

Daar de lucht in laatste instantie in aanraking komt met het

product,moet deze lucht steriel zijn.

Blower.

Dit is een Roots blower type 7I7,met een inlaatdiameter van

550 mm en een uitlaat diameter van 200 mm.Deze "blower zuigt

ongeveer 970 m3/h. aan.

Luchtfilters.

Dit zijn twee Adams luchtfilters,die bestaan uit poreus asbest

pijpen.Aan de buitenkant komt de lucht binnen,en via de

cen-trale middenpijp w;rdt de lucht afgevoerd.

Met deze filters wordt de lucht gezuiverd van stof en andere

grove verontreinigingen. Delbaî filter.

Vervo gens wordt de lucht door een Delbag filter gevoerd.Dit ZijD fibrolan platen, waarmee ongeveer 99% van de bacteriën worden

tegengehouden.

Electro ~reciPitator.

De laats e bacterien worden nu verwijderd in een Trion electro-precipitator.De deeltjes worden eerst positief geladen doordat

ze in een veld komen met een spanning van 13000

v.

De lucht wordt dan tussen lamellen doorgevoerd,die afwisselend positi€f en negatief zijn geladen.Tussen deze lamellen heerst

een spanningsverschil van 5000-6000V.De voorgeladen deeltjes

a

Luchtverhitter.

Deze bestaat uit 27 buizen met een lengte van 2000 mm en een m±I

diameter van 50 mm.

M.b.v.stoom van 2000C wordt de lucht verwarmd tot 140°C, en daarna ingevoerd in de spray-dryer.

Ciclonen.

H erin vindt de scheiding plaats tussen de vaste stof en de warme lucht.

Evenals de spray-dryer moeten deze app~aten ook af en toe schoongemaakt worden.

Warmte balans.

Slurr~tank.

begin emperatuur medium IOoe eind temp er at uur medium 60°C begin temperatuur stoom 150°C

afgeleverde warmte 58 kW. Sterilizator. I. verwarmingsgedeelte. 60 0e begintemperatuur medium eindtemperatuur medium 142°C

temperatuur water onder druk 150°C 3~1 afgeleverde warmte ~ kW. 2.koelgedeelte.

142gc begintemperatuur medium

eindtemperatuur médium 30 C temperatuur koelwater 15°C

opgenomen warmte 468 kW. Luchtverhitter. begintemperatuur lucht 20°C eindtemperatuur lucht 140°C temperatuur stoom 200°C afgeleverde warmte 44 kW. Spray-dryer. temperatuur oplossing 20°C product gedroogd (1% vochtgehalte) temperatuur lucht 1400C

afgeleverde warmte 18 kW.

Stofbalansen.

Op de volgende pagina is getracht om in tabel vorm de stof-stromen weer te geven.

Door de stromen bij dit proces (batch proces) een heel andere betekenis krijgen dan bij een continue proces,zijn de hoeveel-heden weergegeven,berekend over het aantal uren dat voorbijgaat voordat de nieuwe stroom verwerkt wordt.

De tabel is verdeeld in zes kolommen.ln de eerste kolom wordt dE behandeling in de diverse tanks aangegeven.ln tabel 2 staan de tanks vermeld waarin deze behandelingen geschieden.

pree. levan oplossen levan pree.lievan oplossen levan gefrae.pree. gefrae.pree. levan oplossen gefrae.pree. gefrae. prec. oplossen levan 1 1 2 frae.tank frae.tank frac,tan~

, ,

,

,

, ,

, ,

, ,

,

,

oplostank

persfilter 1 frae.tan

1 frae. tar. k rl.ool 1 frae. tar k 2frae.tnk

1 frae. tar k ale.dest.

2 frae.tar.k rl.oo1

,

,

,

,

" " al op.iostank e • de st. oplostank t'i1ter fl.1 ter voedl.ngst. ~pray-áryer voedl.ngs tank. spray-a.rye'" cycloon va t nOOI'QJ:!rOau.ct 100U 1 .med.

nlÜ.l!,l:JI'Uu u.c.: ten

1UUO 1 11 2U +med. zouten/b h.

