UNIVERSITATIS MARIAE CURIE - SKŁODOWSKA LUBLIN — POLONIA
VOL. X, 11. SECTIO C 14.UI.1M7
Z Zakładu Fizjologii Roślin Wydz. Biologii 1 Nauk o Ziemi U. M. C. S Kierownik : Prof, dr Adam Pasrewski
Jerzy TROJANOWSKI
Rozdział chromatograficzny kwasów hymatomelano- wych na celulozie
Разделение гиматомелановых кислот при помощи хроматографии на целлюлозе Chromatography of Hymatomelanic Acids, upon
the Cellulose
Wstęp
Powszechnie dotychczas stosowane chemiczne metody przygoto
wywania preparatów substancji humusowych nie dają możliwości roz
dzielenia naturalnych kompleksów tych związków na pojedyncze składniki (1). Nieznajomość poszczególnych składników humusu i ich niedostateczny rozdział przy pomocy klasycznych metod znacznie utrudniają postęp w badaniach biochemizmu powstawania humusu i jego oddziaływania na rośliny. Postęp tych badań ma duże znaczenie zarówno teoretyczne, jak i praktyczno-rolnicze.
Zazwyczaj przyjmuje-się za Ode nem (14) podział związków humusowych na 3 główne grupy z uwagi na ich rozpuszczalność:
I — kwasy fulwonowe — rozpuszczalne w wodzie,
II — kwasy hymatomelanowe (albo ulminowe) — rozpuszczalne w etanolu,
III — kwasy huminowe rozpuszczają się w wodnych roztworach alkaliów, szczawianu sodu i fluorku sodu.
Między tymi umownie przyjętymi grupami związków istnieje szereg substancji o charakterze przejściowym (29), ponieważ wymię-
nione rozpuszczalniki nie działają ściśle wybiorczo w stosunku do poszczególnych grup. Podział O d e n a ma obecnie uzasadnienie
raczej historyczne niż chemiczne. Kwasy fulwonowe i liymatomela- * nowe uważane są przez niektórych autorów (13) za stadium poprze
dzające syntezę kwasów huminowych.
Przy pomocy konwencjonalnych metod ekstrakcji (23, 20, 21) otrzymuje się z gleb i torfów preparaty o dość złożonym składzie, zawierające głównie szeregi homologiczne związków humusowych o różnym stopniu polimeryzacji (18).
Zawierają one domieszkę substancji towarzyszących, jak np. estry kwasów żywicowych, poliuronidy, garbniki, kwas krzemowy i inne (16, 29). Skład tych preparatów trudno jest więc zdefiniować che
micznie, tym bardziej, gdy pochodzą one z różnych materiałów proch- nicznych, powstających w niejednakowych warunkach klimatycznych i mikrobiologicznych. Używanie niezdefiniowanych chemicznie prepa ratów humusu do doświadczeń biologicznych powoduje duże trudności przy porównywaniu i ocenie wyników, podawanych przez badaczy tych zagadnień (29).
Wydaje się więc rzeczą celową poszukiwanie nowych sposobów izolowania i oczyszczania substancji humusowych w celu uzyskania jednostek określonych pod względem składu chemicznego i czystości.
Mając to na uwadze, autor podjął próbę chromatograficznego rozdzie
lenia kwasów hymatomelanowych na skalę prcparatywną.
Dotychczasowe badania nad zastosowaniem chromatografii do wyodrębniania substancji humusowych
W celu rozdzielenia grupy kwasów fulwonowych zastosował Forsyth (6) w r. 1947 analizę adsorpcyjną na węglu aktywnym. Nie używano kolumn lecz lejki Biichnera, w których formowano warstwę adsorbenta o grubości 5 cm i średnicy 15 cm. Adsorpcja kwasów fulwonowych przebiegała z roztworu wodnego, zakwa
szonego do pH 2,5—3. Przy pomocy eluowania adsorbenta różnymi rozpuszczalni
kami (roztwór 0,1 n HC1, aceton + 10®/0 wody, woda, roztwór 0,5 n NaOH) uzyska! Forsyth 4 frakcje kwasów fulwonowych oraz przeprowadził ich analizę elementarną i jakościową.
W r. 1952 rozdzielił Trojanowski (26) wyciąg etanolowy kwasów hyma
tomelanowych z torfu przy pomocy chromatografii kolumnowej na tlenku magnezu * (MgO gruboziarnisty). Do rozwijania chromatogramu zastosowano układ: kwas
olejowy — etanol (w stosunku 1:7,5 obj.). Posługiwano się lampą analityczną kwarcową dla indykacji warstw na kolumnie. Mechanicznie wydzielone warstwy chromatogramu eluowano przy pomocy kwasu solnego przy pH 2. Autor wskazał
również na możliwość zastosowania pasków bibuły do analizy chromatograficznej kwasów hymatomelanowych.
