WSTÊP
Nowoczesna radioterapia stano- wi jedn¹ z podstawowych metod leczenia nowotworów z³oœliwych.
Pomimo niew¹tpliwych sukcesów przyczyniaj¹cych siê do przed³u-
¿enia czasu ¿ycia chorych, nadal istnieje du¿a ró¿nica pomiêdzy mo¿liwoœciami terapii a oczekiwa- niami pacjentów. W ostatnim okre- sie szczególn¹ wagê zwraca siê na jakoœæ ¿ycia chorych (ang. qu- ality of life) po zakoñczonym lecze- niu. Przyjmuje siê, ¿e rozmiar istot- nych powik³añ popromiennych sta- nowi równie wa¿ne kryterium oceny metody leczenia, jak czas prze¿ycia chorych, co znajduje swój wymiar w definicji zysku te- rapeutycznego (ang. therapeutic gain). Z tego wzglêdu prognozo- wanie odpowiedzi komórki normal- nej tkanki, jak i nowotworowej na dzia³anie promieniowania jonizuj¹- cego stanowi¹ jedno z najwa¿niej- szych wyzwañ dla radioterapii w XXI w.
Promieniowra¿liwoœæ w³aœciwa ko- mórki (intrinsic radiosensitivity) sta- nowi wzglêdnie niezale¿n¹, a uwa- runkowan¹ genetycznie cechê, cha- rakteryzuj¹c¹ guz nowotworowy lub tkanki zdrowe [1]. Ocena promie- niowra¿liwoœci nowotworu oraz tkan- ki zdrowej przed rozpoczêciem kur- su leczenia napromienianiem stano- wi przedmiot badañ, siêgaj¹cych korzeniami praktycznie pocz¹tku ra- dioterapii, kiedy to w oparciu o ce- chy histopatologiczne wyró¿niono guzy charakteryzuj¹ce siê du¿¹ (np. nasieniak), umiarkowan¹ pro- mieniowra¿liwoœci¹ (np. rak p³asko- nab³onkowy) oraz guzy promienio- oporne (np. miêsak). Jednak ten podzia³ jest bardzo daleki od wspó³czesnych oczekiwañ z tego wzglêdu, ¿e nawet w obrêbie tego samego typu histologicznego ob- serwuje siê du¿¹ ró¿norodnoœæ od- powiedzi guza nowotworowego na napromienianie [2, 3]. Kolejnym wa¿nym zagadnieniem przed roz- poczêciem kursu radioterapii jest Radioterapia jest jedn¹ z podsta-
wowych metod leczenia nowotwo- rów z³oœliwych. Niestety, prze¿y- cia chorych oraz intensywnoœæ powik³añ popromiennych s¹ nadal dalekie od oczekiwañ. Z tego wzglêdu prognozowanie odpowie- dzi guza poddanego napromienia- niu oraz intensywnoœci powik³añ sta³yby siê niezwykle u¿yteczne, daj¹c mo¿liwoœæ indywidualizacji leczenia.
Obecnie w ocenie klinicznej po- zostaje kilka testów. Jednym z nich jest test formowania kolo- nii komórkowych po dawce 2 Gy (SF2), który umo¿liwia okreœlenie odpowiedzi dla guza oraz tkanki zdrowej. Jednak ze wzglêdu na d³ugi czas oczekiwania na wyniki oraz zbyt ma³¹ specyficznoœæ, nie znalaz³ zastosowania w rutynowej praktyce. Spoœród innych metod diagnostycznych nale¿y wymie- niæ analizê uszkodzeñ DNA i aberracji chromosomów doko- nywan¹ za pomoc¹ testu kometo- wego (ang. comet assay), mikro- j¹drowego (MN) oraz testu bleo- mycynowego.
Kolejnym kierunkiem badañ, umo¿liwiaj¹cych okreœlenie efek- tu radioterapii jeszcze przed jej rozpoczêciem, jest analiza mole- kularna komórek. Badania te wzbudzaj¹ bardzo du¿o nadziei, ale jak dotychczas znajduj¹ siê we wstêpnej fazie oceny.
Praktyczne zastosowanie testów prognostycznych napotyka na trudnoœci bêd¹ce wynikiem z³o¿o- noœci i zmiennoœci odpowiedzi ko- mórki na napromienianie, któr¹ determinuj¹ czynniki wewnêtrzne (genetyczne) oraz czynniki ze- wnêtrzne (sposób napromieniania, schorzenia internistyczne, lecze- nie operacyjne, cytostatykami, le- czenie wspomagaj¹ce).
W podsumowaniu mo¿na stwier- dziæ, ¿e mo¿liwoœæ prognozowa- nia odpowiedzi na napromienio- wanie zarówno w tkance zdrowej, jak i w guzie nowotworowym sta- nowi niezwykle kusz¹c¹ perspek- tywê, jednak obecnie nie mo¿na wskazaæ ¿adnego z testów, który
W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000033)) vvooll.. 77;; 44 ((333399––334455))
Prognozowanie efektu
napromieniania na podstawie oceny promieniowra¿liwoœci tkanek zdrowych
i guza nowotworowego
– ograniczenia i mo¿liwoœci
Prediction of radiotherapy effect based on evaluation of radiosensitivity of normal and cancer tissue
– limitations and possibilities
Piotr Milecki
1, Krzysztof Szyfter
21Zak³ad Radioterapii, Wielkopolskie Centrum Onkologii w Poznaniu
2Instytut Genetyki Cz³owieka PAN w Poznaniu
identyfikacja chorych, u których mo¿na oczekiwaæ nasilonej reakcji popromiennej w tkankach zdrowych [4, 5]. Powszechnie znany jest fakt wystêpowania u napromienianych chorych nadmiernie nasilonych re- akcji popromiennych (odczynów), niemaj¹cych swego uzasadnienia w parametrach fizycznych napro- mieniania, takich jak dawka ca³ko- wita i frakcyjna [6]. Najczêœciej na- suwaj¹cym siê wyt³umaczeniem ta- kiej nadmiernej reakcji tkanek zdrowych jest obecnoœæ nieznane- go czynnika wewnêtrznego, który jest uto¿samiany z podatnoœci¹ osobnicz¹ [7]. W³aœnie to spostrze-
¿enie leg³o u podstaw poszukiwa- nia testów identyfikuj¹cych chorych obci¹¿onych znacznym ryzykiem wyst¹pienia powik³ania popromien- nego. Równie¿ odpowiedŸ guza no- wotworowego na napromienianie mo¿e zale¿eæ w niewielkim stopniu od promieniowra¿liwoœci tkanki zdrowej [8]. Przekonanie takie wy- nika z faktu, ¿e komórka nowotwo- rowa jest zbli¿ona genotypowo i fe- notypowo do komórki zdrowej [9].
