DLAGN. LAB., 1085, XXI, 1
DAGNA BOBILEWICZ, ANDRZEJ DUKWICZ, JERZY KRA WCZYŃSKI
PORÓWNANIE WYNIKÓW STĘŻEŃ CHOLESTEROLU UZYSKANYCH METODĄ ENZYMATYCZNĄ Z UŻYCIEM PEROKSYDAZY ORAZ METODĄ BEZPOŚREDNIĄ Z REAKCJĄ KOLORYMETRYCZNĄ LIBERMANNA- > | | -BURCHARDA |
Z Zakładu Diagnostyki Laboratoryjnej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego " w Warszawie ..
Porównano wyniki stężenia cholesterolu w surowicy oxnaczanego peroksydazową metodą enzymatyczną zestawy odczynnikowe firm: bio-Merieux, Carlo Erba, Perido- chrom-Boehringer) oraz chemiczną: metodą kolorymetryczną Liebermanna-Burcharda zestaw POCh). Pomimo wysokich współczynników korelacji wartości uzyskane metodą enzymatyczną były wyższe niż otrzymane metodą Liebermanna-Burcharda (błąd względny 18-200, ). Zastosowanie w metodzie Liebermanna-Burcharda wzorca wod- nego, tego samego, przy pomocy którego kalibrowana jest metoda enzymatyczna zmniejsza w sposób istotny różnicę pomiędzy wynikami.
W chwili obecnej około 90%, rutynowych laboratoriów diagnostycznych na
terenie Polski oznacza stężenie cholesterolu stosując bezpośrednią chemiczną metodę kolorymetryczną, opartą na reakcji barwnej opisanej w 1885 r. przez Liebermanna i wprowadzonej kilka lat później przez Burcharda. Polega ona na tworzeniu się barwnego produktu w obecności stężonego kwasu octowego, . bezwodnika kwasu octowego oraz stężonego kwasu siarkowego. Wyjaśnienie mechanizmów reakcji zostało przedstawione m.in. przez Burke i wsp. (3). . Metoda ta nie jest swoista dla cholesterolu a.wyniki są uzależnione również od obecności innych chromogenów, biorących udział w reakcji barwnej (w tym
bilirubiny) (1, 2). .
Prostota wykonania jednak (surowica +-odezynnik) jak również względy ekonomiczne sprawiły, że pomimo krytycznych uwag, dotyczących jej jakości oraz pomimo uciążliwości badania, wynikających z kontaktu ze stężonymi
| "_ | kwasami jest ona nadal w użyciu i nie została zupełnie wyparta przez wprowa- dzone w ostatnich latach metody enzymatyczne. za metody z wyboru w rutynowej diagnostyce a szczególną popularność zyskała metoda peroksydazowa,, przebiegająca wg schematu (4): Metody enzymatyczne oznaczania stężenia cholesterolu są obecnie uznane
1) estry cholesterolu cholesterolowa ——eter224 cholesterol + kwasy thuszezowe, ckeydlans — cholesterol + H,O,
_2) cholesterol +0, cholesterolowa
3) 2H,O, + chromogen (najczęściej 4 aminofenazon) + fenol peroksydaza , d związek barwny (4 p-benzochinonemono iminofenazon) + 4H,O Metoda ta została wykorzystana przez wiele firm do produkcji zestawów odczynnikowych do oznaczania całkowitego oraz wolnego cholesterolu (z wy- łączeniem esterazy). Charakteryzuje się ona, podobnie jak chemiczna metoda |
30 D. Bobilewicz i inni Nr 1 Liebermanna-Burcharda, prostotą i szybkością wykonania (surowica + od- czynnik) z założenia jest jednak bardziej swoista.
Celem przedstawianego doniesienia było porównanie wyników stężeń chole- sterolu uzyskanych metodą peroksydazową i chemiczną a tym samym odpowiedź na pytanie, czy metody te mogą być stosowane równolegle bez konieczności wprowadzenia istotnych poprawek w zakresie wartości referencyjnych ewentual- nie systemu kalibracji.
MATERIAŁY I METODY.
