ALTERNATYWNE SPOSOBY TERAPII I PROFILAKTYKI ZAKAŻEŃ
BIOFILMOWYCH. CZĘŚĆ 1.
ALTERNATIVE WAYS OF THERAPY AND PROPHYLAXIS OF BIOFILMASSOCIATED INFECTIONS. PART 1.
ORCID*: 0000-0001-6383-3972 | 0000-0001-8895-7082 | 0000-0002-2980-6273 | 0000-0003-2944-7327 | 0000-0001-8465-659X
Pracownia Biologii Zakażeń Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego
} BEATA SADOWSKA
Pracownia Biologii Zakażeń,
Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii,
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź, Tel.: 42 635 45 25, e-mail: beata.sadowska@biol.uni.lodz.pl Wpłynęło: 28.10.2019 Zaakceptowano: 07.11.2019 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2019053 *według kolejności na liście Autorów
STRESZCZENIE: W pracy przedstawiono aktualne trendy w badaniach z zakresu nauk biome-dycznych i farmaceutycznych, mających na celu opracowanie nietradycyjnych opcji terapeu-tycznych zakażeń i weryfikację ich skuteczności. Omówiono w skrócie wyniki i konkluzje z ba-dań dotyczących nowych formulacji znanych antybiotyków oraz wdrożenia do praktyki me-dycznej leków biologicznych definiowanych jako produkty, które lub których substancje czyn-ne są wytwarzaczyn-ne w organizmach żywych. Są to produkty pochodzenia naturalczyn-nego (izolowa-ne z mikroorganizmów, roślin, komórek zwierząt, ludzi) lub/i rekombinowa(izolowa-ne (otrzymywa(izolowa-ne na drodze biotechnologicznej), łącznie określane mianem biofarmaceutyków. Biorąc pod uwa-gę wysoką oporność/tolerancję biofilmów na działanie antybiotyków, szczególną uwauwa-gę po-święcono problemom związanym z zapobieganiem ich tworzenia i z eradykacją przez wymie-nione produkty.
SŁOWA KLUCZOWE: alternatywne opcje terapeutyczne, antybiotyki, biofilm, oporność ABSTRACT: The paper presents current trends in research in the field of biomedical and phar-maceutical sciences aimed at developing non-traditional therapeutic options for the infections and verifying their effectiveness. The results and conclusions of the research concerning main-ly the implementation into medical practice of biological drugs defined as the products which or whose active substances are produced in living organisms are here discussed briefly. These are natural-origin products (isolated from microorganisms, plants, animal and human cells) or/ and recombinant (obtained using biotechnological methods), collectively referred to as bio-pharmaceuticals. Considering the high resistance/tolerance of biofilm populations to the ef-fect of antibiotics, special attention was paid to the problems associated with the prevention of their formation and eradication by the above-mentioned products.
KEY WORDS: alternative therapeutic options, antibiotics, biofilm, resistance
WSTĘP
Analiza danych epidemiologicznych z ostatnich dekad skłania do zadania pytania, dlaczego – mimo dużego postę-pu medycyny – problem skutecznego leczenia chorób o pod-łożu infekcyjnym pozostaje wciąż nie do końca rozwiązany. Nawet jeśli uwzględni się w rozważaniach problemy istot-nego deficytu nowych antybiotyków i lawinowego nara-stania stopnia oporności patogenów, nie są one jedynymi przyczynami tego stanu rzeczy. To postęp metodologiczny
i technologiczny w poznawaniu patogenezy zakażeń ujaw-nił znaczenie ważnej, wcześniej przez lata niedocenianej, strategii obronnej drobnoustrojów w postaci tworzenia bio-filmów – struktur wysoce opornych/tolerancyjnych na do-stępne leki. Z tego powodu aktualnie intensywnie rozwija-ją się kierunki badawcze z zakresu biokontroli i bioterapii, dotyczące alternatywnych sposobów zapobiegania ich for-mowaniu się i zwalczania. Badania prowadzone w licznych ośrodkach naukowych obejmują kilka istotnych nurtów, do-tyczących ingerencji w poszczególne etapy tworzenia takich
struktur: prewencja adhezji; zwalczanie tzw. wczesnych mi-krokolonii konsolidujących się w zewnątrzkomórkowym polimerze, wymuszanie dyspersji biofilmu, niszczenie doj-rzałej biomasy. Jest zrozumiałe, że trudności w osiągnięciu wymienionych celów rosną wraz ze stopniem zaawansowa-nia tworzezaawansowa-nia się biofilmu. W tym miejscu rozważań należy przyjąć też za pewnik, iż biofilmy to nie tylko drobnoustro-je osadzone na powierzchni abiotycznej lub biotycznej, lecz także agregaty, które mogą być in vivo zawieszone w war-stwie śluzu lub przemieszczać się w płynach ustrojowych. Równie ważna jest akceptacja faktu, że zakażenie o podłożu biofilmowym niekoniecznie ma charakter miejscowy – ob-jawy uogólnione mogą być wywołane przez uwalniane ko-mórki i/lub fragmenty biofilmu. Populacje biofilmowe czę-sto są strukturami wielogatunkowymi, w których mogą eg-zystować „suwerenne” jednogatunkowe agregaty komórek, wykazujące zazwyczaj różny stopień wrażliwości na kon-wencjonalną terapię. Niewątpliwie istotna jest także niska efektywność humoralnych i komórkowych czynników ukła-du odpornościowego, wynikająca ze zróżnicowanego profi-lu interferujących czynników chorobotwórczości drobno-ustrojów. Powyższe skrótowe uwagi wskazują na koniecz-ność uwzględnienia w badaniach skuteczności alternatyw-nych metod zwalczania biofilmów: ich składu, morfologii, różnej organizacji przestrzennej i zróżnicowanej in vivo eks-pozycji na działanie mechanizmów obronnych.
Poszukiwania alternatyw dla tradycyjnego sposobu zapo-biegania i eradykacji biofilmów opierają się na weryfikacji za-łożeń o zastosowaniu naturalnych czynników przeciwdrob-noustrojowych oraz wzorowanych na ich strukturze odpo-wiedników syntetycznych. Źródła takich oryginalnych pduktów wydają się być nieograniczone: bakterie, wirusy, ro-śliny, zwierzęta jedno- i wielokomórkowe pochodzące ze śro-dowisk lądowych oraz wodnych. Przykładowo w organizmie człowieka jest produkowanych i czynnych wiele takich sub-stancji, zaangażowanych fizjologicznie w ramach systemu odporności wrodzonej w walkę z wnikającymi patogenami. Co więc stoi na przeszkodzie, aby ten potencjał wykorzystać? Odpowiedź na to pytanie wydaje się prosta, ale taka nie jest. Bowiem – mimo szeroko prowadzonych od wielu lat docie-kań naukowych – notowana jest duża rozbieżność między z jednej strony obiecującymi danymi pochodzącymi z badań in vitro, a z drugiej niezbyt optymistycznymi wynikami ba-dań przed- i klinicznych, dotyczących efektywności działa-nia tych produktów in vivo. Ta rozbieżność wynika po części z nieuwzględniania lub z niemożności odtworzenia w bada-niach in vitro złożonych warunków mikrośrodowiska, w któ-rym in vivo toczy się i utrwala zakażenie typu biofilmowego.