Oceniaj¹c realistycznie dotychcza- sowy stan wiedzy, nie nale¿y spo- dziewaæ siê jednak, ¿e na podsta- wie analizy intensywnoœci ostrego odczynu popromiennego mo¿liwym bêdzie prognozowanie odpowiedzi guza na radioterapiê [10].
W praktyce szacowanie odpo- wiedzi guza nowotworowego na le- czenie napromienianiem jest opar- te g³ównie na takich kryteriach jak stopieñ zaawansowania klinicznego (T1 vs T4), objêtoœæ guza (3 cm3 vs 20 cm3), lokalizacja anatomicz- na (piêtro œrodkowe krtani vs piê- tro górne krtani), typ histologiczny nowotworu oraz obecnoœæ przerzu- tów w uk³adzie ch³onnym (pN1 vs pN3). Niestety, nie zawsze spotyka siê tak ostro zdefiniowane ró¿nice, jak zaproponowano powy¿ej, które umo¿liwiaj¹ dok³adniejsze progno- zowanie wyników leczenia [11–13].
Okreœlenie wyniku terapii w przy- padku guza nowotworowego zloka- lizowanego w piêtrze œrodkowym krtani u dwóch chorych z tym sa-
mym zaawansowaniem klinicznym choroby, np. T2N0M0 w sposób ka- tegoryczny (0 lub 1) jest niemo¿li- we, a jedynie mo¿na okreœliæ prze- dzia³ prawdopodobieñstwa zajœcia zdarzenia. Zawê¿enie ryzyka b³êd- nej interpretacji w odniesieniu do guza oraz tkanek zdrowych jest g³ównym celem testów prognostycz- nych w radioterapii [9]. Idealny test prognostyczny winien zatem charak- teryzowaæ siê du¿¹ wiarygodnoœci¹ (du¿a korelacja jego wyniku z wyni- kami radioterapii), ale i równie¿ wi- nien byæ tani, mo¿liwy do po- wszechnego stosowania w praktyce, a nadto nieuci¹¿liwy dla chorego.
Niestety, jak dotychczas nie zdo-
³ano skorelowaæ rezultatów radiote- rapii z wynikami jakiegokolwiek ba- danego testu prognostycznego na tyle silnie, aby na tej podstawie do- konaæ indywidualizacji leczenia ra- dioterapi¹. Aby odpowiedzieæ na to pytanie, dlaczego jak dotychczas nie uda³o siê tego dokonaæ, nale¿y zastanowiæ siê nad ca³¹ z³o¿onoœci¹ zagadnienia. Na taki stan rzeczy ma- j¹ wp³yw w g³ównej mierze zewnêtrz- ne czynniki determinuj¹ce odpo- wiedŸ komórki na promieniowanie jo- nizuj¹ce, do których w pierwszej kolejnoœci zaliczy siê zaaplikowan¹ dawkê ca³kowit¹, dawkê frakcyjn¹, czas leczenia napromienianiem, na- promienian¹ objêtoœæ zdrowych tka- nek, organizacjê narz¹du krytyczne- go, a w dalszej kolejnoœci schorze- nia towarzysz¹ce (np. cukrzyca), czy leczenie operacyjne [14, 15].
Nasuwa siê spostrze¿enie, ¿e do- tychczas przeprowadzone analizy, oceniaj¹ce przydatnoœæ testów pro- gnostycznych niejednokrotnie by³y oparte na materiale klinicznym, cha- rakteryzuj¹cym siê du¿¹ ró¿norod- noœci¹ czynników wp³ywaj¹cych na ostateczny kszta³t odpowiedzi po- promiennej, co zapewne utrudnia³o wyci¹gniêcie wi¹¿¹cych wniosków.
Paradoksalnie, ocenê przydatnoœci danego testu prognozuj¹cego powi- k³anie popromienne w tkankach zdrowych mo¿e nawet utrudniaæ le- czenie wspomagaj¹ce, prowadzone w celu zniwelowania objawów ostre- znajduje rutynowe zastosowanie.
Wydaje siê, ¿e najwiêksze szanse zastosowania bêdzie mia³ ten test, który pozwoli w sposób wystarcza- j¹cy skorelowaæ wyniki testu z efek- tami klinicznymi napromieniania, a ponadto bêdzie szybki i tani.
S³owa kluczowe: radioterapia, te- sty prognostyczne, promieniowra¿- liwoœæ, powik³ania popromienne.