Jako punkt odniesienia zastosowano metodę Liebermanna-Burcharda, zaś metodę enzymatyczną stosowano w zestawach odczynnikowych firm bio-Me- rieux, Boehringer i Carlo Erba wg schematu:
- Metoda kolorymetryczna
Zestaw POCh
wzorzec bezwodny 200 mg/dl (z zestawu)
wykonanie: 0,1 surowicy + 2, 25 ml odczynnika, inkubacja 20 min., długość fali 620 nm.
Metody enzymatyczne 1. Zestaw bio-Merieux
cholesterol enzymatique PAP 100, nr kat. 6 122 4
1 x100 ml, około 100 oznaczeń, -
wzorzec wodny cholesterol enzymatique, ur kat. 6 122 2 2 g/l
wykonanie: 10 l surowicy -- I ml odczynnika, inkubacja 10 min. w 37°С, długość fali 550 nm.
2. Zestaw Boehringer :
Peridochrom Cholesterol, nr kat. 676 535 6X13 ml, okolo 78 oznaczen
wzorzec wodny Preciset Cholesterol, nr kat. 125 512
wykonanie: 10 ul surowicy +- 1 ml odczynnika, inkubacja 10 min. w 37°C, długość fali 550 nm. -
3. Zestaw Clini Cals Farmitalia — Carlo Erba Kit Colesterolo Monoreativo, nr kat. 543 161 3 x200 ml, około 600 oznaczeń
wzorzec wodny z zestawu ,
wykonanie: 10 ul surowicy + 1 ml odezynnika, 10 min. inkubacja w 37°C, długość fali 550 nm.
We wszystkich przypadkach próba wzorcowa była traktowana identycznie jak surowice.
Oznaczenia metodą enzymatyczną wykonano na aparacie (analizatorze) FP 9, co umożliwiło zmniejszenie ilości surowicy do 5ul a odczynnika do 0,5 mł i tym samym podwojenie ilości oznaczeń wykonywanych z jednego opakowa- nia.
Jako materiał do badań służyły surowice normo- i hiperlipemiczne oraz materiały kontrolne: Precilip (Boehringer) o prawidłowych wartościach oraz Clini Cals Carlo Erba Lipidic Serum o podwyższonych wartościach cholesterolu (ponadto 300 mg/dl).
Liniowość metody enzymatycznej sprawdzono wykonując oznaczenia w serii rozcieńczonej surowicy ludzkiej o wysokim poziomie cholesterołu 450 mg/dl.
Nr 1 Porównanie wyników stężeń cholesterolu 31
WYNIKI
Wskaźnik zmienności dla powtarzalności w metodzie enzymatycznej wahał się od 2,6-3,4%, a chemicznej 3,8%. Potwierdzono prostoliniowość metody enzy- matycznej do wartości 450 mg/dl, nie określając jej dla wyższych stężeń z po- wodu braku odpowiedniego materiału. Według instrukcji producentów liniowość jest zachowana do 500 mg/dl (Carlo Erba) i 700 mg/dl (bio-Merieux, Perido- chrom — Boehringer).
Wszystkie wyniki uzyskane zarówno metodą enzymatyczną jak i kolory- metryczną mieściły się w zakresie dopuszczalnych wartości surowic kontrolnych.
W przypadku metody kolorymetrycznej były średnio o 4% niższe przy zasto- sowaniu metody enzymatycznej, zaś o 3% wyższe od podawanych wartości nominalnych. Należy zaznaczyć, że wartości nominalne nie precyzowaly szeze- gółowo metody i zestawu, dla których były wyliczane.
mg/dl Bio~ Merieux
©gjdi| Carlo Erba ° : .
и’
7 .
300- oe A
и 7.
7 z 200|-
P = 0,453
¥ = 1,84x +(-26,3)
BB N= 23
milczy 100 la 200 пи t-8 300 100 О 200 300 1-8 mofdi
1b mgjal| Boehringer
Pertdochrom . . °
.
300|-
. , и 7 ”
° ?
. e 7
3 7
. 7
.% * a a
200|- Że
4. и
. 7 7
и и г=0975 « Ryc. 1. Wykres korelacji stężeń cholesterolu took у” Y =1,33x +(-20,7) N= 33 dla peroksydazowej metody enzymatycznej i chemicznej metody kolorymetrycznej Lie-
. bermanna-Burcharda — L-B (zestaw POCh).
