Charakterystyka proteazy i serpiny Tannerella forsythia

Uniwersytet Jagielloński

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Zakład Mikrobiologii

Mirosław Książek

Charakterystyka proteazy i serpiny Tannerella forsythia.

Praca doktorska

Promotor: prof. dr hab. Jan Potempa

Kraków, rok 2014

Podziękowania dla:

prof. dr hab. Jan Potempa Za możliwość przygotowania pracy magisterskiej, okazaną życzliwość oraz zawsze cenne uwagi.

Rodziców i braci

Za okazaną cierpliwość i wyrozumiałość.

Spis treści

Spis treści ... 3

Streszczenie ... 4

Abstract ... 5

Artykuły stanowiące podstawę ubiegania się o tytuł doktora ... 6

Wprowadzenie ... 7

Cel naukowy ... 11

Osiągnięte wyniki ... 12

Podsumowanie wyników ... 18

Pozostałe osiągnięcia naukowe ... 20

Literatura ... 21

Publikacja I ... 25

Publikacja II ... 26

Streszczenie

Analiza genomu Tannerella forsythia, bakterii uważanej za czynnnik etiologiczny parodontozy u ludzi, ujawniła obencość genów kodujących domniemaną proteazę z rodziny subtylaz oraz domniemany inhibitor z superrodziny serpin, nazwanych, odpowiednio, mirolazą i miropiną. Wobec tego zdecydowaliśmy otrzymać oba białka w formie rekombinowanej, a następnie je scharakteryzować.

Mirolaza jest syntetyzowana jako nieaktywny, wielodomenowy zymogen (85 kDa), który aktywuje się poprzez kolejne cięcia autoproteolityczne do dojrzałej formy (40 kDa), składającej się tylko z domeny katalitycznej. Za latencję mirolazy odpowiedzialny jest N-terminalny profragment (NTP). W przeciwieństwie do niemal wszystkich znanych bakteryjnych subtylaz, odcięty NTP nadal był niekowalencyjnie związany z mirolazą, hamując jej proteolityczną, ale nie amidolityczną aktywność. Następnie NTP był stopniowo degradowany, co prawadziło do pełnej aktywacji enzymu. Zarówno proces aktywacji jak i sama aktywność mirolazy była hamowana przez EDTA, ale w sposób odwracalny przez nadmiar Ca

. Mirolaza jest specyficznym enzymem, który poprzez degradację fibrynogenu, hemoglobiny i peptydu antybakteryjnego LL-37 może przyczyniać się do patogenności T. forsythia.

Miropina jest wydzielniczą lipoproteiną. Miropina wydajnie hamowała mirolazę, subtylizynę Carlsberg, ludzką katepsynę G i elastazę neutrofilową, świńską elastazę trzustkową oraz trypsynę wołową ze stechiometrią inhibicji równą około 3 i stałą asocjacji wynoszącą od 2.7 x 10

(katepsyna G) do 7.1 x 10

M

s

(subtylizyna). Hamowanie proteaz zachodziło z wytworzeniem trwałych, kowalencyjnych kompleksów. Co ciekawe, hamowane proteazy rozpoznawały różne miejsca aktywne w obrębie pętli reaktywnej (RCL) miropiny, z dala od miejsca P1-P1’ przewidzianego na podstawie porównania sekwencji miropiny z innymi serpinami. Miropina jest więc wyjątkowa wśród hamujących serpin i prawdopodobnie uzyskała zdolność hamowania wielu proteaz kosztem wysokiej stechiometrii oraz niskiej wartości stałej asocjacji. W związku z powyższym miropina może być odpowiedzialna za przeżycie T. forsythia w środowisku o wysokiej aktywności proteolitycznej jakim jest płytka nazębna, gdzie T. forsythia jest narażona na działanie proteaz serynowych, a w szczególności elastazy i katepsyny G wydzielanych przez ludzkie neutrofile.

Wykonane badania doprowadziły do opisania dwóch nowych, a zarazem

wyjątkowych białek T. forsythia: proteazy serynowej, mirolazy i inhibitora

należącego do superrodziny serpin, miropiny, które mogą przyczyniać się do

patogenności T. forsythia.

Abstract

Analysis of the Tannerella forsythia genome, a bacterium implicated as an etiologic factor of human periodontitis, revealed the presence of genes encoding a putative subtilisin-like serine protease and an inhibitor of serine proteases, serpin denoted as mirolase and miropin, respectively. Therefore we decided to obtain both recombinant proteins and then characterize them.

Mirolase is produced as an inactive multidomain zymogen (85 kDa), which processed itself through sequential autoproteolytic cleavages into a final form (40 kDa), which is composed only from a catalytic domain. Mirolase latency was driven by the N-terminal profragment (NTP). In stark contrast to almost all known bacterial subtilases, the cleaved NTP remained non-covalently associated with mirolase, inhibiting its proteolytic, but not amidolytic activity. The NTP was subsequently degraded over time, which resulted in full activation of the enzyme.

Both auto-processing and mirolase activity were inhibited by EDTA, but reversed by excess of Ca

. Mirolase is a specific enzyme that may contribute to T. forsythia pathogenicity by degradation of fibrinogen, hemoglobin, and the antimicrobial peptide LL-37.

Miropin was found to be a secretory lipoprotein. Miropin effectively inhibited mirolase, subtilisin Carlsberg, human cathepsin G and neutrophil elastase, porcine pancreatic elastase, and bovine trypsin with stoichiometry around 3 and k

in the range from 2.7 x 10

(cathepsin G) to 7.1 x 10

M

s

(subtilisin). Inhibition occurred through formation of stable, covalent complexes.

Interestingly, target proteases recognised different active sites within the miropin’s reactive site loop (RCL) upstream of the P1-P1’ site predicted by alignment of the miropin sequence with other serpins. Thus, miropin is unique among inhibitory serpins, and it has apparently evolved the ability to inhibit a multitude of proteases at the expense of a high stoichiometry of inhibition and a low association rate constant. Therefore miropin may be responsible for survival of T. forsythia in highly proteolytic environment of dental plaque where T. forsythia is exposed to serine proteases, especially elastase and cathepsin G secreted by human neutrophils.

The conducted research leads to description of two novel and unique

proteins of T. forsythia: a serine protease, mirolase and an inhibitor from serpin

superfamily, miropin, which may contribute to T. forsythia pathogenicity.

Artykuły stanowiące podstawę ubiegania się o tytuł doktora

I. Ksiazek, M., Karim, A. Y., Bryzek, D., Enghild, J. J., Thøgersen, I. B., Koziel, J., and Potempa, J. (2014) Mirolase, a novel subtilisin-like serine protease from the periodontopathogen Tannerella forsythia. Biol Chem. 2014 Nov 13 doi:

10.1515/hsz-2014-0256

II. Ksiazek, M., Mizgalska, D., Enghild, J. J., Scavenius, C., Thogersen, I. B., and

Potempa, J. (2014) Miropin, a novel bacterial serpin from the

periodontopathogen Tannerella forsythia, inhibits a broad range of proteases by

using different peptide bonds within the reactive center loop. J Biol Chem. 2014

Nov 11. pii: jbc.M114.601716

Wprowadzenie

Tannerella forsythia jest gram-ujemną asacharolityczną bakterią bytującą w jamie ustnej człowieka. W jamie ustnej człowieka T. forsythia jest znajdowana w przestrzeni pomiędzy powierzchnią zębów a dziąsłami, gdzie wraz z wieloma innymi gatunkami bakterii tworzy poddziąsłową płytkę nazębną [1]. Poddziąsłowa płytka nazębna jest biofilmem utworzonym przez różne gatunki bakterii: zarówno gram-ujemne jak i gram-dodatnie. Płytka nazębna uzyskuje charakter patologiczny, kiedy wzrośnie w niej liczba bakterii z gatunków T. forsythia, Porphyromonas gingivalis i Treponema denticola, które tworzą grupę mikroorganizmów zwaną

„czerwonym kompleksem”. Poprzez wydzielanie różnych czynników wirulencji bakterie „czerwonego kompleksu” zaburzają lokalną homeostazę, co prowadzi do dalszego wzrostu liczby patogennych bakterii w obrębie płytki nazębnej, co w konsekwencji prowadzi do niekontrolowanego stanu zapalnego. Uwalniane w dużych ilościach czynniki prozapalne są bezpośrednią przyczyną uszkodzenia tkanek podporowych zębów i powstania choroby nazywanej parodontozą. W tym miejscu warto wspomnieć, że etiologia parodontozy jest bardzo skomplikowana, ponieważ w przeciwieństwie do innych znanych chorób, bakterie „czerwonego kompleksu” są wprawdzie uważane za główne periodontopatogeny, ale nie są one głównym składnikiem pod względem ilościowym w patologicznej płytce nazębnej. Obecnie uważa się, że bakterie „czerwonego kompleksu” są odpowiedzialne za przełamanie mechanizmów obronnych gospodarza, co prowadzi do powstania patologicznej płytki nazębnej i rozwoju choroby [2-4].