Powyższe budzi więc poważne wątpliwości, nie tylko od-nośnie perspektyw czasowych powszechnego zastosowa-nia rozwiązań alternatywnych, lecz także – przede wszyst-kim – możliwego zakresu skutecznego samodzielnego
użycia produktów nieantybiotykowych. Dlatego też waż-nymi nurtami badań in vitro, oczekującymi na pilne spraw-dzenie w warunkach jak najbardziej zbliżonych do rzeczy-wistych, jest poszukiwanie synergistycznych połączeń tych preparatów z klasycznymi terapeutykami, o których działa-niu wiadomo więcej. Nie mniej ważne jest opracowanie no-wych formulacji oraz nowoczesnych sposobów dostarcza-nia alternatywnych leków do tzw. centrum zakażedostarcza-nia. Je-śli myJe-śli się o zwalczaniu biofilmu, należy mieć na uwadze przede wszystkim możliwość dotarcia leku do wnętrza bio-masy i przeciwstawienie się działaniu skoncentrowanych tam produktów metabolizmu drobnoustrojów. Równole-gle prowadzone są, ale nie zawsze w sposób wystarczająco uzupełniający się, badania i opracowywanie procedur odno-śnie szeroko pojętej antyseptyki i dezynfekcji w obszarach klinicznych oraz nieklinicznych, z użyciem nowoczesnych produktów biobójczych/biostatycznych. „Lepiej zapobiegać niż leczyć” – to nie jest tylko fragment przysięgi Hipokratesa sprzed przeszło 2400 lat, lecz także udokumentowany anali-zami wymóg chwili. Ten aspekt mikrobiologii klinicznej po-winien zyskać znaczenie priorytetowe.
W prezentowanym opracowaniu, podzielonym na dwie części, zostaną przedstawione syntetyczne rozważania na temat:
t QPT[VLJXBOJBOPXZDIQSFQBSBUØXQS[F[OBD[POZDIEP samodzielnego zastosowania;
t PDFOZ TUPQOJB JNNVOPNPEVMBDKJ NFDIBOJ[NØX obronnych gospodarza przez: antybiotyki, peptydy biobójcze, białka bakteriofagowe itp.;
t LSZUFSJØXFXBMVBDKJFGFLUØXʇD[FOJBTUBSZDIPSB[OP-wych preparatów z innymi biocydami;
t PQSBDPXZXBOJB OPXPD[FTOZDI TQPTPCØX EPTUBSD[B-nia produktów leczniczych i biobójczych do miejsc przeznaczenia.
Jeśli chodzi o odkrywanie nowych preparatów, to w krę-gu zainteresowania są zarówno produkty naturalne izolowa-ne z komórek drobnoustrojów, roślin i zwierząt, jak i prepa-raty syntetyczne projektowane w oparciu o analizę QSAR (ang. quantitative structure-activity relationship) i poszuki-wanie in silico potencjalnych tarcz dla leku.
Z kolei poszukiwanie najbardziej oczekiwanych połączeń dwu lub więcej produktów podporządkowane jest spełnie-niu określonych kryteriów skuteczności. Najbardziej pożą-dane jest uzyskanie synergizmu hiperaddycyjnego (poten-cjalizacji), kiedy działanie produktów zastosowanych łącz-nie przewyższa sumę działania poszczególnych składników. Ten efekt jest możliwy do osiągnięcia jeśli składowe różnią się punktami uchwytu i sposobem działania. Akceptowa-ne jest również uzyskanie efektu addycji (syAkceptowa-nergizmu addy-cyjnego), kiedy działanie produktów podanych razem jest sumą aktywności każdego z nich oddzielnie, co ma miejsce, gdy mechanizm i punkt uchwytu działania obu jest taki sam.
REGRES EFEKTYWNOŚCI
PRZECIWDROBNOUSTROJOWEJ
ANTYBIOTYKÓW, ZNACZENIE
TERAPEUTYCZNE ICH WŁAŚCIWOŚCI
IMMUNOMODULACYJNYCH
Regres efektywności działania przeciwdrobnoustrojowe-go antybiotyków stał się faktem, w efekcie czeprzeciwdrobnoustrojowe-go XXI wiek nazywany jest erą postantybiotykową [2, 4, 18, 19, 46]. Po-wszechne stosowanie antybiotyków w medycynie, wetery-narii i rolnictwie, a tym samym stała ich obecność w środo-wisku najczęściej w stężeniach subinhibicyjnych, przyczy-nia się do szybszego narastaprzyczy-nia zjawiska oporności. Drob-noustroje w odpowiedzi na warunki stresowe, do których z pewnością można zaliczyć ekspozycję na środki biosta-tyczne/biobójcze, włączają mechanizmy adaptacyjne. Wa-runkują one zarówno oporność/tolerancję pojedynczych komórek, jak i tworzenie biofilmów wykazujących wielo-krotnie niższą wrażliwość na środki przeciwdrobnoustro-jowe niż planktoniczne formy tych samych mikroorgani-zmów. Te zmiany mogą zachodzić na poziomie fenotypo-wym i tym samym mają charakter odwracalny – ustępują po usunięciu czynnika stresowego ze środowiska. Rozpa-trując jednak zjawisko klasycznej oporności drobnoustro-jów zmiany dotyczą genomu drobnoustrodrobnoustro-jów i wynikają z nabywania genów oporności lub ze spontanicznych mu-tacji, które utrwalają się pod wpływem działania czynni-ków selekcyjnych, takich jak antybiotyki [20, 32, 52]. Przy-kładem może być promocja, a tym samym ujawnianie się w obecności subinhibicyjnych stężeń antybiotyków komó-rek o fenotypie SCV (ang. small colony variant), czyli od-miany tzw. małych kolonii. Są to mutanty auksotroficzne wykazujące mutacje w obrębie genów metabolicznych, cze-go efektem jest nieprawidłowy przebieg wybranych szla-ków metabolicznych i brak umiejętności samodzielnej pro-dukcji niektórych metabolitów. Konsekwencją tych zmian jest wolniejszy wzrost, defekt transportu elektronów, zaha-mowanie produkcji wybranych czynników wirulencji, in-klinacja do utrzymywania się wewnątrz komórek eukario-tycznych oraz zwiększona oporność na wybrane grupy an-tybiotyków, np. aminoglikozydy czy sulfonamidy. Zdolność do tworzenia form SCV opisano dla wielu gatunków bak-terii, w tym ważnych klinicznie, takich jak: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Shigella spp., Vibrio spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp., Serratia marcescens, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aerugino-sa, Burkholderia cepacia czy Stenotrophomonas maltophi-lia [11, 35, 40]. Mimo że każda klasa antybiotyków dzia-ła na ściśle określony cel komórkowy, zakdzia-łada się, iż nieza-leżnie od specyficznego mechanizmu działania drugorzę-dowym efektem jest zwiększone stężenie reaktywnych form tlenu (RFT) we wnętrzu komórek drobnoustrojów. Zaś
następstwem akumulacji RFT mogą być spontaniczne mu-tacje genomu, w tym prowadzące do nabywania oporności [20]. W rezultacie jeżeli zmiany genotypowe dotyczą chro-mosomu drobnoustrojów, są przekazywane komórkom po-tomnym w cyklu reprodukcyjnym. Te związane z ruchomy-mi elementaz ruchomy-mi genetycznyz ruchomy-mi mogą być przekazywane in-nym szczepom, a nawet gatunkom drobnoustrojów, dzię-ki istnieniu mechanizmów warunkujących horyzontalny transfer genów, takich jak koniugacja [32].
