Prace metodyczne
ALICJA STRZELCZYK
M ETODY BA DA NIA GRZYBÓW GLEBOW YCH
Polskie Tow arzystwo Gleboznawcze, K om isja Biologii Przewodniczący — prof. dr J. G ołębiowska
WSTĘP
G rzyby stano w ią obok b a k te rii w ażną g rupę d ro b n o u stro jó w roz w ija ją c y c h się w glebie. Ich grzyb n ia p rzenika g ru d k i gleby w form ie strzęp ek tw orząc w w oln ych p rzestrzen iach pom iędzy nim i olbrzym ie ilości zarodników . W odróżnieniu od grzyb n i ro zw ijającej się w glebie i ak ty w n ie uczestniczącej w jej przem ian ach biochem icznych zarodniki grzybów są form am i n ie a k ty w n y m i o bardzo słabej przem ianie m aterii.
W glebie w y stę p u ją licznie przedstaw iciele n a stę p u jąc y c h klas g rz y bów: P h y c o m y c ete s (glonowce), A scom ycetes (workowce), Basidiom ycetes (podstaw czaki) oraz Fungi im perfecti (grzyby niedoskonałe). W ięcej niż połow ę ogólnej liczby grzybów ro zw ija ją c y c h się w glebie stanow ią p rzedstaw iciele grzybów niedoskonałych [5, 7], w śród k tó ry c h najczęściej spo ty k an e są g a tu n k i należące do rodzajów : Pénicillium, Aspergillus,
Trichoderma, F u sarium i inne. R ozw ijają się one szybko i z łatw ością
zaro d n ik u ją. Szybko rosnące grzy by o panow ują łatw iej środow isko w p ły w ając często ograniczająco n a ro d zaje o słab y m tem pie w zrostu przez k o n k u ren c ję p o karm ow ą lub przez w y tw a rz an ie toksyczn ych pro d u k tó w p rzem ian y m aterii. P rzedm io tem zain tereso w ania m ikrobiologów są głów nie te grzyby, k tó re ak ty w n ie p rzep ro w ad zają procesy biochem iczne w glebie, niezależnie od ich zdolności do zarodnikow ania. W yodręb n ian ie a k ty w n y c h fo rm grzybów (strzępek) z gleby jest tru d n e i w ym aga zasto sow ania sp ecjaln y ch m etod. T rudność stanow i tu rów nież uzyskanie in fo rm acji dotyczących system atycznego zróżnicow ania grzybów zasie d lają cy c h b a d an ą glebę (np. w y o d ręb n ian ie podstaw czaków obok grzybów n iedoskonałych).
O pisane w n in iejszej p racy m etody należą do najczęściej stosow anych przez m ikrobiologów i mikologów. O b ejm u ją one technikę w y o d ręb n ian ia i oznaczania grzybów ro zw ija ją c y c h się w glebie i zasied lających korzenie roślin oraz m etody hodow li, po m iaru w zro stu grzybów , obserw acje org a nów rozm nażania oraz przechow yw ania czystych k u ltu r grzybów .
I. POBIERANIE PRÓBEK GLEBY DO BADAŃ MIKOLOGICZNYCH [17]
W y k o n a n i e . O dkażoną ło p atk ą zd ejm u je się górną, ok. 3 -cen ty- m etrow ą, w a rstw ę gleby i m etalow y m pierścieniem w ycin a się słupek gleby odpow iedniej w ysokości (ok. 15 cm). W b ra k u odpow iedniego cy lin d ra m ożna pobrać glebę ło p atk ą w y jało w io ną z głębokości 3-15 cm. W celu o trzy m an ia śre d n ie j próbki pobiera się z jednego m iejsca po 5 p ró bek gleby i m iesza dokładnie w jało w y m n aczy n iu lub w w o rk u p la s ti kow ym . Do b a d a ń bierze się ok. 50 g tak ie j gleby. W celu uzy skan ia m ożliw ie dokładnego zespołu m ik oflo ry określonego pola n ależy pobrać z niego ok. 5 śred n ich próbek. P ró b k i gleby przechow uje się w chłodnym m iejscu. A nalizę m ikrobiologiczną tak ie j gleby należy przeprow adzać w m ożliw ie n a jk ró tsz y m czasie po jej p o b raniu. W ten sposób pob rane próbki gleby m ożna analizow ać jed y n ie m etodą rozcieńczeniow ą. P rz y stosow aniu in n y ch m etod b ad an ia gleba nie p ow inna być m ieszana, gdyż zabieg ten niszczy jej p ierw o tn ą stru k tu rę .
II. METODY OKREŚLANIA LICZEBNOŚCI GRZYBÓW W GLEBIE
1. R O Z C IE Ń C Z E N IO W Ą M E T O D A P Ł Y T K O W A [17]
W y k o n a n i e . Glebę przesiew a się przez sito w celu usunięcia z niej zanieczyszczeń w postaci k am ieni, w iększych resztek ro ślin n y ch itp. 10-gram ow ą próbkę gleby um ieszcza się w 90 m l jałow ej w ody d esty lo w anej i w y trzą sa silnie przez 5 m in u t. Tę zaw iesinę tra k tu je się jako rozcieńczenie 1 : 10. Z niej p rzyg o to w u je się dalsze rozcieńczenie p rz e nosząc po 10 m l tak ie j zaw iesiny do 90 m l jałow ej w ody. Po p rzy go to w an iu każdego następneg o rozcieńczenia w y trzą sa się o trz y m an ą zaw ie sinę przez 1 m in. Po o trzy m an iu odpow iedniego rozcieńczenia końcowego, którego w ielkość należy uprzednio u stalić dośw iadczalnie dla każdej gleby oddzielnie, przenosi się jed n o m ililitro w ą porcję do p ły te k P etrieg o i zalew a rozpuszczonym , p rzestu d zo n y m ag arem glikozow o-peptonow ym M a rtin a [17, 34] lub pożyw kę OAES [19]. Hodow lę pozostaw ia się w tem
p e ra tu rz e 20-25°C do czasu p o jaw ienia się kolonii. Za n ajodpow iedniejsze rozcieńczenie gleby należy uznać to, w k tó ry m ro zw ija się średnio 25 ko lonii grzybów n a płytce. O trzy m an e w y n ik i przelicza się najczęściej n a 1 g suchej m asy gleby. W yrosłe n a p ły tk a c h kolonie odszczepia się n a skos z ag arem glikozow o-ziem niaczanym [40].
O pisana m etoda jest pow szechnie stosow ana do oznaczania ogólnej liczebności b a k te rii i prom ieniow ców w glebie. Stosow ana jest rów nież do oznaczania liczebności grzybów , chociaż w ty m p rzy p a d k u m a nieco m niejsze zastosow anie. M etoda ta pozw ala bow iem n a oznaczanie przede w szy stk im grzybów szybko rosn ący ch i łatw o zaro d n ik u jący ch . Pożyw ka M artin a, zaw iera ją c a róż b engalski i an ty b io ty k i, u zn an a jest za n a j lepszą p rzy ilościow ym oznaczaniu grzybów tą m etodą. J e st rów nież lepsza od in n y ch stosow anych przy w y o d ręb n ian iu grzybów z gleby [17, 21]. Róż beng alsk i ogranicza w ielkość kolonii szybko ro snący ch grzybów nie przeszkadzając innym . A n ty b io ty k h a m u je rozw ij b a k te rii i prom ieniow ców . K a u f m a n n i in. [19] poleca pożyw kę OAES, na k tó re j u zy sk ali n ajw ięk szą ilość kolonii o n a jw ięk szej różnorodności rodzajów . N a te j pożyw ce zostaje nieco w strz y m a n y rozw ój grzybów szybko rosn ący ch bez zaham o w an ia tw o rzen ia zarodników , co czyni ją p rz y d a tn ą do id e n ty fik a c ji grzybów w y ro sły ch bezpośrednio n a p ły tk ach . N adto pożyw ka ta jest bezb arw n a w p rzeciw ieństw ie do pożyw ki M a rtin a zabarw ionej różem bengalskim .