Postęp parodontozy objawia się zniszczeniem tkanek podporowych zębów, tj. dziąsła, ozębnej, okostnej, cementu korzeniowego oraz kości wyrostka zębodołowego, co prowadzi do powstania głębokich patologicznych kieszonek dziąsłowych [5]. Nieleczone zaawansowane postacie parodontozy, które dotykają 10-15% dorosłych ludzi na świecie, mogą w ostateczności doprowadzić do utraty zębów [6, 7]. Parodontoza nie wywołuje tylko zmian chorobowych w jamie ustnej, ale również przyczynia się do powstawania bardziej poważnych schorzeń, takich jak zachłystowe zapalenie płuc [8], reumatoidalne zapalenie stawów [9], cukrzyca [10], zapalenia wsierdzia i osierdzia [11], miażdżyca tętnic [12] oraz przedwczesne urodzenie dziecka [13].

Wspólną cechą bakterii „czerwonego kompleksu” jest wysoka

zewnątrzkomórkowa aktywność proteolityczna, która jest uważana za główny czynnik

wirulencji tych bakterii [14]. Wydzielnicze proteazy P. gingivalis i T. denticola są

bardzo dobrze opisane, w tym w szczegółach znana jest ich rola w powstawaniu

i rozwoju parodontozy [15, 16]. Gingipainy (RgpA, RgpB i Kgp), które są

odpowiedzialne za 85% zewnątrzkomórkowej aktywności P. gingivalis [17], są

zaangażowane w takie procesy jak pozyskiwanie składników odżywczych, obronę

przed atakiem antybakteryjnym wrodzonego układu odpornościowego oraz

immunomodulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza [18, 19]. W przypadku

T. denticola najlepiej scharakteryzowaną wydzielniczą proteazą jest dentylizyna. Ta

proteaza serynowa jest związana z powierzchnią T. denticola i jest odpowiedzialna

m.in. za koagregację z P. gingivalis, aktywację ludzkiego układu dopełniacza i degradację interleukiny 6, i 8 (IL-8), immunoglobulin A, i G, fibronektyny, lamininy oraz kolagenu typu IV [16].

W przeciwieństwie do pozostałych dwóch przedstawicieli „czerwonego kompleksu”, nasza wiedza na temat wydzielniczych proteaz T. forsythia jest wciąż ograniczona. Do tej pory opisano tylko dwie proteazy T. forsythia. Pierwszą z nich jest proteaza cysteinowa PrtH, której aktywność prowadzi do odczepienia komórek adherentnych od podłoża oraz do indukcji ekspresji IL-8 [20, 21]. Ponadto poziom PrtH jest powiązany z głębokością kieszonek dziąsłowych [22]. Natomiast drugą proteazą jest karilizyna, która jest bardziej podobna do ludzkich metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej niż do bakteryjnych metaloproteinaz [23, 24]. Karilizyna inaktywuje ludzki peptyd antybakteryjny LL-37, składnik wrodzonego układu odpornościowego niezbędny do zachowania homeostazy w jamie ustnej [25], hamuje wszystkie drogi aktywacji układu dopełniacza [26] oraz ścina z powierzchni ludzkich makrofagów w pełni biologicznie aktywną rozpuszczalną formę czynnika martwicy nowotworów α (TNFα) [27].

Karilizyna jest syntetyzowana jako 472 aminokwasowe wielodomenowe białko, które składa się, zaczynając od N-końca, z 19 aminokwasowego peptydu sygnałowego, 14 aminokwasowego propeptydu, 18-kDa domeny katalitycznej (CD) i C-terminalnego fragmentu (CTE), który jest zakończony 86 aminokwasową domeną C-terminalną (CTD) [23]. CTD została znaleziona w wielu białkach P. gingivalis oraz T. forsythia i jest odpowiedzialna za wydzielanie białek, m.in. gingipain, poprzez niedawno opisany IX system sekrecji (T9SS) (Figura 1) [28, 29].

Figura 1: Porównanie wielodomenowej budowy mirolazy i karilizyny.

We wnętrzu domeny katalitycznej (CD) zaznaczono reszty aminokwasowe kluczowe dla mechanizmu katalizy. SP - peptyd sygnałowy; NTP - N-terminalny profragment; CD - domena katalityczna;

CTE - C-terminalny fragment; CTD - domena C-terminalna; preCTD - domena poprzedzająca CTD;

PP - propeptyd.

Hamowanie aktywności proteaz wydzielanych przez bakterie jest uważane za

najlepszą strategię mającą na celu opracowanie skutecznej metody leczenia parodontozy

[30]. Jednakże biorąc pod uwagę redundancję proteaz, tzn. zdolność różnych proteaz do

pełnienia tych samych funkcji, wydaje się, że zahamowanie tylko jednej proteazy nie

będzie skuteczne. Wobec tego kluczowe jest scharakteryzowanie wszystkich

zewnątrzkomórkowych proteaz bakterii „czerwonego kompleksu” uważanych za główne periodontopatogeny. W związku z powyższym postanowiliśmy scharakteryzować proteazę serynową T. forsythia z rodziny subtylaz (bfor_c_1_10621;

Bioinformatics Resource For Oral Pathogens, www.brop.org) nazwaną przez nas mirolazą, która podobnie jak karilizyna, zawiera domenę katalityczną (CD) otoczoną unikalnymi domenami: N-terminalnym profragmentem (NTP) oraz C-terminalnym fragmentem (CTE) zakończonym CTD (Figura 1).

Oprócz domniemanych proteaz, w genomie T. forsythia znaleziono również otwartą ramkę odczytu (ORF), bfor_c_1_8111 kodującą domniemany inhibitor z rodziny serpin. Serpiny (ang. serine protease inhibitor) są rodziną białek posiadającą wspólny motyw strukturalny składający się trzech β-harmonijek (A-C) oraz co najmniej 7 α-helis (zazwyczaj 9, od A do I). Pomiędzy dwoma β-harmonijkami łańcuch peptydowy tworzy tzw. pętlę reaktywną (ang. reactive centre loop, RCL). RCL nie posiada struktury drugorzędowej i jest bardzo dobrze wyeksponowany do środowiska, a co za tym idzie jest idealnym substratem dla proteaz. W obrębie RCL znajduje się też specjalne wiązanie peptydowe, które jest nazywane miejscem aktywnym (ang. reactive site), które w ogromnej większości serpin jest pojedyncze oraz zakonserwowane w pozycji P1-P1’ [31]. Hydroliza serpiny w miejscu aktywnym wywołuje dramatyczne zmiany w konformacji inhibitora: pozostała, nieodcięta część pętli reaktywnej jest włączana jako czwarty łańcuch w β-harmonijkę A, czemu towarzyszy translokacja związanej z serpiną proteazy na drugi biegun cząsteczki inhibitora. W wyniku tego procesu proteaza ulega częściowej denaturacji oraz zostaje utworzony trwały, kowalencyjny kompleks serpiny z hamowaną proteazą [32]. Serpiny są jedyną znaną grupą inhibitorów enzymów proteolitycznych, która tworzy kowalencyjny kompleks z hamowaną proteazą.

Serpiny zostały znalezione we wszystkich organizmach wielokomórkowych zanalizowanych do tej pory: roślinach, nicieniach, owadach i kręgowcach, a w szczególności u ssaków [31]. Ludzkie serpiny są najlepiej opisane. Serpiny obecne we krwi są odpowiedzialne za hamowanie proteaz serynowych wydzielanych przez neutrofile, kontrolę procesów zapalnych, krzepnięcia, fibrynolizy i aktywacji układu dopełniacza, a serpiny wewnątrzkomórkowe chronią komórki przed proteazami uwolnionymi z lizosomów do cytoplazmy oraz są zaangażowane w odpowiedź przeciw patogenom [31, 33]. Niektóre serpiny nie hamują proteaz, ale pełnią inne ważne funkcje takie jak transport hormonów, białek opiekuńczych przy fałdowaniu białek czy też regulacja upakowania chromatyny DNA [31]. W przeciwieństwie do eukariontów, serpiny są rzadko znajdowane u prokariontów. Przez wiele lat uważano nawet, że serpiny nie są potrzebne organizmom jednokomórkowym. Jednakże sekwencjonowanie genomów bakterii ujawniło obecność ORF-ów, kodujących domniemane serpiny [34].