W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000033)) vvooll.. 77;; 44 ((333399––334455))
go odczynu popromiennego. Nie bez znaczenia s¹ zapewne niedo- k³adnoœci zwi¹zane z ocen¹ rzeczy- wistego stopnia nasilenia odczynu popromiennego. Wynika to m.in.
z faktu stosowania wielu klasyfikacji odczynów popromiennych (WHO, RTOG/EORTC, SOMA/LENT, CTC, DISHEGO), które opieraj¹ siê bar- dzo czêsto na subiektywnej ocenie intensywnoœci powik³ania, raportowa- nej zarówno przez chorego i leka- rza. W takim przypadku, np. wyst¹- pienie powik³ania popromiennego, które nie zmienia samopoczucia chorego mo¿e nie zostaæ zauwa¿o- ne (brak raportu klinicznego) w przypadku niewykonania dodatko- wych badañ (np. subkliniczna nie- doczynnoœæ tarczycy bez wykona- nia badañ hormonalnych). Z tego wzglêdu œcis³a wspó³praca klinicy- stów z przedstawicielami nauk pod- stawowych umo¿liwi dok³adniejsze odzwierciedlenie stanu rzeczywiste- go w napromienianym obszarze.
Równie¿ wiele pu³apek mo¿e byæ zwi¹zanych z niedok³adnoœci¹ podawanej dawki oraz b³êdami geometrycznymi, wystêpuj¹cymi podczas napromieniania. Uwzglêd- niaj¹c znaczne konsekwencje bio- logiczne b³êdu fizycznego (ang. do- uble trouble) szczególn¹ uwagê zwraca siê na ten aspekt kliniczny w analizie oceny przydatnoœci te- stu prognostycznego.
Przyjmuje siê, ¿e podstawowym mechanizmem odpowiedzialnym za popromienn¹ œmieræ komórki jest uszkodzenie DNA [16]. Promienio- wanie jonizuj¹ce powoduje przede wszystkim powstanie pêkniêæ w obrêbie DNA. Naprawa uszko- dzeñ popromiennych w obrêbie DNA jest skomplikowanym proce- sem biologicznym, w który [17] za- anga¿owanych jest ponad 130 ge- nów. Z tego wzglêdu efekt biolo- giczny w napromienianej komórce stanowi genetyczn¹ reprezentacjê.
Kliniczny obraz powik³ania popro- miennego jest wypadkow¹ stopnia uszkodzenia komórki, jej zdolnoœci¹ do naprawy uszkodzenia oraz spo- sobu organizacji podjednostek funk-
cjonalnych narz¹du lub tkanki.
W przypadku organizacji liniowej podjednostek funkcjonalnych, jak¹ obserwuje siê, np. w rdzeniu krê- gowym, uszkodzenie zaledwie jed- nej z nich wywo³uje przerwanie funkcji ca³ego ³añcucha pozosta-
³ych, nawet tych nieuszkodzonych przez promieniowanie jonizuj¹ce.
Prowadzi to do wy³¹czenia z funk- cjonowania znacznie wiêkszej licz- by komórek ani¿eli zosta³o bezpo- œrednio uszkodzonych [18]. Dodat- kowo na ostateczny kszta³t odczynu popromiennego mog¹ wp³ywaæ równie¿ czynniki modyfikuj¹ce, zwi¹zane ze schorzeniami interni- stycznymi (np. zaburzenia w mi- krokr¹¿eniu spowodowane cukrzy- c¹, chorobami naczyñ krwiono- œnych). Powoduje to progresjê objawów uszkodzenia popromien- nego, bêd¹c¹ wynikiem na³o¿enia siê obu wymienionych patologii.
Wreszcie nie bez znaczenia jest czas obserwacji chorych po za- koñczonym napromienianiu, ponie- wa¿ powik³ania póŸne ujawniaj¹ siê wraz z up³ywem czasu. Z tego wzglêdu zbyt krótka obserwacja chorych lub paradoksalnie bardzo z³e wyniki leczenia (np. paliatyw- na brachyterapia) prowadz¹ do ukrycia rzeczywistej liczby powi- k³añ popromiennych.
Jednym z istotnych problemów w prognozowaniu odpowiedzi na napromienianie jest brak wiedzy o potencjale regeneracyjnym tkan- ki zdrowej, na który sk³ada siê m.in. tempo proliferacji komórek rozrodczych oraz ukrwienie tkanki.
Z tego wzglêdu ocena stopnia uszkodzenia jedynie komórek tar- czowych tkanki czy narz¹du mo¿e nie stanowiæ wystarczaj¹cej si³y predykcyjnej do okreœlenia stopnia intensywnoœci odczynu popromien- nego. Kolejnym problemem, utrud- niaj¹cym dokonanie wiarygodnej i jednoczeœnie kompleksowej anali- zy dla ostrego i póŸnego odczynu jest brak œcis³ej korelacji pomiêdzy ich intensywnoœci¹. Testy, które w wystarczaj¹cy sposób prognozo- Radiotherapy plays an important
role in the treatment of many cancers. Unfortunately, the patient’s survival and the intensity of radiation complications are still far from the expected results. For this reason predicting the response of irradiated tumours and intensity of side effects would be very useful in the process of qualifying patients for radiotherapy. Adequately sensitive and specific tests of radiosensitivity would allow for the individualization of treatment. A variety of DNA damage assays have been applied in an effort to predict the sensitivity of cells to ionizing radiation. Currently, a few predictive tests are still under clinical evaluation. The colony- forming test after applied test dose of 2Gy (SF2) is one of them.
However, mainly due to relatively long waiting time needed for results, the test is not applied in the routine practice. Analysis of chromosome damage can be a useful method in the evaluation of radiotherapy effects. Among tests from this group, comet assay and micronuclei tests (MN) should be mentioned above all.
Molecular analysis of genes in- volved in response to radiotherapy is another type of research field enabling the prediction of radio- therapy effects. This research is very promising but currently it is at the initial phase of evaluation.
In summary, an attempt to do research on possibility of the prediction of tumour response to radiotherapy effects is very temp- ting. However, currently none of tests can be routinely applied. It seems that the greatest chance for application will have a test which is fast and cheap and above all which strongly correlates with the results of radiotherapy.
Key words: radiotherapy, predictive tests, radiosensitivity, side effects.