2. M E T O D A P Ł Y T E K G L E B O W Y C H W A R C U P A (T H E SO IL P L A T E S ) [52]
W y k o n a n i e . N iew ielką ilość gleby przenosi się aseptycznie do szalek P etriego. Ilość gleby zależy od jej zasobności w g rzy b y i dlatego należy ją dośw iadczalnie u stalić (0,005-0,15 g). Glebę w szalkach zalew a się 8-10 m l p rzestu d zo nej pożyw ki agarow ej (agar C zapek-D oxa z d o d a t kiem 0,05Vo w yciągu drożdżow ego, zakw aszony do pH 4,0 kw asem fosfo row ym [17]). P ły tk i in k u b u je się w tem p e ra tu rz e 20-25°C.
P rzyto czon a m etoda jest szeroko stosow ana w b ad an iach ekologicznych nad rozm ieszczeniem ró żn y ch g ru p grzybów w glebie. B ezpośrednie um ieszczenie gleby w pły tce zapew nia w zrost grzybów zasiedlający ch w iększe cząstki m in eraln e i organiczne gleby (hum us), k tóre w m etodzie rozcieńczeń zo stają pom inięte w sk u te k opadania ich n a dno n aczynia z zaw iesiną. N adto m asy zarodników m a ją tu praw dopodobnie w iększą szansę zachow ania swego n a tu ra ln e g o u k ład u pozostając n ie rozbite. Tą m etodą u d aje się w yodrębnić w iększą ilość rodzajó w grzybów w porów n aniu z m etodą rozcieńczeniow ą. W arcu p w ykazał, że w iele w yh od ow a nych tą m etodą grzybów pochodzi z cząstek h u m usu.
3. M O D Y F IK A C J A M E T O D Y W A R C U P A [18, 29, 30, 31]
W y k o n a n i e . Z 6 m iejsc badanego pola pobiera się ok. 100 g próbki gleby z głębokości 3-15 cm do jało w ych kolbek. Po przeniesieniu do p r a cowni m iesza się je dokładnie razem . M ałą ilość gleby przenosi się n a stępnie do p ły tk i i m iesza ru ch em ro ta c y jn y m , aby n ajd ro b n iejsze cząstki gleby osadziły się na dnie. 1 g tej n ajd ro b n iejszej fra k c ji m iesza się n astęp n ie w m oździerzu z niew ielką ilością jałow ego, drobnego p iasku kw arcow ego, odsypanego z 74 g porcji. W p rzy p a d k u gleby m ało p ró ch n i- cznej należy m ieszać k ró tk o i łagodnie. Glebę silnie próchniczną rozciera się ok. 2 m in. Po u zy sk an iu bezgrudkow ej m ieszaniny przenosi się ją do ko lby z resztą piasku. W ten sposób u zy sk u je się p ro p o rcję gleby do piasku rów no 1 : 74. Glebę z p iaskiem m iesza się łagodnie o b racając n a czynie lub tocząc je po stole przez 10 m in. P o rc ję ok. 30 m m 3 tej m ie szan iny przenosi się do p ły te k i zalew a p rzestud zoną pożyw ką (agar M a rtin a z dod atkiem 0,5% w yciągu glebowego). In k u b u je się w 21-23°C.
M a ń k a i w spółpracow nicy stosow ali tę m etodę do gleb z a w ie ra ją cych bogatą m akroflorę.
III. METODY BEZPOŚREDNIEGO BAD A NIA MIKOFLORY GLEBOWEJ
1. M E T O D A S Z K IE Ł E K K O N T A K T O W Y C H C H O Ł O D N Y -R O S S I [1]
W y k o n a n i e . S zkiełka przedm iotow e um ieszcza się bezpośrednio w glebie. Po upływ ie 1, 2 i 3 tygo d ni w y jm u je się je ostrożnie z gleby, usuw a w iększe g ru d k i gleby przez o p łukanie ich lekkim stru m ien iem w ody lub z an u rzając w n aczyn iu z wodą. Szkiełka suszy się, n astępn ie u trw a la w słabym płom ieniu, b arw i ery tro zy n ą przez 5-6 m in i m ik ro skopuje.
2. M O D Y F IK A C J A M E T O D Y C H O Ł O D N Y -R O S S I W E D Ł U G Z IE M IĘ C K IE J [55]
W y k o n a n i e . S zkiełka przedm iotow e pow leka się ro ztw orem b a d a nego s u b s tra tu (np. glikozy, skrobi, p ep ton u itp.) i um ieszcza w glebie. W określonych odstępach czasu w y jm u je się szkiełka z gleby, u trw a la i b arw i ja k w yżej. W ten sposób m ożna badać m etabiozę (następczy rozw ój) drobnou stro jów .
M etody przyg otow an ia szlifów glebow ych do obserw acji dro b n o ustrojów w s tru k tu ra ln e j (nie naru szo n ej) glebie, utw ard zo n ej agarem lub żywicą sy n tety czn ą, znaleźć m ożna w p racach K u b i e n y [22], H a r - l o v a i W e i s s - F o g h a [13], A l e x a n d r a i N i c h o l a s a [6].
IV. METODA IZOLOWANIA GRZYBÓW Z GLEBY
1. IZ O L O W A N IE Z P Ł Y T E K A G A R O W Y C H
N ajczęściej sto so w an y m sposobem w yodrębniania" grzybów z gleby jest odszczepianie kolonii w yro sły ch n a p ły tk a c h agarow ych (przygotow anych m etodam i II.1-II.3 ) na skosy z u n iw e rsa ln ą pożyw ką (najczęściej agar glikozow o-ziem niaczany lub pożyw ka z w yciągiem słodow ym ).
2. M E T O D A B E Z P O Ś R E D N IE G O S Z C Z E P IE N IA G L E B Ą (D IR E C T IN O C U L A T IO N ) [17, 51]
W y k o n a n i e . G ru dkę gleby ok. 1 cm śred n icy przenosi się jałow o na środ ek p ły tk i z zestaloną pożyw ką agarow ą (agar glikozow o-ziem nia czany lub pożyw ka M artina). P ły tk i in k u b u je się w 20-22°C przez 24 godz. Po ty m czasie odszczepia się grzy bn ię w y ra sta ją c ą z g ru d k i gleby.
M etoda ta pozw ala na w yo d rębn ien ie grzybów p rze ra sta ją c y c h glebę w postaci grzybni. Czas hodow li jest tu kró tk i, aby w y sta rc z y ł n a w y tw orzenie z zarodników obecnych w glebie grzybni w idocznej gołym okiem . P rz y jm u je się więc, że uzyskan e grzy b y pochodzą ze strzępek, a nie z zarodników grzyba.
3. M E T O D A P Ł Y T E K P E R F O R O W A N Y C H (S C R E E N E D IM M E R SIO N P L A T E S ) [49]
J e st to m o d y fik acja m etod y opisanej w punk cie III. 2.
W y k o n a n i e . Szkiełko przedm iotow e w w y m iarach 10,5X4,0 cm um ieszcza się w ściśle p asu ją c y m p ły tk im pudełeczku z pleksiglasu (rys. 1). W ierzch pudełeczka zak ry w a się p ły tk ą z pleksiglasu o grubości 1 m m , w k tó re j z n a jd u ją się 2 rzęd y po 5 otw orów o śred n icy 5 m m. Po w y jało w ien iu urząd zen ie to um ieszcza się w dużej alum iniow ej p łytce i zalew a w odnym agarem (2% agaru). A gar nalew a się przez jeden z otw o rów w p erfo ro w anej p łytce zw racając uw agę, ab y ta p ły tk a nie zetk n ęła się z w a rstw ą agaru. Po zakrzepnięciu a g a ru p erforo w aną p ły tk ę za m ienia się d ru g ą p ły tk ą , a otw ory zabezpiecza przed in fek cją z a k ry w ają c dużym jało w ym n ak ry w k o w y m szkiełkiem . Całe urządzen ie przenosi się V/ p ły tce na pole. T am w y jało w io ny m nożem w y k o n u je się odkryw ki, do k tó ry c h p rzy tw ie rd z a się szalki w raz z całym urządzeniem . U przednio usuw a się z pow ierzchni szkiełko z a k ry w ające otw ory. Zależnie od celu p racy serię p ły te k p erfo row an y ch um ieszcza się w płaszczyźnie pionow ej lub poziom ej p ro filu glebowego. N ależy uw ażać, aby szkiełka nie b y ły p rze trz y m y w a n e zbyt długo w glebie, gdyż strzęp k i w y ra sta jąc e z gleby
do a g a ru przez p o ry w p ły tce z pleksiglasu m ogą p rze ra sta ć się n aw zajem tw o rząc kolonie m ieszane lub w zajem n ie się ham ow ać. Po w y jęciu p ły te k z gleby szkiełka przedm iotow e um ieszcza się (agarem w dół) pod m ik ro skopem n a m etalow ym staty w ie. Z aobserw ow ane strzęp k i g rzy b a od- szczepia się n a św ieżą pożyw kę.