Serpiny nie są szeroko rozpowszechnione wśród prokariontów, ponieważ domniemane

serpiny znaleziono tylko w 31% i 13% pełni zsekwencjonowanych genomach,

odpowiednio, Archae i Bacteria [35]. Mimo to do tej pory scharakteryzowano tylko

kilka serpin: thermopin (bakteria termofilna Thermobifida fusca) [36], tengpin (bakteria

termofilna Thermobifida fusca) [37], aeropin (bakteria hypertermofilna Pyrobaculum

aerophilum) [38], Tk-serpin (bakteria hypertermofilna Thermococcus kodakaraensis) [39] oraz serpiny z Clostridium thermocellum [40] i Bifidobacterium longum [41].

Obecnie biologiczna funkcja większości prokariotycznych serpin, oprócz TK-serpiny oraz serpiny z B. longum i C. thermocellum, nie jest znana. Przypuszcza się, że TK-serpina może chronić T. kodakaraensis przed aktywnością wydzielniczej proteazy TK-subtilizyny [39], a serpina C. thermocellum wchodząca w skład cellulosomu może chronić tę wielobiałkową strukturę przed proteazami [40]. Podobnie przypuszcza się, że serpina B. longum, komensalnej bakterii izolowanej z jelita człowieka, chroni drobnoustrój przed elastazami: neutrofilową i trzustkową obecnymi w przewodzie pokarmowym człowieka [41].

Serpiny bakteryjne są znajdowane głównie w zupełnie niegroźnych dla człowieka bakteriach bytujących w różnych niszach środowiskowych. Co ciekawe, ORF-y kodujące serpiny znaleziono również w zsekwencjonowanych genomach bakterii wyizolowanych z jelita i jamy ustnej człowieka [42]. Wśród tych bakterii jest tylko jeden ludzki patogen, T. forsythia.

W poddziąsłowej płytce nazębnej T. forsythia jest narażona na działanie proteaz serynowych (m.in. elastaza, katepsyna G) wydzielanych przez ludzkie neutrofile [43].

Proteazy neutrofilowe zabijają bakterie poprzez hydrolizę ich białek powierzchniowych

[44]. Wobec tego postawiliśmy hipotezę, że serpina T. forsythia (bfor_c_1_8111),

nazwana przez nas miropiną, może być odpowiedzialna za przeżycie T. forsythia

w środowisku o wysokiej aktywności proteolitycznej, jakim jest płytka nazębna i co za

tym idzie postanowiliśmy scharakteryzować miropinę.

Cel naukowy

Parodontoza jest powszechnym schorzeniem, które prowadzi do uszkodzenia tkanek podporowych zębów, co może w ostateczności doprowadzić do utraty zębów. Ponadto parodontoza jest istotnym czynnikiem ryzyka w powstawaniu poważniejszych chorób takich jak cukrzyca, miażdżyca tętnic czy też reumatoidalne zapalenie stawów. Za główne czynniki etiologiczne parodontozy są uważane trzy gatunki bakterii, tworzące tzw. „czerwony kompleks”: P. gingivalis, T. denticola i T. forsythia. W przeciwieństwie do pozostałych dwóch członków „czerwonego kompleksu”, nasza wiedza o molekularnych mechanizmach wirulencji T. forsythia jest wciąż ograniczona.

W związku z powyższym postanowiono scharakteryzować dwa nieznane białka T. forsythia: proteazę serynową, mirolazę oraz serpinę, miropinę, a w szczególności:

i) przesekwencjonować ORF-y kodujące mirolazę (bfor_c_1_10621) i miropinę (bfor_c_1_8111) wraz z obustronnym otoczeniem;

ii) określić poziom ekspresji i wewnątrzkomórkową lokalizację badanych białek;

iii) scharakteryzować proteazę i serpinę pod względem biochemicznym oraz sprawdzić czy badane białka oddziałują ze sobą;

iv) określić potencjalne biologiczne funkcje mirolazy i miropiny.

Osiągnięte wyniki

Wyniki uzyskane dla karilizyny sugerują, że zsekwencjonowany genom T. forsythia ATCC43037 wciąż zawiera nieścisłości [23]. W związku z powyższym pierwszym etapem pracy było przesekwencjonowanie fragmentów genomu T. forsythia kodujących mirolazę i miropinę, wraz z obustronnym otoczeniem. Uzyskane wyniki pokazały w obu przypadkach obecność delecji skutkujących w przesunięciu N-końca obu białek. Wynik ten był niezwykle istotny, ponieważ umożliwił sklonowanie badanych białek o poprawnej długości. Przed przystąpieniem do dalszych prac sprawdzono czy oba badane białka są produkowane przez szczep laboratoryjny T. forsythia. W tym celu wykorzystano PCR w czasie rzeczywistym, a za poziom odniesienia wybraliśmy poziom ekspresji karilizyny (Figura 2, wyniki nieopublikowane).

Figura 2: Względny poziom ekspresji mirolazy i miropiny.

Poziom ekspresji określono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Poziom ekspresji karilizyny przyjęto arbitralnie jako 100. Przedstawione wyniki są średnią z trzech niezależnych eksperymentów.

Doświadczenie wykonane przez dr Danutę Mizgalską.

Oba białka są ekspresjonowane przez szczep laboratoryjny T. forsythia, a poziom ekspresji miropiny jest ponad 20 razy większy od poziomu ekspresji mirolazy.

Kolejnym pytaniem, które postawiono przed dalszą pracą, było czy badane białka są produkowane w szczepach klinicznych T. forsythia. Dzięki współpracy z zespołem badawczym Sigrun Eick (Universität Bern, School of Dental Medicine, Switzerland) wiemy, że mirolaza jest ekspresjonowana na poziomie mRNA w prawie 100%

szczepów klinicznych T. forsythia (liczba zbadanych szczepów: 37).

Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki wstępne sklonowano geny kodujące mirolazę oraz miropinę, bez peptydu sygnałowego w przypadku mirolazy, do wektora ekspresyjnego pGex-6P-1 w celu otrzymania we wnętrzu komórek Escherichia coli rekombinowanych białek, które zostały wykorzystane w dalszych badaniach.

Zgodnie z przewidywaniami teoretycznymi mirolaza jest produkowana jako

85-kDa proenzym o wyjątkowej wielodomenowej budowie. Proteaza składa się,

zaczynając od N-końca, z 20-kDa NTP, 40-kDa CD oraz 25-kDa CTE zakończonego

CTD (Figura 1). W związku z powyższym pierwszym problemem wymagającym wyjaśnienia jest czy i w jaki sposób mirolaza aktywuje się. W tym celu podjęto próby oczyszczenia rekombinowanej promirolazy o pełnej długości, proMir. Niestety mimo zastosowania różnych technik chromatograficznych nie uzyskano czystej proMir.

Aczkolwiek inkubacja preparatu proMir w 37

C przez tydzień pozwoliła na analizę procesu proteolitycznej obróbki mirolazy. Mirolaza procesuje się poprzez kolejne cięcia proteolityczne do dojrzałej formy, Mir 40-kDa, która składa się tylko z CD. Procesowi dojrzewania mirolazy towarzyszył wzrost aktywności enzymatycznej, który był śledzony za pomocą różnych technik badawczych: zymografia, znakowanie biotyną skoniugowaną z fluoroizofosforanem (FP-biotyna) oraz pomiar aktywności amidolitycznej [substrat bursztynylo(Suc)-AAPF-p-nitroanilid(pNA)] i proteolitycznej (Azocoll). Analiza wyników wzrostu aktywności mirolazy ujawniła pewną nieścisłość:

pomimo, że wzrost aktywności amidolitycznej i na zymografii następował w ciągu 15 min, to wzrost aktywności proteolitycznej i znakowania FP-biotyną następował w sposób skokowy dopiero po 24 h inkubacji. Sugeruje to obecność mechanizmu latencji, który utrzymuje enzym w stanie nieaktywnym przez dłuższy czas. W celu zbadania tego zjawiska otrzymano skróconą formę mirolazy, która jest pozbawiona CTE (MirΔCTE). W tym przypadku odcinanie NTP zachodziło błyskawicznie.

Wystarczy wspomnieć, że już po pierwszym etapie oczyszczania, chromatografia powinowactwa na kolumnie ze złożem glutation-sefaroza, niemal 90% MirΔCTE miało odcięty NTP, ale NTP nadal oczyszczał się razem z CD, co sugeruje tworzenie niekowalencyjnego kompleksu pomiędzy NTP a CD. Co ciekawe, tak oczyszczony preparat posiadał aktywność amidolityczną, ale nie posiadał aktywności proteolitycznej, co w pełni potwierdza wyniki uzyskane dla dojrzewania proMir. Trwałość kompleksu pomiędzy NTP a CD została dodatkowo potwierdzona za pomocą sączenia molekularnego na skalibrowanej kolumnie. W czasie sączenia uzyskano jeden pik zawierający kompleks NTP z CD, którego wyznaczona masa molekularna (34.2 kDa) jest dużo niższa od sumy mas molekularnych NTP i CD (60 kDa). Rozbieżność tą można wytłumaczyć przez domniemany nieglobularny kształt kompleksu CD z NTP.