Thiele i Kettner (24) ogłosili w roku 1953 metodę oddzielania grupy
»• kwasów huminowych od frakcji kwasów fulwonowych i hymatomelanowych za pomocą elektroforezy na bibule. Rozdział tych grup prowadzono w roztworze /buforowanym przy pH 8. pod napięciem 220—400 V.
Hayas hi T s u netom o i Nagai Takeo (9) rozdzielali uwolnione od substancji bitumicznych kwasy huminowe na 3 bądź 4 frakcje na ko
lumnie wypełnionej tlenkiem glinu Dla indykacji warstw używano lampy kwarcowej.
’Drozdowa (4) rozwinęła metodę Forsyth'a (6) przez wprowadzenie dodatkowego oczyszczania frakcji kwasów fulwonowych na kationicie.
Badania własne
Jak wynika z piśmiennictwa grupa kwasów hymatomelanowych jest dotychczas najmniej zbadaną frakcją humusu. W niniejszej pracy podjęto próbę wyodrębnienia rozpuszczalnych w acetonie składników tej frakcji.
Przy opracowywaniu metody przyjęto następujące założenia:
1) Metoda powinna umożliwiać wyodrębnianie składników kwa
sów hymatomelanowych na skalę preparatywną.
2) Proces ekstrahowania wyjściowych materiałów próchnicznych oraz chromatograficznego rozdzielania uzyskanych przez ekstrakcję wyciągów powinien się odbywać bez użycia alkaliów, w temperaturze nie wyższej niż 60° oraz w warunkach zapobiegających utlenieniu preparatów. Istnieją bowiem wypowiedzi, że substancje humusowe łatwo utleniają się na powietrzu wobec alkaliów (2, 1), a nawet ulegają pod ich działaniem rozkładowi na związki prostsze (17, 20, 21, 22). Działanie rozkładające wywiera także temperatura ponad 100° (27), a nawet spotyka się wypowiedzi, że temp. 60° jest naj
wyższą dopuszczalną ciepłotą, nie powodującą zmian chemicznych v/ substancjach humusowych (29).
Dopuszczono natomiast użycie w opracowywanej metodzie roz
cieńczonych roztworów kwasu solnego, ponieważ powszechnie przyj-
♦ muje się, że związki humusowe są bardzo odporne na działanie roz
cieńczonych kwasów mineralnych (8, 29). Traktowanie wyjściowych materiałów próchnicznych roztworem kwasu solnego przed właściwą ekstrakcją jest z reguły zalecane w celu rozłożenia nierozpuszczal
nych w wodzie i alkoholu połączeń humusu z wapniem i żelazem (l',ć2, 14, 20, 21, 29).
Ekstrakcja materiału
Kwasy hymatomelanowe wydzielano z ziemi kompostowej i z torfu.
Próbki ziemi kompostowej pochodziły z pryzm dwu-, cztero-, i cześno- letnich; materialem do kompostowania byty liście drzew różnych gatunków. Próbki torfu pochodziły z miejscowości Oborniki w woj.
Poznańskim (torf wysoki) oraz z lęk nadbystrzyckich pod Lublinem (torf niski).
Materiał próchniczny powietrznie suchy rozdrobniono i przesiano.
Substancje bitumiczne usuwano z materiału przez wyczerpujęcą eks
trakcję w aparatach Soxhleta przy pomocy mieszaniny benzenu z eta nolem w stosunku 1:1, zgodnie z przyjętą zasadą (3, 7, 19).
Pozbawiony bitumin materiał wymywano roztworem 0,2 n HCI w celu rozłożenia nierozpuszczalnych połączeń kwasów hymatomela
nowych z Ca i Fe. Przemywanie prowadzono na lejkach Buchnera, utrzymując ciągły przepływ cieczy przez warstwę materiału. Gdy prze
sącz nie zawierał już jonów żelaza i wapnia przepłukano materiał wodą dest. wielokrotnie, aż do usunięcia jonów chloru. Tak przemyty materiał pozbawiony był nie tylko wymywalńych roztworem 0,2 n HCI jonów, nieorganicznych, lecz także wszystkich rozpuszczalnych w kwa
sie solnym i w wodzie związków organicznych towarzyszących humu
sowi (27) oraz kwasów fulwonowych.
W celu wydzielenia kwasów hymatomelanowych ekstrahowano przepłukany wodą materia! kilkakrotnie przy pomocy 95-procentowego etanolu w zamkniętych naczyniach, w temp, pokojowej. Z 1 kg mate
riału próchnicznego uzyskiwano łącznie około 20 litrów wyciągu eta
nolowego.