Rys. 1. Płytka perforowana, w idziana z góry oraz z boku w raz z pudełeczkiem , w ed łu g John
sona [17]
a — o t w o r y w p ły t c e , b — p ły t k a p e r fo r o w a n a , c — w a r s t e w k a a g a r u , cl — s z k ie ł k o p r z e d m io to w e , e — p u
d e łe c z k o
Screen im mersion plate seen from top and side according to Johnson [17]
a — p e r f o r a t io n in s c r e e n , b — s c r e e n , с — a g a r film , d — s lid e , e — b o x
T h r o n t o n [50] podał m o d y fik ację tej m etody. P e rfo ro w a n a p ły tk a jest w niej zastąpio na w ieczkiem p rz y k ry w a ją c y m pudełeczko ze szkieł kiem przedm iotow ym . Ś red nica otw orów w ynosi w n im ok. 0,3 cm.
4. M E T O D A R U R E K P E R F O R O W A N Y C H (T H E IM M E R S IO N T U B E ) [9, 10, 17]
W y k o n a n i e . W glebie w y w ierca się otw ór za pom ocą odpow iedniej długości korkobora. Na m iejsce u su n ię te j gleby um ieszcza się p erforo w aną r u rk ę z pożyw ką (rys. 2). G rzyby w ra s ta ją do pożyw ki przez otw ory. R u rk ę perfo ro w an ą przyg o to w u je się z grubościennej probów ki, k tó re j dno
Rys. 2. Rurka perforowana do jałow ienia, w ed łu g Johnsona [17]
a — k o r k i z w a t y , b — p r o b ó w k a d o w y j a ła w ia n ia , с — k a p tu r e k s z k la n y , d — r u r k a p e r fo r o w a n a , e — p r o b ó w k a o c h r o n n a , / — k a p lla r y , g — p o ż y w k a a g a r o w a , h — p o d k ła d k a z w a ty , i — w p u k lo n a k a p ila r a ,
w id o c z n a z b o k u
Im mersion tube prepared to sterilisation according to Johnson [17]
a — c o t t o n p lu g s , b — s t e r il is a t io n tu b e , с — g la s s h o o d , d — p e r f o r a te d tu b e , e — j a c k e t tu b e , / — in v a g i n a t e d c a p illa r ie s , g — a g a r m e d iu m ,
h — c o t t o n b e d , i — in v a g i n a t e d c a p illa r y s e e n f r o m s id e
w yciąga się n ad płom ieniem , ab y p o w stał szpiczasty koniec. Jednocześnie z dolnej połow y ru rk i w yciąga się 4 -6 k a p ila r w zdłuż sp ira ln e j linii obiegającej probów kę. Te k a p ila ry skręca się, rozgrzew a i za pom ocą naw oskow anej igły w p u k la do w ew n ątrz (rys. 2, F, i). O stre końce ty ch k ap ilar, w n ik ające w św iatło ru rk i, spiłow uje się tak , aby śred n ica otw o
rów w k a p ila ra c h w ynosiła ok. 1,5 m m . K a p ila ry nie pow inny zbyt głę boko w nikać w św iatło ru rk i. D olną część ru rk i, zaopatrzoną w k a p ila ry , um ieszcza się w niskiej probów ce ochronnej o nieco w iększej średn icy (rys. 2, E). Od gó ry r u rk a zam k nięta jest k orkiem i z a k ry ta szk lanym k a p tu rk iem , k tó ry w w a ru n k a ch polow ych m a chronić k orek p rzed zam oknięciem . Całość um ieszcza się w g ru b ej probów ce i zam yk a k o r kiem z w aty . W tej probów ce ru rk ę p erfo ro w an ą poddaje się w y ja ło w ieniu. N astęp nie n ap ełn ia się ją pożyw ką agarow ą do w ysokości 1 cm n ad n ajw y żej położony otw ór. A gary zo w an a pożyw ka n ap ełn ia ru rk ę i przez otw ory p rzed o staje się do probów ki ochronnej. P o n ap ełn ien iu pożyw ką całość jałow i się ponow nie. G dy w y jało w io na pożyw ka zakrzepnie, ru rk ę w y jm u je się z probów ki och ro n n ej i usuw a się w y jałow ioną igłą resztk i na z ew n ątrz zakrzepniętego agaru. P ow ierzch n ię przeciera się alkoholem i um ieszcza w jało w ej probów ce. W tak im stan ie kom plet ru re k przenosi się n a pole i po w y jęciu z probów ek um ieszcza w otw orach w y w iercon ych w glebie. R u rk i pozostaw ia się w glebie przez 7 dni. W ty m czasie g rzy b n ia z gleby p rz e ra sta do pożyw ki przez k a p ila rn e otw ory. Po w y jęciu r u re k z gleby do ich w n ę trz a w prow adza się m etalow y korkobor (0,6 cm średnicy) i w y cina słu pek a g a ru z ru rk i. S łupek ten w yp ych a się jałow ą bagietk ą z k o rk ob oru zaznaczając położenie najw yższej i n ajn iższej k a p i lary . N astęp nie tak i słu p ek dzieli się n a 4 różne części i każdą z nich przenosi do jałow ej pły tk i. Z kolei cząstki te tn ie się na 4 rów noległe krążki, któ re um ieszcza się p rzy brzegach p ły tk i. N a środek p ły tk i n alew a się ostrożnie p rzestu dzo ną pożyw kę agarow ą, k tó ra otacza k rążk i agarow e i zastyga. R ozw ijające się po p a ru d niach kolonie grzybów odszczepia się i po ró w n u je z grzy b am i w y ro sły m i z krążkó w um ieszczonych w sąsiedz tw ie poszczególnych otw orów w ru rce.
M etoda ta pozw ala n a uzyskanie in fo rm a c ji w zespołach grzybów p rze ra s ta ją c y c h glebę w form ie ak ty w n e j grzybni. M odyfikację tej m etody podają: M u e l l e r i D u r r e l l [37] oraz M а с - W h i t h e y [24].
M etodą pozw alającą n a w yo dręb n ien ie z gleby grzybów należących do rzęd u O om ycetes opisują M a ń k a i K o w a l s k i [32], M i l l e r [35] oraz E t c h e l l s i in ni [11] p o dając m etody w y o d ręb n ian ia drożdży, a W а г с u p [54] — m etodę w y o d ręb n ian ia podstaw czaków z gleby.
5. IZ O L O W A N IE S T R Z Ę P E K G R Z Y B N I Z G L E B Y
a. M etoda W arcupa [55]
W y k o n a n i e . G ru d k ę gleby 1,0-1,5 g um ieszcza się w wodzie do n asycenia. Po 4 -5 m in ro zb ija się ją siln y m stru m ie n ie m w ody w odocią gowej. Całość pozostaw ia się n a 1-1,5 m in w celu opadnięcia w iększych
cząstek. Zaw iesinę w ylew a się pozostaw iając osad, k tó ry p rze p łu k u je się ta k długo, dopóki w oda ponad nim nie stan ie się zupełnie klarow na. Osad s k ła d a jąc y się z szybko o p adający ch cząstek przenosi się następ n ie z od ro biną w ody do trzech jało w ych pły tek. W nich pod m ikroskopem w y n a jd u je się poszczególne k a w a łk i grzy bn i i d elik atn ie przenosi do k ro p li w ody um ieszczonej w inn ej jałow ej płytce. S trzęp k i o b rastające cząstki m in eraln e lub cząstki h u m u su p o w inn y być sta ra n n ie w yprep aro w ane. S k u pien ia strzęp ek należy rozdzielić na pojedyncze fra g m en ty , gdyż p rze w ażnie sk ła d a ją się one z w ielu g a tu n k ó w grzybów . 20-50 frag m en tó w strzęp ek um ieszcza się na jednej szalce, po czym zalew a 10-13 m l p rze studzonej agarow ej pożyw ki. Po zestaw ieniu a g aru ogląda się odw róconą p ły tk ę pod m ikroskopem i zaznacza m iejsca rozm ieszczenia frag m en tó w grzybni. C odziennie przeprow ad za się obserw acje w zrostu. Z w yrosłej g rzyb ni obcina się końce strzęp ek i w raz z bloczkiem a g a ru przenosi na św ieżą pożyw kę. O dszczepia się ty lk o kolonie w y ra sta ją c e z grzybni, a nie z zarodników . K olonie w y ra sta jąc e z zarodników lub z bogaty ch w nie szczątków h u m u su n ależy usunąć, gdyż m ogą zagłuszyć rozw ój pow oli rosn ący ch lub nie z a ro d n ik u jący ch grzybów . Począw szy od dzie siątego dnia obserw acje przeprow adza się co kilka dni. Jak o pożyw kę poleca się agar C zapek-D oxa, z d odatkiem 0,5%> w yciągu drożdżow ego o pH 5,6-5,8, rozcieńczoną 1 : 6 [52].
