Barbara Bobrowska, Andrzej Tokarz, Sławomir Białek 1), Tserendejid Bat-Erdene 8-izoPGF2α W SUROWICY KRWI JAKO BIOWSKAŹNIK ZMIAN ZACHODZĄCYCH W PROCESIE NOWOTWOROWYM
INDUKOWANYM DMBA U SZCZURÓW
Katedra i Zakład Bromatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. nadzw. dr hab. A. Tokarz
1) Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. dr hab. J. Pachecka
Celem pracy było określenie wpływu czynników dietetycznych, działających peroksydacyjnie (wybranych olejów ogrzewanych i nie ogrzewanych) oraz an-tyoksydacyjnie (związków polifenolowych-genisteiny i resweratrolu) na zawar-tość 8-izoprostaglandyny F2α (8-izoPGF2α) w surowicy u szczurów traktowanych
w celu wywołania nowotworu sutka 7,12-dimetylobenz[a]antracenem (DMBA). W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że obecność DMBA w die-cie szczurów powoduje wzrost zawartości 8-izoPGF2α w surowicy krwi badanych
zwierząt. Zawartość badanego biowskaźnika w surowicy pozostaje zależna od występowania w diecie zarówno olejów, jak i związków przeciwutleniających. Związki przeciwutleniające (genisteina i resweratrol) zastosowane w wybranych dawkach nie obniżają podwyższonej zawartości 8-izoPGF2α wywołanej
czynni-kiem kancerogennym.
Hasła kluczowe: 8-izoprostaglandyna F2α (8-izoPGF2α), 7,12-dimetylobenzantracen
(DMBA), oleje roślinne, związki polifenolowe.
Key words: 8-isoprostane F2α (8-isoPGF2α), 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA),
plant’s oils, polyphenolic compounds.
W poszukiwaniu najskuteczniejszych biowskaźników peroksydacji lipidów szczególną uwagę zwraca się ostatnio na grupę F2-izoprostanów, związków
wy-twarzanych z kwasu arachidonowego. Ich podwyższone stężenie wykryto w moczu i krwi w wielu stanach patologicznych, którym towarzyszy nadmierne tworzenie się wolnych rodników, w tym w nowotworach. Związki te posiadają wiele zalet, są dobrymi wskaźnikami określającymi stopień nasilenia choroby, jak również dostar-czają informacji o zachodzących zmianach w organizmie (1, 2, 3).
Celem pracy było więc określenie wpływu wybranych elementów diety, dzia-łających prooksydacyjnie (olejów ogrzewanych i nie ogrzewanych) oraz antyok-sydacyjnie (związków polifenolowych-genisteiny i resweratrolu) na zawartość 8-izoPGF2α w surowicy szczurów traktowanych w celu wywołania nowotworu sutka
7,12-dimetylobenz[a]antracenem.
Pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów działania związków pro- i antyok-sydacyjnych na proces peroksydacji lipidów może przyczyniać się do
skuteczniej-szego jej wykorzystania w profi laktyce chorób bądź we wspomaganiu leczenia farmakologicznego, a także w ocenie możliwości wykorzystania 8-izoPGF2α jako
wiarygodnego biowskaźnika.
MATERIAŁ I METODY
Materiałem do badań była surowica szczurów Sprague-Dawley (masa ciała ± 210 g).
Zwierzęta pochodziły z Pracowni Zwierząt Laboratoryjnych Katedry i Zakładu Patologii Ogólnej i Doświadczalnej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Ba-dania na zwierzętach uzyskały aprobatę Komisji Etycznej przy WUM.
Zwierzęta podzielono na dwie grupy badawcze:
Grupa Ι – grupa badana – szczury, którym podawano w 50 i 80 dniu życia 7,12-dimetylobenz[a]antracen w dawce 80 mg/kg masy ciała w celu wywołania no-wotworów sutka (grupa DMBA+).
Grupa IΙ – grupa kontrolna – szczury, które przebywały w identycznych warun-kach jak zwierzęta z grupy badanej, otrzymywały analogiczną dietę; nie traktowane były 7,12-dimetylobenz[a]antracenem (grupa DMBA-).
