Olsztyn, ul. Żołnierska 14 EGGS. Wstęp

AKTYWNOŚĆ TRYPSYNY I ALFA-AMYLAZY W TRZUSTCE ŚWINEK MORSKICH. IV. PORÓWNANIE WPŁYWU PODAWANIA MIESZANI- NY LOTNYCH KWASÓW ORGANICZNYCH, INWAZYJNYCH JAJ

ASCARIS SUUM I ICH HOMOGENATÓW

KRYSTYNA ŻÓŁTOWSKA

Katedra Biologii Ogólnej, Instytut Biologii WSP 10-561 Olsztyn, ul. Żołnierska 14

THE ACTIVITY OF TRYPSIN AND ALPHA-AMYLASE IN PANCREAS OF GUINEA PIGS. IV. THE INFLUENCE OF ADMINISTRATION MIXTURE OF VOLATILE OR- GANIC ACIDS, THE INVASIVE EGGS OF ASCARIS SUUM, AND HOMOGENIZED

EGGS

Abstract. The activity of alpha-amylase in the experimental groups of guinea pigs was lower than in control animals. The decreased level of activity of trypsin was noted (p<0.05) also in infected animals, and in treatment with organic acids. In the group of guinea pigs, which was administrated homogenized eggs of parasite, the activity of enzyme was a little higher than in control animals. The infection of animals was associated with increase of relative weight, of lungs.

The guinea pigs treatment with organic acids had also a higher weight of spleen.

Wstęp -

Askarydozie wywołanej eksperymentalnie u świnek. morskich towarzyszy obniżenie aktywności enzymów trawiennych w trzustce (Żółtowska i Jab- łonowski 1989, Żółtowska i wsp. 1989). Aby poznać mechanizm tego zjawiska oznaczano wpływ homogenatów z inwazyjnych jaj Ascaris suum oraz mieszani- ny kwasów organicznych C,-C, na aktywność trypsyny i alfa-amylazy w wyciągach z trzustki świnek morskich (Żółtowska (1990). Wykazano, że obecność tych kwasów, które można uważać za końcowe produkty metaboliz- mu glisty (Greichus i Greichus 1966), prowadziła do obniżenia aktywności amylazy, pozostając bez istotnego wpływu na aktywność trypsyny. Odwrotną zależność obserwowano po wprowadzeniu do środowiska reakcji wyciągów z homogenatów jaj pasożytów. Zastanawiające było to, że aktywność proteoli- tyczna wzrastała w tym przypadku w sposób statystycznie istotny. Podobne zjawisko odnotowano po dojelitowym wprowadzeniu inwazyjnych jaj A. suum (Żółtowska i wsp. 1990). Sugerowano występowanie w materiale pochodzącym z jaj pasożytów bliżej nieokreślonego czynnika aktywującego obojętne protea-

3 — Wiad. Parazytol. 2/91

zy żywiciela. Czynnik ten ulegałby inaktywacji w kwaśnym środowisku żołądka. Obecnie, aby zweryfikować tę hipotezę, podawano w warunkach in vivo świnkom morskim doustnie wyciąg z jaj A. suum oraz mieszaninę lotnych kwasów organicznych.

Materiał i metody

Do badań użyto 28 samców świnek morskich, każdy o masie ok. 230 g.

Zwierzęta były wolne od inwazji pasożytniczych. Podzielono je na 4 grupy po 7 osobników. Grupa I była kontrolną, grupę II zarażano per os 5000 inwazyjnych jaj 4. suum (w ciągu kolejnych 7 dni), grupie III podawano 30 uM roztwór kwasów organicznych C,-C,, grupa IV otrzymywała homogenat z inwazyjnych jaj 4. suum. Homogenat ten oraz mieszaninę lotnych kwasów organicznych przygotowano według Żółtowskiej (1990). Podawano je bez dodatkowych rozcieńczeń, doustnie, w jednorazowej dawce po 0,2 ml przez 7 kolejnych dni. Równolegle zwierzęta grupy I i II otrzymywały po 0,2 ml roztworu soli fizjologicznej. W ósmym dniu eksperymentu świnki morskie ważono, usypiano chloroformem, po czym izolowano trzustkę, wątrobę, płuca, nerki i śledzionę. Narządy ważono i wyliczano ich względną masę. Intensyw- ność inwazji u zwierząt grupy II określano na podstawie próby Baermanna

(Stefański i Żarnowski 1971).