O pisana m etoda pozw ala n a uzyskanie rodzajów grzybów glebow ych p o m ijan y ch zw ykle w w ysiew ach in n y m i m etodam i. W ykazano bow iem , że w czasie p rzyg o tow y w an ia w odnej zaw iesiny gleby w m etodzie roz- cieńczeniow ej, jak rów nież w b ad an iach grzybów glebow ych in n y m i m etodam i w iele grzybów nie u d a je się w yk ryć, gdyż pozostają w osadzie.
b. M etoda pa skó w z folii n y lo n o w e j [12]
S to su je się w ąskie paski oddzielone od siebie tak, aby strzęp k a ok re ślonego grzyba m ogła rozw ijać się w zdłuż jednego tylk o paska.
W y k o n a n i e . W prostokącie z folii nylonow ej w ycina się paseczki o szerokości 1 m m pozostaw iając je połączone na jed n y m jego boku. Paseczki te w m iejscu połączenia p rzy lep ia się do szkiełka przedm ioto wego, a końce ich um ocow uje p rzylepcem n a d rugim końcu szkiełka (u łatw ia to w y p rostow anie i zagrzebanie pasków w glebie). P ask i na szkiełku jałow i się alkoholem i um ieszcza w glebie, podobnie jak w m e todzie C hołodny-R ossi-Z iem ięckiej. Pozostaw ia się je w glebie przez okres jednego tygodnia. Po w y jęciu z gleby szkiełko w raz z p askam i płucze się jałow ą w odą, paski odcina w y jało w io ną ży letk ą i u k ład a na p ły tk a c h z pożyw ką, stro n ą eksponow aną do góry. Część pasków pozo
staw ia się do d o k ład nej k o n tro li m ikroskopow ej. W razie zbyt silnego w zrostu grzybów na p askach tn ie się je w poprzek przed w yłożeniem na pożyw kę. N astępnie p ły tk i odw raca się i pod m ikroskopem p rzy po w iększeniu 100-krotnym zaznacza się położenie strzępek grzybów . O b serw acje w zrostu kolonii p rzeprow adza się codziennie przez 3-4 dni od- szczepiając cienką igiełką p o jaw iające się kolonie. Izolaty oczyszcza się na św ieżej pożywce.
G a m s izolow ał tą m etodą w iele rodzajów grzybów glebow ych, m .in.
Fusarium , Pénicillium, Mortierella, grzy b y nie ow ocujące — Mycelia ste- rilia oraz podstaw czaki.
c. W yod rębn ian ie strzę pe k celulolityczn ych [12]
W y k o n a n i e . W ilgotne paski celofanow e ok. 1 cm szerokości n a k ład a się n a szkiełka, suszy i końce p rzy tw ie rd z a przylepcem . W ycina się z nich ży letk ą paseczki szerokości 1 mm. Jało w i się w alkoholu i um ieszcza w glebie. Czas pozostaw ania ich w glebie należy ustalić do św iadczalnie. P ow inien on być dłuższy niż w m etodzie pasków ny lo n o w ych z uw agi na to, że celofan jako pożyw ka m a działać selekcjonująco na m ik ro flo rę sp rz y ja ją c rozw ojow i grzybów celulolitycznych. Po w y jęciu z gleby paski sp łu k u je się jało w ą w odą i oczyszcza jałow ym p ędzel kiem . Ma to n a celu u łatw ien ie obserw acji i izolow ania grzybów . W pływ a zaś w bardzo nieznacznym sto p n iu n a sk ład jakościow y i ilościow y w y od ręb n ian y ch grzybów . P ask i u k ład a się n a stę p n ie na se lek ty w n y m pod łożu dla grzybów błonn ikow y ch z karbo k sy m etylocelu lozą (np. agar C zapeka z dod atkiem 1ю/о k arb o k sy m etylocelu lozy lub rozdrobnionej b ibu ły filtra c y jn e j W h atm an 1) [8, 16].
V. BADANIE GRZYBÓW ZASIEDLAJĄCYCH KORZENIE ROŚLIN
1. P R Z Y G O T O W A N IE P R Ó B E K K O R Z E N I D O B A D A Ń
W y k o n a n i e . R ośliny w y k o p u je się z całym sy stem em ko rzen io w ym , otrząsa je z p rzy leg ającej gleby i w y jało w ion ą żyletką lub nożycz k am i obcina cienkie, nie zdrew n iałe korzenie. W p rzy p a d k u roślin o g ru b y ch zd rew n iały ch korzen iach (np. ro ślin y drzew iaste lub lu c e r na) do b ad a ń przeznacza się korzenie boczne, nie zdrew niałe, grubości do 3 mm.
2. O Z N A C Z A N IE L IC Z E B N O Ś C I G R Z Y B Ó W W R IZ O S F E R Z E R O Ś L IN [44]
W y k o n a n i e . Około 10 g korzeni um ieszcza się w jałow ej wodzie (90 ml) w w y ta ro w a n ej bu telce i w y trz ą sa przez 5 m in (rozcieńczenie 10“ 1). Z tej zaw iesiny p rzy g oto w u je się w yższe rozcieńczenie w y trzą sa ją c silnie każdorazow o n a stę p n e rozcieńczenie przez 1 m in w w y taro w an ej butelce. Po u zy sk an iu odpow iedniego rozcieńczenia końcowego (rzędu 10~4-1 0 ” 6) dozuje się w 1 m l p o rcję zaw iesiny gleby rizosferow ej na p ły tk i i zalew a p rzestu d zo n ą pożyw ką M artin a.
K orzenie pozostałe n a dnie pierw szej b u telk i (10-1) op łu k u je się do k ład n ie i odrzuca. P ozostałą w b u telk a ch glebę z rozcieńczenia 10-1 i 10-2 łączy się i odparow uje. Pozostałość suszy się w 105°C. O trzy m an e w y n ik i przelicza się n a 1 g suchej m asy gleby rizosferow ej.
3. IZ O L O W A N IE G R Z Y B Ó W Z R IZ O S F E R Y R O Ś L IN
a. M etoda
M etoda ta podana przez H a r l e y ’ a i W a i d a [14] została w ielo k ro tn ie zm odyfikow ana. Z n a jd u je jed n ak że szerokie zastosow anie w b a d an iach n a d sk ładem g atu n k o w y m grzybów zasiedlających rizosferę ro ślin [31, 39, 47]. P oniżej pod aje się m o d y fikację M ańki [31].
W y k o n a n i e . P rz y g o to w u je się serię dziew ięciu 200-m ililitrow ych kolb zaw ierający ch po 70 m l jałow ej w ody. O sta tn ia z serii zaw iera oprócz w ody 30 g jałow ego drobnego piasku. W y trząsa się 1 g korzeni kolejno po 2 m in w serii kolb z w odą. Po jed n ej k ro p li zaw iesiny u zy sk a nej w każdej kąp ieli korzeni n a k ra p la się n a p ły tk i z pożyw ką M a rtin a i ro zprow adza po p ły tc e za pom ocą szklanej szpachelki. Po 6 d niach hodow li w te m p e ra tu rz e 23°C kolonie grzybów w yrosłe n a pow ierzchni odszczepia się i oznacza.
M etoda ta może m ieć zastosow anie p rzy ilościow ym oznaczaniu g rz y bów zasied lających rizosferę.