Inkubacja oczyszczonego kompleksu NTP z CD przez 24 h w 37

C prowadziła do stopniowej degradacji NTP, aż do uzyskania przez enzym pełnej aktywności mierzonej na substracie Azocoll. Wyniki uzyskane dla dojrzewania proMir i MirΔCTE pozwoliły na opracowanie schematu aktywacji promirolazy (Figura 3).

Mirolaza jest syntetyzowana jako nieaktywny zymogen. Pierwszym etapem

dojrzewania jest odcięcie NTP, który jednak nadal jest niekowalencyjnie związany

z CD. W dalszych etapach jest odcinany CTD, a następnie NTP jest degradowany,

czemu towarzyszy pełna aktywacja enzymu. W ostatnim etapie jest odcinany CTE,

który w przeciwieństwie do pozostałych domen mirolazy, jest w pełni stabilny i nie jest

już degradowany. Proces aktywacji mirolazy jest wyjątkowy, ponieważ w przypadku

wszystkich znanych bakteryjnych subtylaz, z wyjątkiem jednej [45], profragment po

odcięciu od zymogenu jest natychmiast degradowany. Natomiast w przypadku mirolazy

wciąż jest związany z enzymem i hamuje jego aktywność.

Figura 3: Schemat przedstawiający proces aktywacji mirolazy.

Hydrolizowane wiązania peptydowe zostały określone za pomocą sekwencjonowania metodą degradacji Edmana. Ciągłe i przerywane strzałki wskazują odpowiednio, główne i drugorzędowe miejsca proteolizy.

Czerwonymi literami oznaczone są reszty aminokwasowe kluczowe dla mechanizmu katalizy, a mniejszą czcionką oznaczono aminokwasy pochodzące z wektora ekspresyjnego.

W dalszym etapie pracy postanowiono znaleźć syntetyczny substrat dla mirolazy. W tym celu wykorzystano zestaw komercyjnie dostępnych syntetycznych substratów aminokwasowych z przyłączą p-nitroaniliną. Mirolaza hydrolizowała tylko 3 substraty: Suc-AAPF-pNA, Suc-AAPL-pNA i Suc-AAPA-pNA. Wyznaczenie parametrów K

i k

dla tych substratów pozwoliło stwierdzić, że najlepszym substratem dla mirolazy jest Suc-AAPF-pNA, a najgorszym Suc-AAPA-pNA.

Powyższe wyniki oraz brak hydrolizy innych substratów (m.in. Suc-AAPI-pNA, Suc-AAPV-pNA i Suc-VPF-pNA) świadczy o tym, że mirolaza jest specyficznym enzymem, który tnie wiązania peptydowe w obrębie określonego motywu sekwencyjnego.

Znalezienie syntetycznego substratu umożliwiło dokładną biochemiczną

charakterystykę aktywności enzymatycznej mirolazy. Mirolaza jest aktywna

w szerokim zakresie pH (7-10), a aktywność proteolityczna enzymu jest hamowana

zarówno przez inhibitory proteaz serynowych (DFP) jak i chelatory jonów

dwudodatnich, które są inhibitorami metalopeptydaz. Hamowanie przez EDTA i brak

hamowania przez o-fenantrolinę sugeruje, że mirolaza, jak większość subtylaz, wymaga

do swojej aktywności jonów wapnia. Obserwacja ta została potwierdzona przez

odwracalność inhibicji mirolazy przez EDTA nadmiarem kationów wapnia. Ponadto

w dalszych badaniach wykazano, że Ca

jest nie tylko niezbędny do aktywności, ale

również odpowiada za stabilność mirolazy. Warto również dodać, że za wiązanie

wapnia jest odpowiedzialny NTP, ponieważ inhibicja dojrzałej mirolazy, Mir 40-kDa przez EDTA nie jest odwracalna.

Ostatnim etapem pracy było sprawdzenie czy mirolaza hydrolizuje istotne fizjologicznie substraty białkowe i peptydowe. Mirolaza hydrolizuje ludzki peptyd antybakteryjny LL-37, ludzki fibrynogen i hemoglobinę, a nie degraduje ludzkiej fibronektyny i kolagenu typu I.

Pierwszym etapem prac z rekombinowaną miropiną było znalezienie proteazy hamowanej przez badaną serpinę. W tym celu wykorzystano fakt, że specyficzność serpin jest w zdecydowanej większości determinowana przez chemiczną naturę aminokwasu w pozycji P1 [46]. Miropina w pozycji P1 ma treoninę, co sugeruje hamowanie ludzkiej elastazy neutrofilowej. I rzeczywiście miropina wydajnie hamowała elastazę neutrofilową. Dzięki temu pokazano, że całe komórki T. forsythia, w sposób zależny od dawki, hamują elastazę neutrofilową, co potwierdza przewidywania teoretyczne, według których miropina jest wydzielniczą lipoproteiną związaną z zewnętrzną błoną komórkową. Ponadto brak hamowania elastazy neutrofilowej przez izogeniczny mutant delecyjny miropiny T. forsythia, potwierdził, że badana serpina jest odpowiedzialna za zaobserwowaną aktywność hamującą badanej bakterii. W celu dalszego zbadania wewnątrzkomórkowej lokalizacji miropiny, wykonano frakcjonowanie komórek T. forsythia. Aktywność hamująca względem elastazy neutrofilowej została znaleziona we frakcji otoczki zawierającej m.in. błony komórkowe, co w pełni potwierdziło, że miropina jest wydzielniczą lipoproteiną.

Wstępna ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej miropiny nie pozwoliły na uzyskanie homogennego preparatu miropiny o pełnej długości, więc postanowiono uzyskać konstrukty genetyczne kodujące różne wersje miropiny: Tfs62, Tfs55 i Tfs46.

Następnie odpowiednie białka wyprodukowano w E. coli i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie ze złożem glutation-sefaroza. Porównanie wydajności ekspresji, czystości i względnej aktywności hamującej wobec elastazy neutrofilowej 3 uzyskanych wariantów miropiny pozwolił wybrać najlepszy wariant serpiny, Tfs46, który wykorzystano w dalszych badaniach.

Dalsze oczyszczanie miropiny (Tfs46) za pomocą sączenia molekularnego pozwoliło na uzyskanie miropiny o czystości ponad 95%. Na uzyskanym chromatogramie, oprócz piku odpowiadającego czystemu monomerowi miropiny, zauważono pik zawierający polimer miropiny. W przeciwieństwie do znanych serpin, polimer miropiny wciąż hamował elastazę neutrofilową. Jest to niezwykle interesujące, ponieważ polimeryzacja innych znanych serpin prowadzi do całkowitej utraty właściwości hamujących wobec enzymów proteolitycznych [47].

Następnie sprawdzono czy miropina hamuje 7 znanych bakteryjnych

i ssaczych proteaz serynowych. Miropina hamowała 5 proteaz: ludzką elastazę

neutrofilową, trypsynę wołową, ludzką katepsynę G, świńską elastazę

trzustkową i bakteryjną subtylizynę Carlsberg, a nie hamowała ludzkiej trombiny oraz wołowej chymotrypsyny. Miropina hamuje więc szeroki zakres proteaz o zupełnie różnej specyficzności, co nie jest spotykane w przypadku innych znanych serpin [31, 41].

Sam fakt hamowania proteaz przez miropinę nie mówi nam nic o wydajności tego oddziaływania. Wobec tego wyznaczono dwa parametry: stechiometrię inhibicji (SI), czyli liczbę cząsteczek miropiny niezbędnych do zahamowania 1 cząsteczki danej proteazy, oraz drugorzędową stałą szybkości tworzenia kompleksu pomiędzy serpiną a enzymem proteolitycznym (stała asocjacji, k

). Miropina hamuje badane proteazy z niemal identyczną SI wynoszącą około 3 oraz k

wynoszącą od 2.7 x 10

do 7.1 x 10

M

s

. Porównując wartości uzyskane dla miropiny z innymi znanymi serpinami, można zauważyć, że miropina hamuje badane enzymy z dużo wyższą SI (SI dla większości znanych serpin wynosi 1) oraz z niższą k

(dla innych znanych serpin jest to zazwyczaj 10

-10

M

s

) [31].