Przygotowywano wyciągi z trzustek zwierząt oraz oznaczano aktywności enzymatyczne według Żółtowskiej i wsp. (1990). Aktywność alfa-amylazy oznaczano metodą Fennela, trypsyny metodą Ansona. Aktywności enzymaty- czne przeliczano na 1 mg białka (Lowry i wsp. 1951). Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej testem t-Studenta.

Wyniki

W porównaniu z kontrolą aktywność alfa-amylazy we wszystkich pozos- tałych grupach była niższa (różnice statystycznie istotne, tab.). Aktywność trypsyny w trzustkach zwierząt zarażonych była wyraźnie niższa w jednym przypadku (grupa II vs gr I, p< 0,05). Nieznacznie różniła się od kontroli w grupie otrzymującej kwasy organiczne (gr. III). Natomiast u świnek, którym podawano homogenaty z inwazyjnych jaj A. suum kształtowała się na nieco wyższym poziomie niż u zwierząt kontrolnych (tab.).

W płucach wszystkich zarażanych zwierząt (II grupa) wykryto obecność larw pasożyta (średnio po 107 sztuk). Masa płuc świnek z tej grupy różniła się w sposób wysoce statystycznie istotny w porównaniu z kontrolą (tab. gr. II vs I). Również po podawaniu świnkom kwasów organicznych nastąpił przyrost masy płuc (tab. gr. III vs I). Obserwowano też wzrost względnej masy śledziony u świnek (gr. III) otrzymujących kwasy organiczne (p<0,01), lub

TABELA

Aktywność enzymów w trzustce świnek morskich i względna masa płuc i śledziony

TABLE

The activity of enzymes in the pancreas and relative weight of lungs and spleen of guinea pigs

Grupy zwierząt Alfa-amylaza Trypsyna Płuca Śledziona

Goomps of aninals Alpha-amylase Trypsin | Lung Spleen

U. mg—1 uJA. mg—1 g/kg /kg

I Kontrola 88,0 = 23,7 74 = 3,2 9,2 = 1,7 2,0 = 0,5 Control

II Zarazona 59,6 = 17,1** 3,9 = 2,5 14,2 = 5,1** 2,9 = 1,3 Infected

III Otrzymująca kwasy

organiczne 65,2 = 12,3* 6,3 = 3,4 13,1 = 1,4* 5,3 = 1,5**

Treatment with organic |

acids

IV Otrzymujaca homoge-

nat z jaj A. suum 55,8 = 15,9** 9,1 = 4,7 9,3 = 2,1 3,7 = 0,9*

Treatment with homo-

genized eggs of A. suum

Objaśnienia: Istotność różnic średnich grupy kontrolnej i porównawczych oznaczano: * — dla p < 0,05; i ** dla p < 0,01.

Explanations: The significance of differences between control and compared groups was marked as * for p < 0,05, and ** for

p < 0,01. |

homogenaty z jaj pasożyta (gr IV, p < 0,05). Zastosowane czynniki doświad- czalne nie wpływały na masę pozostałych izolowanych narządów, toteż nie uwzględniano ich w tabeli.

Dyskusja

W ostatnich latach opublikowano szereg prac poświęconych regulacji na zasadzie sprzężenia zwrotnego egzokrynowych funkcji trzustki (Liebow 1987, Kein i wsp. 1988 Fushuki i Iwai 1989). Autorzy zwracają uwagę na decydujący wpływ poziomu aktywności trypsyny w treści dwunastniczej na sekrecję trzustki. Takie substancje jak białka pokarmowe czy też inhibitory trypsyny, wiążąc się z centrum aktywnym enzymu, obniżają jego względną aktywność, co pociąga za sobą stymulację wydzielania soku trzustkowego. Można zakładać, że syntetyzowane przez A. suum inhibitory proteaz powinny działać podobnie.

Nie jest jednak pewne, czy inhibitory te są białkami sekrecyjnymi wy- dzielanymi do środowiska (Juhasz i Matskasi 1979), czy działają wewnątrz organizmu pasożyta, wiążąc i blokując aktywność zaabsorbowanych przez niego enzymów proteolitycznych żywiciela (Martzen i wsp. 1985, 1986).

Inhibitory te, niezależnie od mechanizmu działania, w efekcie prowadzą do obniżenia aktywności trypsyny w dwunastnicy żywiciela (Jabłonowski i wsp.