W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000033)) vvooll.. 77;; 44 ((333399––334455))
Wspó³czesna Onkologia
342
wa³yby intensywnoœæ ostrego od- czynu (wczesnego), niekoniecznie musz¹ odzwierciedlaæ skalê nasile- nia póŸnych powik³añ. Równie¿
sporo kontrowersji dotyczy wyboru do badañ predykcyjnych reprezen- tatywnej komórki zdrowej tkanki.
Najczêœciej testy opieraj¹ siê na analizie fibroblastów skóry, limfocy- tów krwi obwodowej czy keratocy- tów. Nale¿y jednak nadmieniæ, ¿e niektóre komórki s¹ zwi¹zane z okreœlonym typem powik³ania po- promiennego, np. fibroblast jest ty- pow¹ komórk¹ tarczow¹ dla póŸ- nych zw³óknieñ popromiennych, ale ma³o charakterystyczn¹ dla ostrego odczynu popromiennego b³ony œlu- zowej. Jeszcze wiêcej kontrowersji budz¹ limfocyty krwi obwodowej, które nie s¹ bezpoœredni¹ tarcz¹ dla odczynów popromiennych, a przyj- muje siê, ¿e reprezentuj¹ ogólny stan promieniowra¿liwoœci pacjenta.
W ocenie laboratoryjnej oraz kli- nicznej znajduje siê obecnie wiele testów diagnostycznych, oceniaj¹- cych nastêpuj¹ce parametry zwi¹za- ne z promieniowra¿liwoœci¹ komórki:
zdolnoœci klonogenne po napro- mienieniu,
intensywnoϾ aberracji chromoso- mowych,
efektywnoϾ naprawy DNA,
ekspresjê genów zaanga¿owanych w odpowiedŸ popromienn¹.
Spoœród testów oceniaj¹cych zdolnoœci klonogenne wymieniany jest przede wszystkim test formowa- nia kolonii komórkowych (colony for- mation test) – SF2 (survival fraction), który jest uwa¿any jak dotychczas za tzw. z³oty standard. Test ten zo- sta³ zaproponowany przez Fertila i Malaise [19], którzy wykazali zwi¹- zek pomiêdzy prawdopodobieñ- stwem zniszczenia guza nowotwo- rowego (TCP – tumour control pro- bability) a wielkoœci¹ frakcji komórek prze¿ywaj¹cych po testo- wej dawce 2 Gy (SF2). Okreœlenie wartoœci SF2 s³u¿¹ce do estymacji TCP u indywidualnego pacjenta wy- maga przeprowadzenia czasoch³on-
nej i pracoch³onnej hodowli komór- kowej. Czas oczekiwania na wyniki testu wynosz¹cy ok. 4 tyg. w przy- padku u¿ycia fibroblastów, a leuko- cytów ok. 2 tyg., jest jedn¹ z przy- czyn ograniczaj¹cych jego prak- tyczne zastosowanie [20]. Pobrane od pacjenta komórki tkanki zdrowej (np. fibroblasty lub limfocyty) lub nowotworowe zostaj¹ poddane na- promienianiu najczêœciej stosowa- n¹ dawk¹ w praktyce klinicznej, tj.
2 Gy. Podstawowym za³o¿eniem, na którym opiera siê test jest prze- konanie, ¿e miar¹ promieniowra¿li- woœci komórek poddanych napro- mienianiu dawk¹ testow¹ jest zdol- noœæ do tworzenia nowych kolonii komórkowych. Warunkiem niezbêd- nym do uznania tego faktu jest za- chowanie zdolnoœci do rozplemu, którego reprezentacj¹ jest powsta- nie kolonii komórkowej, czyli zajœcia przynajmniej od 4 do 5 podzia³ów komórkowych. Test mo¿e znaleŸæ potencjalne zastosowanie w pro- gnozowaniu odpowiedzi guza no- wotworowego oraz tkanek zdrowych na napromieniowanie (zw³óknienie popromienne) [21, 22]. Najczêœciej stosowanymi komórkami w ocenie promieniowra¿liwoœci tkanek zdro- wych s¹ fibroblasty, ze wzglêdu na ich obecnoœæ zarówno w tkance podskórnej, jak i w naczyniach krwionoœnych. Ten ostatni fakt mo-
¿e mieæ znaczenie równie¿ dla oce- ny intensywnoœci teleangiektazji, bê- d¹cych wynikiem popromiennego uszkodzenia drobnych naczyñ w ob- rêbie skóry. Dotychczasowe badania promieniowra¿liwoœci w oparciu o ten test wskazuj¹ na dobr¹ kore- lacjê wyników testu ze zw³óknie- niem popromiennym tkanki podskór- nej [23, 24]. Nale¿y jednak zauwa-
¿yæ, ¿e brak jest wystarczaj¹co przekonywuj¹cych dowodów daj¹- cych podstawê do korekty sposo- bu napromieniania (np. obni¿enie, zwiêkszenie dawki lub te¿ alterna- tywne leczenie w przypadku zwiêkszonej promieniowra¿liwoœci tkanek normalnych) w oparciu o jego wyniki, co stanowi³oby pod- stawê do jego uznania jako wiary-
godnego testu promieniowra¿liwo- œci. Podsumowuj¹c, 2 podstawo- we elementy wykluczaj¹ obecnie jego praktyczne zastosowanie.
Pierwszy to d³ugi czas wymagany do wykonania testu. Natomiast drugi jest zwi¹zany z ma³¹ precy- zj¹ metody. Podkreœlenia wymaga fakt, ¿e wyst¹pienie niewielkiego b³êdu w ocenie wartoœci SF2 pro- wadzi do jego znacznego wzrostu w odniesieniu do wartoœci TCP lub NTCP (ang. normal tissue compli- cation probability).