4 l a— zestaw enzymatyczny bio-Merieux,
4 1 b— zestaw enzymatyczny Carlo Erba,
я 100 i le ‘ 200 1-8 l mgłdl 300 teoretyczne krzywe pełnej zgodności porów- Boehringer. Linią przerywaną zaznaczono l e — zestaw enzymatyczny Peridochrom — nywanych metod.
TE Ee ee ee a a WENN Nr l
Tabela I. Procentowe różnice pomiędzy wynikami uzyskanymi metodą kolorymetryczną Liebermanna-Burcharda i poszczególnymi zestawami enzymatycznymi. Metoda L-B przyjęta została jako metoda odniesienia (100%) .
Stężenie Różnice w procentach: zestawy:
mg/dl ,
L-B (100%) Peridochrom Carlo-Erba Bio-Merieux
50 —8,4 —4 —18
100 +12,3 +11,5 +7,7
150 ‘ +19,2 +16,7 +16,5
200 +22,6 ; +19,3 +20,9
250 300 +26,1 +24,7 +20,8 +21,8 +23,5 +25,2
W zakresie stężeń cholesterolu najczęściej spotykanych w pracy rutynowej (100-300 mg/dl) wyniki otrzymane przy zastosowaniu różnych zestawów enzy- matycznych były wyższe niź w metodzie kolorymetrycznej co wynika z ryc. 1.
Różnice procentowe dla poszczególnych wartości stężeń przedstawia tabela I.
W metodzie Liebermanna-Burcharda wykazano ponadto różnice absorbancji dla wzorca bezwodnego i wodnego cholesterolu o tym samym stężeniu — 200 mg/dl. Absorbancja uzyskana dla wzorca wodnego (Boehringer, Carlo Erba).
była średnio o 13%, niższa niż wzorca bezwodnego, stosowanego do kalibracji metody chemicznej (Boehringer, POCh).
OMÓWIENIE
Wszystkie omówione zestawy enzymatyczne oparte są na oznaczaniu stężenia cholesterolu przy zastosowaniu peroksydazy. Charakteryzuje je duża prostota wykonania oraz dobra powtarzalność i dokładność. Zestaw Peridochrom firmy Boehringer ma tę zaletę, że odczynnik przygotowuje się w ilości możliwej do wykorzystania w ciągu jednego dnia pracy, co eliminuje ewentualne błędy, wynikające z przechowywania roztworów roboczych.
Jak wynika z obserwacji własnych w dwóch pozostałych zestawach, roz- twory przechowywane zgodnie z instrukcją zmieniają zabarwienie. Fakt ten w próbach przez nas wykonywanych nie wpływał na zmianę wyniku i jak należy sądzić, jest przewidziany przez producenta i eliminowany przez wykonywanie próby zerowej odczynnikowej.