Unikalną cechą procesu hamowania proteaz przez serpiny jest utworzenie trwałego kowalencyjnego kompleksu pomiędzy serpiną a enzymem. Wobec tego miropinę inkubowano ze wzrastającymi stężeniami proteaz, a uzyskane próbki rozdzielono elektroforetycznie w warunkach denaturujących. Na wybarwionych żelach uwidoczniono nowe prążki, nieobecne w przypadku samej miropiny i proteaz, które posiadały masę molekularną odpowiadającą sumie mas serpiny i danej proteazy. Prążki te wycięto i poddano analizie spektroskopii masowej, która potwierdziła obecność zarówno miropiny jak i danej proteazy. Serpiny tworzą z hamowanymi protezami kompleks poprzez wiązanie O-estrowe pomiędzy grupą hydroksylową seryny z proteazy i grupą karboksylową aminokwasu w pozycji P1 w serpinie [31]. W celu zbadania chemicznej natury uzyskanych kompleksów, kompleks miropiny z elastazą neutrofilową inkubowano z NaOH, co prowadziło do uwolnienia elastazy neutrofilowej z kompleksu. Miropina tworzy więc z badanymi proteazami klasyczne kowalencyjne kompleksy poprzez wiązanie O-estrowe.

Pierwszym z etapów mechanizmu inhibicji proteaz przez serpiny, jest hydroliza specjalnego wiązania peptydowego, zwanego miejscem aktywnym, w obrębie RCL, co prowadzi do uwolnienia ok. 5 kDa fragmentu z C-końca serpiny. Uzyskanie sekwencji N-terminalnej uwolnionego peptydu pozwala na zidentyfikowanie miejsc cięcia serpiny w obrębie RCL. W związku z powyższym miropinę inkubowano z hamowanymi proteazami, a następnie uzyskane próbki rozdzielono elektroforetycznie, a na końcu wykonano elektrotransfer na membranę PVDF. Wybarwione prążki o masie molekularnej ~5 kDa zostały wycięte, a następnie uzyskano sekwencje N-terminalne odpowiednich peptydów (Figura 4). Badane enzymy proteolityczne rozpoznawały i hydrolizowały zupełnie różne wiązania peptydowe. Wystarczy wspomnieć, że tylko dwa badane enzymy: trypsyna i katepsyna G hydrolizowały RCL w tej samej pozycji.

Ponadto miejsca aktywne dla badanych enzymów znajdują się daleko od

zakonserwowanej w przypadku innych serpin pozycji P1-P1’.

Figura 4: Miejsca proteolizy w obrębie pętli reaktywnej zidentyfikowane dla miropiny i innych znanych serpin.

Aminokwasy oznaczono różnymi kolorami: czerwonym (kwasowe), niebieskim (zasadowe), zielonym (polarne) i żółtym (niepolarne). CatG - katepsyna G; HNE - ludzka elastaza neutrofilowa; PPE - świńska elastaza trzustkowa; SC - subtylizyna Carlsberg; Trp - trypsyna. [39, 41, 48-51]

.

Ponadto w przypadku znanych serpin hydroliza w obrębie RCL poza pozycją P1-P1’ prowadzi zazwyczaj do inaktywacji inhibitora, a nie do skutecznej inhibicji.

Natomiast w przypadku miropiny miejsca aktywne znajdują się na niemal całej długości RCL i są daleko oddalone od zakonserwowanej pozycji P1-P1’.

Miropina jest w pełni funkcjonalną serpiną, a mirolaza w pełni aktywną proteazą, więc postawiono pytanie, czy miropina hamuje mirolazę. W badaniach wykorzystano 2 formy mirolazy: proMir oraz Mir 40-kDa. Miropina hamowała promirolazę o pełnej długości, ale nie hamowała już dojrzałej formy mirolazy (Figura 5, wyniki nieopublikowane).

Figura 5: Hamowanie mirolazy przez miropinę.

W doświadczeniu wykorzystano dwie formy mirolazy: promirolazę o pełnej długości (proMir) oraz dojrzałą formę mirolazy, składającą się z samej domeny katalitycznej (Mir 40-kDa) (Figura 3).

Przedstawione wyniki są średnią z dwóch niezależnych eksperymentów.

Wyniki te sugerują, że NTP mirolazy nie jest tylko odpowiedzialny za latencję

enzymu, wiązanie wapnia, ale również może wpływać na oddziaływanie enzymu

z inhibitorem jakim jest miropina.

Podsumowanie wyników

Wyniki będące podstawą przedstawianej rozprawy doktorskiej doprowadziły do opisania dwóch nowych białek: proteazy serynowej, mirolazy oraz serpiny, miropiny, co przyczyni się znacząco do poszerzenia naszej wiedzy na temat T. forsythia. Ponadto oba białka posiadają wyjątkowe cechy. W przypadku mirolazy jest to unikalny mechanizm aktywacji, a w przypadku miropiny jest to hamowanie szerokiej grupy proteaz o zupełnie różnej specyficzności z wykorzystaniem różnych pozycji w obrębie pętli reaktywnej. W szczególności wykazano:

1. Mirolaza i miropina są produkowane przez laboratoryjny szczep T. forsythia ATCC43037, a poziom ekspresji miropiny jest ponad 20 razy większy od mirolazy. Ponadto mirolaza jest produkowana przez prawie 100% klinicznych szczepów T. forsythia;

2. Mirolaza jest produkowana jako wielodomenowy zymogen, który w wyniku sekwencyjnej autoproteolizy określonych wiązań peptydowych aktywuje się do dojrzałej formy składającej się z samej domeny katalitycznej. Towarzyszy temu znaczący wzrost aktywności proteolitycznej;

3. Za latencję mirolazy jest odpowiedzialny 20-kDa N-końcowy profragment, NTP. W przeciwieństwie do praktycznie wszystkich, z wyjątkiem jednej, znanych bakteryjnych subtylaz, NTP mirolazy po odcięciu nie jest natychmiast degradowany, ale tworzy niekowalencyjny kompleks z mirolazą i nadal hamuje aktywność proteolityczną, ale nie amidolityczną, badanego enzymu;

4. Mirolaza wymaga zarówno do swojej aktywności jak i stabilności kationów wapnia. Biorąc pod uwagę, że we wszystkich bakteriach gram-ujemnych stężenia Ca

jest ściśle regulowane tj. w cytoplazmie jest bardzo niskie, a w peryplazmie wysokie, zależność aktywności mirolazy od wapnia powinna zapobiegać niechcianej aktywacji enzymu w cytoplazmie zaraz po procesie translacji, a przed sekrecją do peryplazmy;

5. Mirolaza posiada aktywność proteolityczną, która może przyczynić się do wirulencji T. Forsythia, poprzez degradację ludzkiego peptydu antybakteryjnego LL-37, ludzkiego fibrynogenu i hemoglobiny;

6. Miropina jest wydzielniczą lipoproteiną i odpowiada za hamowanie ludzkiej elastazy neutrofilowej przez całe komórki T. forsythia;

7. Miropina jest pierwszą scharakteryzowaną bakteryjną serpiną pochodzącą z ludzkiego patogenu. Miropina hamuje proteazy z wytworzeniem trwałych, kowalencyjnych kompleksów;

8. Miropina hamuje szeroki zakres proteaz serynowych: zarówno ssaczych, w tym

ludzkich, jak i bakteryjnych z niemal identyczną stechiometrią inhibicji (~3)

i stałą asocjacji, k

w przedziale od 2.7 x 10

do 7.1 x 10

M

s

. Jest to

możliwe dzięki wykorzystaniu różnych miejsc aktywnych w obrębie RCL

znajdujących się bardzo daleko od zakonserwowanej pozycji P1-P1’, co jest

niespotykane wśród innych znanych serpin. Wydaje się, że niższa wydajność

inhibicji, przejawiająca się wyższą SI i niższą k niż w przypadku innych

znanych serpin, jest swoistym kosztem ewolucyjnym zapłaconym przez miropinę za hamowanie większej liczby proteaz;

9. Szeroki zakres hamowania miropiny może być adaptacją ewolucyjną T. forsythia do środowiska o wysokiej aktywności proteolitycznej, jakim jest płytka nazębna, w której bakterie są narażone na działanie zarówno bakteryjnych jak i ludzkich proteaz, w tym produkowanej przez neutrofile elastazie i katepsynie G;

10. Miropina hamuje również endogenną proteazę T. forsythia, mirolazę. Co ciekawe, miropina hamuje tylko promirolazę, a nie hamuje dojrzałej formy mirolazy.

Opisana powyżej biochemiczna charakterystyka mirolazy i miropiny jest dopiero pierwszym etapem badań. Drugim etapem badań będzie sprawdzenie, czy badane białka są w rzeczywistości czynnikami wirulencji T. forsythia. W tym celu najpierw należy otrzymać izogeniczne mutanty delecyjne T. forsythia mirolazy i miropiny (obecnie dysponujemy już mutantem delecyjnym miropiny). Następnie należy sprawdzić w warunkach in vitro czy uzyskane mutanty mają jakiś fenotyp: w przypadku mutanta mirolazy jest to np. wpływ LL-37 na przeżywalność bakterii a w przypadku mutanta miropiny przeżywalność bakterii w obecności neutrofili w warunkach beztlenowych.