1984), co zgodnie z regułą „feedback” nasilać winno sekrecję enzymów

z trzustki. Uzyskane w niniejszej i wcześniejszych pracach wyniki (Żółtowska i wsp. 1989, 1990) dotyczące obniżonej aktywności trypsyny i alfa-amylazy w trzustkach świnek morskich zarażonych A. suum zdają się potwierdzać ten sposób modyfikacji funkcji gruczołu żywiciela przez pasożyta. Dostrzeżono różnice, czyli wzrost zamiast obniżenia aktywności trypsyny, w odpowiedzi na dojelitowe wprowadzenie inwazyjnych jaj A. suum do organizmu żywiciels- kiego w porównaniu z doustnym (Żółtowska i wsp. 1989). Dojelitowe zarażenie powoduje zmiany zbliżone do tych jakie obserwowano po bezpośrednim zadziałaniu homogenatów z inwazyjnych jaj A. suum na wyciągi z trzustki (Żółtowska 1990). Oznaczana w obu wymienionych przypadkach wyższa niż w próbach kontrolnych aktywność trypsyny sugerowała występowanie w nie- naruszonych jajach lub ich homogenatach czynnika aktywującego enzym.

Wyniki niniejszych badań pozwalają przypuszczać, że czynnik ten nie odgrywa istotnej roli przy zarażeniu per os, gdyż aktywność trypsyny w trzustkach świnek morskich, którym podawano doustnie homogenaty z jaj A. suum była podwyższona tylko w niewielkim stopniu w porównaniu z kontrolą. Praw- dopodobnie czynnik ten jest rozkładany w żołądku lub środowisko żołądka modyfikując składniki homogenatu doprowadza do maskowania jego działa- nia.

Nie bez znaczenia w warunkach in vivo okazał się wpływ mieszaniny lotnych kwasów organicznych, będących końcowymi metabolitami glisty (Greichus i Greichus 1966). Roztwory dwu- do sześciowęglowych kwasów - zastosowane w tej pracy powodowały wzrost masy płuc i śledziony u świnek morskich. Wiadomo jest (Shiratori i wsp. 1988), że długołańcuchowe, nienasy- cone kwasy organiczne są czynnikami regulującymi sekrecję trzustki, działając poprzez zmiany poziomu CCK i sekretyny oraz przemiany inozytolofosfa- tydów w błonach komórek (Chaudbry i wsp. 1987) i aktywność kinazy białkowej C (Wooten i Wrenn 1988). Podobne sekretogenne działanie wykaza- no w przypadku mieszaniny rozgałęzionych kwasow organicznych C,-C, - (McCollum i wsp. 1987), kwasu propionowego (Johnson 1 wsp. 1986), kwasu masłowego (Bloom i wsp. 1989, Katoh i Yajima 1989). Podawany świnkom morskim maślan sodu powodował nasilenie wydzielania trzustkowego oraz wzrost poziomu alfa-amylazy w soku trzustkowym. W komórkach pęcherzyko- wych trzustki wykazano podwyższenie poziomu wewnątrzkomórkowego Ca?*, co chyba jest ważnym etapem w procesach regulacji sekrecji trzustki przez krótkołańcuchowe kwasy organiczne (Katoh i Tsuda 1987). Obser- wowane obecnie obniżenie poziomu trypsyny i alfa-amylazy w trzustce świnek morskich otrzymujących kwasy organiczne może być rezultatem wzmożonego wydzielania ich z narządu.

W końcu nasuwa się przypuszczenie, że A. suum może nasilać funkcje egzokrynowe trzustki żywiciela w dwojaki sposób, poprzez ujemne sprzężenie zwrotne dostarczając inhibitorów proteaz oraz poprzez działanie końcowych produktów jej metabolizmu, krótkołańcuchowych kwasów organicznych.

LITERATURA

Bloom E. J., Siddiqui B, Hicks J., W., Kim Y. S. 1989. Effect of sodium butyrate, a differentiating agent, on cell surface glycoconjugates of a human pancreatic cell line.

Pancreas 4: 59-64.

Chaudhry A., LaychockS.G,, Rubin R. P. 1987. The effect of fatty acids on phosphoinositide synthesis and myo-inositol accumulation in exocrine pancreas. J. Biol. Chem. 262:

17426-17431.

Fushiki T., Iwai K. 1989. Two hypothesis on the feedback regulation of pancreatic enzyme secretion. FASEB J. 3: 121-126.