W celu zagęszczenia roztworu, a także częściowego oczyszczenia zawartych w nim substancji humusowych, wykorzystano zdolność kwa
sów hymatomelanowych do tworzenia nierozpuszczalnych połączeń z wapniem. Do wyciągu etanolowego dodano roztworu 5-procentowego octanu wapnia w stosunku 50 ml octanu na 1000 ml wyciągu. Kwasy hymatomelanowe wytrącały się w postaci ciemno brązowego, kłaczkc watego osadu (połączenia z Ca). Pozostały nad osadem roztwór nie- strącalnych przy pomocy octanu wapnia związków towarzyszących miał barwę żółto-pomarańczową. Wartość pH = 6,8 podczas strącama ustalano przy pomocy pehametru lampowego z elektrodą szklaną i na syconą kalomelową; w celu zobojętnienia kwasu octowego, uwalnia
jącego się w toku reakcji, dodawano kilka ml roztworu 0,1 n NaOH.
Strącanie odbywało się w zamkniętych na szlif cylindrach szklanych o wysokości 75 cm i średnicy 8 cm, w których strąt sedymentował
* przez 12 godzin. Osad po sedymentacji odwirowywano z szybkością 5000 obr./min. W celu uwolnienia odwirowywanego preparatu od wap
nia poddawano go niezwłocznie wypłukiwaniu przy pomocy 0,5 n roztworu HC1 aż do zaniku reakcji na Ca (ze szczawianem). Na koniec przemyto osad kwasów hymatomelanowych roztworem 0,1 n HC1 i wodą dest. Całkowite wymywanie osadu z pozostałości HCl nie jest wska
zane wobec łatwej peptyzacji wydzielonych substancji w wodzie.
Podczas odwirowywania i przemywania osad pozostawał w tych samych naczyniach do wirowania, zamkniętych szczelną przykrywką celofanową.
Przemyt)' osad kwasów hymatomelanowych rozpuszczano w ace
tonie, nieznaczną pozostałość nierozpuszczalną w acetonie usuwano przez odwirowanie w szczelnie zamkniętym naczyniu. Uzyskane w ten sposób z różnych materiałów wyjściowych wyciągi acetonowe frakcjo
nowano przy pomocy chromatografii.
Chromatografia acetonowego wyciągu kwasów hymatomelanowych
Przy opracowywaniu warunków chromatografowania autor starał się unikać stosowania takich odczynników, których ślady trudno by
łoby usunąć potem całkowicie z preparatów, przeznaczonych między innymi i do doświadczeń biologicznych (np. pirydyna). Wykluczono również stosowanie alkaliów i silnych kwasów z przyczyn podanych poprzednio.
Kwasy hymatomelanowe rozpuszczają się dobrze tylko w niewielu rozpuszczalnikach organicznych. Przy dobieraniu układu rozpuszczał riików do chromatografii należało więc wypróbować przede wszystkim alkohole i aceton, w których ta grupa substancji dobrze się rozpuszcza.
Wykonano szereg wstępnych prób z różnymi alkoholami (mety-
« Iowy, etylowy, izopropylowy, n-butylowy) oraz z mieszaninami alko
holów, acetonu i wody. Jako adsorbenta używano celulozy sproszko
wanej Whatmana i bibuły Whatmana Nr 1 (stosując na bibule technikę wstępującą i krążkową).
Ponieważ ilość składników w badanych wyciągach acetonowych oraz ich zdolność adsorbowania się na celulozie były nieznane, więc
za kryterium przydatności układu rozpuszczalników przyjęto maksy
malną ilość stref uzyskanych na chromatogramie bibułowym oraz możliwie duże zróżnicowanie wartości współczynników Rf. Po prze
prowadzeniu kilkuset prób ustalono, że do rozdzielania acetonowego roztworu kwasów hymatomelanowych nadaje się układ n-butanol — aceton — woda. Dla indykacji stref posługiwano się analityczną lampą kwarcową z filtrem Wood’a.
W toku doświadczeń nad ustaleniem optymalnego stosunku n-butanolu do wody i acetonu poczyniono następujące obserwacje:
1) Optymalny stosunek objętościowy n-butanolu do acetonu wy
nosi 1:1.
2) Wzrost od 2 — 50"/» zawartości wody w układzie zwiększa wartość współczynników Rf. Jednak przy zawartości wody powyżej 15*/» otrzymuje się zbyt male różnice w wartościach R, poszczegól
nych stref.
3) Zakwaszenie badanych roztworów acetonowych kwasem sol
nym powoduje wzrost wartości Rt. Ponieważ bezpośredni pomiar bez
względnej wartości stężenia jonów wodorowych w roztworach niewod- nych nie jest możliwy (28), określano to stężenie w jednostkach względnych. Przeprowadzono w tym celu następujące doświadczenia wstępne: Do 75 ml acetonowego roztworu kwasów hymatomelanowych o stężeniu 4 mg/ml dodano 0,6 ml roztworu ln HC1. Tak zakwaszony roztwór miareczkowano przy pomocy 0,2 n NaOH, śledząc zmiany potencjału wobec elektrody szklanej i kalomelowej nasyconej (włączo nej przez klucz agarowy). Na skali pH użytego pehametru lampowego dokonywano odczytu, uważając znalezione wartości za proporcjonalne do stężenia jonów wodorowych (w jednostkach względnych); pomiary są porównywalne tylko pod warunkiem zachowania identycznych pa
rametrów doświadczenia (28). Na rys. 1 podana jest zależność między stężeniem HC1 w roztworze acetonowym kwasów hymatomelanowych a potencjałem mierzonym między elektrodą szklaną a kalomelową.