W przypadku pozytywnych wyników, fenotyp uzyskanych mutantów T. forsythia

zostanie sprawdzony na modelu mysim, co da odpowiedź na pytanie, czy badane białka

są czynnikami wirulencji T. forsythia.

Pozostałe osiągnięcia naukowe

Oprócz wyników znajdujących się w dwóch opublikowanych artykułach będących podstawą przedstawionej rozprawy doktorskiej, byłem również zaangażowany w realizację innych projektów badawczych prowadzonych we współpracy z zagranicznymi ośrodkami badawczymi. Głównym tematem badań była charakterystyka metaloproteazy karilizyny, pierwszego dokładnie scharakteryzowanego enzymu proteolitycznego T. forsythia. Efektem tych badań jest:

• rozwiązanie struktury krystalicznej karilizyny. Karilizyna wykazuje większe podobieństwo strukturalne i filogenetyczne do ssaczych, w szczególności ludzkich metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej niż do bakteryjnych metaloproteinaz. Pozwoliło to stwierdzić, że karilizyna jest najprawdopodobniej ksenologiem pozyskanym w bardzo rzadkim zjawisku horyzontalnego transferu genów pomiędzy patogenem a gospodarzem [24];

• wykazanie, że karilizyna degraduje ludzki peptyd antybakteryjny LL-37, będący głównym peptydem antybakteryjnym w jamie ustnej człowieka. Dzięki temu T. forsythia może unikać mechanizmów obronnych gospodarza oraz kontrolować procesy zapalne w czasie powstawania i/lub rozwoju parodontozy [25];

• pokazanie, że karilizyna inaktywuje wszystkie drogi aktywacji ludzkiego układu dopełniacza. Zjawisko to może tłumaczyć oporność T. forsythia względem układu dopełniacza, co jest niezbędną cechą każdego ludzkiego patogenu [26];

• znalezienie inhibitora peptydowego karilizyny, który może zostać w przyszłości wykorzystany do opracowania skutecznego leku znajdującego zastosowanie nie tylko w leczeniu, ale przede wszystkim w profilaktyce parodontozy [52];

• rozwiązanie struktury krystalicznej karilizyny w kompleksie z inhibitorem peptydowym [53];

• pokazanie, że karilizyna ścina z powierzchni ludzkich makrofagów w pełni aktywną biologicznie, rozpuszczalną formę TNFα, co może przyczyniać się do kontroli procesu zapalnego w miejscu infekcji przez T. forsythia [27].

Oprócz badań nad karilizyną byłem również zaangażowany w projekty mające na

celu charakterystykę procesu aktywacji i wydzielania przez niedawno opisany IX

bakteryjny system sekrecji (T9SS) gingipain. Gingipainy są uważane za główny

czynnik wirulencji bakterii P. gingivalis, uważanych za jeden z głównych

periodontopatogenów. Efektem tych prac jest ukazanie się jednej pracy, w której

pokazaliśmy, że aktywność gingipain jest ściśle kontrolowana przez N-terminalne

profragmenty. Mechanizm ten najprawdopodobniej zapobiega przedwczesnej aktywacji

gingipain w peryplazmie, co może być szkodliwe dla komórki. Dzięki temu gingipainy

mogą być w bezpieczny sposób wydzielone na zewnątrz komórki przez T9SS [54].

Literatura

1. Colombo, A. P., Boches, S. K., Cotton, S. L., Goodson, J. M., Kent, R., Haffajee, A. D., Socransky, S. S., Hasturk, H., Van Dyke, T. E., Dewhirst, F., and Paster, B. J. (2009) Comparisons of subgingival microbial profiles of refractory periodontitis, severe periodontitis, and periodontal health using the human oral microbe identification microarray. J Periodontol. 80, 1421-32

2. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., and Kent, R. L. Jr.

(1998) Microbial complexes in subgingival plaque. J ClinPeriodontol. 25, 134- 3. Schenkein, H. A. (2006) Host responses in maintaining periodontal health and 44

determining periodontal disease. Periodontol 2000 40, 77-93

4. Hajishengallis, G., and Lamont, R. J. (2012) Beyond the red complex and into more complexity: the polymicrobial synergy and dysbiosis (PSD) model of periodontal disease etiology. Mol Oral Microbiol. 27, 409-19

5. Armitage, G. C. (2004) Periodontal diagnoses and classification of periodontal diseases. Periodontol 2000 34, 9-21

6. Fox, C. H. (1992) New considerations in the prevalence of periodontal disease.

Curr. Opin. Dent. 2, 5–11

7. Hugoson, A., Sjdin, B., and Norderyd, O. (2008) Trends over 30 years, 1973–

2003, in the prevalence and severity of periodontal disease. J. Clin. Periodontol.

35, 405–414

8. Garcia, R. I., Nunn, M. E., and Vokonas, P. S. (2001) Epidemiologic associations between periodontal disease and chronic obstructive pulmonary disease. Ann. Periodontol. 6, 71–77

9. Maresz, K. J., Hellvard, A., Sroka, A., Adamowicz, K., Bielecka, E., Koziel, J., Gawron, K., Mizgalska, D., Marcinska, K. A., Benedyk, M., Pyrc, K., Quirke, A. M., Jonsson, R., Alzabin, S., Venables, P. J., Nguyen, K. A., Mydel, P., and Potempa, J. (2013) Porphyromonas gingivalis facilitates the development and progression of destructive arthritis through its unique bacterial peptidylarginine deiminase (PAD). PLoS Pathog. 9, e1003627

10. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., and Johnson, N. W. (2005) Periodontal diseases. Lancet 366, 1809–1820

11. Paturel, L., Casalta, J. P., Habib, G., Nezri, M., and Raoult, D. (2004) Actinobacillus actinomycetemcomitans endocarditis. Clin Microbiol Infect. 10, 98-118

12. Haynes, W. G., and Stanford, C. (2003) Periodontal Disease and Atherosclerosis: From Dental to Arterial Plaque. Arterioscler Thromb Vasc Biol.

23, 1309-1311

13. Offenbacher, S., Katz, V., Fertik, G., Collins, J., Boyd, D., Maynor, G., McKaig, R., and Beck, J. (1996) Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103–1113

14. Holt, S. C. and Ebersole, J. L. (2005) Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the “red complex”, a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol. 2000 38, 72–

15. Guo, Y., Nguyen, K. A., and Potempa, J. (2010) Dichotomy of gingipains action 112

as virulence factors: from cleaving substrates with the precision of a surgeon’s

knife to a meat chopper-like brutal degradation of proteins. Periodontol. 2000 54, 15–44

16. Ishihara, K. (2010) Virulence factors of Treponema denticola. Periodontol.

2000 54, 117–35

17. Potempa, J., Pike, R., and Travis, J. (1997) Titration and mapping of the active site of cysteine proteinases from Porphyromonas gingivalis (gingipains) using peptidyl chloromethanes. Biol. Chem. 378, 223–230

18. Potempa, J. and Pike, R. N. (2005) Bacterial peptidases. Contrib. Microbiol. 12, 132–180

19. Potempa, J. and Pike, R. N. (2009) Corruption of innate immunity by bacterial proteases. J. Innate Immun. 1, 70–87

20. Nakajima, T., Tomi, N., Fukuyo, Y., Ishikura, H., Ohno, Y., Arvind, R., Arai, T., Ishikawa, I., and Arakawa, S. (2006) Isolation and identification of a cytopathic activity in Tannerella forsythia. BiochemBiophys Res Commun. 8, 133-9

21. Tomi, N., Fukuyo, Y., Arakawa, S., and Nakajima, T. (2008) Pro-inflammatory cytokine production from normal human fibroblasts is induced by Tannerella forsythia detachingfactor. J Periodontal Res. 43, 136-42

22. Hamlet, S. M., Ganashan, N., Cullinan, M. P., Westerman, B., Palmer, J. E., and Seymour, G. J. (2008) A 5-year longitudinal study of Tannerella forsythia prtH genotype: association with loss of attachment. J Periodontol. 79, 144-9

23. Karim, A.Y., Kulczycka, M., Kantyka, T., Dubin, G., Jabaiah, A., Daugherty, P.

S., Thogersen, I. B., Enghild, J. J., Nguyen, K. A., and Potempa, J. (2010) A novel matrix metalloprotease-like enzyme (karilysin) of the periodontal pathogen Tannerella forsythia ATCC 43037. Biol Chem. 391, 105-17

24. Cerdà-Costa, N., Guevara, T., Karim, A. Y., Ksiazek, M., Nguyen, K. A., Arolas, J. L., Potempa, J., and Gomis-Rüth, F. X. (2011) The structure of the catalytic domain of Tannerella forsythia karilysin reveals it is a bacterial xenologue of animal matrix metalloproteinases. Mol Microbiol. 79, 119-32 25. Koziel, J., Karim, A. Y., Przybyszewska, K., Ksiazek, M., Rapala-Kozik, M.,

Nguyen, K.vA. and Potempa, J. (2010) Proteolytic inactivation of LL-37 by karilysin, a novel virulence mechanism of Tannerella forsythia. J Innate Immun.