W celu w y o d ręb n ien ia grzybów z p ow ierzchni korzeni (rizoplana) w y p łu k an e w 9 -k rotn ej kąp ieli korzenie (jak w yżej) osusza się w w a ru n k ach jałow ych, tn ie n a fra g m e n ty długości 5 m m i um ieszcza n a p ły t k ach z pożyw ką H a g e n - M e l i n [31] lub n a agarze M artin a. In k u b ac ja trw a 6 dni w tem p e ra tu rz e 23°C. P o tem odszczepia się i id e n ty fik u je w yrosłe grzyby.
b. M o d yfika c ja w g Parkinsona [17, 38]
W y k o n a n i e . Pozbaw ione gleby (przez otrząśnięcie) korzenie (jak w p unk cie 1) przenosi się do jałow ej p ły tk i i przez w strząsan ie nią od dziela się n ajd ro b n iejsze części gleby rizosferow ej, przyleg ającej do ko rzeni. P o rc je gleby o ciężarze 0,005-0,01 g przenosi się do n a stę p n y c h jałow ych p ły te k i rozk ru sza igłą. N a tę glebę n alew a się 8-10 m l o stu dzonej pożyw ki agarow ej i dokładnie m iesza. W yrosłe g rzy b y przesiew a się na skosy agarow e (np. ag ar glikozow o-ziem niaczany).
c. Izolowanie g rzyb ó w z pow ierzchni korzeni (rizoplana) [39, 47] W ykonanie. R ośliny w y k o pu je się ostrożnie nie n a ru sz a ją c sy ste m u korzeniow ego. K orzenie otrząsa się z p rzy leg ającej gleby i op łu- k u je w bieżącej wodzie. W y p rep aro w u je się cienkie nie zdrew niałe korzonki, k tó re tn ie się n a fra g m e n ty długości 5 cm i um ieszcza w 50-m ili- litro w y c h kolbach E rle n m ey e ra z 20 m l jałow ej w ody. W y trząsa się przez 5 m in, d e k a n tu je i 4 -k ro tnie zm ienia w odę w y trzą sa ją c za k ażd ym razem przez 1 m in. N astępnie korzenie przenosi się do św ieżej p o rcji w ody i 4 -k ro tn e p łu k an ie p o w tarza jeszcze 5 razy. W y płu kan e fra g m en ty ko rzen i przenosi się na jałow ą p ły tk ę i obcina 5-m ilim etrow e odcinki z obu końców każdego frag m en tu . Te odcinki w y k ład a się n a pożyw kę M artin a i h o d u je w tem p e ra tu rz e 20-22°C. W yrosłe strz ę p k i przesiew a się n a skosy.
d. Izolowanie g rzyb ó w z w n ę tr za korzeni [25, 26, 27, 28]
W y k o n a n i e . K orzenie tn ie się na odcinki długości 3 cm, płucze s ta ra n n ie w odą w odociągow ą i d ezy n fek u je (alkohol e ty lo w y — 10-15 sek, su b lim ât — 30 sek, w oda d esty lo w ana i jało w a po 90 sek). Po w y ja ło w ieniu korzenie tn ie się n a odcinki 5 m m i w k ła d a n a agar glikozow o- ziem niaczany. Po in k u b ac ji w tem p e ra tu rz e pokojow ej odszczepia się ro zw ijające się kolonie n a skosy agarow e.
VI. METODY BAD A NIA INTENSYWNOŚCI WZROSTU GRZYBÓW M ają one zastosow anie w b ad an iach nad w pływ em różny ch czynników na grzyby.
1. P O M IA R P R Z Y R O S T U Ś R E D N IC Y K O L O N II [57]
W y k o n a n i e . P rzy g o to w u je się zaw iesinę zaro d n ik ń w grzy bó w w p ó łp ły n n y m agarze w o d n y m (0,3% agaru). T aką zaw iesiną zaszczepia
się p ły tk i z agarem glikozow o-ziem niaczanym um ieszczając kroplę za w iesiny na śro d k u p ły tk i. W celu u n ik n ięcia ro zp ry sk iw an ia się z aro d ników szczepienia dokon u je się p rzy odw róconej płytce. P ły tk i in k u b u je się w te m p e ra tu rz e 21-25°C doko n u jąc przez 10 dni co 24 godz. pom iarów śred n icy kolonii grzyba.
2. O Z N A C Z A N IE P R Z Y R O S T U SU C H E J M A S Y G R Z Y B Ó W [33, 43, 47]
W y k o n a n i e . P ły n n ą pożyw kę dla grzybów w ilości 20 m l rozlew a się do 100-m ililitrow ych kolbek E rlen m ey era i zaszczepia 0,5 m l w odnej zaw iesiny zarodników grzyba. Zaw iesinę p rzy gotow uje się z 7-dniow ej k u ltu ry grzy ba na skosie agaro w y m sp łu k u ją c ją 5 m l jałow ej w ody. Po 10 d niach hodow li w tem p e ra tu rz e 20-25°C g rzybnię oddziela się od po żyw ki na zw ażonym sączku bibułow ym , tk an in ie jed w abn ej lub sicie 0 bardzo d ro b n y ch oczkach, przem y w a dokładnie w odą i suszy do stałej w agi w tem p e ra tu rz e 80°C.
G rzyby ro zw ijające się słabo w p ły n n y ch pożyw kach m ożna hodow ać na p ły tk a c h agarow ych. Po in k u b ac ji p ły tk i podgrzew a się w celu ro z puszczenia agaru , n astęp nie odsącza się n a bibule i płucze gorącą w odą. Dalsze postępow anie ja k w yżej.
VII. BADANIA ZDOLNOŚCI KIEŁKOWANIA ZARODNIKÓW
1. B A D A N I E W P Ł Y W U A N T A G O N IS T Ó W N A K IE Ł K O W A N IE Z A R O D N IK Ó W [42]
W y k o n a n i e . Szczep d ro b n o u stro ju antagonistycznego, w y ro sły w postaci ry sy na płytce, zalew a się 2 m l zaw iesiny zarodników badanego grzy ba w rozpuszczonym agarze glikozow o-ziem niaczanym . K iełkow anie zarodników spraw dza się um ieszczając p ły tk i pod m ikroskopem po 1, 3 1 7 dniach. Po zaobserw ow aniu stre fy zaham ow ania w zrostu grzyba w y cina się skalpelem paski ag aru z ty ch stref. U m ieszcza się je n astę p n ie na szkiełku przedm iotow ym , u trw a la i b arw i roztw o rem b łęk itu b aw e łn ia nego lakto fen olu (2-3 m in), n astęp n ie się płucze. S praw d za się pod m ik ro skopem zaham ow anie k iełkow ania zarodników .
2. B A D A N I E W P Ł Y W U F U N G IC Y D Ó W N A K IE Ł K O W A N IE Z A R O D N IK Ó W [3, 4, 2*0]
W y k o n a n i e . Na dw óch szkiełkach p rzedm iotow ych um ieszcza się po 3 k rążk i w yk onane z p a ra fin y , o w ew n ętrzn ej śred n icy 7 mm. W nich um ieszcza się po ok. 0,05 m l ro ztw oru badanego p re p a ra tu , k tó ry w ysusza
się w tem p e ra tu rz e pokojow ej. Na suchy osad środka grzybobójczego nanosi się 0,05 m l zaw iesiny zarodników . P rzy g o to w u je się ją z 5-dniow ej hodow li grzyba sp łu k u ją c w zrost w odą. Zaleca się przem ycie sp łu k an y ch zarodników jałow ą w odą i odw irow anie. S zkiełka z naniesio ny m i kroplam i um ieszcza się następ nie na 24-42 godz. w w ilgotnej kom orze w 20°C. Po ty m czasie oblicza się pod m ikroskopem pro cent skiełko w any ch zaro d n i ków, an alizu jąc po 50 zarodników w każdym k rąż k u (razem 300 zaro d ników). W yniki w yraża się w procencie zarodników nie w y kiełk ow an ych oraz w stopniach skuteczności obliczonych w sto su n k u do k o n tro li (bez fungicydu). S topień skuteczności oblicza się wg w zoru:
gdzie:
A — ilość zarodników w y k iełko w an y ch w kom binacji k o n tro ln e j, В — ilość zarodników w y k iełko w an y ch w ko m bin acji b adanej.
N a podstaw ie co n a jm n ie j 5 stężeń p re p a ra tu w y k reśla się k rzy w ą ED (effective dose) i graficznie w yznacza w artość ED50 (daw ka h a m u ją ca k ie ł kow anie w 50°/o).