Zwierzęta w obu grupach badawczych otrzymywały diety o zwiększonej zawarto-ści tłuszczów ogrzewanych i nie ogrzewanych bądź diety zróżnicowane pod wzglę-dem rodzaju związków polifenolowych zawieszonych w układzie wodnym bądź olejowym.
Rodzaje diet zastosowane w badaniach: – dieta z dodatkiem oliwy nie ogrzewanej,
– dieta z dodatkiem oleju słonecznikowego nie ogrzewanego, – dieta z dodatkiem oleju rzepakowego nie ogrzewanego, – dieta z dodatkiem oliwy ogrzewanej (10 minut, 200°C),
– dieta z dodatkiem oleju słonecznikowego ogrzewanego (10 minut, 200°C), – dieta z dodatkiem oleju rzepakowego ogrzewanego (10 minut, 200°C). – dieta z dodatkiem resweratrolu w dawce 0,1 mg/ml w oleju rzepakowym, – dieta z dodatkiem resweratrolu w dawce 0,1 mg/ml w zawiesinie wodnej, – dieta z dodatkiem genisteiny w dawce 0,375 mg/ml w oleju rzepakowym, – dieta z dodatkiem genisteiny w dawce 0,375 mg/ml w zawiesinie wodnej, – dieta z dodatkiem genisteiny w dawce 0,1 mg/ml w zawiesinie wodnej.
Wyżej wymienione elementy diety podawano indywidualnie każdemu szczurowi sondą dożołądkową w ilości 0,4 ml/dzień od 40 dnia życia do czasu dekapitacji (20 tydzień życia szczurów). Dawki związków polifenolowych ustalono na podstawie danych z piśmiennictwa, dotyczących średniego dziennego spożycia ww. związków z dietą przez ludzi (w przeliczeniu na masę ciała).
Szczury miały zapewniony ciągły dostęp do wody i paszy. Przebywały w warun-kach o stałej temperaturze (22°C) i kontrolowanym okresie dzień/noc.
Zawartość 8-izoPGF2α w surowicy szczurów oznaczano metodą ELISA. W tym
celu wykorzystano test 8-isoprostane EIA Kit, fi rmy Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
W przeprowadzonych badaniach oznaczano zawartość 8-izoPGF2α w surowicy
krwi szczurów, u których wywoływano nowotwór sutka za pomocą DMBA oraz w grupie kontrolnej, nie narażonej na czynnik kancerogenny. Dodatkowo zbadano również wpływ wybranych składników diety, tłuszczów ogrzewanych i nie ogrze-wanych, traktowanych jako czynniki prooksydacyjne, bądź diety zróżnicowane pod względem rodzaju i dawki związków polifenolowych (genisteina i resweratrol) działających antyoksydacyjnie, na proces tworzenia się badanego biowskaźnika
Otrzymane wyniki wskazują, że zawartość 8-izoPGF2α w surowicy szczurów
trak-towanych DMBA i otrzymujących dietę standardową była wyższa w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą analogiczną dietę, pozbawioną DMBA (853,57±428,24 pg/ml wobec 500,38±89,69 pg/ml) (ze względu na wysoką wartość odchylenia stan-dardowego nie były to jednak różnice istotne statystycznie) (ryc. 1).
Ryc. 1. Zawartość 8-izoPGF2α w surowicy szczurów traktowanych bądź nie-DMBA i otrzymujących dietę standardową wzbogaconą ogrzewanymi bądź nie ogrzewanymi olejami.
Fig. 1. The effect of diet suplemented with heated or unheated oils on serum 8-isoPGF2α content (means ± standard deviation) in DMBA treated and untreated animals.
/DMBA+/-grupa traktowana 7,12-dimetylo-1,2-benz[a]antracenem. /DMBA-/-grupa nie traktowana 7,12-dimetylo-1,2-benz[a]antracenem.
Podobną tendencję zauważono, gdy zwierzęta otrzymywały dietę wzbogaconą w wybrane polifenole (genisteinę i resweratrol) w zawiesinie wodnej (ryc. 2).
Wyższą zawartość 8-izoPGF2α stwierdzono u zwierząt traktowanych DMBA
i otrzymujących olej rzepakowy ogrzewany, w porównaniu do szczurów nie trakto-wanych czynnikiem kancerogennym, otrzymujących analogiczną dietę (ryc. 1).