2, 288-93

26. Jusko, M., Potempa, J., Karim, A. Y., Ksiazek, M., Riesbeck, K., Garred, P., Eick, S., and Blom, A. M. (2012) A metalloproteinase karilysin present in the majority of Tannerella forsythia isolates inhibits all pathways of the complement system. J Immunol. 188, 2338-49

27. Bryzek, D., Ksiazek, M., Bielecka, E., Karim, A. Y., Potempa, B., Staniec, D., Koziel, J., and Potempa, J. (2014) A pathogenic trace of Tannerella forsythia - shedding of soluble fully active tumor necrosis factor α from the macrophage surface by karilysin. Mol Oral Microbiol. 29, 294-306

28. Sato, K., Sakai, E., Veith, P. D., Shoji, M., Kikuchi, Y., Yukitake, H., Ohara, N., Naito, M., Okamoto, K., Reynolds, E. C. and Nakayama, K. (2005) Identification of a new membrane-associated protein that influences transport/maturation of gingipains and adhesins of Porphyromonas gingivalis. J Biol Chem. 280, 8668-77

29. Tomek, M. B., Neumann, L., Nimeth, I., Koerdt, A., Andesner, P., Messner, P.,

Mach, L., Potempa, J. S., and Schäffer, C. (2014) The S-layer proteins of

Tannerella forsythia are secreted via a type IX secretion system that is

decoupled from protein O-glycosylation. Mol Oral Microbiol. 29, 307-20

30. Ingar, O., and Potempa, J. (2014) Strategies for the inhibition of gingipains for the potential treatment of periodontitis and associated systemic diseases. J. Oral Microbiol. 6, 24800

31. Gettins, P. G. (2002) Serpin structure, mechanism, and function. Chem. Rev.

102, 4751–4804

32. Huntington, J. A., Read, R. J., and Carrell, R. W. (2000) Structure of a serpin- protease complex shows inhibition by deformation. Nature 407, 923–926

33. Kantyka, T., Plaza, K., Koziel, J., Florczyk, D., Stennicke, H. R., Thogersen, I.

B., Enghild, J. J., Silverman, G. A., Pak, S. C., and Potempa, J. (2011) Inhibition of Staphylococcus aureus cysteine proteases by human serpin potentially limits staphylococcal virulence. Biol. Chem. 392, 483–489

34. Irving, J. A., Steenbakkers, P. J., Lesk, A. M., Opden Camp, H. J., Pike, R. N., and Whisstock, J. C. (2002) Serpins in prokaryotes. Mol. Biol. Evol. 19, 1881–

1890

35. Kantyka, T., Rawlings, N. D., and Potempa, J. (2010) Prokaryote-derived protein inhibitors of peptidases: A sketchy occurrence and mostly unknown function. Biochimie 92, 1644–1656

36. Irving, J. A., Cabrita, L. D., Rossjohn, J., Pike, R. N., Bottomley, S. P., and Whisstock, J. C. (2003) The 1.5 A crystal structure of a prokaryote serpin:

controlling conformational change in a heated environment. Structure. 11, 387- 37. Zhang, Q., Buckle, A. M., Law, R. H., Pearce, M. C., Cabrita, L. D., Lloyd, G. 97

J., Irving, J. A., Smith, A. I., Ruzyla, K., Rossjohn, J., Bottomley, S. P., and Whisstock, J. C. (2007) The N terminus of the serpin, tengpin, functions to trap the metastable native state. EMBO Rep. 8, 658-63

38. Cabrita, L. D., Irving, J. A., Pearce, M. C., Whisstock, J. C., and Bottomley, S.

P. (2007) Aeropin from the extremophile Pyrobaculum aerophilum bypasses the serpin misfolding trap. J Biol Chem. 282, 26802-9

39. Tanaka, S., Koga, Y., Takano, K., and Kanaya, S. (2011) Inhibition of chymotrypsin- and subtilisin-like serine proteases with Tk-serpin from hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Biochim Biophys Acta 1814, 299-307

40. Kang, S., Barak, Y., Lamed, R., Bayer, E. A., and Morrison, M. (2006) The functional repertoire of prokaryote cellulosomes includes the serpin superfamily of serine proteinase inhibitors. Mol. Microbiol. 60, 1344–1354

41. Ivanov, D., Emonet, C., Foata, F., Affolter, M., Delley, M., Fisseha, M., Blum- Sperisen, S., Kochhar, S., and Arigoni, F. (2006) A serpin from the gut bacterium Bifidobacterium longum inhibits eukaryotic elastase-like serine proteases. J. Biol. Chem. 281, 17246–17252

42. Rawlings, N.D., Waller, M., Barrett, A.J. and Bateman, A. (2014) MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res 42, D503-D509

43. Mailhot, J. M., Potempa, J., Stein, S. H., Travis, J., Sterrett, J. D., Hanes, P. J., and Russell, C. M. (1998) A relationship between proteinase activity and clinical parameters in the treatment of periodontal disease. J. Clin. Periodontol. 25, 578–

44. Belaaouaj, A. (2002) Neutrophil elastase-mediated killing of bacteria: lessons 584

from targeted mutagenesis. Microbes Infect. 4, 1259–1264.

45. Adams, C.M., Eckenroth, B.E., Putnam, E.E., Doubli., S., and Shen, A. (2013).

Structural and functional analysis of the CspB protease required for Clostridium spore germination. PLoS Pathog. 9, e1003165

46. Owen, M. C., Brennan, S. O., Lewis, J. H., and Carrell, R. W. (1983) Mutation of antitrypsin to antithrombin. 1-Antitrypsin Pittsburgh (358 Met leads to Arg), a fatal bleeding disorder. N. Engl. J. Med. 309, 694–698

47. Mast, A. E., Stadanlick, J. E., Lockett, J. M., and Dietzen, D. J. (1999) Solvent/detergent-treated plasma has decreased antitrypsin activity and absent antiplasmin activity. Blood 94, 3922–3927

48. Carrell, R. W., and Owen, M. C. (1985) Plakalbumin, alpha 1-antitrypsin, antithrombin and the mechanism of inflammatory thrombosis. Nature 317, 730- 49. Potempa, J., Fedak, D., Dubin, A., Mast, A. and Travis, J. (1991) Proteolytic 2

inactivation of alpha-1-anti-chymotrypsin. Sites of cleavage and generation of chemotactic activity. J Biol Chem. 266, 21482-7

50. Potempa, J., Shieh, B. H., and Travis, J. (1988) Alpha-2-antiplasmin: a serpin with two separate but overlapping reactive sites. Science 241, 699-700

51. Potempa, J., Watorek, W., and Travis, J. (1986) The inactivation of human plasma alpha 1-proteinase inhibitor by proteinases from Staphylococcus aureus.

J Biol Chem. 261, 14330-4

52. Skottrup, P. D., Sørensen, G., Ksiazek, M., Potempa, J., and Riise, E. (2012) A phage display selected 7-mer peptide inhibitor of the Tannerella forsythia metalloprotease-like enzyme Karilysin can be truncated to Ser-Trp-Phe-Pro.

PLoS One. 7, e48537

53. Guevara, T., Ksiazek, M., Skottrup, P. D., Cerdà-Costa, N., Trillo-Muyo, S., de Diego, I., Riise, E., Potempa, J., and Gomis-Rüth, F. X. (2013) Structure of the catalytic domain of the Tannerella forsythia matrix metallopeptidase karilysin in complex with a tetrapeptidic inhibitor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, 472-6

54. Veillard, F., Sztukowska, M., Mizgalska, D., Ksiazek, M., Houston, J., Potempa,

B., Enghild, J. J., Thogersen, I. B., Gomis-Rüth, F. X., Nguyen, K. A., and

Potempa, J. (2013) Inhibition of gingipains by their profragments as the

mechanism protecting Porphyromonas gingivalis against premature

activation of secreted proteases. Biochim Biophys Acta. 1830, 4218-28

Publikacja I

Biol. Chem. 2014; x(x): xxx–xxx

*Corresponding author: Miroslaw Ksiazek, Faculty of Biochemistry, Department of Microbiology, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Krakow, Poland, e-mail: ksiazek.miroslaw@gmail.com

Abdulkarim Y. Karim: Faculty of Biochemistry, Department of Microbiology, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Krakow, Poland; and Department of Biology, College of Science, Salahaddin University, Kerkuk Street, 44002 Erbil, Kurdistan, Iraq

Danuta Bryzek and Joanna Koziel: Faculty of Biochemistry, Department of Microbiology, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Krakow, Poland Jan J. Enghild and Ida B. Thøgersen: Center for Insoluble Protein Structures (inSPIN) and Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO) at the Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, Aarhus DK-8000, Denmark

Jan Potempa: Faculty of Biochemistry, Department of Microbiology, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, ul.