W kontekście regresu efektywności antybiotyków szczególną uwagę należy poświęcić biofilmom mikroor-ganizmów. U podstaw ich nasilonej oporności/toleran-cji na niekorzystne czynniki środowiskowe, w tym pre-paraty biostatyczne czy biobójcze, leży wiele dobrze już znanych mechanizmów. Przede wszystkim znacze-nie ma sama struktura biofilmów – agregatów/mikroko-lonii drobnoustrojów zanurzonych w zewnątrzkomór-kowej macierzy (ang. extracellular polymeric substance – EPS). Obecność EPS z jednej strony w sposób mecha-niczny ogranicza przenikanie antybiotyków i ich bezpo-średni dostęp do komórek mikroorganizmów, z drugiej warunkuje kumulację produkowanych enzymów roz-kładających antybiotyki. Sugeruje się również, iż dzię-ki negatywnemu ładunkowi zewnątrzkomórkowy DNA (eDNA) wchodzący w skład EPS wykazuje zdolność che-latowania kationów metali (np. Mg2+) i niektórych
katio-nowych antybiotyków oraz aktywuje dwuskładnikowe systemy regulacyjne, takie jak PhoPQ/PmrAB u P. aeru-ginosa czy S. enterica serovar Typhimurium, nasilając zja-wisko oporności biofilmów tych drobnoustrojów na pep-tydy kationowe. Natomiast dostępność tlenu i materiałów odżywczych warunkuje zróżnicowanie fenotypowe ko-mórek w zależności od miejsca ich lokalizacji w agrega-tach/mikrokoloniach, prowadząc do powstawania komó-rek o obniżonej aktywności metabolicznej – tzw. persi-sters (komórek upartych). W komórkach tych nie zacho-dzą procesy replikacji i podziałów, a tym samym wykazu-ją one oporność na większość stosowanych antybiotyków, w szczególności tych, dla których celem działania jest synteza ściany komórkowej drobnoustrojów. Wykazano również, że w komórkach tworzących biofilm dochodzi do nadekspresji pomp efluksowych odpowiedzialnych za aktywne usuwanie antybiotyków z wnętrza komórek mi-kroorganizmów. Bliski kontakt drobnoustrojów w obrę-bie utworzonych agregatów/mikrokolonii sprzyja również horyzontalnemu transferowi genów, w tym genów opor-ności [21, 37, 41]. Wobec tak szerokiego zakresu mecha-nizmów obronnych funkcjonujących w ramach struktu-ry biofilmu stosowanie klasycznej antybiotykoterapii za-każeń o podłożu biofilmowym często nie przynosi pożą-danych skutków, mimo panelu leków dobranych celowo na podstawie przeprowadzonych antybiogramów [22, 37,
38, 41]. W takiej sytuacji jednym z proponowanych roz-wiązań jest stosowanie antybiotykoterapii w formie pul-sacyjnej, zakładającej odstępy czasowe między kolejnymi sesjami podawania antybiotyków. Stale podejmowane są również badania dotyczące poszukiwania nowych źródeł substancji antybiotycznych, a przegląd postępów tych ba-dań przedstawiono w niniejszym opracowaniu.
Rozpatrując terapeutyczne zastosowanie antybiotyków, oprócz podstawowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej, warto przyjrzeć się również ich właściwościom immunomo-dulacyjnym. Najlepiej udokumentowane klinicznie zastoso-wanie immunomodulacyjne antybiotyków dotyczy makro-lidów i ich działania przeciwzapalnego wykorzystywanego w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych układu oddecho-wego. Przykładowo stwierdzono, iż wielomiesięczne stoso-wanie erytromycyny i klarytromycyny w leczeniu rozlanego zapalenia oskrzelików (ang. diffuse panbronchiolitis – DPB) poprawia sprawność oddechową płuc, zmniejsza wydziela-nie śluzu, ogranicza wysięk neutrofilów oraz obniża stężewydziela-nie cytokin prozapalnych w popłuczynach oskrzelowo-płuc-nych i w surowicy, a tym samym poprawia stan fizjologicz-ny pacjentów i zmniejsza śmiertelność w przebiegu DPB. Natomiast podawanie azytromycyny u osób z mukowiscy-dozą polepsza sprawność płuc, ułatwia wydzielanie śluzu (usprawnia klirens śluzowo-rzęskowy), obniża częstość ko-lonizacji płuc przez patogeny i ogranicza rozwój biofilmu drobnoustrojów, poprawiając jakość życia chorych, ogra-niczając częstość zakażeń płuc i zmniejszając śmiertelność. Mechanizmy przeciwzapalnego działania makrolidów obej-mują cztery podstawowe ścieżki działania:
t PHSBOJD[BOJFVXBMOJBOJBXZCSBOZDIDZUPLJOQSP[BQBM-nych i mediatorów zapalenia (IL-8, LTB4, TNF-α, IL- -1, IL-6, NO);
t XQZX OB GVOLDKF OFVUSPĕMØX Xڀ UZN [NOJFKT[BOJF produkcji i uwalniania reaktywnych form tlenu, ha-mowanie procesu degranulacji ziarnistości cytopla-zmatycznych oraz indukcja apoptozy w aktywowa-nych neutrofilach;
t PCOJ˃BOJF FLTQSFTKJ SFDFQUPSØX 5-3 OB LPNØSLBDI układu odpornościowego, nabłonka i śródbłonka, czego następstwem jest ograniczanie odpowiedzi na czynniki zakaźne;
t XQZX OB LPNØSLJ OBCPOLB PEEFDIPXFHP Xڀ UZN stabilizacja błon komórkowych, obniżanie ekspresji cząsteczek adhezyjnych ICAM-1, ograniczanie pro-dukcji śluzu przy jednoczesnym nasileniu propro-dukcji defensyn (HBD-1, HBD-2) [25, 28, 44].
Ten aspekt działania antybiotyków dotyczy modulacji odpowiedzi odpornościowej organizmu gospodarza, jest więc niezależny od narastającego zjawiska oporności drob-noustrojów i nadal warto go wykorzystywać w celach tera-peutycznych wybranych zmian patologicznych.
STRATEGIE WYKORZYSTYWANIA TZW.
STARYCH ANTYBIOTYKÓW, ŹRÓDŁA
NOWYCH SUBSTANCJI ANTYBIOTYCZNYCH
Prężnie rozwijająca się nanotechnologia może okazać się skutecznym narzędziem w przezwyciężeniu trudności w zwalczaniu zakażeń związanych z postępującą lekoopor-nością drobnoustrojów oraz powstawaniem biofilmów. Zdolność nanomateriałów do kontrolowania zakażeń wy-nika bezpośrednio z posiadanych przez nie właściwości przeciwdrobnoustrojowych bądź też – w przypadku po-łączenia ich z antybiotykami – związana jest ze zwiększe-niem efektywności działania oraz bezpieczeństwa przyj-mowania tych drugich [42]. Nanocząstki (ang. nanopar-ticles – NPs) o wymienionych cechach stanowią dość sze-roką pod względem składu chemicznego grupę – mogą za-wierać metale lub ich tlenki (np.: Ag NPs, ZnO NPs, TiO2 NPs, Au NPs), mogą być zbudowane z węgla (np. nanorur-ki węglowe czy fureleny) lub naturalnych związków prze-ciwdrobnoustrojowych (np. polimery chitosanu). Mogą również występować w formie nanoemulsji zawierających surfaktanty czy jako nanocząstki uwalniające tlenek azotu. Przeciwdrobnoustrojowe działanie nanomateriałów zwią-zane jest głównie z generowaniem uszkadzających kom-ponenty komórkowe drobnoustrojów reaktywnych form tlenu, naruszaniem integralności ściany/błony komórko-wej mikroorganizmów czy hamowaniem aktywności en-zymów odpowiedzialnych za replikację i/lub transkryp-cję ich materiału genetycznego [15, 24, 29]. Wykorzysta-nie nanomateriałów jako nośników antybiotyków pozwa-la z kolei kontrolować dystrybucję leku i jego uwalnianie w miejscu zakażenia, zwiększać jego rozpuszczalność czy ograniczać efekty uboczne związane z klasycznymi meto-dami podawania antybiotyków [9, 23, 49].