Podsumowując można stwierdzić, że DMBA, czynnik indukujący nowotwory piersi adenocarcinoma, powoduje wzrost zawartości 8-izoPGF2α w surowicy
szczurów intoksykowanych czterochlorkiem węgla. W innym badaniu, ilość izopro-stanów wzrosła aż 200-krotnie w porównaniu do grupy kontrolnej, kiedy szczurom poddano czterochlorek węgla lub parakwat (5).
Nieco inaczej przedstawiają się wyniki badań, wśród zwierząt otrzymujących die-tę standardową wzbogaconą olejami nie ogrzewanymi (oliwą, olejem słoneczniko-wym, olejem rzepakowym) (ryc. 1). Podwyższona ilość tłuszczu w diecie stymulo-wała proces tworzenia izoprostanów, szczególnie w grupie nie traktowanej DMBA. W związku z powyższym zawartość badanego biowskaźnika u zwierząt nie stymu-lowanych czynnikiem kancerogennym i otrzymujących oleje nie ogrzewane była wyższa niż u zwierząt, u których wywołano guzy.
Istotne statystycznie różnice w zawartości biowskaźnika wystąpiły u zwierząt nie traktowanych DMBA i otrzymujących dietę z nie ogrzewanym olejem rzepakowym bądź oliwkowym, w odniesieniu do grupy będącej na diecie standardowej (ryc. 1).
Ciekawy jest fakt, że u zwierząt traktowanych DMBA i otrzymujących oleje nie ogrzewane obserwowano nawet niższą (choć nie istotną statystycznie) zawartość badanego biowskaźnika w porównaniu z grupą kontrolną na diecie standardowej (ryc. 1).
Zwierzęta otrzymujące diety z olejami ogrzewanymi (oliwkowym i rzepakowym) charakteryzowały się wyższą zawartością badanego biowskaźnika w porównaniu do zwierząt będących na diecie standardowej zarówno dla grupy traktowanej, jak i nie traktowanej DMBA (ryc. 1).
Podobną tendencję zaobserwowano u zwierząt otrzymujących dietę z oliwą ogrze-waną w odniesieniu do grupy otrzymującej oliwę nie ogrzeogrze-waną (grupa DMBA+/ DMBA-), jak również w przypadku grupy traktowanej DMBA dla diety z olejem rzepakowym (wartości istotne statystycznie) (rycina 1).
Z przeprowadzonych badań wynika, że wzbogacanie diety olejami (ogrzewanymi i nie ogrzewanymi) ma wpływ na zawartość 8-izoPGF2α w surowicy. W przypadku
grup zwierząt traktowanych DMBA silniejsze oddziaływanie stymulujące wykazy-wały oleje ogrzewane.
Podobne rezultaty uzyskali badając oleje nie ogrzewane Visioli i współpr. (6). Badane związki przeciwutleniające nie zdołały obniżyć podwyższonej zawarto-ści 8-izoPGF2α wywołanej czynnikiem kancerogennym-DMBA (ryc. 2). A nawet
w przypadku, gdy polifenole podawano w zawiesinie olejowej obserwowano wy-raźnie wyższą zawartość biowskaźnika zarówno w odniesieniu do grupy zwierząt otrzymujących dietę standardową, jak i diety wzbogacone analogicznymi polife-nolami podawanymi w zawiesinie wodnej. Podobne rezultaty otrzymał Willcox i współpr. (7). Na podstawie uzyskanych wyników analizy zawartości F2
-izoprosta-nów w sercu i surowicy szczurów badacze stwierdzili, że w zastosowanym modelu doświadczalnym związki fl awonoidowe nie zdołały zahamować, wywołanej pod-wyższoną ilością tłuszczu w diecie, peroksydacji lipidów (7). Cacetta i współpr. (8) w przeprowadzonym badaniu nie zaobserwowali zmian zawartości biowskaźnika u palaczy, którzy spożywali czerwone i białe wino. Natomiast istotnie statystyczne obniżenie wystąpiło, gdy uczestnicy doświadczenia (palacze) spożywali czerwone wino bezalkoholowe (8). W badaniu przeprowadzonym przez Wiseman i współpr. (9) osoby, które spożywały dietę bogatą w izofl awony sojowe charakteryzowały się niższą zawartością 8-izoPGF2α.