Wykonano chromatogramy bibułowe odpowiadające poszczegól
nym etapom zakwaszenia roztworu. Znalezione w len sposób opty
malne dla celów chromatograficznych stężenie jonów wodorowych wynosiło 1 (w omówionej skali względnej).
Rozdział chromatograficzny kwasów hymatomelanowych według opisanej metody jest możliwy przy zakwaszeniu roztworu acetono
wego kwasem solnym w zakresie od 0,6 do 2 przyjętych jednostek
względnych. Poniżej wartości 0,6 strefy na chromatogramie grupują się zbyt blisko czoła układu rozpuszczalników. Powyżej wartości 2 — strefy skupiają się w pobliżu linii startowej.
Rys. 1. Zależność potencjału roztworu acetonowego kwasów hymatomela- nowych od zawartości kwasu solnego.
Na osi rzędnych podano odczyt na skali pH pehametru lampowego przy użyciu elektrody szklanej i kalomelowej nasyconej. Wielkość tę uważano za miarę stężenia jonów H* w jednostkach względnych.
Na osi odciętych podane są objętości roztworu NaOH, którym miareczkowano zakwaszony kwasem solnym roztwór.
Określenie kwasowości roztworów acetonowych w jednostkach względnych przy pomocy pehametru przeprowadzono następnie we wszystkich dalszych doświadczeniach, ustalając ją na wartość opty
malną = 1. Dbano o zachowanie jednakowej zawartości wody w ba
danych roztworach (1 ml wody na 100 ml), gdyż konieczne jest za
chowanie jednakowych warunków doświadczenia.
4) Do rozdzielania na bibule nadają się także roztwory acetonowe kwasów hyniatomelanowych pozbawione HC1 przy pomocy kationitu, wyciągi takie chromatografowano na bibule nasyconej zakwaszonym układem rozpuszczalników i rozwijano w układzie z dodatkiem HC1.
Bibułę nasycano techniką wstępującą w zamkniętej kamerze szklanej, przed naniesieniem próbek.
Chromatografia kolumnowa na celulozie
Pomyślne wyniki wstępnych prób chromatografowania roztworu acetonowego kwasów hymatomelanowych na bibule skłoniły autora do wykorzystania tych doświadczeń w technice kolumnowej. Kolumny formowano z celulozy sproszkowanej Whatmana, oznaczonej przez firmę angielską W. i R. Balston jako „Genuine Whatman Cellulose Powder for Chromatography, В-Quality, Chemically Prepared”.
Po próbach wstępnych wypracowano następującą metodykę for
mowania kolumn i rozwijania chromatogramu na celulozie sprosz
kowanej:
a) Formowanie kolumny. 30 g celulozy sproszkowanej, wy
suszonej w 100°, przesianej przez sito o średnicy oczek 0,5 mm, zale
wano mieszaniną 200 ml acetonu + 10 ml wody dest. w zlewce Phi
lipsa pojemności 750 ml. Po starannym rozbeltaniu wlewano zawiesinę cd razu w całości do rury chromatograficznej konwencjonalnego kształtu, zaopatrzonej na dnie w dziurkowany krążek porcelanowy.
Używano rur o wymiarach 3,5 x 40 cm. Po wlaniu zawiesiny pozwalane jej sedymentować dopóki odciekał aceton. Następnie lekko naciskano prętem szklanym na górną powierzchnię uformowanego słupa celulozy, powodując tym wyciśnięcie dalszych ilości acetonu. Naciskanie po
wtarzano wielokrotnie, bardzo równomiernie i lekko. Osiąga się w ten sposób dokładne ułożenie adsorbenta w rurze i jego należytą prze
puszczalność dla cieczy. Odsysanie nadmiaru acetonu pod zmniejszo
nym ciśnieniem nie jest tu odpowiednie, gdyż powoduje z reguły od- stawanie słupa adsorbenta od ścian, co uniemożliwia chromalogra- fowanie.
Na uformowany w ten sposób słup adsorbenta nakładano krążek porcelanowy dziurkowany (od tygla Goocha). Na kolumnę wlewano 8 ml acetonowego roztworu kwasów hymatomelanowych otrzymanego z ziemi kompostowej w sposób poprzednio opisany. Chromatografo- wany roztwór zawierał 6 mg/ml suchej substancji. Pozorna wartość pH (wobec elektrody szklanej i kalomelowej) wynosiła 1 w jednost
kach względnych.
b) Rozwijanie i elucja. W celu rozwinięcia chromatogramu wle
wano na kolumnę 25 ml układu: n-butanol nasycony H2O — aceton (1:1 obj.). Wygląd kolumny w świetle ultrafioletowym po przemyciu powyższym układem przedstawia rysunek 2-a. Dalsze rozwijanie chro-
odeorbank
V
ciemny fiolcf brqzowy cicmno-brqz. brozowo-zółty żoRy
Rys. 2. Kolejne stadia rozwijania i elucji chromatogramu kolumnowego kwasów hymatomelanowych.
