EDMUND SZYSZKO
MIKROOZNACZANIE WAPNIA OBOK MAGNEZU METODĄ OSCYLOPOLAROGRAFICZNĄ
Instytut Polarograficzny Czechosłowackiej Akademii Nauk, Praga Zakład Badania Żywności i Przedmiotów Użytku PZH, Warszawa
Opracowano metodę oscylopolarograficznego oznaczania wapnia obok magnezu. Praca ta jest pierwszym etapem do oznaczania tych pierwiastków w bardzo małych obję- tościach surowicy krwi.
Zagadnienie oznaczania wapnia м surowicy krwi ludzkiej, otrzymanej z jednej kropli krwi wskutek nakłucia opuszki palca, ma poważne zna- czenie praktyczne. Dotyczy to nie tylko badań zawartości tego pier- wiastka we krwi dzieci i młodzieży w różnych okresach ich rozwoju, ale również ma znaczenie w badaniach wpływu wielofosforanów przyj- mowanych z żywnością na tworzenie się trudno rozpuszczalnych związ- ków kompleksowych wapnia. Te dwa zagadnienia różne pod względem fizjologicznym mają jednak tę samą trudność polegającą na 'oznacza- niu wapnia w bardzo małej objętości surowicy krwi rzędu 0,02 — 0,05 ml. Pobieranie krwi od ludzi dorosłych, a szczególnie dzieci i młodzie- ży w takich objętościach umożliwi przeprowadzenie licznych i długo- trwałych badań.
Drugim założeniem tej pracy było wybranie względnie opracowanie takiej metody oznaczania wapnia, która, poza dużą dokładnością, cha- rakteryzowałaby się jeszcze szybkością i pozostawiała trwały dowód analizy, co ma szczególne znaczenie w okresowych badaniach porów- nawczych.
Z tych względów pod uwagę wchodziły tylko nowoczesne metody instrumentalne, a wśród nich metody polarograficzne. Metoda Pfibila i Roubala (1) okazała się najbliższa założeniom tej pracy. Metoda opar- ta jest na reakcji wymiany jonów cynkowych z kompleksonianu cyn- kowego na jony wapniowe, w myśl następującej reakcji:
Zn-kompleksonian III + Ca?* = Ca-kompleksonian II + Zn?*
Ilościowo reakcja zachodzi w 4-n — 6-n roztworze amoniaku. Wydzie- lone jony cynkowe oznacza się polarograficznie. Spośród różnych jo- nów towarzyszących jonom wapnia w surowicy krwi istotny wpływ na wynik oznaczenia tego metalu ma magnez. W metodzie Pribila i Rou- bala wytrąca się go fosforanem amonowym.
Wymieniona metoda została przez nas zaadaptowana do oznaczenia wapnia w surowicy uzyskanej przez odwirowanie jednej kropli krwi (2).
Badania wykazały, że dokładność wyrażona błędem pomiaru wynoszą- cym 40/90 uznana może być za dostatecznie dużą z uwagi na stężenia po- szukiwanego pierwiastka w surowicy. Stwierdzono również odtwarzal-
ność tej metody z wyjątkiem tych przypadków, kiedy nie przestrzegano ściśle parametrów polarograficznych, dlatego metoda ta wymaga dużej wprawy w dziedzinie oznaczeń polarograficznych.
Te ostatnie trudności stały się przyczyną dalszych poszukiwań, które ułatwiłyby oznaczenia i zwiększyłyby odtwarzalność oraz dokładność.
Spróbowano metody oscylopolarograficznej, opartej na tej samej reakcji chemicznej. W pierwszym etapie postanowiono oznaczyć jony wapniowe obok magnezowych przy zachowaniu stosunku, w jakim pier- wiastki te występują w surowicy krwi, z jednoczesnym założeniem, że ilość Ca w badanej próbce powinna mieścić się w granicach od 3 do 7 ug.
Odczynniki
1. Roztwór amoniakalny kwasu etylenodwuaminoczterooctowego (komplekson III). Do kolby 250 ml nalewa się 60 ml wody i rozpuszcza 1,24 g kompleksonu III, po czym uzupełnia sie 25°/o amoniakiem do kreski.
2. Roztwor 3,5%o jednowodorofosforanu amonowego (NH,),HPO,.
3. Roztwor 20°/o azotanu cynkowego Zn(NOs3). . 6H.O.
4. Roztwor wzorcowy CaCl, o stezeniu 10 mg®/o Ca. W kolbie 1-litro- wej rozpuszcza się 0,25 g CaCO;3 (calcium carbonicum praecipitatum) w niewielkiej ilości stęż. HCI i uzupełnia świeżo przegotowaną wodą destylowaną do kreski. 1 ml zawiera 0,1 mg Ca.