Ryc. 2. Zawartość 8-izoPGF2α w surowicy szczurów traktowanych bądź nie-DMBA i otrzymujących dietę standardową wzbogaconą w wybrane związki polifenolowe.
Fig. 2. The effect of diet-enriched polyphenolic compounds on serum 8-isoPGF2α content (means ± stan-dard deviation) in DMBA treated and untreated animals.
WNIOSKI
1. Traktowanie szczurów DMBA, związkiem indukującym nowotwory piersi, powoduje wzrost zawartości 8-izoPGF2α w surowicy krwi badanych zwierząt.
2. Zawartość badanego biowskaźnika w surowicy pozostaje zależna od obecno-ści w diecie zarówno olejów, jak i związków przeciwutleniających.
3. Związki przeciwutleniające (genisteina i resweratrol) zastosowane w wybra-nych dawkach nie obniżają podwyższonej zawartości 8-izoPGF2α wywołanej
czyn-nikiem kancerogennym DMBA.
4. Ze względu na zakres zmian, jakim podlega wybrany biowskaźnik i jego reak-cję na składniki diety, wydaje się niemożliwe traktowanie go jako dobrego markera stanów patologicznych, natomiast może służyć dla oceny elementów diety pod ką-tem ich oddziaływania na procesy prooksydacyjne.
B. B o b r o w s k a, A. T o k a r z, S. B i a ł e k, T. B a t-E r d e n e 8-isoPGF2α IN SERUM AS A BIOMARKER OF CHANGES IN THE INDUCED DMBA
CANCER PROCESS IN RATS S u m m a r y
The correlation between diets supplemented with heated and unheated oils or polyphenolic compounds on oxidative lipids damage (8-isoPGF2α in serum) in rats in which breast cancer was induced with DMBA was assessed.
The results of the study show that DMBA-induced carcinogenesis was accompanied by increased se-rum 8-isoPGF2α levels in rats. The intensity of this process was distinctly conditional upon the presence of polphenolic compounds or fatty acids. Enrichment of diet with polyphenols did not reduce 8-isoPGF2α contents resulting from DMBA-induced carcinogenesis.
PIŚMIENNICTWO
1. Cracowski J.L.: Isoprostanes: an emerging role in vascular physiology and disease. Chem. Phys. Lipids, 2004; 128: 75-83. – 2. Cracowski J.L., Durand T., Bessadr G.: Isoprostanes as a biomarker of lipid peroxidation in humans: physiology, pharmacology and clinical implications. Trends Phamacol. Sci, 2002; 23: 360-366. – 3. Montuschi P., Corradi M., Ciabattoni G., Nightingale J., Kharitonov S.A., Barnes
P.J.: Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients. Am.
J. Crit. Care Med, 1999; 160: 216-220. – 4. Awad J.A., Morrow J.D.: Excretion of F2-izoprostanes in bile: A novel index of hepatic lipid peroxidation. Hepatology, 1995; 22: 962-968. – 5. Tokarz A., Jelinska M.,
Ozga A.: Izoprostany nowym wskaźnikiem stresu oksydacyjnego. Bromat. Chem. Toksykol, 2004; 37:
203-208. – 6. Visioli F., Caruso D., Grande S., Bosisio R., Villa M., Gall G., Sittoni C., Galli C.: Virgin olive oil study (VOLOS): vasoprotective potential of extra virgin olive oil in mildly dyslipidemic patients. Eur. J. Nutr, 2005; 44: 121-127. – 7. Willcox J.K., Catignani G.L., Roberts L.J.: Dietary fl avonoids fail to suppress F2-isoprostane formation in vivo. Free Radical Bio. Med, 2003; 34: 795-799. – 8. Cacetta R.A.A.,
Burke V., Mori T.A., Beilin L.J., Puddey I.B., Croft D.K.: Red vine poliphenols, in the absense of alcohol,
reduce lipid peroxidative stress in smoking subjects. Free Radical Bio. Med, 2001; 30: 636-642. – 9.
Wise-man H., O’Reilly J.D., Adlercreutz H., Mallet A.I., Bowey E.A., Rowland I.R., Sanders T.A.B.: Isofl avone
estrogens consumed in soy decrease F2-isoprostane concentrations and increase resistance of low-density lipoprotein to oxidation in humans. Am. J. Clin. Nutr, 2000; 72: 395-400.