Rozdzielano wyciąg acetonowy z ziemi kompostowej cztero-letniej, którego stężenie jonów H‘= 1,1 w jednostkach względnych, przyjętych poprzednio. Barwy podane na rysunku widoczne są pod lampą kwarcową analityczną. Kolejne stadia, a = chromatogram po przemyciu przy pomocy 25 ml układu: n-butanol nasycony
wodą — aceton (1:1 obj.).
b = chromatogram po rozwinięciu powyższym układem i przemyciu acetonem (50 ml), c = chromatogram po elucji acetonem warstw I, II i III, Warstwa IV częściowo
rozmyta.
d •-= chromatogram po elucji warstwy IV przy pomocy układu: aceton — woda (5:1 obj.).
e = końcowa faza elucji warstwy V.
matogramu prowadzono przy pomocy bezwodnego acetonu. Po prze
myciu kolumny przy użyciu 50 ml tego rozpuszczalnika można było odróżnić pod analityczną lampą kwarcową 5 warstw o różnym za
barwieniu, które oznaczono na rys. 2-b cyframi od 1 do V.
Poszczególne warstwy eluowano następnie różnymi rozpuszczal
nikami.
Warstwy I, II, III — eluowano przy pomocy bezwodnego acetonu.
Wyciek zbierano w porcjach objętości 1 ml. Barwa eluatu początkowo żółta, następnie brązowa, w końcu żótto-brązowa.
Przemywano acetonem do chwili, gdy wyciek stal się bezbarwny, wygląd chromatogramu w ultrafiolecie po elucji acetonem przedsta
wia rys. 2-c.
Warstwę IV, która została częściowo rozmyta przy elucji acetonem, eluowano układem aceton — woda (5:1 obj.). Warstwa IV spływa bardzo powoli, zużycie eluentu wynosi około 180 ml.
Elucję warstwy V przeprowadzono przy pomocy wody; końcową fazę wymywania kolumny przedstawia rys. 2-e.
Objętości eluatów z poszczególnych warstw oraz zawarte w nich ilości suchej masy substancji organicznych wynosiły:
I — 5 ml, 15,5 II — 4 „ H,2 III — 10,5 „ 6,3 IV — 178 „ 9,6
V — 12,5 „ 4,0
W eluacie z warstwy V wykryto żelazo po zakwaszeniu stęż, kwa
sem solnym do koncentracji ca 2O®/o HCI.
Zaliczanie poszczególnych porcji (1 ml) wycieku z kolumny do wyżej wymienionych frakcji (I, II, III, IV, V) przeprowadzono na podstawie:
1) obserwacji kolumny podczas wymywania w świetle ultra
fioletowym,
2) kontrolnej rechromatografii próbek wycieku na bibule Wliat- mana Nr 1 (opis zamieszczony poniżej).
Rechroiuatograiia wycieku z kolumny na bibule
Z każdego ml wycieku, odpowiadającego warstwom I, II, III, IV i V na kolumnie, pobierano próbki w celu wykonania rechromato
grafii na arkuszu bibuły Whatmana Nr 1. Roztwory nanoszono mikro
Rys, 3. Chromatogramy bibułowe sporządzone z kolejnych próbek wycieku z kolumny celulozy.
Bibuła Whatmana Nr 1 impregnowana układem butanol — aceton — 0,5 n HC1; chromatogram rozwijany układem n-butanol — aceton — 0,5 n HC1 (12:12:1,5)
Cyfry rzymskie oznaczają kolejne frakcje wymyte z kolumny, oznaczenie tych frakcji podane jest w objaśnieniu do rys. 2. Liczby ułamkowe oznaczają współ
czynniki Rf.
W świetle ultrafioletowym przechodzącym przez bibułę stwierdzono następujące barwy stref:
la — jasno oliwkowa, Ib żółta, Ic — jasno żółta, Ila — oliwkowa, llb — jasno żółta, III brązowo oliwkowa, IV ciemno o'iwkowa, V- fioletowo brunatna.
pipetą o pojemności 0,005 ml, powtarzając nakroplenie (po prze-, schnięciu plamy) dotąd, aż ilość substancji naniesionej na bibułę wy
niosła 20 mikrogramów. Ilość tę obliczano na podstawie znanego stę
żenia i objętości nanoszonego roztworu. Do rozwijania, użyto układu:
n-butanol nasycony wodą — aceton — roztwór wodny 0,5 n HCI w stosunku obj. 12:12:1,5.