Oceniając aktywność nanomateriałów wobec biofilmu bakteryjnego, wykazano, że nanocząstki uwalniające tlenek azotu mogą zarówno zapobiegać jego formowaniu się, jak i eradykować już istniejące struktury. Uważa się, że prze-ciwbiofilmowy mechanizm działania NO uwalnianego z na-nocząstek związany jest ze stymulacją aktywności bakte-ryjnej fosfodiesterazy, co przyczynia się do obniżenia we-wnątrzkomórkowego stężenia cyklicznego monofosfora-nu dwu-guanozyny (c-di-GMP) i w konsekwencji do wzro-stu bakterii w formie planktonicznej [12]. Skuteczność dzia-łania w zwalczaniu biofilmu bakteryjnego wykazano także dla liposomalnej formy antybiotyków aminoglikozydowych na modelu zwierzęcym chronicznych infekcji z udziałem P. aeruginosa [34]. Skuteczne w zwalczaniu biofilmu Kleb-siella pneumoniae i szczepu MRSA (ang. methicillin-resi-stant Staphylococcus aureus) okazały się także nowo zsyn-tetyzowane nanocząsteczki srebra ze związaną na ich po-wierzchni ryfampicyną [14].
Oprócz badań nad modyfikacjami właściwości i sposo-bów dostarczania znanych już antybiotyków, równocześnie prowadzone są poszukiwania nowych substancji antybio-tycznych. Nieocenionym źródłem związków przeciwdrob-noustrojowych są powszechnie zasiedlające glebę oraz wody słodkie i słone promieniowce (rząd Actinomycetales) [17]. Na przestrzeni ostatniego dwudziestolecia zostało odkrytych/ opracowanych około 30 nowych antybiotyków, w tym 12 po-chodzących bezpośrednio od promieniowców i ich pochod-nych [8]. Mimo to postępująca antybiotykooporność drob-noustrojów oraz spadek innowacyjności w opracowywaniu nowych antybiotyków półsyntetycznych lub syntetycznych zmusza do poszukiwania ich nowych źródeł, zwłaszcza po-śród rzadkich morskich i glebowych gatunków promieniow-ców. Według danych literaturowych w latach 2007–2017 od-kryto 276 nowych związków bioaktywnych o zróżnicowa-nym działaniu biologiczzróżnicowa-nym (m.in. przeciwdrobnoustrojo-wym, modulującym odpowiedź immunologiczną czy cyto-toksycznym), które zostały wyizolowane z 96 gatunków Acti-nomycetales z rodzajów: Nocardiopsis (52 związki), Micromo-nospora (46 związków), Salinispora (41 związków), Verrucosi-spora (20 związków), Pseudonocardia (17 związków), Actino-alloteichus (16 związków), Dermacoccus (10 związków) i Ma-rinispora (10 związków) [48]. Zidentyfikowane do tej pory metabolity Nocardiopsis sp. należą do grup związków, takich jak α-pirony, poliketydy i ich pochodne czy cykliczne heksa-peptydy, a kilka związków z wymienionych grup wykazuje działanie przeciwdrobnoustrojowe. Wyizolowane z morskie-go promieniowca Nocardiopsis CNX037, a następnie także zsyntetyzowane przez zespół Wu i wsp., nokardiamid A i B (cykliczne heksapeptydy) wykazują działanie przeciwdrob-noustrojowe wobec Escherichia coli (ATCC 25922), Staphy-lococcus aureus (ATCC 29213), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Bacillus thuringiensis (SCSIO BT01), Bacillus subti-lis (SCSIO BS01), Micrococcus luteus (SCSIO ML01) i Can-dida albicans (ATCC 10231) [53]. Przeciwbakteryjne dzia-łanie posiadają również nokarimidazol A oraz B wyizolowa-ne ze szczepu Nocardiopsis CNQ115, w tym wobec B. subtilis (oba związki) i S. epidermidis (nokarimidazol A) [31]. Spo-śród dwunastu nowo wyizolowanych związków ze szczepu Nocardiopsis G057, należących do benzamidów i indoli, kil-ka także charakteryzuje się działaniem przeciwdrobnoustro-jowym, hamując wzrost: E. coli, E. faecalis, S. aureus, B. ce-reus, P. aeruginosa, S. enterica czy C. albicans [50]. Biologicz-nie aktywne związki z Micromonospora sp. o potencjale prze-ciwdrobnoustrojowym to głównie związki należące do grupy alkaloidów, diterpenoidów i dioksanów. Stwierdzono, że wy-izolowane ze szczepu Micromonospora WMMC-218 mikro-monohalimany A i B wykazują działanie przeciwbakteryjne wobec MRSA [57]. Z kolei alkaloid chinoliny wyizolowany ze szczepu Micromonospora G019 jest aktywny wobec E. coli, S. enterica i E. faecalis, a pochodna 1,4-dioksanu uzyskana
z tego samego szczepu promieniowca hamuje wzrost E. fa-ecalis i C. albicans [51]. Bytujący w żachwach (osłonice) z ga-tunku Trididemnum orbiculatum promieniowiec Solwaraspo-ra sp. (szczep WMMB329) jest źródłem bioaktywnych kwa-sów aromatycznych posiadających podstawniki trialkilowe, które mogą działać przeciwdrobnoustrojowo. Takie właści-wości biologiczne stwierdzono w przypadku kwasów solwa-rowych A i B wobec E. coli (ATCC 25922) i P. aeruginosa (ATCC 27853) oraz szczepów MSSA (ang. methicillin-sen-sitive S. aureus) (ATCC 29213) i MRSA (ATCC 33591) [13]. Nie tylko morskie drobnoustroje, lecz także mikroorgani-zmy bytujące w glebie mogą stać się źródłem potencjalnych związków przeciwdrobnoustrojowych. Opracowana przez ze-spół Nicolsa metoda hodowli in situ mikroorganizmów wy-bitnie wymagających na specjalnych czipach (iChip) umiesz-czonych w glebie umożliwia odkrywanie nowych związków biologicznie czynnych [36]. Dzięki hodowli tą metodą drob-noustrojów glebowych udało się odkryć teiksobaktynę, nowy antybiotyk wyizolowany z Elefhteria terrae, który wykazuje aktywność wobec bakterii Gram-dodatnich [33].