VIII. OTRZYMYWANIE KULTUR Z JEDNEGO ZARODNIKA [41]
1. W y k o n a n i e . 10 m l rozpuszczonej pożyw ki agarow ej szczepi się niew ielką ilością zarodników grzy b a i w ylew a n a pły tkę. R eszta pożyw ki pozostała w probów ce służy jako in oculum do zaszczepienia n a stę p n e j probów ki z rozpuszczoną pożyw ką, k tó rą w ylew a się rów nież na p ły tkę. W ten sposób o trzy m u je się coraz rzadszą zaw iesinę zarodników w po żywce. Po 24-48 godz. hodow li w yb iera się z p ły te k pod lup ą lub pod m ały m pow iększeniem m ikroskopu 1 w y k iełko w an y zarodnik, w ycina się go w raz z otaczający m agarem i przenosi na św ieżą pożywkę.
2. W y k o n a n i e . Na p ły tk ę z pożyw ką agarow ą w ylew a się rzadk ą zaw iesinę zarodników grzyba w wodzie. Po p a ru m in u tac h n a d m ia r w ody zlew a się. Część zarodników pozostaje przy tw ierd zo n a do pow ierzchni agaru. Po k ró tk ie j in k u b ac ji w szczepia się pojedyncze zarodniki na p ły tk i ze św ieżą pożyw ką.
L i l l y i B a r n e t t [23] podają łatw y sposób w yizolow ania p o je dynczych zarodników z agaru. M ałą igłę do szycia um ieszcza się o stry m końcem w uchw ycie. D rugi jej koniec zagina się tak, aby mógł być um ieszczony rów nolegle do pow ierzchni agaru. Uszko zaokrągla się i spiłow uje w ten sposób, aby od s tro n y ag aru tw orzyło oczko. Na płytce pod m ałym pow iększeniem m ikroskopu z n a jd u je się skiełko w any p o je d y n czy zarodnik. Igłę um ieszcza się n ad nim w ten sposób, aby przez
uszko m ożna było w idzieć zarodnik. W bija się uszko w agar i w raz z nim przenosi zaro dn ik n a św ieżą pożyw kę.
3. W y k o n a n i e . Z aw iesinę spor w wodzie lub w p ły n ie fizjologicz nym rozcieńcza się dotąd, dopóki 1 eza nie zaw iera 1 zarod nik a (spraw dzić pod m ikroskopem ). N astępnie przenosi się ezą krople zaw iesiny n a agar sp raw d zając pod m ikroskopem , gdzie z n a jd u ją się pojedyncze zarodniki. M iejsca te zaznacza się na dnie p ły tk i. Po in k u b ac ji kolonię pow stałą z 1 zaro dn ik a przeszczepia się n a św ieżą pożyw kę.
4. M etoda H ansena w y o d ręb n ian ia grzybów o dużych zaro dnikach [15]. W y k o n a n i e . S porządza się zaw iesinę spor w rozpuszczonej pożywce agarow ej. W ciąga się ją do k a p ila r o św ietle nieznacznie w iększym od śred n icy zarodników . P o d m ikroskopem w y n a jd u je się m iejsca w k ap i- lara ch zaw ierające po jed n y m zarodniku. Te m iejsca w y ła m u je się z k a pilar, jałow i zew n ętrzn ie i przenosi na p ły tk i ze św ieżą pożyw ką.
IX. METODY OBSERWACJI ORGANÓW ROZMNAŻANIA U GRZYBÓW
1. B E Z P O Ś R E D N I A O B S E R W A C J A M IK R O S K O P O W A
Je st to n a jp ro stsz y i najp o w szech n iejszy sposób obserw ow ania org a nów rozm n ażania u grzybów .
W y k o n a n i e . G rzyby h o d u je się n a pożyw kach u n iw ersaln y ch , np. pożyw ka glikozow o-ziem niaczana, brzęczkow a, pożyw ka z w yciągu słodow ego lub pożyw ka C zapek-D oxa. P o o trzy m an iu obfitego w zrostu (9-12 dni hodow li lub dłużej) do w ieczka odw róconej p ły tk i w lew a się k ilk a m ililitró w 5-10-procentow ego ro ztw o ru fo rm alin y i jałow i się grzyb przez 10-12 godz. Po ty m zabiegu m ożna z hodow li g rzyba w yk raw ać w ycin ki do obserw acji m ikroskopow ej. W p rzy p a d k u grzybów tru d n o ow ocujących należy stosow ać pożyw ki n a tu ra ln e , jak pożyw ka m archw io- w a, fasolow a, śliw kow a i inne.
W p rac y z grzyb am i należy zw racać baczną uw agę n a aseptyczne w a ru n k i p racy , gdyż w szelka nieostrożność, np. prep aro w an ie żyw ych zaro d n ik u ją c y c h hodow li, pow oduje rozsiew anie się zarodników w po w ietrzu , co n astęp n ie uniem ożliw ia u trz y m an ie grzybów w czystych hodow lach i grozi zakażeniem p racow ników przez grzy b y chorobotw ór cze, w y stęp u jące w glebie.
2. M IK R O K U L T U R Y
Ten ty p hodow li grzybów sto su je się do rodzajów tw orzących m ałe sporofory. W hodow lach tego ty p u m ożna rów nież obserw ow ać a k ty w ność kiełk ow an ia zarodników .
W y k o n a n i e . D w a szkiełka p rzedm iotow e um ieszcza się w p łytce na zgiętej tró jk ą tn ie g ru b ej bagietce. Całość jałow i się w autoklaw ie. Z pożyw ki agarow ej w y la n e j n a p ły tk ę w ycina się dw a k rąż k i i przenosi na szkiełka um ieszczone w płytce. K rążk i zaszczepia się k u ltu rą badanego g rzyba i z ak ry w a w y jało w io n y m szkiełkiem n ak ry w k o w y m . Na dno p ły tk i nalew a się k ilk a m ililitró w jałow ego 20-procentow ego ro ztw o ru glicerolu, w celu zapew nienia odpow iedniej w ilgotności pow ietrza w p ły t ce. Po k ilk u d niach in k u b ac ji obserw u je się sporofory w y ra sta jąc e pod szkiełkiem n a k ry w k o w y m n a brzegu k rąż k a agarow ego.
3. H O D O W L A N A K W A D R A C IK A C H C E L O F A N O W Y C H [41]
W y k o n a n i e . K w ad racik i celofanow e n asyca się rozcieńczoną po żyw ką, osusza b ib u łk ą i um ieszcza w płytce. Jało w i się w bieżącej p arze w odnej. 6-8 kw ad racik ó w um ieszcza się w jałow ej p ły tce na zw ilżonej bibule. K ażdy k w a d ra cik szczepi się w jed n y m lub k ilk u m iejscach i in k u - b u je. K w ad racik i w y jm u je się co pew ien czas w celu sp raw d zen ia p o ja w ian ia się ciał ow ocujących. W celu o trzy m an ia p rz e jrz y sty c h cienkich kolonii należy używ ać pożyw ki rozcieńczonej 10-100-krotnie. W celu ob serw acji zdolności k iełkow an ia zarodników tą m etodą używ a się po żyw ek o p ełn y m składzie.
X . METODA PRZECHOWYWANIA KULTUR
1. P R Z E C H O W Y W A N IE P O D O L E JE M P A R A F IN O W Y M
J e st to najczęściej stosow any sposób p rzy ch o w y w an ia k u ltu r grzybów . W ty c h w a ru n k a c h pozostają one praw ie nie zm ienione zachow ując ży w otność przez k ilk a lat.
W y k o n a n i e . G rzyb h o d u je się n a k ró tk im skosie agarow ym . Po u zy sk an iu dobrego w zro stu i zaro dn ik ow an ia hodow lę zalew a się jało w ym olejem p ara fin o w y m (jałow ic 30 m in przy ciśnieniu 1 at) z an u rzając całą hodow lę pod olej.
2. P R Z E C H O W Y W A N IE W J A Ł O W E J G L E B IE
W y k o n a n i e . Zm ieszać 1 część ogrodow ej gleby, 1 część grubego piasku, V°/o C a C 0 3, rozdzielić do probów ek, zakorkow ać w atą, w y jałow ić 30 m in w 1 at. S praw dzić jałow ość gleby na bulionie odżyw czym . Z a szczepić ok. 2 m l zaw iesiny zarodników . Po ok. 10 dniach in k u b ac ji uszczelnić k o rk i p a ra fin ą .