Dodatek kwasu solnego do układu zwiększał ruchliwość i ostrość stref na chromatogramie. Korzystny wpływ zakwaszenia układu roz puszczalników na ostrość rozdziału kwasów organicznych na bibule podkreśla Isherwood (19), tłumacząc ten efekt cofnięciem dysocjacji słabego kwasu organicznego przez silny kwas, mineralny. Przed nanie
sieniem próbek bibułę nasycano mieszaniną. 10 ml n-butanolu nasy
conego wodą -I- 10 ml acetonu + 2 ml wodnego roztworu 0,5 n HCI.
Nasycanie bibuły prowadzono techniką wstępującą w zamkniętej ka
merze, po dojściu czoła podsiąkającego układu do brzegu arkusza wyjmowano bibułę z kamery i pozwalano jej przeschnąć w powietrzu
przez 2 godziny w temp. 18°.
Na przygotowanej w ten sposób bibule wykonano cliromatogramy techniką wstępującą z kolejnych frakcji wycieku z kolumny celulozo
wej. Obraz tych chromatogramów w świetle ultrafioletowym oraz war tości Rf podaje rys. 3.
Rechromatografowanie wycieku kolumnowego na bibule zapewnia lepsze zdefiniowanie uzyskanych przy pomocy kolumny frakcji przez:
1) wyznaczenie wartości współczynnika Rf,
2) określenie barw fluorescencyjnych w świetle ultrafioletowym przechodzącym przez bibułę. Zastosowanie światła ultrafio letowego przechodzącego zamiast odbitego pozwala dokładniej ocenić odcień barwy fluorescencji.
Jak widać na rys. 3, frakcje I i II nie wymywały się z kolumny celulozy selektywnie i muszą być celem oddzielenia rechromatografo- wane na bibule. Elucja poszczególnych plam z bibuły jest możliwa przy pomocy wody.
Frakcje III, IV i V przedstawiają się w opisanych warunkach na bibule jako jednorodne.
Porównanie różnych materiałów wyjściowych
Przy użyciu opisanej metody chromatografii kolumnowej rozdzie
lono na celulozie roztwory acetonowa kwasów hymalomelanowych uzyskane z 2 próbek torfu (niskiego i wysokiego) oraz z 3 próbek ziemi
kompostowej (dwu-, cztero- i sześcioletniej). Sposób przygotowania tych roztworów podano poprzednio w ustępie pt. „Ekstrakcja mate
riału”. Odmiennie przygotowano wyciąg etanolowy Nr 4; wydzielono z torfu kwasy huminowe przy pomocy roztworu NaOH metodą Sprin
gera (23), preparat wysuszono pod próżnią w temp. 60" i wyekstra howano etanolem na zimno. Uzyskany w ten sposób wyciąg etanolowy Nr 4 chromatografowano na bibule, obok roztworów przygotowanych własną metodą, w celu porównania obu metod.
Opisane roztwory kwasów hymatomelanowych (pełne) oraz uzy
skane z nich przy pomocy techniki kolumnowej frakcje chromatogra
fowano na bibule Whatmana Nr 1 w układzie n-butanol — aceton — 0,5 n HC1 (12:12:1,5). Szczegóły dotyczące przygotowania bibuły przez nasycenie mieszaniną butanolu, acetonu i kwasu solnego oraz techniki nanoszenia próbek i rozwijania opisano poprzednio w ustępie pt.
„Rechromatografia na bibule wycieku z kolumny”.
Dla zachowania możliwie identycznych warunków doświadczenia wszystkie próbki chromatografowano na tym samym arkuszu bibuły Whatmana Nr 1 o wymiarach 56 x 56 cm. Na rys. 4 przedstawiono część otrzymanego w ten sposób chromatogramu bibułowego z poda
niem współczynników Rf i barw fluorescencyjnych poszczególnych stref, widocznych pod lampą kwarcową analityczną.
Zwraca uwagę zgrupowanie stref w trzech dość wąskich zakre
sach Rf: I — od 0,45 do 0,53, II — od 0,69 do 0,73 i III — od 0,94 do 0,95. Niewielkim różnicom w wartościach Rf towarzyszy podobieństwo barw fluorescencyjnych w obrębie tych zakresów.
Dyskusja
Opisana metoda rozdzielania kwasów hymatomelanowych na ce
lulozie jest wynikiem dalszego ciągu badań nad frakcjonowaniem humusu, zapoczątkowanych przez autora w roku 1952 (26). Poprzednio ogłoszona metoda rozdziału chromatograficznego substancji humuso
wych na tlenku magnezu (26) nastręczała trudności w stadium elucji.
Warstwy chromatogramu należało najpierw wydobyć mechanicznie z kolumny a potem dopiero kolejno eluować.
Obecnie opracowana metoda usuwa te trudności; elucję warstw z celulozy przeprowadza się przez wymywanie kolumny różnymi roz
puszczalnikami.