Uszkodzenie chromosomów i chromatyd, wyra¿aj¹ce siê niepra- wid³owoœciami w zakresie ich licz- by lub struktury mo¿e byæ wynikiem oddzia³ywania nawet ju¿ niewielkich dawek promieniowania jonizuj¹ce- go. Z tego te¿ wzglêdu analiza obecnoœci aberracji chromosomal- nych w zdrowych komórkach, do- konywana najczêœciej w limfocytach krwi obwodowej, po ekspozycji zna- nego czynnika testowego (okreœlo- na dawka promieniowania jonizuj¹- cego) mo¿e stanowiæ u¿yteczne Ÿród³o informacji o podatnoœci ko- mórki na uszkodzenie popromien- ne. Najczêœciej analizê wykonuje siê w oparciu o limfocyty, które s¹ wyj¹tkowo wygodne w praktyce ze wzglêdu na ³atwoœæ ich pozyskania.
Jednym z testów z tej grupy jest test bleomycynowy, który zosta³ za- proponowany przez Hsu [25], a je- go istot¹ jest indukcja uszkodzeñ chromosomów w warunkach hodow- li in vitro. Wynik testu opiera siê na pomiarze liczby pêkniêæ chromatyd, która jest poœrednim miernikiem zdolnoœci naprawy przez komórkê uszkodzonego DNA po zadzia³aniu na ni¹ testowego zwi¹zku, jakim jest bleomycyna. Bleomycyna zosta³a wybrana z powodu jej szczególnych w³aœciwoœci radiomimetycznych, in- dukuj¹cych zarówno pojedyncze, jak i podwójne pêkniêcia DNA. Ist- nieje równie¿ mo¿liwoœæ zast¹pienia bleomycyny innymi czynnikami ra- diomimetycznymi. W teœcie okreœla- na jest liczba pêkniêæ chromatyd na komórkê (b/c – breaks per cell) oraz odsetek komórek z uszkodzeniami
[26]. Wartoœæ testu bleomycynowe- go dobrze koreluje ze stopniem nie- stabilnoœci chromosomowej, definio- wanej jako obecnoœæ zwiêkszonej czêstoœci z³amañ oraz innych uszkodzeñ chromosomów w bada- nej populacji w porównaniu z popu- lacj¹ kontroln¹.
Test ma obecnie ustalon¹ pozy- cjê w rozpoznawaniu zwiêkszonej predyspozycji do zachorowania na pewne nowotwory z³oœliwe [26]. Na- tomiast ma³o jest informacji na te- mat potencjalnych mo¿liwoœciach jego wykorzystania dla identyfikacji chorych nadwra¿liwych na uszka- dzaj¹ce dzia³anie promieniowania jonizuj¹cego [27].
Kolejnym testem z tej grupy jest test kometowy (comet assay) – elektroforeza ¿elowa pojedynczych komórek – bazuj¹cy na analizie swoistego ogona tzw. komety, któ- rej d³ugoœæ koreluje ze stopniem nienaprawionego uszkodzenia DNA w komórce, stanowi¹cego swoist¹ reprezentacjê promieniowra¿liwoœci komórki [28–30]. Najczêœciej stoso- wanymi do analizy komórkami s¹ limfocyty, które po napromienieniu zostaj¹ umieszczone w polu elek- trycznym. Z uwagi na szybkoœæ uzyskania wyników, niewysoki koszt testu, wymagan¹ niewielk¹ liczbê komórek poddawanych analizie oraz du¿¹ korelacjê jego wyników z efektem biologicznym napromie- niania mo¿na przyj¹æ, ¿e jest to je- den z testów, mog¹cych znaleŸæ w przysz³oœci miejsce w praktyce klinicznej. Problemem technicznym jest relatywnie du¿a pracoch³onnoœæ podczas analizy mikroskopowej ocenianego materia³u. Obecnie trwaj¹ zaawansowane prace nad wprowadzeniem automatycznego odczytu wyników na drodze zasto- sowania analizy komputerowej (in- formacja ustna: dr Odilia Popanda, Niemiecki Instytut Rakowy w Hilder- bergu, Niemcy).
Test mikroj¹drowy (micronucleus – MN) jest testem, którego nazwa pochodzi od charakterystycznych mikroj¹der, przypominaj¹cych kla- syczne j¹dra komórkowe, a spoty-
kanych w komórce po jej ekspo- zycji na promieniowanie jonizuj¹ce.
Mikroj¹dra utworzone s¹ przez uszkodzone chromosomy (w fazie G0) lub chromatydy (w fazie G2) powsta³e w zale¿noœci od fazy cy- klu ¿yciowego komórki. Test polega na pomiarze liczby powsta³ych mi- kroj¹der w komórce w mikroskopie œwietlnym, bêd¹cego reprezentacj¹ uszkadzaj¹cego efektu promienio- wania jonizuj¹cego. Mikroj¹dra mo- g¹ równie¿ powstaæ w wyniku za- dzia³ania innych czynników uszka- dzaj¹cych niæ DNA, takich jak bleomycyna, kolchicyna, vinkrytyna.
Oprócz indukowanych mikroj¹der w trakcie testu, spotyka siê ponad- to mikroj¹dra spontaniczne, bêd¹- ce przede wszystkim reprezentacj¹ skumulowanych uszkodzeñ, powsta-
³ych w trakcie ¿ycia pacjenta.