3. P R Z E C H O W Y W A N IE N A Ź D Ź B Ł A C H S Ł O M IA N Y C H
W y k o n a n i e . Um ieścić w probów kach źdźbła słom y długości 2-3 cm. Dodać 2-3 m l w ody, w yjałow ić, zaszczepić grzybem . W yhodow ać go w ciągu ok. 10 dni, dopóki w oda na dnie nie w yschnie. N astępnie cały ko rek z w aty w kręcić do probów ki, a w ylot uszczelnić p arafin ą.
Podobnie m ożna przechow yw ać k u ltu ry grzybów na w ysuszonych skosach agarow ych.
XI. SPIS PODSTAWOWYCH POŻYWEK
A g a r g l i k o z o w o - p e p t o n o w y M a r t i n a [17,34] A gar 20,0 g k h2p o4 1,0 g M g S 0 4-7H 20 0,5 g pepton 5,0 g glikoza 10,0 g w oda destylow . 1000,0 m l róż bengalski 10,0 m l ro ztw o ru 1 : 300 stre p to m y c y n a 30 m cg/m l lub aureo m y cy n a 2 m cg/m l
P r z y g o t o w a n i e . W szystkie sk ład n ik i, oprócz różu bengalskiego i an ty b io ty k u , rozpuszcza się w wodzie. M ieszaninę ogrzew a się powoli do zagotow ania. O dstaw ia się i dodaje ro ztw ór różu bengalskiego. P rzed w y lan iem pożyw ki n a p ły tk i dodaje się roztw ó r a n ty b io ty k u w jałow ej wodzie. Ze w zględu n a liczne d ro b n o u stro je strep tom y cyn oo dp orne spo ty k an e w glebie b ardziej polecane jest stosow anie aureom ycy ny .
E k s t r a k t g l e b o w y [18]
500 g b ad an ej gleby zalać 1500 m l wody. Po 24 godz. zdekantow ać i przesączyć przez f iltr bakteriologiczny. D odaw ać do pożyw ki po w y ja łow ieniu, przed w y lan iem n a p ły tk i.
A g a r g l i k o z o w o - z i e m n i a c z a n y [17, 40]
A gar 17,0 g
ziem niaki (obrane i po
krojone) 200,0 g
glikoza 20,0 g
w oda 1000,0 m l
Z iem niaki go tu je się przez 1 godz. lub p a ru je w au to k law ie przez 40 m in z 500 m l w ody. A gar rozpuszcza się w pozostałych 500 m l wody. W yciąg z ziem niaków d e k a n tu je się i sączy łącząc go z rozpuszczonym
ag arem i glikozą. O bjętość dopełnia się w odą do 1000 ml. Jało w i się w bieżącej parze przez 3 dni po 30 m in.
A g a r C z a p e k - D o x a [17,48] A gar 15,0 g N a N 0 3 2,0 g k2h p o4 1,0 g M g S 0 4-7H 20 0,5 g KC1 0,5 g F e S 0 4 • 7H20 0,01 g sacharoza 30,0 g w oda d esty lo w an a 1000,0 m l
Sacharozę dodaje się tuż przed jałow ieniem . M ożna dodać do pożyw ki 1 g w yciągu drożdżowego. P o ż y w k a H a g e n - M e l i n [31] G likoza 20,0 g w yciąg słodow y 5,0 g K H 2P 0 4 1,0 g am on b u rsz ty n ia n 0,5 g M g S 0 4-7H 20 0,5 g Z n S 0 4 0,5 m l (1 : 500 roztw . wodnego)
c y try n ia n żelaza 0,5 m l (l°/o roztw . wodnego)
w itam in a В 50 mcg
agar 15,0 g
w oda d estylo w ana 1000,0 m l
P o ż y w k a n a w y c i ą g u s ł o d o w y m W yciąg słodow y 30,0 g „M alto” a gar 17,0 g w oda 1000 m l P o ż y w k a m a r c h w i o w a z g l i k o z ą [41]
100 g m arch w i pokrojo n ej d robno g o tu je się 1 godz. w 1 1 w ody. Sączy się, dopełnia w odą do 1 1, d odaje 2%> sacharo zy oraz 1,5-2,0% agaru. Jałow ość 20-30 m in przy ciśnieniu 1 at.
P odobnie p rzy g o tow uje się pożyw kę z fasoli (50 g fasoli na 1 litr wody). P o ży w ka ze śliw ek (80 g suszonych śliw ek n a 1 1 wody) bez d o d atk u c u k ru n a d a je się do hodow li w iększości grzybów .
P o ż y w k a OAES (wg przep isu Ohio A g ricu ltu ra l E x p e rim en ta l S tation) [19]
G likoza 5,0 g
N a N 0 3 1,0 g M g S 0 4 0,5 g KH2PO4 1,0 g siarczan stre p to m y c y n y 0,050 g ch lo ro m ycetyn a 0,050 g o xgall 1,0 g
propio nian sodu 1,0 g
a g ar 20,0 g
w oda d estylo w ana 1000 m l
Jałow ic w 3/4 a t przez 15 m in.
R o z t w ó r b ł ę k i t u b a w e ł n i a n e g o w l a k t o f e n o l u [41J B łęk it b a w e łn ia n y 0,05 g lak to feno l 100,0 m l L a k t o f e n o l d o u t r w a l a n i a h o d o w l i [41] Fenol 10,0 g kw as m lekow y 10,0 g glicerol 20,0 g w oda desty lo w an a 10,0 m l
F enol z w odą ogrzew a się do rozpuszczenia. N astępnie dodaje się kw as m lekow y i glicerol.
LITERATURA
[1] A l l e n O. N.: Experim ents in soil bacteriology. Burgess Publ. Co. M inneapolis, 1951.
[2] A l e x a n d e r F. E. S., J a c k s o n R. M.: Preparation of sections for study of soil m icroorganism s. Soil Zoology, Butterw orth Scientific Publications - -London, Acad. Press, N ew York 1955.
[3] B o r e c k i Z., B u r k o w i c z A.: Badania biologiczne nad fungicydem Ro- datox i jego zastosow aniem w ochronie sadów. Acta Agrobot., X II, 149-173, 1962. [4] B o r e c k i Z., C z e r w i ń s k a E., E c k s t e i n Z., K o w a l i k R.: Che
m iczne środki grzybobójcze-fungicydy, PWRiL, W arszawa 1965.
[5] B u r g e s A.: The soil m icroflora — its nature and biology. Ecology of soil born plant pathogens-prelude to biological control. Univ. Calif. Press, B er keley, Los A ngeles 1965.
[6] B u r g e s A., N i c h o l a s D. P.: U se soil sections in studying amount of fungal hyphae in soil. Soil Sei., 92, 25-29.
[7] B u r g e s A.: M icroorganisms in the soil. Hutchinson Univ. Library, London 1964. [8] C h a k r a v a r t y Т., В o s е е R. G., B a s u S. N.: Fungi grow ing in jute
fabrics deteriorating under w eather exposure and in storage. Appl. Microbiol., 10, 5, 1962, 441-447.
[9] C h e s t e r s C. G. C.: A m ethod for isolating soil fungi. Trans. Brit. Mycol, Soc., 24, 1940, 352-355.
[10] E t c h e l s J. L., С о s t i 1 o w R. N., В e 11 T. A., D e m a i n A. L.: Appl. Microbiol., 2, 1954, 296-300.
[11] C h e s t e r s C. G. C.: A contribution to the study of fungi in th e soil. Trans. Brit. Mycol. Soc., 30, 1948, 100-117.
[12] G a m s W.: Isolierung von Hyphen aus dem Boden. Sydow ie, Annales M yco logie., II, 13, 1959, 1-6.
[13] H a a r l o v a. W e i s s - F o g h : A m icroscopical technique for studying the undisturbed texture of soils. Soil Zoology. B utterw orth Scientif. Publications, London Acad. Press N. Y., 1955.
[14] H a r l e y J. L., W a i d J. S.: A m ethod of studying active m ycelia on livin g roots and other surfaces in the soil. Trans. Brit. Mycol. Soc., 38, 1955, 104-119. [15] H a n s e n H. N.: A sim ple m ethod of obtaining single spore cultures. Sei. 64,
1926, 384.
[16] H o r t o n J. C., K e e n N. T.: Regulation of induced cellulose synthesis in Pyrenochaeta terrestris Gorntz at al. by utilizable carbon compounds. Can. J. Microbiol., 12, 1966, 209-220.