Zmodyfikowano również, proces zagęszczenia wyciągów alkoholo
wych z materiałów próchnicznych. Zamiast uciążliwego oddestylowy- wania alkoholu pod próżnią z wielu dziesiątków litrów ekstraktu (20 1 z 1 kg materiału) zastosowano wytrącanie kwasów hymato- melanowych z roztworu etanolowego za pomocą octanu wapnia;
wapń usuwano następnie przez wymywanie osadu roztworem kwasu * solnego. Przez wytrącanie kwasów hymatomelanowych z wapniem
osiąga się nadto częściowe usunięcie substancji nieswoistych — towa
rzyszących, niestrącalnych przez Ca. Działanie związkiem wapnia na kwasy hymatomelanowe nie powoduje powstawania artefaktu, gdyż w naturalnych materiałach próchnicznych występują te kwasy często w połączeniach z wapniem.
Pewne ograniczenie w zakresie stosowalności opracowanej me
tody wynika z zastosowania acetonu jako ostatecznego rozpuszczal
nika do chromatografii zamiast etanolu, w którym rozpuszcza się praw
dopodobnie większa ilość składników humusu (16). Wybór acetonu podyktowany byl m. in. koniecznością dostosowania rozpuszczalnika do charakteru sorbenta i warunków rozwijania chromatogramu. Ace
tonu używano tylko jako rozpuszczalnika do chromatografii, natomiast wydzielanie substancji humusowych z materiału odbywało się przez bezpośrednią ekstrakcję etanolem. Uzasadnienie tego sposobu eks
trakcji znajduje się zarówno w poprzedniej pracy autora (26), jak i na rys. 4 w niniejszej publikacji. Z porównania chromatogramów Nr 1 i Nr 4 na rys. 4 wynika, że roztwór kwasów hymatomelanowych uzy
skany przez wyekstrahowanie etanolem preparatu humusowego, przy
gotowanego według Springera (23), różni się swymi składnikami od wyciągów otrzymanych metodą autora. Istotna różnica polega na braku składnika o wartości Rf 0,94—6,95. Pozostałe strefy chromatogramów Nr 1 i Nr 4 wykazują zbliżone wartości Rf.
Wydaje się zatem, że bezpośrednia ekstrakcja materiału etanolem daje pełniejszy skład frakcji „kwasów hymatomelanowych”, niż zwykle stosowane metody pośrednie (5, 11, 12, 14, 15, 16, 29). Na podkreślenie zasługuje występowanie składnika o współczynniku Rf = 0,95 zarówno w wyciągach z torfów, jak i ziemi kompostowej, przygotowanych
według opisanej powyżej metody. ♦
Użycie celulozy jako sorbenta usuwa prawdopodobieństwo prze
biegu reakcji katalitycznych na jego powierzchni, zmniejszając tym samym ryzyko powstawania artefaktu. W tym celu wykluczono rów
nież użycie alkaliów.
Rys. 4. Chromatogramy bibułowe wyciągów kwasu hymatomelanowego, po
chodzących z różnych materiałów wyjściowych oraz niektórych frakcji wydzielonych z tych wyciągów na kolumnie celulozy.
1 = wyciąg acetonowy Nr 1 (z torfu niskiego). Barwy stref: la — ciemno żółta, lb — jasno brązowa, Ic — brązowo żółta.
2 = I frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu Nr 1. Barwa ciemno brązowa 3 — III frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu Nr 1, barwa ciemno żółta.
4 = wyciąg etanolowy z preparatu humusowego, przygotowanego klasyczną me
todą przy użyciu NaOH z torfu niskiego. 4a — barwa żółta, 4b — barwa żółta.
5 = wyciąg acetonowy Nr 5 (z torfu wysokiego). Barwy stref: 5a — oliwkowa, 5b — brązowa, 5c — brązowo oliwkowa.
6 = I frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu Nr 5. Barwa ciemno brązowa.
7 = III frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu Nr 5. Barwa oliwkowa 8 = wyciąg acetonowy Nr 8 z ziemi kompostowej 4-letniej. Barwy stref: 8a — ciemno oliwkowa, 8b brązowo oliwkowa, 8c oliwkowa, 8d jasno żółta,
8e — jasno żółta.
9 = 111 Irakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu Nr 8. Barwa brązowo oliwkowa.
10 = IV frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu Nr 8. Barwa ciemno oliwkowa.
11 = 11 frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu ziemi kompostowej dwuletniej. Barwa oliwkowa.
„ 12 = 111 frakcja wydzielona techniką kolumnową z wyciągu ziemi kompostowej dwuletniej. Barwa oliwkowa.
UWAGA: podane barwy stref widoczne są w świetle ultrafioletowym przechodzącym.
» Liczby ułamkowe na rysunku oznaczają wartości R,. Oznaczenia frakcji kolumno wych zgodnie z rys. 2.