POTENCJAŁ PRZECIWDROBNOUSTROJOWY/
PRZECIWBIOFILMOWY NEUTROFILÓW,
PEPTYDÓW OBRONNYCH
I NEUTROFILOWYCH PUŁAPEK
ZEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH
Jak wspomniano wcześniej, tworzenie biofilmu prowa-dzi do wyraźnego zwiększenia oporności/tolerancji drobno-ustrojów na zastosowane antybiotyki/chemioterapeutyki, co wymusza poszukiwanie skuteczniejszych leków oraz spo-sobów zwiększania aktywności znanych preparatów. Inną, ale nie mniej istotną kwestią do rozważenia, jest powszech-nie akceptowany fakt upośledzonej odpowiedzi układu od-pornościowego gospodarza na powstały biofilm. To nakazu-je również intensyfikację badań z zakresu immunometabo-lizmu, koncentrujących się na śledzeniu zmian w metaboli-zmie leukocytów, które ostatecznie regulują ukierunkowanie fenotypu komórek na pro- lub przeciwzapalny [55]. Tym bar-dziej, iż do niedawna sądzono, że wrodzona odpowiedź ukła-du odpornościowego, w przeciwieństwie do odpowiedzi na-bytej, nie podlega istotnym zmianom podczas życia osobni-czego. Natomiast wyniki prac naukowych opublikowanych w ciągu ostatnich kilku lat wskazują na taką możliwość, a od-kryte zjawisko tzw. treningu odporności naturalnej oparte na zasadzie przeprogramowania epigenetycznego komórek sta-ło się przedmiotem badań z zakresu poszukiwania alterna-tywnych metod zapobiegania i wspomagania leczenia zaka-żeń [1, 3, 30]. Kluczowymi komórkami organizmu człowie-ka najwcześniej reagującymi na bodziec infekcyjny są granu-locyty obojętnochłonne (PMN, neutrofile) obdarzone silną
aktywnością fagocytarną. Tym komórkom należy poświę-cić szczególną uwagę, nie ujmując nic ze znaczenia monocy-tów, makrofagów i innych komórek immunokompetentnych. W tym miejscu można nawiązać do publikacji przeglądowej autorstwa Yamada i Kielian, w której można znaleźć obszer-ne i przekonujące wyjaśnienia sposobów unikania przez bio-filmy eradykacji z udziałem wrodzonych i adaptacyjnych me-chanizmów układu odpornościowego [55].
Fagocytoza jest efektywną strategią wykonawczą neutro-filów, prowadzącą do eliminacji pojedynczych komórek lub małych agregatów drobnoustrojów. Jak wykazano w bada-niach in vitro, skutecznej fagocytozie ulegają też tzw. wcze-sne biofilmy. Jednak dowodów na ten fakt pochodzących z badań in vivo jest na tyle niewiele, że nie mogą one prze-sądzać o słuszności takiego założenia. Pewne jest natomiast, że dojrzałe populacje biofilmowe osiadłe na powierzch-ni abiotycznej (protezy, implanty, cewpowierzch-niki itp.) lub biotycz-nej (zawieszone w warstwie śluzowej lub zintegrowane z po-wierzchnią tkanki) nie poddają się łatwo eradykacji immu-nologicznej. W publikacjach z tego zakresu potwierdza się bezpośredni kontakt neutrofilów z powierzchnią biomasy, ich akumulację w jej uchyłkach i kanałach oraz penetrację pojedynczych fagocytów w głąb struktury biofilmu [55]. Ich efektywną rekrutację w pobliże biofilmu dokumentuje też wykrywanie zwiększającego się sukcesywnie stężenia RFT pochodzących z fagocytów i fakt zauważalnej immunoop-sonizacji komórek w powierzchniowych warstwach biofil-mu. Z drugiej strony obserwuje się pewien impas fazy wy-konawczej, realizowanej z powodzeniem w przypadku kon-taktu z drobnoustrojami rozproszonymi. Ten biofilmowy efekt wywoływania niewydolności neutrofilów objawia się zmianami płynności błony ich komórek, skutkującymi bra-kiem tworzenia pseudopodiów oraz pobudzeniem uwalnia-nia z ziarnistości cytoplazmatycznych enzymów i peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Prowadzi to do tzw. wyczer-pania metabolicznego fagocytów pozostających w kontak-cie z biofilmem (ang. frustrated phagocytosis). Należy pod-kreślić, że uwolnione produkty bójcze neutrofilów wtedy nie tylko nie spełniają wydajnie swojej ewolucyjnie przypi-sanej funkcji, lecz także generują i/lub intensyfikują stan za-palny w tkankach, w których toczy się zakażenie o podłożu biofilmowym [55]. Podsumowując, w przypadku biofilmów pochłanianie oraz zależne i niezależne od tlenu wewnątrz-komórkowe mechanizmy zabijania patogenów przez fago-cyty są niestety mało skuteczne. Mechanizmy odporności nieswoistej, oprócz mechanizmów komórkowych, obejmu-ją w istocie syntezę bardzo licznych przeciwdrobnoustrojo-wych białek i peptydów kationoprzeciwdrobnoustrojo-wych/anionoprzeciwdrobnoustrojo-wych (ang. an-timicrobial peptides – AMPs), nazywanych z tego powodu peptydami obronnymi (ang. host defence peptides – HDPs). Ale czy takie peptydy (natywne/syntetyczne) dostarczo-ne egzogennie mogą spełnić oczekiwania jako opcja tera-peutyczna? Aby ocenić szanse takiego rozwiązania należy
uwzględnić odpowiedzi na zapytania co do warunków ich zastosowania (w jakich przypadkach chorobowych, poda-wanie jaką drogą, w jakiej formulacji, w jakim stężeniu).
W organizmie człowieka ważnym źródłem HDPs są nie tylko ziarnistości cytoplazmatyczne fagocytów i płytek krwi, lecz także komórki nabłonkowe o różnej lokalizacji tkanko-wej. Zaletami peptydów jest zdolność do szybkiego zabijania komórek mikroorganizmów oraz zakres działania, zwykle szerszy niż antybiotyków, czyli brak swoistości rodzajowej/ gatunkowej [16, 27, 45, 56]. Stosunkowo dobrze poznaną i liczną podgrupę HDPs człowieka stanowią defensyny oraz katelicydyny. Te ostatnie wykazują nie tylko szerokie działa-nie wobec bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, lecz także oddziałują synergistycznie przeciwbakteryjnie z defen-synami oraz są czynnikiem chemotaktycznym dla innych komórek. Są to cząsteczki o rozległych właściwościach im-munomodulacyjnych, takich jak: mediowanie procesów za-palnych, wpływ na proliferację komórek, ich aktywność wy-dzielniczą i wiele innych [55]. W grupie peptydów o wyka-zywanej in vitro aktywności przeciwbiofilmowej ważne miej-sce zajmuje katelicydyna hCAP 18, obecna w ziarnistościach granulocytów, monocytów, limfocytów, komórek nabłonko-wych oraz tucznych. Aktywność biologiczną wykazuje pep-tyd LL-37 uwalniany z natywnej cząsteczki hCAP 18 po za-działaniu proteazy serynowej 3. Innym przykładem związku o działaniu przeciwbiofilmowym jest laktoferyna ulegająca in vivo ekspresji w neutrofilach i komórkach nabłonkowych o funkcji wydzielniczej. Kolejnym produktem wartym za-uważenia jest indolicydyna, deponowana w granulach neu-trofilów – kationowy peptyd o nietypowej budowie (linio-wy), zawierający zaledwie 13 aminokwasów [45].