W wielu nowotworach spotyka siê równie¿ zwiêkszon¹ obecnoœæ mi- kroj¹der spontanicznych, które s¹ wówczas miernikiem niestabilnoœci genetycznej. Istotn¹ cech¹ testu mi- kroj¹drowego jest to, ¿e w sposób wiarygodny odzwierciedla iloœæ nie- naprawionych struktur DNA, co ko- reluje z wydolnoœci¹ mechanizmów naprawczych w komórce. Jest te- stem szybkim, czyli mo¿liwym do zaakceptowania w rutynowej prak- tyce i mo¿e s³u¿yæ do oceny pro- mieniowra¿liwoœci guza oraz tkanek zdrowych (fibroblasty lub limfocyty) [32]. Wymaga jednak przeprowa- dzenia hodowli komórkowej. Obec- nie test nie jest jednak aprobowa- ny do zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej jako narzêdzie s³u¿¹ce do oceny promieniowra¿li- woœci guza lub tkanki zdrowej.
ANALIZA GENETYCZNA
Obecnie uwaga wielu badaczy skupia siê na genetycznych uwa- runkowaniach odpowiedzi komórki na napromienianie. Podstawê do powy¿szego kierunku badañ da³y m.in. obserwacje chorych, u któ- rych stwierdza siê takie uwarunko- wane genetycznie zespo³y, jak ata- xia teleangiectasia (AT), zespó³ Nij-
megen (Nijmegen Breakage Syn- drom – NBS), anemia Fanconiego, czy zespó³ Blooma. U chorych tych wspó³istnieje nadwra¿liwoœæ normal- nych komórek na uszkadzaj¹ce dzia³anie promieniowania jonizuj¹- cego [33]. Nadwra¿liwoœæ jest wy- nikiem nieprawid³owego funkcjono- wania genów, bior¹cych udzia³ w popromiennej naprawie uszko- dzonego DNA. Wiele badañ po- œwiêcono genowi ATM, koduj¹cemu bia³ko nadzoruj¹ce detekcjê popro- miennego uszkodzenia DNA, zatrzy- manie cyklu komórkowego, napra- wê DNA, czy wreszcie apoptozê, a którego mutacja prowadzi do ataksji teleangiektazji (AT) [34, 35].
W zdrowej populacji obecnoœæ he- terozygot tego genu wynosi od 0,5 do 1 proc., jednak w populacji cho- rych na chorobê nowotworow¹ ten odsetek jest zwykle wy¿szy. Wyniki przeprowadzonych dotychczas ba- dañ oceniaj¹cych zwi¹zek pomiê- dzy obecnoœci¹ genotypu heterozy- goty AT a intensywnoœci¹ odczynu popromiennego mog¹ wskazywaæ na to, ¿e gen ATM jest jednym z wielu wa¿nych czynników, deter- minuj¹cych odpowiedŸ komórki na napromienianie. W kolejnym zespo- le nale¿¹cym do grupy tzw. zespo-
³ów niestabilnoœci chromosomowych znajduje siê zespó³ Nijmegen, któ- ry charakteryzuje siê wystêpowa- niem samoistnych pêkniêæ oraz strukturalnych rearan¿acji chromo- somów, co znacznie zwiêksza wra¿- liwoœæ na promieniowanie jonizuj¹- ce. Z najnowszych badañ wynika,
¿e tzw. s³owiañska mutacja genu NBS1 wystêpuje w populacji Polski z czêstoœci¹ przekraczaj¹c¹ 0,5 proc., a ryzyko zachorowania jej heterozygotycznych nosicieli na no- wotwór z³oœliwy jest ponadcztero- krotnie zwiêkszone [36].
Poznanie sekwencji genów w genomie cz³owieka otwiera du¿e mo¿liwoœci badawcze, aczkolwiek najistotniejszym jest poznanie funk- cji tych genów oraz wystêpuj¹cych interakcji pomiêdzy nimi. Wprowa- dzanie nowych technik do analizy
Prognozowanie efektu napromieniania na podstawie oceny promieniowra¿liwoœci tkanek zdrowych i guza nowotworowego – ograniczenia i mo¿liwoœci
343
Wspó³czesna Onkologia
344
genomu, m.in. techniki mikromacie- rzy, pozwala na ocenê tysiêcy in- dywidualnych mRNA w bardzo krótkim czasie. Zw³aszcza ocena aktywnoœci genów zaanga¿owa- nych w popromienn¹ naprawê DNA mo¿e byæ niezwykle u¿ytecz- na w prognozowaniu odpowiedzi komórki na dzia³anie promieniowa- nia jonizuj¹cego.
Badania nad molekularnymi me- chanizmami odpowiedzi komórki na napromienianie s¹ w pocz¹tkowej fazie, aczkolwiek budz¹ wiele na- dziei na lepsze ich poznanie i co za tym idzie – ewentualne mo¿liwo- œci modyfikacji terapii. Pewn¹ prze- szkod¹ mo¿e byæ fakt braku jedno- znacznie skorelowanej zwiêkszonej wra¿liwoœæ jednego typu zdrowych komórek z identyczn¹ promieniow- ra¿liwoœci¹ innego typu komórek u tego samego pacjenta. Mo¿na, co najwy¿ej rozpoznaæ zwiêkszon¹ promieniowra¿liwoœæ, z tym jednak zastrze¿eniem, ¿e stopieñ jej eks- presji mo¿e byæ znacz¹co ró¿ny dla poszczególnych narz¹dów [37].
Inn¹ wa¿n¹ przes³ank¹ wynikaj¹- c¹ z badañ nad genetycznie uwa- runkowan¹ promieniowra¿liwoœci¹, jest jej zale¿noœæ od ekspresji do- tychczas nieujawnionych jeszcze genów, a ponadto jest ona wypad- kow¹ wspó³dzia³ania wielu genów, dodatkowo modyfikowan¹ przez czynniki zewnêtrzne. Z tego te¿
wzglêdu, istotnego prze³omu w ba- daniach nad genetyczn¹ ocen¹ promieniowra¿liwoœci bêdzie mo¿na oczekiwaæ w wyniku wdro¿enia no- wych technik, wspomnianych wcze- œniej, tj. oceny mikromacierzy (mi- croarray assay) z wykorzystaniem komputerowej analizy otrzymanych wyników (biostatystyka) i lepszego poznania funkcji genów zaanga¿o- wanych w odpowiedzi komórki na napromienianie [38].