Greichus A., Greichus V. A. 1966. Chemical composition and volatile fatty acid production of male Ascaris lumbricoides before and after starvation. Exp. Parasitol. 19: 85-90.

Jabtonowski Z., Zottowska K., Dziekonska J. 1984. Wplyw podawania witamin A, B,, iB, na aktywność enzymów proteolitycznych jelita krętego, czczego 1 dwunastnicy. podczas askarydozy larwalnej. Materiały XX Zjazdu Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, Olsztyn

1984: 141. |

Johnson D. D., Mitchell G. E, Tucker R. E,, Muntifering R. B. 1986. Pancreatic amylase, plasma glucose, and insulin responses to propionate or monensin in sheep. J. Dairy Sci. 69:

52-57.

JuhaszS., Matskasi J. 1979. Proteolytic enzymes and enzyme inhibitors in Ascaris suum. III. In utro study of proteinase inactivation by the parasite. Acta Vet. Acad. Sci. Hungar. 27: 93-97.

Katoh K., Tsuda T. 1987. Effects of intravenous injection of butyrate on the exocrine pancreatic secretion in guinea pigs. Comp. Biochem. Physiol. 87A: 569-572.

—., Yajima T. 1989. Effects of butyric acid and analogues on amylase release from pancreatic segments of sheep and goats. Pfliigers Arch. 413: 256-260.

Keim V., Goke B., Adler G. 1988. Changes in pattern of enzyme secretion by rat pancreas during repeated trypsin inhibitor treatment. Am. J. Physiol. 255 (Gastrointest. Liver Physiol.

18): 236-241.

Liebow Ch. 1987. Specific end product feedback regulation of pancreatic protein synthesis.

Pancreas 2: 136-140.

Lowry O.H., RosenbroughN. J., Farr A. L., Randall R. J. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Martzen M. R., GeiseG. L,, HoganR.J., Peanasky R. J. 1985. Ascaris suum: Localization of the host proteases and parasite proteinase inhibitors in cross section using immunochemical and fluorescent probe techniques. Exp. Parasitol. 60: 139-149.

—. —. Peanasky R. J. 1986. Ascaris suum: Immunoperoxidase and fluorescent probe analysis of host proteases and parasite proteinase inhibitors in developing eggs and second stage larvae.

Ibid. 61: 138-145.

McCollum F. T., Kim Y. K., Owens F. N. 1987. Influence of supplemental four — and five

— carbon volatile fatty acids on forage intake and utilization by steers. J. Anim. Sci. 65:

1674-1679.

ShiratoriK., Jo Y. H., Lee K. Y., Chang T. M., Chey W. Y. 1989. Effect of pancreatic juice and tripsin on oleic acid — stimulated pancreatic secretion and plasma secretion in dogs.

Gastroenterology 96: 1330-1336.

Stefański W., Żarnowski E. 1971. Rozpoznawanie inwazji pasożytniczych. PWRiL Warszawa.

Wooten M. W., Wrenn R. W. 1988. Linoleic acid is a ponent activator of protein kinase C type III —« isoform in pancreatic acinar cells; Its role in amylase secretion. Biochem. Biophys. Res. . Commun. 153: 67-73.

Żółtowska K. 1990. Aktywność trypsyny i alfa-amylazy w trzustce świnek morskich. III. Wpływ homogenatów z inwazyjnych jaj Ascaris suum oraz mieszaniny kwasów organicznych C,-C;

na aktywność enzymu w wyciągach trzustek. Wiad. Parazytol. 36: 9-14.

—. Dziekonska-Rynko J., Jabtonowski Z. 1989. Aktywnos¢ trypsyny I alfa-amylazy w trzustce świnek morskich. I. Wpływ wielkości dawki zarażeniowej i czasu trwania inwazji Ascaris suum, Goeze 1782. Ibid. 35: 47-52.

„Jabłonowski Z. 1989. Aktywność alfa-amylazy w surowicy i niektórych narządach świnek morskich. Ibid.: 41-45.

„Piechocki D., Zygadlewicz Е. 1990. Aktywność trypsyny i alfa-amylazy w trzustce świnek morskich. II. Wpływ zarażenia per os : dojelitowo inwazyjnymi jajami Ascaris suum. Ibid. 36:

3-8.

Otrzymano 27 XI 1989, zaakceptowano 5 ТУ 1991