Gronostajowa 7, 30-387 Krakow, Poland; and Department of Oral Immunology and Infectious Disease, University of Louisville School

Miroslaw Ksiazek*, Abdulkarim Y. Karim, Danuta Bryzek, Jan J. Enghild, Ida B. Thøgersen, Joanna Koziel and Jan Potempa

Mirolase, a novel subtilisin-like serine protease from the periodontopathogen Tannerella forsythia

Abstract: The genome of Tannerella forsythia, an etiologi- cal factor of chronic periodontitis, contains several genes encoding putative proteases. Here, we characterized a subtilisin-like serine protease of T. forsythia referred to as mirolase. Recombinant full-length latent promiro- lase (85 kDa, without its signal peptide) processed itself through sequential autoproteolytic cleavages into a mature enzyme of 40 kDa. Mirolase latency was driven by the N-terminal prodomain (NTP). In stark contrast to almost all known subtilases, the cleaved NTP remained non-covalently associated with mirolase, inhibiting its proteolytic, but not amidolytic, activity. Full activity was observed only after the NTP was gradually, and fully, degraded. Both activity and processing was absolutely dependent on calcium ions, which were also essential for enzyme stability. As a consequence, both serine protease inhibitors and calcium ions chelators inhibited mirolase activity. Activity assays using an array of chromogenic substrates revealed that mirolase specificity is driven not only by the substrate-binding subsite S1, but also by other subsites. Taken together, mirolase is a calcium-dependent serine protease of the S8 family with the unique mecha- nism of activation that may contribute to T. forsythia

pathogenicity by degradation of fibrinogen, hemoglobin, and the antimicrobial peptide LL-37.

Keywords: pathogenicity; periodontitis; protease specific- ity; protein expression; serine protease; virulence factor.

DOI 10.1515/hsz-2014-0256

Received October 2, 2014; accepted November 10, 2014

Introduction

Peptidases (proteases) are enzymes that hydrolyze peptide bonds. Genes encoding peptidases constitute approximately 3% of all genes in prokaryotes. However, the number of peptidase genes in individual prokary- otic genomes differs greatly, ranging from very few in species of bacteria in the genus Mycoplasma to up to 179 genes encoding potential proteolytic enzymes in Bacil- lus cereus (Potempa and Pike, 2005). Due to the wide distribution and variety of enzymes, it is not surprising that bacterial peptidases play a key role in processes such as degradation of unwanted proteins, proteolytic modification of proteins and their precursors (e.g., removal of signal peptides), hydrolysis of extracellu- lar polypeptides to generate nutrients, and regulation of gene expression through the limited proteolysis of regulatory proteins (Rao et al., 1998; Gupta et al., 2002;

Koziel and Potempa, 2013).

Many bacterial proteases can be considered virulence factors because they can degrade the proteinaceous con- stituencies of infected tissues, facilitate host colonization and spreading of bacteria within organisms, or protect pathogens against the immune system response (O-Brien- Simpson et al., 2003; Ingmer and Brøndsted, 2009; Koziel and Potempa, 2013; Jusko et al., 2014; Palm et al., 2014).

Moreover, prokaryotic proteases are also required for the production of other virulence factors (e.g., peptidases are components of secretion systems) and thus indirectly contribute to pathogen virulence (Tuteja, 2005; Glew

Q1:

Please ensure that chemical names, abbre- viations and acronyms are given on first mention in text

Q2:

Reference

“Ingmer et al. (2009)

“ has been changed to

“Ingmer and Brøndsted (2009) “ to match the reference list. Please check and

2  M. Ksiazek et al.: Mirolase, a novel subtilisin-like serine protease from Tannerella forsythia

One example of a disease in which bacterial proteases play a crucial role is periodontitis, an infectious disease affecting the human oral cavity, leading to the destruc- tion of supportive tissues of the teeth. It is estimated that up to 15% of adults experience severe forms of periodon- titis (Fox, 1992; Hugoson et al., 2008). Progression of the disease is manifested by alveolar bone resorption and loss of attachment between teeth and gums, resulting in the formation of deep periodontal pockets. In severe cases, the disease can lead to loss of teeth (Armitage, 2004). In addition, due to its infectious and inflammatory charac- ter, periodontitis is considered a significant factor in the development and/or progression of more serious diseases, such as lung disease (Garcia et al., 2001), low-birth-weight preterm births (Offenbacher et  al., 1996), atherosclerosis (Behle and Papapanou, 2006), diabetes (Pihlstrom et al., 2005), and rheumatoid arthritis (Maresz et al., 2013).

The etiology of periodontitis is multifactorial, and as a result, it is impossible to identify a single pathogen that is responsible for development of the disease (Hajishen- gallis and Lamont, 2012; Wright et al., 2013). The develop- ment of periodontitis can start when subgingival biofilm is colonized by three species of bacteria: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia (previously Bacteroides forsythus and Tannerella forsyth- ensis), referred to as the ‘red complex’. Due to the striking correlation between the presence of these bacteria and the severity of symptoms, members of the ‘red complex’

are considered major periodontopathogens (Socransky et  al., 1998). All three of these bacterial strains possess one important common feature, strong extracellular pro- teolytic activity, which is thought to be the crucial viru- lence factor of these pathogens (Holt and Ebersole, 2005).

Hydrolysis of the synthetic trypsin substrate benzoyl-dl- arginine-naphthylamide is used to detect ‘red complex’

bacteria (Loesche et al., 1992).

The role of secretory proteases of P. gingivalis and T. denticola as virulence factors is well described (Guo et al., 2010; Ishihara, 2010). The gingipains Rgps and Kgp, which are responsible for 85% of the extracellular pro- teolytic activity of P. gingivalis (Potempa et al., 1997), are involved in processes such as nutrient acquisition, cor- ruption of the innate immune system and immunomodu- lation (Potempa et al., 2003; Potempa and Pike, 2009). In the case of T. denticola, dentilisin is the best-characterized secretory protease and has been shown to play a role in the etiology of periodontitis. This serine protease is associated with the surface of T. denticola and is responsible for coag- gregation with P. gingivalis, activation of the complement system, and hydrolysis of IL-6, IL-8, IgG, IgA, fibronectin,

In stark contrast to the other two members of the ‘red complex’, our knowledge of the functions of T. forsythia proteases is still limited. Thus far, only two proteases in T. forsythia, PrtH (a peptidase with hemolytic activity) (Saito et al., 1997) and karilysin (Karim et al., 2010), have been identified and characterized. PrtH, a 41-kDa cysteine peptidase, was identified as a T. forsythia detachment factor and is proposed to be responsible for the disintegra- tion of human epithelium (Tomi et  al., 2008). Compared with PrtH, our knowledge of the metallopeptidase karily- sin is more detailed. It is synthesized as a 472-amino acid, multidomain protein composed of a signal peptide (SP), a 14-amino acid propeptide, an 18-kDa catalytic domain (CD) similar to animal matrix metalloproteinases, and a C-terminal extension (CTE) (Cerdà-Costa et al., 2011). Kari- lysin was shown to degrade LL-37 and inhibit activation of all pathways of the complement system (Koziel et al., 2010;

Jusko et al., 2012). Thus, karilysin could be involved in the evasion of host innate immune system by T. forsythia.

Bacterial secretory proteases are likely to be promis- ing targets for the treatment of periodontitis (Ingar and Potempa, 2014). However, the multietiological charac- teristics of the disease and redundant functions of the proteolytic enzymes produced by different periodontal pathogens suggest that the inhibition of proteases from only one periodontopathogen may be insufficient for effec- tive treatment and/or prevention of periodontitis. Thus, it is crucial to characterize all of the proteases secreted by

‘red complex’ bacteria. Here, we describe the characteri- zation of a novel serine protease of T. forsythia, comprised of a CD flanked by N- and C-terminal domains, which may contribute to the pathogenesis of periodontitis.

Results

Loci bfor_c_1_10621 and 10622 constitute a single ORF encoding a serine protease

Recently, we detected several errors in the sequence of an ORF (bfor_c_1_10593) encoding a matrix metalloprotein- ase-like enzyme (karilysin) in the sequenced genome of T. forsythia (www.brop.org) (Karim et  al., 2010). In addi- tion to karilysin and several other presumed proteases, this genome contains two adjacent ORFs (bfor_c_1_10622 and bfor_c_1_10621) coding for putative serine proteases.

Sequencing of these loci together with the surrounding regions revealed several errors, including insertion and deletion affecting the reading frame and substitutions

Q4:

BANA has been expanded – abbre- viations/

acronyms mentioned only once do not need to be abbreviated Q3:

Please check and confirm the short title