5. Roztwór chlorku magnezowego MgCl; w stęż. 10 mg”/o Mg.
6. Roztwór 25/0 amoniaku.
Aparatura
Polaroskop czeski P 576 firmy Kfizik wraz z przerywaczem kropli, połączony z kroplową elektrodą rtęciową i elektrodą grafitową jako elektrodą odniesienia.
Wyposażenie dodatkowe
Zestaw do jednoczesnego przepuszczania azotu przez wszystkie na- czyńka z roztworami wzorcowymi i badanymi (ryc. 1.) Mikrobiureta, pipety, butla z azotem, sekundomierz.
ARRARE
SSN BESS n 1 RN n | 1
н.о] 3 1 2 2 41 |
o
K J
R J
k J
m
Ryc. 1. Zestaw dg jednoczesnego przepuszczania azotu przez wszystkie naczyńka z roztworami wzorcowymi i badanymi,
i '
Wykonanie oznaczenia
Pierwszą czynnością po sprawdzeniu poszczególnych części zestawu (ryc. 2.) jest przygotowanie roztworu podstawowego. W tym celu do
Ryc. 2. Zestaw do pomiarów oscylopolarograficznych, 1 — naczyńko z roztworem Ryc. 2.
FO O О O O O
EJ]O O O O O O O Of
Ryc. 3.badanym, 2 — przerywacz kropli, 38 — polaroskop P576 Kfizik. Ryc. 3. Krzywa oscylopolarograficzna cynku w roztworze kompleksonianu cynkowego.
kolbki na 100 ml nalewa się 50 ml roztworu (1), następnie dodaje się 25 ml roztworu 3,5%/0 МНаНРО. (2) oraz 0,75 ml 20% Zn(NOs)2 . 6H2O, po czym 250/0 amoniakiem uzupełnia roztwór do kreski. Po wymieszaniu roztwór pozostawia się w spokoju na przeciąg 1. godziny, a następnie sączy. 3 ml przesączu przenosi się do małej płaskodennej probówki o wy- miarach ca 6 cm wysokości i 1,5 — 1,8 cm średnicy, dolewa się jeszcze 1 ml wody, miesza się i zanurza w nim kroplową elektrodę rtęciową wraz z elektrodą grafitową. Elektrody te przechodzą przez korek gu- mowy, zamykający roztwór w probówce.
Za pomocą miękkich drutów miedzianych łączy się elektrody z zacis- kami przerywacza kropli, a ten ostatni z polaroskopem. Przy najwyższej czułości i prądzie polaryzującym 0,15—0,2 mA, przy czasie trwa- nia kropli 2 sek. oraz przy odpowiednio skompensowanym spadku napięcia w roztworze i R, otrzymuje się na ekranie krzywą oscylopola- rograficzną zależności dE/dt = f(E) dla jonów cynkowych o kształcie przedstawionym na ryc. 3.
Dla ożnaczeń ilościowych ważna jest część katodowa tej krzywej.
Uzyskanie właściwego, wyraźnego, ale niezbyt głębokiego wcięcia cynku
jest warunkiem rozpoczęcia pomiarów. W przypadku jego braku należy rozbwór podstawowy uzupełnić odpowiednią objętością 20%/0 roztworu
(МО) z 6H,0.
Drugą czynnością wstępną jest przygotowanie złożonego roztworu za- wierającego jony wapniowe obok magnezowych w stosunkach ilościo- wych, takich w jakich te pierwiastki występują w surowicy krwi. W tym celu przygotowujemy roztwór złożony z roztworu (4) i (5) w stosunku objętościowym 3 : 1i następnie rozcieńczamy go dziesięciokrotnie.
Dalszy tok postępowania polega na przygotowaniu 6 naczynek o tych samych wymiarach, podobnych do naczyńka omówionego na wstępie części doświadczalnej, które muszą być połączone w szereg w sposób pokazany na ryc. 1. Naczyńka te należy w sposób trwały ponumerować.