Wprawdzie nabywanie przez drobnoustroje oporności na AMPs jest zdecydowanie wolniejsze i mniej częste niż w od-niesieniu do antybiotyków, ale i tak należy to mieć na uwa-dze w rozważaniach dotyczących ich potencjału terapeu-tycznego. Z uwagi na powszechną dostępność publikacji do-tyczących tego aspektu, zostanie on przedstawiony jedynie skrótowo i tylko w odniesieniu do mniejszej skuteczności HDPs wobec populacji biofilmowych. Podobnie jak w przy-padku klasycznych chemioterapeutyków oporność biofilmu na działanie HDPs jest wieloczynnikowa i zbieżna z tą, któ-rą wykazują drobnoustroje planktonowe danego gatunku. Z kolei ta jest zależna od ich ewolucyjnie wykształconych lub nabytych właściwości w tym zakresie. Wśród tych mechani-zmów wymienia się: wzmożoną aktywność pomp eflukso-wych, koncentrację w biomasie enzymów inwazyjnych (pro-teazy), toksyn i surfaktantów, zmiany w strukturach osłon komórek oraz znaczącą ochronną rolę EPS. Równie ważny jest kamuflaż immunogenności, polegający między innymi na maskowaniu powierzchniowych wzorców patogenności (ang. pathogen-associated molecular pattern – PAMP) ko-mórek drobnoustrojów w biomasie czy zwiększenie ekspre-sji genów odpowiedzi na stres oraz tych kodujących enzymy
zaangażowane w usuwanie RFT [55]. Do szczegółowego omówienia powyższych aspektów poświęconych charakte-rystyce i aktywności peptydów przeciwdrobnoustrojowych autorzy odsyłają do wcześniejszych publikacji zespołu au-torskiego niniejszego opracowania [45].
Wobec udokumentowanej nieskuteczności klasycznej fa-gocytozy i zabijania patogenów w biofilmie przez neutrofile można dyskutować o możliwościach jego eradykacji z wyko-rzystaniem mechanizmu alternatywnego. Aktualnie mija 15 lat od opisanego w 2004 roku przez Brinkmanna i wsp. zja-wiska walki z wnikającymi patogenami, nazwanego zewną-trzkomórkowymi pułapkami neutrofilowymi (ang. neutro-phil extracellular traps – NETs), mechanizmu uzupełniają-cego do fagocytozy [6]. Stwierdzono wtedy, że w odpowiedzi na PAMPs patogenów i cytokiny zapalne neutrofile uwalnia-ją z uwalnia-jądra DNA i strukturalne białka histonowe oraz enzymy i peptydy bójcze z ziarnistości cytoplazmatycznych, tworząc zewnątrzkomórkową sieć wyłapującą drobnoustroje, same przy tym ginąc. Obecnie wiadomo, że nie tylko neutrofile mogą wykazywać zdolność do samobójczej śmierci – „NETo-zy”. Ponadto wiadomo, że jest możliwe tworzenie przyżycio-we NETs, kiedy źródłem zasadniczej struktury sieci jest DNA z mitochondriów [7]. Co powoduje dekondensację chroma-tyny pozwalającą na jej uwolnienie do cytoplazmy i złącze-nie się z peptydami biobójczymi z ziarnistości lizosomal-nych, w jaki sposób drobnoustroje są wiązane i zatrzymywa-ne w sieci NET, jaka jest inna (immunomodulująca) rola sieci, jak ta wiedza pochodząca z badań in vitro aktualnie ma się do sytuacji towarzyszącej zakażeniu in vivo? Z uwagi na założony plan niniejszego opracowania i dostępność wielu opracowań przeglądowych z powyższego zakresu te wątki nie będą roz-szerzone. NETs, niezależnie od pochodzenia włókien DNA tworzących strukturę sieci: stanowią barierę fizyczną (pułap-kę dla drobnoustrojów i czynników bójczych), zapewniają miejscową koncentrację czynników bójczych (zabijają pato-geny z udziałem białek/peptydów niezależnie od fagocytozy) w procesie kontrolowanej NET-ozy ograniczają eskalację od-czynu zapalnego w tkankach [7].
Niestety podobnie jak w przypadku efektu „sabotażu” klasycznej fagocytozy – patogeny kontra neutrofile – ma miejsce wzajemna interferencja aktywności patogeny kon-tra NET. Jeśli dotyczy to populacji rozproszonej bakterii, to bez wątpienia drobnoustroje produkujące DNA-zy mogą uniknąć zatrzymania w NET i zabicia przez zdeponowane tam AMPs. Te, które charakteryzują się dużą plastyczno-ścią składu ściany komórkowej i membrany, produkcją licz-nych proteaz i toksyn, również [7]. Jeśli natomiast dotyczy to populacji biofilmowej, to efekt „sabotażu” efektywności mechanizmu NETs/NETozy jest wypadkową znacznie więk-szej różnorodności możliwych aktywności patogenów. Bio-filmy niektórych ważnych klinicznie patogenów charakte-ryzują się np. paradoksalnie nieuzasadnioną strategią zmu-szania neutrofilów do wejścia na ścieżkę tworzenia NETs.
Ciekawym przykładem w tym względzie są gronkowce S. aureus, które – syntezując DNA-zy, inne nukleazy, proteazy, leukocydyny, alfa- i gamma-toksyny – niwelują zarówno działanie NETs, jak i klasyczną aktywność fagocytarną neu-trofilów [5]. Wśród innych strategii można wymienić ha-mowanie powstawania sieci NET przez składowe zewnątrz-komórkowego polimeru biofilmów drożdżaków Candida al-bicans czy Candida glabrata [26]. Niektóre bakterie w prze-biegu realizowanego procesu patogenezy wręcz korzystają z produktów rozpadu fagocytów powstających podczas NE-Tozy. Taką aktywność wykazuje przykładowo P. aeruginosa, ważny czynnik etiologiczny zakażeń ran oraz infekcji ukła-du oddechowego u chorych na mukowiscydozę, czy patoge-ny odpowiedzialne za zakażenia błopatoge-ny śluzowej jamy ustnej i przyzębia [47].
W kontekście powyższych faktów można zadać pytanie: czy jest uzasadnione prowadzenie badań dotyczących eg-zogennego zastosowania peptydów HDP w terapii zakażeń o podłożu biofilmowym? Analiza dostępnego piśmiennic-twa dowodzi, że odpowiedź na powyższe pytanie jest pozy-tywna, jakkolwiek nie jednoznaczna. Peptydy te są wpraw-dzie uważane za szczególnie obiecujące środki terapeutycz-ne o potencjale przeciwbiofilmowym, ale natywterapeutycz-ne HDPs nie są pozbawione licznych wad. Wśród nich wymienia się: ich tendencję do wiązania ze składnikami płynów ustrojowych, cytotoksyczność, wrażliwość na działanie proteaz, krótki okres trwałości i podatność na degradację podczas przecho-wywania oraz możliwość generowania oporności drobno-ustrojów. Dzięki rozwojowi technik biochemicznych wiele powyższych mankamentów zostało usuniętych i można za-obserwować postęp w opracowaniu AMPs pozbawionych zasadniczych wad. Jednakże, ze względu na wysokie kosz-ty izolacji i modyfikacji pepkosz-tydów nakosz-tywnych, nadzieją jest raczej postęp w bioinformatycznym planowaniu ich analo-gów. Możliwe jest bowiem zaprojektowanie in silico synte-tycznych AMPs nowej generacji, o podwyższonych profi-lach stabilności i aktywności biologicznej [10]. Kwestie do-tyczące optymalnych sposobów formulacji i aplikacji pep-tydów, m.in. przygotowywanych z wykorzystaniem narzę-dzi z narzę-dzienarzę-dziny nanotechnologii, zostały skrótowo omówio-ne we wcześniejszym podrozdziale.