PODSUMOWANIE
Perspektywa prognozowania re- akcji na napromienianie zdrowych komórek pacjenta oraz komórek no-
wotworowych jest niezwykle kusz¹- ca. Klinicysta, posiadaj¹c narzêdzie w postaci wiarygodnego testu pro- mieniowra¿liwoœci móg³by precyzyj- nej planowaæ leczenie (indywiduali- zacja postêpowania), uwzglêdniaj¹c ryzyko wyst¹pienia powik³ania u chorego oraz prognozuj¹c odpo- wiedŸ na zastosowany rodzaj tera- pii (radioterapia, chemioterapia). Po- zwoli³oby to zapewne na lepsze wy- korzystanie posiadanych metod leczenia, a nadto zaoszczêdzi³oby wielu chorym cierpienia, bêd¹cego nastêpstwem wyst¹pienia powik³añ popromiennych.
Dowodem du¿ego zainteresowa- nia opisan¹ tematyk¹ by³o zorgani- zowane w ostatnim okresie (maj 2003 r.) przez Niemieckie Centrum Badañ nad Rakiem w Heidelbergu sympozjum na temat biologicznych podstaw wra¿liwoœci na promienio- wanie jonizuj¹ce. ¯a³owaæ mo¿na tylko, ¿e sympozjum by³o zdomino- wane przez biologiczny punkt wi- dzenia, z nik³ym odniesieniem do praktyki radioterapeutycznej. Nale-
¿y jednak nadmieniæ, ¿e organiza- torzy przewiduj¹ kontynuowanie ko- lejnych spotkañ, z zak³adanym wiêkszym udzia³em klinicystów.
PIŒMIENNICTWO
1. Szumiel I. Intrisnic radiosensitivity of pro- liferating mammalian cells. Advances in Radiation Biology 1981; 9: 281-321.
2. Tucker SL, Thames HD. The effect of pa- tient-to patient variability on the accura- cy of predictive assays of tumor respon- se to radiotherapy – a theoretical evalu- ation. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1989; 17: 145-57.
3. Tucker SL, Geara FB, Peters LJ, Brock WA. How much could the radiotherapy dose be altered for individual patients ba- sed on predictive assay of normal-tissue radiosensitivity? Radiother Oncol 1996;
38: 103-13.
4. Burnet NG, Johansen J, Turesson I, Ny- man J, Peacock JH. Describing patients’
normal tissue reactions: concerning the possibility of individualising radiotherapy dose prescriptions based on potential pre- dictive assays of normal tissue radiosen- sitivity. Int J Cancer 1998; 79: 606-13.
5. Burnet NG, Nyman J, Turesson I, et al.
Potential for improving radiotherapy cure rates by predicting normal tissue toleran- ce from in vitro cellular radiation sensitivi- ty. Lancet 1992; 339: 1570-1.
6. Russell NS, Knaken H, Bruinvis IA, et al.
Qualification of patients to patient varia- tion of skin erythema developing as a re- sponse to radiotherapy. Radiother Oncol 1994; 30: 213-21.
7. Bush D. Genetic susceptibility to radia- tion and chemotherapy injury: diagnosis and management. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1994; 30: 997-1002.
8. Andreassen CN, Alsner J, Ovegaard J.
Does variability in normal tissue reactions after radiotherapy have a genetic basis – where and how to look for it? Radiother Oncol 2002; 64: 131-40.
9. Bartelink H, Begg A, Martin JC, van Dijk M, van’t Veer M, van der Vaart P, Ver- heij M. Towards prediction and modula- tion of treatment response. Radiother On- col 1999; 50: 1-11.
10. Budach W. Genetic predisposition and ra- diation sensitivity of tumors. Strahlenther Onkol 1997; 173: 469-79.
11. Overgaard J, Hansen HS, Jorgensen K, et al. Primary radiotherapy of larynx and pharynx carcinoma – an analysis of some factors influencing local control and survi- val. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1986;
12: 515.
12. Lundahl RE, Foote RL, Bonner JA, Su- man VJ, Lewis JE, Kaperbauer JL, McCaffrey TV, Olsen KD. Combined neck dissection and postoperative radiation the- rapy in the management of high-risk neck:
a matched-pair analysis. Int Radiat On- col Biol Phys 1998; 40: 529-34.
13. Dubben HH, Thames HD, Beck-Born- holdt HP. Tumor volume: a basic and spe- cific response predictor in radiotherapy.
Radiother Oncol 1998; 47: 167-74.
14. Parsons JT, Mendenhall WM, Stringer SP, Cassisi NJ, Million RR. An analysis of fac- tors influencing the outcome of postope- rative irradiation for squamous cell carci- noma of the oral cavity. Int J Radiat On- col Biol Phys 1997; 39: 137-48.
15. Zatterstrom UK, Wennerberg J, Ewers SB, Willen R, Attewell R. Prognostic fac- tors in head and neck cancer: histologic grading, DNA ploidy, and nodal status.
Head Neck 1991; 13: 477-87.
16. Radford IR. Evidence for a general rela- tionship between the induced level of DNA double-strand breakage and cell killing after X-irradiation of mammalian cells. Int J Ra- diat Oncol Biol Phys 1986; 49: 611-20.
17. Venkitaraman AR. A growing network of cancer-susceptibility genes. N Engl J Med 2003; 8: 1917-9.
18. Maciejewski B. Tolerancja zdrowych zdro- wych tkanek w radioterapii nowotworów.
Odczyny popromienne. Wydawca – Cen- trum Onkologii, Gliwice 1991.
19. Fertil B, Malaise EP. Intrinsic radiosensi- tivity of human cell lines is correlated with radioresponsivness of human tumours.