Trzy pierwsze służyć będą do badania roztworów wzorcowych, dwa na- stępne, tzw. 4 i 5 do oznaczania wapnia w badanym roztworze, a naczyń- ko 6 przeznaczone jest dla roztworu 10%/0 amoniaku. Objętości poszczegól- nych roztworów we wszystkich sześciu naczyńkach muszą być takie same. Azot przepuszczony jest przez wszystkie naczyńka jednocześnie, poczynając od naczyńka szóstego, w którym jest amoniak. Z naczyń- ka pierwszego azot poprzez rurkę gumową jest wyprowadzony do wody znajdującej się w maleńkiej zleweczce.
Jak już wspomniano, naczyńko 1, 2 i 3 wypełnione jest roztworem wzorcowym, zawierającym jony wapnia obok magnezowych, w stęże- niach odpowiadających stężeniom tych elementów w surowicy.
W tym celu do naczyniek tych nalewano po 3 ml roztworu pod- stawowego, a następnie do pierwszego dodawano 0,2 ml, do drugiego 0,6 i do trzeciego 0,9 ml roztworu wzorcowego złożonego z jonów Ca?*
i Mg?*, przygotowanego w sposób uprzednio opisany. Odpowiada to 1,5 vg, 4,5 ug i 6,75 ug Ca w każdym naczyńku. Należy w tym miejscu zaznaczyć, że zawartość Ca w jednej kropli surowicy odpowiadającej objętości 0,05 ml wynosi przeciętnie u człowieka dorosłego i zdrowego
5 ug.
Do dwóch następnych naczyniek, tzn. 4 i 5, nalewano roztwory za- wierające jony wapniowe i magnezowe, pozostające w stosunku do sie- bie jak 3 : 1 o stężeniach jonów Ca?* różnych, niemniej w granicach od 3 do 7 ug Ca?* w próbce. Pięć pierwszych naczyniek uzupełniano wodą do 5 ml, do naczyńka 6 nalewano 5 ml 10% amoniaku i po zamknięciu wszystkich naczyniek korkami przepuszczano przez nie azot w ciągu 10 min., dbając o to, żeby zbyt duże ciśnienie gazu nie spo- wodowało przelania roztworu z jednego naczyńka do drugiego.
Po przepuszczeniu azotu, a więc usunięciu tlenu i wymieszaniu roz- tworów, pozostawia się naczyńka w spokoju na okres 30 min. Następnie rozpoczyna się pomiary głębokości wcięć cynku w części katodowej krzy- wej oscylopolarograficznej. W tym celu wyjmuje się z zestawu naczyń- ko 5 i zanurza w roztworze elektrody w ten sposób, żeby jednocześnie korek gumowy, przez który przechodzą elektrody zamykał szczelnie na- czyńko z badanym roztworem. Po 1 min. od chwili włożenia elektrod do roztworu wykonuje się pomiar głębokości wcięcia na krzywej oscy- lopolarograficznej w części katodowej, za pomocą przesuwanej osi po- ziomej, sprzężonej ze skalą. Pomiar wykonuje się w momencie, kiedy kropla rtęci odrywa się i krzywa znika. Z trzech otrzymanych wyników N oblicza się średnią.
Po wykonaniu pomiaru zdejmuje się naczyńko z korka, przez który przechodzą elektrody i wkłada się je do statywu, po czym wykonuje się w podobny sposób pomiary z roztworem znajdującym się w naczyńku 4, a następnie 3, 2 i 1. Wartości N uzyskane z trzech pierwszych roztworów
M ną
U
100 5
90 - NN
80 N
"NJ70 PN
.
pyc. 4а
50 Krzywa zależności pS
N=f (ml) 40
02 04 06 08 10
m 07770% 69
Вус. 4.
wzorcowych pozwalają na wykreślenie krzywej . wzorcowej (ryc. 4).
Średnia wyników N uzyskanych z pomiarów zawartości wapnia w na- czyńku 4 i 5 pozwala na drodze interpolacji obliczyć z krzywej N = f(ml) (ryc. 4) ilości wapnia w badanych próbkach.
OMÓWIENIE DOŚWIADCZEŃ I OTRZYMANYCH WYNIKÓW
Opisana metoda oscylopolarograficznego oznaczania wapnia w ma- łych stężeniach oparta jest na tej samej reakcji wymiennej, na której oparli swoją metodę РИБИ 1 Roubala. Różnice polegają na tym, że oprócz zastosowania oscylopolarografii zmiennoprądowej zamiast polaro- grafii zmieniono metodykę przygotowania roztworu podstawowego i zło- żonego roztworu wzorcowego. Poza tym nie stosowano roztworu. żelaty- ny i alkoholu kaprylowego do usuwania pienienia się roztworu w czasie azotowania.