Czy ta wiedza przekłada się wprost na realne możliwości terapeutyczne? Trwające aktualnie badania kliniczne fazy I–III dotyczą w przewadze zastosowania miejscowego syn-tetycznych AMPs. Na liście znajdują się następujące posta-cie kliniczne schorzeń: trądzik pospolity i różowaty, śród-nabłonkowa neoplazja sromu, brodawki weneryczne wy-wołane wirusem brodawczaka ludzkiego, biegunka związa-na z zakażeniem Clostridioides (wcześniej Clostridium) dif-ficile, ostre zakażenia skórne o etiologii S. aureus, zakaże-nia grzybicze paznokci, zapalezakaże-nia błony śluzowej jamy ust-nej, zapalenie dziąseł i kandydoza jamy ustust-nej, atopowe za-palenie skóry, ostre i przewlekłe zaza-palenie ucha środkowego,
liszajec bakteryjny, stany zapalne i kandydoza układu mo-czowo-płciowego, owrzodzenia żylne kończyn dolnych [54]. Jak łatwo zauważyć, nie wszystkie jednostki chorobowe ob-jęte badaniami klinicznymi mają tło infekcyjne, a w nielicz-nych z nich udowodniona jest rola powstałego biofilmu. Na-leży jednak sądzić, że z czasem będzie podejmowanych co-raz więcej badań klinicznych inspirowanych zachęcający-mi obserwacjazachęcający-mi z badań in vitro lub ex vivo, na których li-ście znajdą się tzw. zakażenia trudne, bez wątpienia mające tło biofilmowe. Chociaż podane przykłady z badań prowa-dzonych in vitro, opisujące aktywność przeciwbiofilmową HDPs zastosowanych samodzielnie, są w przewadze zachę-cające, to ostatnio zauważa się wzrost zainteresowania in-nym nurtem badań – oceną skuteczności działania pepty-dów skojarzonych z konwencjonalnymi antybiotykami. Wy-daje się, że taka właśnie strategia ma większy potencjał per-spektywicznego zastosowania HDPs w warunkach klinicz-nych. Również ten aspekt badań został zasygnalizowany we wcześniejszej części niniejszego opracowania.
Funkcja profilaktyczna/terapeutyczna naturalnych i syntetycznych AMPs (HDPs), najbliższa do zrealizowa-nia w praktyce, to ich wykorzystanie do przeciwdrobno-ustrojowej modyfikacji wyrobów medycznych (biomateria-łów). Ponieważ tworzenie biofilmów na implantach, prote-zach i cewnikach odgrywa główną rolę w przewlekłych fekcjach typu BAI (ang. biomaterial/biofilm-associated in-fections), zastosowanie w tym celu peptydów o aktywno-ści przeciwadhezyjnej to ich aplikacja perspektywicznie in-teresująca. Wartość dodaną stanowić mogą funkcje immu-nomodulujące peptydów, w tym aktywność przeciwzapal-na i stymulująca działanie humoralnych oraz komórkowych komponentów układu odpornościowego [43, 57]. Jeśli na-tomiast chodzi o terapię eksperymentalną, jeszcze nie ujętą w rygory zarejestrowanych badań klinicznych, to jak dotąd z powodzeniem stosowano peptydy AMP w terapii wspo-magającej gojenie ran przewlekle zakażonych oraz w profi-laktyce i wspomagającym leczeniu stanów zapalnych/infek-cyjnych śluzówki jamy ustnej, a także narządów płciowych o innej etiologii niż te podlegające aktualnie ocenie [10, 39].
PODSUMOWANIE
Jak przedstawiono w tym i we wcześniejszym opracowa-niu autorskim, dowodów z danych dostarczonych z aktual-nych badań in vitro, ex vivo oraz in vivo jest wystarczają-co dużo, aby można było przeprowadzić ocenę całościową przydatności AMPs (HDPs) w terapii/profilaktyce, ze skut-kiem pozytywnym [45]. Powodzenie wdrożenia do praktyki medycznej nowych, przedstawionych wyżej strategii zwal-czania biofilmów będzie zależne w dużej mierze od postę-pów w metodach projektowania i modyfikacji preparatów terapeutycznych pod kątem polepszenia ich właściwości
biologicznych. Równie ważne będzie ustalenie kryteriów standaryzacji produktów farmaceutycznych i precyzyjnych wyznaczników określających ich spodziewaną skuteczność in vivo. W tym kontekście kluczem do sukcesu będzie do-starczenie przekonujących danych pochodzących z użycia stosownych modeli badawczych, które w miarę możliwości technicznych odtworzą warunki mikrośrodowiska docelo-wego i pozwolą na podjęcie badań klinicznych.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENICTWO
1. Arts RJW, Moorlag S, Novakovic B et al. BCG vaccination protects against expe-rimental viral infection in humans through the induction of cytokines associa-ted with trained immunity. Cell Host Microbe 2018;23(1):89–100.e5. 2. Bassetti M, Peghin M, Vena A, Giacobbe DR. Treatment of infections due to
MDR Gram-negative bacteria. Front Med 2019;6:74.
3. Bekkering S, Block BA, Joosten LA, Riksen NP, van Crevel R, Netea MG. In vitro experimental model of trained innate immunity in human primary monocy-tes. Clin Vaccine Immunol 2016;23(12):926–933.
4. Bérdy J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading. J Antibiot (Tokyo) 2012;65(8):385–395.
5. Bhattacharya M, Berends ETM, Chan R et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proc Natl Acad Sci U S A 2018;115(28):7416–7421. 6. Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C et al. Neutrophil extracellular traps kill
bacteria. Science 2004;303(5663):1531–1535.
7. Brinkmann V. Neutrophil extracellular traps in the second decade. J Innate Im-mun 2018;10(5–6):414–421.
8. Butler MS, Blaskovich MA, Cooper MA. Antibiotics in the clinical pipeline at the end of 2015. J Antibiot (Tokyo) 2017;70(1):3–24.
9. Cavalieri F, Tortora M, Stringaro A, Colone M, Baldassarri L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. J Hosp Infect 2014;88(4):183–190.
10. Dostert M, Belanger CR, Hancock REW. Design and assessment of anti-biofilm peptides: steps toward clinical application. J Innate Immun 2019;11(3):193–204. 11. Drescher SPM, Gallo SW, Ferreira PMA, Ferreira CAS, Oliveira SD. Salmonella
en-terica persister cells form unstable small colony variants after in vitro exposure
to ciprofloxacin. Sci Rep 2019;9(1):7232.
12. Duong HT, Jung K, Kutty SK et al. Nanoparticle (star polymer) delivery of nitric oxide effectively negates Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Bioma-cromolecules 2014;15(7):2583–2589.
13. Ellis GA, Wyche TP, Fry C, Braun DR, Bugni TS. Solwaric acids A and B, antibacterial aromatic acids from a marine Solwaraspora sp. Mar Drugs 2014;12:1013–1022. 14. Farooq U, Ahmad T, Khan A et al. Rifampicin conjugated silver nanoparticles:
a new arena for development of antibiofilm potential against methicillin re-sistant Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. Int J Nanomedicine 2019;14:3983–3993.
15. Franci G, Falanga A, Galdiero S et al. Silver nanoparticles as potential antibac-terial agents. Molecules 2015;20(5):8856–8874.
16. Gakhar L, Bartlett JA, Penterman J et al. PLUNC is a novel airway surfactant pro-tein with anti-biofilm activity. PLoS One 2010;5(2):e9098.
17. Genilloud O. Actinomycetes: still a source of novel antibiotics. Nat Prod Rep 2017;34(10):1203–1232.
18. Goudarzi M, Seyedjavadi SS, Nasiri MJ, Goudarzi H, Nia RS, Dabiri H. Molecu-lar characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains isolated from patients with bacteremia based on MLST, SCCmec, spa, and agr locus types analysis. Microb Path 2017;104:328–335.