[17] J o h n s o n F. L., C u r l E. A., B o n d J. H., F r i b o u r g H. A.: Method for studying soil m icroflora-plant disease relationships. Burgess Publ. Comp., M inneapolis, Minn., 1960.
[18] J o h n s o n F. L., M a ń к a K.: M odification of Warcup’s soil plate method for isolating soil fungi. Soil Sei., 92, 1961, 79-84.
[19] K a u f m a n n D. D., W i l l i a m s L. E., S u m n e r C. В.: The effect of plating m edium and incubation tem perature on growth of fungi in soil dilution plates. Can. J. Microbiol., 9, 1963, 741-751.
[20] K o o p m a n s M. J.: Fungicide Research. P hilip s Technical R eview , 17 (7-8), 1956, 222-229.
[21] K u l i ń s k a D., M o l s k a I.: M etody inw entaryzacji grzybów glebowych. Post. Mikrobiol., 2, 1962, 245-252.
[22] К u b i e n a W. L.: Micropedology, Iowa 1938.
[23] L i l l y V. G., B a r n e 11 H. L.: Fizjologia grzybów. Tłum aczenie, PWRiL, W arszawa 1959.
[24] M a c W r i t h e y H. S.: Another m odification of the C hester’s tube m ethod for exam ination of soil miaroflora. Rept. 36th Ann. Conven. N orw est Ass. Hort. Etomol. and P lan t Pathol., 1957.
[25] M a ń k a I.: Badania terenowe i laboratoryjne nad opieńką m iodow ą A r m il- laria melles (Vahl.) Quel. W arszawa 1953.
[26] M a ń k a K., T r u s z k o w s k a W.: Próba m ykologicznej analizy korzeni świerka Picea excels LK. Acta Soc. Bot. Pol., XVII, 1958, 45-73.
[27] M a ń k a K., G i e r c z a k M.: Badania nad florą grzybową korzeni sosny zwyczajnej Pinus silvestris (L). P.T.P.N. IX, 1961, 1, 3-47.
[28] M a ń k a K., R z ą s a S.: Badania nad m ikroflorą korzeniową drzew leśnych. Folia Forest. Polon., 6, A, 1961, 27-48.
[29] M a ń k a K., B ł o ń s k a A., W n ę k o w s k i S.: Badania nad skła-dem m ikoflory kilku rodzajów gleb i jej oddziaływ anie na rozwój niektórych pasożytniczych grzybów glebowych. Prace Nauk. Inst. Ochr. Roślin, 3, 2, 1961. 145-231.
[30] M a ń k a K.: Próby dalszego udoskonalenia zm odyfikowanej m etody Warcupa izolowania grzybów z gleby. P.T.P.N., 17, 1964, 29-45.
[31] M a ń k a K.: Saprophytic soil fungi as a factor determ ining the developm ent of phytopathogenic fungi livin g in the soil. Wyd. P ow iel. IOR, Poznań 1965. [32] M a ń k a K., K o w a l s k i S.: Porów nawcze studium nad m etodam i izolo
[33] M a r s h a l l C. K., A l e x a n d e r M.: Competition between soil bacteria and Fusarium. Plant a. Soil, 2, I960, 143.
[34] M a r t i n J. P.: Use of acid, rose bengal and streptom ycin in the plate m ethod of estim ating soil fungi. Soil Sei., 69, 1950, 215-233.
[35] M i l l e r J. J.: Isolation of yeasts from soil w ith the aid of acid, rose bengal and oxgall. Soil Sei., 77, 1954, 197-204.
[36] M i n d e r m a n n G.: The preparation of m icrotom e sections of unaltered soil for the study of soil organisms in situ. Pant and Soil, 8, 1956, 42-48.
[37] M u e l l e r K. E., D u r r e l l L. W.: Sam pling tubes for soil fungi, P hyto- pathol., 1957, 47, 423.
[38] P a r k i n s o n D.: N ew methods for the qualitative and quan titative study of fungi in the rhizosphere. Sym posium Methodes d’Etudes M icrobioloques du Sol, Louvain.
[39] P e t e r s o n E. A.: Observations of fungi associated w ith plant roots. Can. J. Microbiol., 4, 1958, 257-265.
[40] R i к e r A. J., R i к e r R. S.: Introduction to research on plant disceases. John S w ift and Co., St. Louis, Mo., 1936.
[41] S m i t h G., R a i s t r i c k H.: An introduction to industrial m ycology. Ed. Arnold and Co. Ltd., London 1946.
[42] S t e v e n s o n I. L.: A ntibiotic activity of actinom ycetes in soil as dem on strated by direct observation techniques. J. Gen. Microbiol., 15, 1956, 372-380. [43] S t r z e l c z y k E., S t r z e l c z y k A.: W pływ środków owadobójczych
i grzybobójczych na m ikroflorę gleby. Annales UMCS, Sec. E, 18, 1963, 55-71. [44] S t r z e l c z y k E.: Studies on the rhizosphere m icroflora of plants resistant
and susceptible to soil borne diseases. I. Microbial characteristics of rhizosphere and non-rhizosphere soil. Acta Microbiol. Polon., 12, 1963, 211-223.
[45] S t r z e l c z y k E.: Studies on the rhizosphere m ikroflora of plants resistant and susceptible to soil borne diseases. II. E ffect of aminoacids and vitam ins on growth of Thielaviopsis basicola and Fusarium oxysporum f. Uni. Acta Microbiol. Polon., 13, 1964, 137-148.
[46] S t r z e l c z y k E.: Studies on the rhizosphere m icroflora of plants resistant and susceptible to soil borne diseases. III. Incidence of antagonists and com peti tors of Fusarium oxysporum /. Uni and Thielaviopsis basicola in rhizosphere and non rhizosphere soil. Acta Microbiol. Polon., 14, 1965, 87-100.
[47] S t r z e l c z y k E., S z e m b e r A., W y c z ó ł k o w s k i A.: Fungi associated w ith roots of tobacco resistant and susceptible to black root rot. Acta M icro biol. Polon., 14, 1965, 315-320.
[48] T h o m C., R a p e r K. B.: A m annual of Aspergilli. W illiam s a. W ilkins Co., B altim ore Md. 1945.
[49] T h o r n t o n R. H.: The screend immersion plate — a method of isolating soil microorganism s. Research, 5, 1952, 190-191.
[50] T h o r n t o n R. H.: Rhizoctonia in natural grassland soils. Nature, 177, 1956, 230-231.
[51] W a к s m a n S. A.: Do fungi live and produce m ycelium in the soil? Sei., N.S., 44, 1916, 320-322.
[52] W a г с u p J. H.: The soil-p late method for isolation of fungi from soil. Nature, 166, 1950, 117-118.
[53] W a r e u p J. H.: Isolation of fungi from hyphae present in soil. Nature, 175, 1955, 953-955.
[54] W a r c u p J. H.: Studies on Basid io mycetes in soil. Trans. Brit. Soc. Mycol., 1, 1959, 227-231.
[55] Z i e m i ę c k a J.: Mikrobiologia gleby i nawozów organicznych. PWRiL,
Warszawa 1958.
[56] Z i e m i ę c k a J.: The ecology of soil fungi. Intern. Symp. Liverpool Univ. Press, I960.
[57] V i n c e n t J. M.: J. Soc. Chem. Ind., 66, 1947, 149. Opracowano w 1967 r.
А . С Т Р Ж Е Л Ь Ч И К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ ГРИБОВ П о л ь с к о е О б щ е ст в о П о ч в о в е д о в , К о м и с с и я Б и о л о г и и Р е з ю м е Описаны методы наиболее часто применяемые почвенными микробиоло гами и микологами. Методы касаются техники изолирования и идентифика ции грибов развивающ ихся в почве и в корневой системе растений. Описаны такж е методы культивирования, определения интенсивности их возраста, на блюдения органов размножения и хранения чистых культур грибов. A . S T R Z E L C Z Y K
METHODS OF STUDYING OF SOIL FUNGI
P o lis h S o il S c ie n c e S o c ie t y . C o m m isio n o f B io lo g y
S u m m a r y
The Methods m ost often applied by soil m icrobiologists and m ycologists are described.
They comprise the techniques of isolation and determ ination of fungi habitating the soil and plant roots, the m ethods of their cultivation, and growth m easurm ent, the observation of fruit bodies and storage of fungal pure cultures.