50 1 medium/6 h. ~5U 1 medium/6 h. + 18.5 kg leva /12 h. ~OOOO 1 96% ethanol/12 h. 18.5 kg levan/12 h. 4000 1 vuile ale./ 12 h. 370 1 water/ 12 hoo 3'{0 1 .l:I 20,lö.5 kg levan/12 h. _150U 1 a1e./12 h. 1ö.5 kg le~an/12 ~. 370 1 water/ 12 h. ~ kg diato.cüeënaarde/12h. 3'(0 lwater; 1ö.5 kg levan 2_kg a.latow.aardef 12h. 3'701 water 1 ö • 5 ltg levan 500 1 ale ./12h. I 1.~ kg ~oogmol. levan/12h. i ~UU 1 ale.!12h. 12 kg levan/12noo i ! , I 11.) kg ~evan/1rh.

I

120 lwater+11.5

k~

levan+2 kg aarde/~2h. 12U 1 water + 11~Ü lvul.le ale/12h. 24U 1 water /12h. jöU 1 ale./12h. 6 .. 2 kg hOOgill01.levan/12h. 1 30 1 al e • / 1 2h '{50 lvul.le a.1e./1~h. 120 1 water/12h. 1.5 kg ál.atomeënaarde/12h 11.) Kg levan/1 ~h.

12U 1 wster t 11~5 Kg leY:an/5h.

11., kg

l.evan/5

ht

•

•

•

In tabel 3en 4 is de weg van het product weergegeven. In tabel

5

is de overeenkomstige hoeveelheid weergegeven die overgaat,indien het hoofdproduct van het ene vat naar het andere gaat.

In tabel 6 zijn de hulp- en afval producten aangegeven,die toegevoegd of afgevoerd worden bij de overgangen die in tabel 3 en 4 verm~ld zijn.

opmerkin~n.

I.De tec ische tekening is zodanig opgezet,dat de fermentors enttanken en eerste fractioneertanken op de derde verdieping st'aan.

De sterilizator,precipitatietanken en de tweede fractioneer-tanken staan op de tweede verdieping.

De oplostanken en slurry tank staan op de eerste verdieping.

Op deze manier wordt de zwaartekracht op de beste manier gebruikt.

2.Een groot gedeelte van de gegevens over het verkrijgen van steriele lucht zijn verkreg~n,door het practisch werken bij Philips-Duphar te Weesp in de maand Mei 1961 •

•

..

Literatuurlijst.

I)Hogan,J/J/ J.Am.Med.Assoc. 64,721,(1915)

2 Hurwitz,S.H. idem 68,699,(1917)

3 Bayliss,W.M.Proc.Roy.Soc.(London),B.89,380,(1916)

4 Hecht,G. und Weese,H.Munch.med.Wochschr. 90,11,(1943)

5 Gronwall,A.J.T. and Ingelman,B.G.A. Acta Physiol.Scand.7,97,'43

6 " ,,, " " " .2,11,' 45.

7) ,, - " , ,U.S.patent 2.437.518.

8)Bixler ,G.H. et al. lnd.Eng.Chem. ~,692 (1953)

9)Sohns,V.E. et al. Pilot-plant production of clinical sized

dextran by acid hydrolysis df the

enzyma-ticall' synthesized high polymere

Northern Utilization Research Branch,Peoria,Illinois.

10JLOhmar,ROlland, J.Am.Chem.Soc. 74,4974 (1952) .

11 Beyerinck,M.W. Proc.Koninkl.Akad.Wetenschap A'dam 12,635 (1910)

12 Perquin,L.H.C. Antonie v. Leeuwenhoek,J.Microbiol.Serol.6,221,

(1939 I3)Fuchs,A. On the synthesis and breakdown of levan by bacteria

Thesis,Delft.

16 Dedonder,R. et Slizewicz,P. Bull.Soc.chim.biol. 22,483 (1958)

14)Roe,J.H. J.Biol.Chem. 107,15,(1934)

1 5 jSOmOgYi tM. idem , 160,61,(1945)

17 \fhitmarsh British Fermentations lndustries,104~TI958)

18 Underkofler,L.A. and Hickey,R.J. 1ndustrial fermentations 387,(1954).

3. enttank 4, fermentor 5. precipitatietank 6. oplostank

7.

persfilter 8. 1.fractioneertank 9. 2.fractioneertank 10. oplOGtank 11. persfilter 12. voedingstank spray-dryer 13. blower 14. stoffilter 15. delbagfilter 16. electroprecipitator 17. luchtverhitter 18. spray-dryer

19.

cycloon •

...

.

-1.

,

t

.

-

.'--"";-

*--

_{! I}