Wyniki uzyskane przy pomocy zastosowanych zestawów enzymatycznych są wyższe niż wyniki otrzymane metodą Liebermanna-Burcharda, przy czym wykazane różnice w zakresie stężeń spotykanych w pracy rutynowej są na tyle istotne, że wykluczają stosowanie tych metod zamiennie i wskazują na ko- nieczność wyznaczania dla każdej grupy metody odrębnego zakresu wartości referencyjnych. -
Poza stwierdzeniem opisanych rozbieżności trudno w tej chwili dyskutować przyczyny ich powstawania. Na uwagę zasługuje fakt związany z kalibracją obu metod, a mianowicie zastosowanie wzorca wodnego do reakcji Liebermanna- -Burcharda podwyższałoby otrzymywane tą metodą wyniki o około 13%, zmniejszając tym samym rozbieżność pomiędzy wynikami uzyskanymi metodą enzymatyczną kalibrowaną również przy pomocy tego samego wzorca. Problemy związane z unifikacją wzorców cholesterolu, aczkolwiek powszechnie znane, nie doczekały się jednoznacznego rozwiązania (4). Jak wiadomo cholesterol w substancji nie jest rozpuszczalny w wodzie. Rozpuszczalniki organiczne
4
Мг 1 | "_ Porównanie wyników stężeń cholesterolu 33
jak np. izopropanol stosowane do przygotowywania wzorców dla metod che- micznych nie mogą znaleźć zastosowania w metodach enzymatycznych. Te ostatnie wymagają bowiem wzorców wodnych, które sporządzane przez roz- }
puszczenie cholesterolu w roztworach detergentów również nie stwarzają takich samych warunków reakcji, jakie mają miejcse w surowicy. Jest więc sprawą dyskusyjną, na ile ich zastosowanie w chemicznej metodzie kolorymetrycznej może być uzasadnione. Żaden ze stosowanych wzorców nie zawiera estrów cholesterolu w takich proporcjach jak w surowicy, co jest kolejnym dowodem na to, że praktycznie wszystkie dostępne wzorce należy traktować jako „sztucz- ne” istotnie odbiegające od formy w jakiej cholesterol rozpuszczony jest w wod- nym środowisku osocza. Zdaniem wielu autorów (wg. 4) optymalnym rozwiąza- _ niem byłoby zastosowanie tzw. wtórnego wzorca, to znaczy surowicy z uprzednio
| gznaczonym stężeniem cholesterolu przy zastosowaniu metod referencyjnych. Taki schemat postępowania stosowany w wielu referencyjnych laboratoriach lipidowych na świecie, w badaniach rutynowych nie znalazł jednak jeszcze powszechnego zastosowania.
WNIOSEK
Д. Бобилевич, А. Дуквич, Е. Кравчиньски
СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОНЦЕНТРАЦИЙ ХОЛЕСТЕРИНА ПОЛУЧЕННЫХ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ СРЕДСТВЕННЫМ МЕТОДОМ С КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ РЕАКЦИЕЙ. ЛИБЕРМАННА-БУРХАРДА И НЕПО-
Резюме
Авторы сопоставили результаты концентраций холестерина в сыроротке определяемого пероксидазным энзиматическим методом (реактивные устройства фирм: Мо Мешеих, Carlo Erba, Periodochrom-Boehringer) (относительная онтибка 18—20%). Применение в методе Либерманна-Бурхарда водяного Эталона, того-же самого, при помощи которого титруют энзиматический метод, уменьшает существенным способом разницу между результатами.
D. Bobilewiez, A. Dukwicz, J, Krawczyński
A COMPARISON OF THE RESULTS OF CHOLESTEROL CONCENTRATION DETERMINATIONS BY THE ENZYMATIC METHOD WITH PEROXIDASE AND BY THE DIRECT METHOD USING THE COLORIMETRIC REACTION OF LIEBERMANN- -BURCHARD
Summary
The results of determinations of serum cholesterol level were compared after using the enzy- matic peroxidase method (reagents supplied by the firms: bio-Merieux, Carlo Erba, Peridochrom- Boehringer) and by the chemical colorimetric-method of Lieberman-Burchard (POCh kit).
Despite high correlation coefficients the values obtained by the enzymatic method were higher than those obtained by the Liebermann- Burchard method (relative error 18-20%). The use of an aqueous standard in the Liebermann-Burchard method, the same standard used for cali- bration of the enzymatic method, decreases significantly the difference between the results,
3 — Diagnostyka Labor.
34 | D. Bobilewicz i inni
w bo
. Badzio T., Pawłowski R.: Oznaczanie cholesterołu li
„ Bałantyne F. C.: Role of the elinical biochemistry laborator
Nr' i PIŚMIENNICTWO
poproteidów o wysokim ciężarze właściwym za pomocą reakcji z chlorkiem żelazowym. — Diagn. Lab., 16, 205, 1980.
. Zak B.: Cholesterol methodologies: a review. Clin. Chem., 1201, 23, 1977.
- Burke R. W. i in.: Mechanism of the Lieber mann-Burchard and Zak colour ‘reactions for cholesterol. — Clin. Chem., 794, 20, 1974. 4 y in the assessment of dyslipo- proteinaemias. — Ann. Clin. Biochem., 166, 21, 1984.
Adres autorów: Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej CMKP, 02-097 Warszawa, ul. Banacha LA.