Wydaje się również, że pewne korzystne znaczenie ma jednoczesne i jednakowe usuwanie tlenu z roztworów wzorcowych i badanych o nie- znanym stężeniu wapnia. Wpływ temperatury nie odgrywa w tym żad- nej roli. Dodatek żelatyny w ilości 1 kropli 0,5%/0 roztworu był przyczy- ną powstawania drugiego wcięcia na części katodowej przy potencjałach "
bardziej ujemnych. Wcięcie to wpływało na wielkość wcięcia cynku i utrudniało pomiar.
Sączenie roztworu podstawowego było konieczne z powodu wytwarza- nia się kryształów fosforanu amonowego w środowisku silnie amonid- kalnym. Otrzymane wyniki zestawiono w tab. I.
Tabela I
2 W WA ;
wroreowy Ca o а Са Średnio | Błąd
stęż. 0,75 mg %w ml o stęż. 0,75 mg% ml Who
0,40 0,40 | 0,44 | 0,35 | 0,40 | 0,40 0,398 + 0,5 0,50 0,50 | 0,48 | 0,50 | 0,51 0,52 0,520 + 4,0 0,60 0,61 0,55 | 0,61 | 0,59 | 0,58 0,588 + 2,0 0,70 0,69 | 0,73 — — — 0,710 + 1,4 0,80 0,80 | 0,75 | 0,82 | 0,80 | 0,83 0,800 0,0
0,90 0,89 | 0,91 | 0,96 | 0,92 | — | 0,920
+ 2,2 W zakresie stężeń od 3 ug do 6,75 ug wapnia w 5 ml próbki błąd waha się od 0 do £ 4%. Stwierdzono również, że obecność jonów magnezo- wych zwiększa wynik oznaczanego wapnia metodą oscylopolarograficz- ną; dlatego w roztworze wzorcowym obok jonów wapniowych znajdo- wały się jony magnezowe w stosunku Ca : Mg = 3 : 1, a więc w takim, w jakim występują one w surowicy krwi. Całkowity czas oznaczenia jednej próbki wynosi przeciętnie około 30 min.
WNIOSKI
1, Opracowano metodę oscylopolarograficznego oznaczania wapnia w stężeniu 0,06 mg*”/o do 0,135 mg'/o z błędem od 0 do + 4%, średnio
+= 1,7%/o.
2. Wyeliminowano wplyw magnezu, tlenu i zmian temperatury.
3. Uzyskano trwały dowód przeprowadzonych oznaczeń ilościowych w postaci oscylopolarogramu.
4. Czas pojedynczego oznaczenia wynosił około 30 min.
Э. Шишко
МИКРООБОЗНАЧЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В ПРИСУТСТВИИ МАГНИЯ ОСЦИЛОПОЛАРОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Содержание
Разработан осцилополарографический метод обозначения кальция в кон- центрациях от 0,06 мг% до 0,135 мг% в присутствии магния, соблюдая коли- чественное соотношение этих элементов Са : МЕ = 3:1 так как в сыворотке крови. Принцип этого метода это реакции обмена между комплексом цинка и кальция находящихся в исследуемом растворе.
Освобожденный процессом реакции цинк обозначается количественно осци- лополарографически. Этот метод исключает влияние магния, кислорода а также колебание температуры на результат обозначенного кальция. Ошибка обозна- чения кальция в представленных границах концентраций выносит около + 17%.
Затрата времени для обозначения одной пробы — около 30 минут.
E Szyszko
MICRODETERMINATION OF CALCIUM IN PRESENCE OF MAGNESIUM BY MEANS OF OSCYLOPOLAROGRAPHIC METHOD
Summary
Oscylopolarographic method was elaborated for determination of calcium in the amounts of 0,06 to 0,135 mg%/o in presence of magnesium, with Ca : Mg ratio of 3:1, similar to that of blood.
The basis of the method is furnished by exchange reaction of zinc complexo- nate with calcium in the solution. Zinc liberated in the reaction is determined by oscylopolarography. Effects of magnesium, oxygen or changes in temperature on the results of calcium determination are eliminated in the method. The error is + 1,7%o and the time of determination is 30 minutes.
PISMIENNICTWO
1. Pribil R., Roubala Z.: Collection Czechoslov. Chem. Commun., 19, 1954. — 2. Brzezińska Z., Szyszko E.: Roczniki PZH, 2, 1962.