19. Guanghui Z, Jing L, Guojun Z, Hong L. Epidemiology and risk factors of neu-rosurgical bacterial meningitis/encephalitis induced by carbapenem resistant
Enterobacteriaceae. J Infect Chemother 2020;26(1):101–106.
20. Hoeksema M, Jonker MJ, Brul S, Ter Kuile BH. Effects of a previously selected antibiotic resistance on mutations acquired during development of a second resistance in Escherichia coli. BMC Genomics 2019;20(1):284.
21. Høiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, Molin S, Ciofu O. Antibiotic resistance of bac-terial biofilms. Int J Antimicrob Agents 2010;35(4):322–332.
Staphylococcus aureus by liposomal oleic acids. Biomaterials 2011;32:214–221.
24. Huh AJ, Kwon YJ. “Nanoantibiotics”: a new paradigm for treating infectious di-seases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J Control Release 2011;156(2):128–145.
25. Kanoh S, Rubin BK. Mechanisms of action and clinical application of macrolides as immunomodulatory medications. Clin Microbiol Rev 2010;23(3):590–615. 26. Kernien JF, Johnson CJ, Nett JE. Conserved inhibition of neutrophil
extracellu-lar trap release by clinical Candida albicans biofilms. J Fungi 2017;3(3). 27. Kumar P, Kizhakkedathu N, Straus SK. Antimicrobial peptides: diversity,
mecha-nism of action and strategies to improve the activity and biocompatibility in
vivo. Biomolecules 2018;8(1).
28. Kwiatkowska B, Maślińska M. Macrolide therapy in chronic inflammatory dise-ases. Mediators Inflamm 2012;2012:636157.
29. Lan M-Y, Liu C-P, Huang H-H, Lee SW. Both enhanced biocompatibili-ty and antibacterial activibiocompatibili-ty in Ag-decorated TiO2 nanotubes. PLoS One 2013;8(10):e75364.
30. Lerm M, Netea M G. Trained immunity: a new avenue for tuberculosis vaccine development. J Internal Med 2016;279(4):337–346.
31. Leutou AS, Yang I, Kang H, Seo EK, Nam SJ, Fenical W. Nocarimidazoles A and B from a marine-derived actinomycete of the genus Nocardiopsis. J Nat Prod 2015;78(11):2846–2849.
32. Li B, Qiu Y, Song Y, Lin H, Yin H. Dissecting horizontal and vertical gene trans-fer of antibiotic resistance plasmid in bacterial community using microfluidics. Environ Int 2019;131:105007.
33. Ling LL, Schneider T, Peoples AJ et al. A new antibiotic kills pathogens witho-ut detectable resistance. Nature 2015;517(7535):455–459.
34. Meers P, Neville M, Malinin V et al. Biofilm penetration, triggered release and in
vivo activity of inhaled liposomal amikacin in chronic Pseudomonas aerugino-sa lung infections. J Antimicrob Chemother 2008;61(4):859–868.
35. Melter O, Radojevič B. Small colony variants of Staphylococcus aureus – review. Folia Microbiol (Praha) 2010;55(6):548–558.
36. Nicols D, Cahoon N, Trakhtenberg EM et al. Use of ichip for high-throughput
in situ cultivation of “uncultivable” microbial species. Appl Environ Microbiol
2010;76(8):2445–2450.
37. Omar A, Wright JB, Schultz G, Burrell R, Nadworny P. Microbial biofilms and chronic wounds. Microorganisms 2017;5(9):1–15.
38. Percival SL, Cutting KF. Biofilms: possible strategies for suppression in chronic wounds. Nurs Stand 2009;23(32):64–72.
39. Pfalzgraff A, Brandenburg K, Weindl G. Antimicrobial peptides and their the-rapeutic potential for bacterial skin infections and wounds. Front Pharmacol 2018;9:281.
40. Proctor R. Respiration and small colony variants of Staphylococcus aureus. Mi-crobiol Spectr 2019;7(3).
tion mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem 2015;7(4):493–512.
42. Rai M, Ingle AP, Gaikwad S, Gupta I, Gade A, da Silva SS. Nanotechnology based an-ti-infectives to fight microbial intrusions. J Appl Microbiol 2016;120(3):527–542. 43. Riool M, de Breij A, Drijfhout JW, Nibbering PH, Zaat SAJ. Antimicrobial
pepti-des in biomedical device manufacturing. Front Pharmacol 2017;5:63. 44. Rodriguez-Cerdeira C, Sanchez-Blanco E, Molares-Vila A. Clinical application
of development of nonantibiotic macrolides that correct inflammation-dri-ven immune dysfunction in inflammatory skin diseases. Mediators Inflamm 2012;2012:563709.
45. Różalska B, Budzyńska A, Micota B, Sadowska B. Wybrane strategie zwalczania biofilmów w zakażeniach. Część 1. Potencjał terapeutyczny peptydów prze-ciwdrobnoustrojowych. Forum Zakażeń 2014;5(5):271–278.
46. Saxena S, Gomber Ch. Surmounting antimicrobial resistance in the Millen-nium superbug: Staphylococcus aureus. Cent Eur J Med 2010;5(1):12–29. 47. Storisteanu DML, Pocock JM, Cowburn AS et al. Evasion of neutrophil
extracellu-lar traps by respiratory pathogens. Am J Respir Cell Mol Biol 2016;56(4):423–431. 48. Subramani R, Sipkema D. Marine rare Actinomycetes: a promising source of structurally diverse and unique novel natural products. Mar Drugs 2019;17(5). 49. Teixeira MC, Sanchez-Lopez E, Espina M et al. Advances in antibiotic
nanothe-rapy: overcoming antimicrobial resistance. In: Shegokar R, Souto EB (eds). Mi-cro and Nano Technologies. Emerging Nanotechnologies in Immunology. El-sevier, 2018, pp. 233–259.
50. Thi QV, Tran VH, Mai HD et al. Secondary metabolites from an Actinomycete from Vietnam’s east sea. Nat Prod Commun 2016;11(3):401–404.
51. Thi QV, Tran VH, Maia HD et al. Antimicrobial metabolites from a marine-deri-ved Actinomycete in Vietnam’s east sea. Nat Prod Commun 2016;11(1):49–51. 52. Wein T, Hülter NF, Mizrahi I, Dagan T. Emergence of plasmid stability un-der non-selective conditions maintains antibiotic resistance. Nat Commun 2019;10(1):2595.
53. Wu ZC, Li S, Nam SJ, Liu Z, Zhang C. Nocardiamides A and B, two cyclohe-xapeptides from the marine-derived actinomycete Nocardiopsis sp. CNX037. J Nat Prod 2013;76(4):694–701.
54. www.clinical.trials.gov
55. Yamada KJ, Kielian T. Biofilm-leukocyte cross-talk: impact on immune polariza-tion and immunometabolism. J Innate Immun 2019;11(3):280–288. 56. Yasir M, Willcox MDP, Dutta D. Action of antimicrobial peptides against
bacte-rial biofilms. Matebacte-rials 2018;11(12).
57. Yurko Y, McDeavitt K, Kumar RS et al. Antibacterial mesh: a novel technique involving naturally occurring cellular proteins. Surg Innov 2012;19(1):20–26. 58. Zhang Y, Adnani N, Braun DR et al. Micromonohalimanes A and B:
antibacte-rial halimane-type diterpenoids from a marine Micromonospora species. J Nat Prod 2016;79(11):2968–2972.