Analysis of 101 published survival curves.
Int Radiat Oncol Biol Phys 1985; 11:
1699-707.
20. Opptiz U, Baier K, Wulf J, Schakowski R, Flentje M. The in vitro colony assay:
a predictive of clinical outcome. Int J Ra- diat Biol 2001; 77: 105-10.
21. Bjork-Eriksson T, West C, Karlsson E, Mercke C. Tumor radiosensitivity (SF2) is a prognostic factor for local control in head and neck cancers. Int J Radiat On- col Biol Phys 2000; 46: 13-9.
22. Hsu TC. Bleomycin test for evaluation DNA damage. In Vitro Cell Dev Biol 1987; 23: 591-603.
23. Geara FB, Peters LJ, Ang KK, et al. Pro- spective comparison of in vitro normal cell radiosensitivity and normal tissue reac- tions in radiotherapy patients. Strahlen- ther Oncol 1992; 27: 1173-9.
24. Burnet NG, Nyman J, Turesson I, et al.
The relationship between cellular radiation sensitivity and tissue response may provi- de the basis for individualising radiothera- py schedules. Radiother Oncol 1994, 33:
228-38.
25. Jarmu¿ M, Szyfter K. Zastosowanie testu bleomycynowego do okreœlenia predys- pozycji genetycznej do zachorowania na nowotwory. Wspó³czesna Onkol 1999; 5:
188-90.
26. Szyfter K. Rola czynnika genetycznego w powstaniu i przebiegu p³askonab³onko- wego raka krtani. Postêpy w chirurgii g³o- wy i szyi 2002; 1: 5-19.
27. Cloos J, Steen J, Timmerman AJ, et al.
DNA – damage processing in blood lym- phocytes of head – and – neck squamous cell carcinoma patients in dependent on tumour site. Int J Cancer 1996; 27: 26-9.
28. Wada S, Kurahayashi H, Kobayashi Y, Funayama T, et al. The relationship be- tween cellular radiosensitivity and radia- tion-induced DNA damage measured by the comet assay. J Vet Med Sci 2003;
65: 471-7.
29. Le QT, Kovacs MS, Dorie MJ, Koong A, et al. Comparison of the comet assay and the oxygen microelectrode for measuring tumour oxygenation in head and neck cancer patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003; 56: 375-83.
30. Palyvoda O, Polanska J, Wygoda A, Rzeszowska-Wolny J. DNA damage and repair in lymphocytes of normal individu- als and cancer patients: studies by the co- met assay and micronucleus tests. Acta Biochem Pol 2003; 50: 181-90.
31. Sarkaria JN, Bush C, Eady JJ, Peacock JH, Steel GG, Yarnold JR. Comparison between pulsed-field gel electrophoresis and the comet assay as predictive for ra- diosensitivity in fibroblasts. Radiat Res 1998; 150: 17-22.
32. Shibamoto Y, Sterffer C, Fuhrmann C, Budach V. Tumour radiosensitivity predic- tion by the cytokinesis-block micronuclei assay. Radiat Res 1991; 128: 29.
33. Coleman CN. Clinical applications of mo- lecular biology in radiation oncology. Se- min Radiat Oncol 1996: 6: 245-9.
34. Elkind MM. DNA repair and cell repair, are they related? Int J Radiat Oncol Biol Phys 1979; 5: 1089-94.
35. Coleman CN. Of what use is molecular biology to the practicing radiation oncolo- gist? Radiother Oncol 1998; 46: 117-25.
36. Steffen J, Siwicki JK. Molekularna pato- geneza zespo³u Nijmegen. Implikacje dla postêpu wiedzy o mechanizmach rozwo- ju nowotworów na pod³o¿u defektów ³¹- czenia dwuniciowego pêkniêcia DNA. No- wotwory 2000; 5: 507-14.
37. Arrand JE, Kysela B. Molecular analy- sis of radiation damage and repair in nor- mal and mutant cells. Br J Radiol 1992;
24: 43-7.
38. Hartman AK, Modlich D, Prisack BH, Gerlach B, Bajor H. Gene expression pro- filing of advanced head and squamous cell carcinoma and two squamous cell carci- noma cell lines under radio/chemotherapy using cDNA arrays. Radiother Oncol 2002; 63: 309-20.
39. Brock WA, Tucher SL. In vitro radiosen- sitivity and normal tissue damage. Radio- ther Oncol 2000; 55: 93-4.
40. Brown JM, Evans J, Kovacs MS. The prediction of human tumour radiosensiti- vity in situ: an approach using chromoso- me aberrations detected by fluorescence in situ hybridization. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1992; 24: 279-86.
41. Coco JM, Mooren E, Ottenheim C, et al.
Potential of radiation-induced chromoso- me aberrations to predict radiosensitivity in human tumour cells. Int J Radiat Biol 1999; 75: 1161-8.
42. Alsner J, Sorensen BS, Overgaard J. TP 53 mutation is related to poor prognosis after radiotherapy, but not surgery in squamous cell carcinoma of the head and neck. Radiother Oncol 2001; 59: 179-85.
43. Rudat V, Dietz A, Nollert J, Condradt C, Weber JK, Flentje M, Wannemacher M.
Acute and late toxicity, tumour control and intrisinic radiosensitivity of primary fibroblasts in vitro of patients with advanced head and neck cancer after concomitant boost radiochemotherapy.
Radiother Oncol 1999; 53: 233-45.
ADRES DO KORESPONDENCJI dr med. PPiioottrr MMiilleecckkii
Zak³ad Radioterapii
Wielkopolskie Centrum Onkologii ul. Garbary 15
61-866 Poznañ
e-mail: pmilecki@wco.pl Prognozowanie efektu napromieniania na podstawie oceny promieniowra¿liwoœci tkanek zdrowych i guza nowotworowego – ograniczenia i mo¿liwoœci