Chemiczne oddziaływanie acetonu na kwasy hymatomelanowe w nim rozpuszczone wydaje się mało prawdopodobnym. Chromato
gramy wykonane przez autora z tego samego roztworu acetonowego tej frakcji humusu przed i po upływie 2 lat nie wykazały żadnych róż nic. Również w piśmiennictwie nie znaleziono żadnych danych o che
micznym oddziaływaniu acetonu na związki próchniczne. Rozpu szczalnik ten był używany wielokrotnie w badaniach chemicznych humusu (6, 16, 25). Również alkohol etylowy często stosowano jako rozpuszczalnik w preparatyce i analizie kwasów hymatomelanowych
(5, 11, 12, 14, 15, 16, 29).
Zasadniczym celem pracy było opracowanie metody chromato
graficznego rozdzielenia kwasów hymatomelanowych na skalę prepa- ratywną. Na jednej kolumnie, zawierającej 30 g celulozy sproszkowa
nej rozdzielano 48 mg substancji, uzyskując dość dobrą wydajność łączną eluatów (46,6 mg). Warstwy 1 i II z wyciągów z ziemi kompo
stowej nie udało się rozdzielić przy pomocy kolumny, lecz rozdział ich jest możliwy na bibule w układzie rozpuszczalników zakwaszonym kwasem solnym. Pozostałe warstwy chromatogramów kolumnowych z wyciągów z ziemi kompostowej wydają się być jednorodne także i na chromatogramie bibułowym w układzie z HC1. Warstwę I na ciiro- matogramach z wyciągu z torfów udało się wymyć z kolumny selek
tywnie, podobnie jak i pozostałe warstwy z tych wyciągów.
Wydaje się, że warstwa V na chromatogramie z wyciągu ziemi kompostowej (rys. 3) jest połączeniem żelazo-organicznym humusu, opisywanym przez Aleksandrową (1).
Niewielkie różnice w wartościach Rf, jakie znaleziono dla stref w zakresie R, od 0,46 do 0,53 zdają się potwierdzać pogląd o możli
wości występowaniu wśród związków humusowych homologicznych szeregów polimerów (18).
Wnioski
1) Zastosowano metodę chromatografii kolumnowej na celulozie sproszkowanej Whatmana do rozdzielenia i wyodrębnienia na skalę preparatywną składników frakcji humusu zwanej kwasem hymato- melanowym, rozpuszczalnych w acetonie.
Do rozwijania chromatogramu kolumnowego użyto układu: n-bu tanol nasycony wodą — aceton (1:1 obj.).
2) Rozdział acetonowego roztworu kwasów liymalomelanowycii uzyskano również metodę chromatografii bibułowej. Do rozwijania chromatogramu bibułowego stosowano układ:
n-butanol — aceton — 0,5n HC1 (12:12:1,5 obj.). W celu indykacji stref używano światła ultrafioletowego, stwierdzając w ten sposób od trzech do pięciu fluoryzujących składników kwasu hymatomelanowego.
Przy pomocy rechromatografowania próbek na bibule kontrolo
wano jednorodność wycieku z kolumny celulozowej.
3) Zmodyfikowano klasyczne metody przygotowywania prepara
tów kwasu hymatomelanowego. Zamiast użycia alkaliów — ekstraho
wano material bezpośrednio etanolem. W celu zagęszczenia uzyska
nych ekstraktów etanolowych wytrącano kwasy hymatomelanowe octa
nem wapnia.
4) Na podstawie zbliżonego rozmieszczenia stref na chromato- gramie (w trzech wąskich zakresach Rf) można sądzić, że budowa chemiczna badanych składników kwasu hymatomelanowego, pocho
dzącego z różnych materiałów wyjściowych, jest zbliżona.
s
»I
e
PIŚMIENNICTWO
1. Aleksandrowa L. N. -- Poczwowiedienije, 1954, 1, 14.
2. Biber W. Л. Doki. Akad. Nauk. SSSR, 1952, 83, 1.
3. В i I) e r W. Л., В o go lubo w N. S. Doki. Akad Nauk. SSSR, 1951,76.
4. Drozdowa T. W. Poczwowiedienije, 1955, 1, 83.
5. Eblandt 11. K- Die natürliche Huminsäuren, Diss. Techn. Hochscb.
Breslau, 1924 (cytowane według W a к s m a n S. A., „Humus”, London, 1936, na str. 53).
6. Forsyth W. G. C. — Biochem. J. 1947, 41, 176.
7. Fuchs W. — )Die Chemie der Kohle. Berlin, 1931.
8. Grosskopf W. Brennstoff — Chemie, 1926, 7, 295.
9. H а у a s h i T s u n e t o m o, Nagai Takeo J. Sei. Soil Manure, Japan, 1955, 25, 285.
10. I she r wood F. — Biochem. J., 1946, 40, 688.
11. Kon d ratiew E. W - 2urn. prikl. chimii, 1940, 12.
12. Kucha ren ко T. A. 2urn. prikl. chimii, 1948, 21.
13. I.aatsch W„ Bauer I., Bi eneck O. - Landw. Forsch. 1950, 2,38.
’4. Oden S. — „Die Huminsäuren“, Dresden u. Leipzig, 1922.
15 S a m e c M„ Pirkmaier B. — Kolloid—Z. 1930, 51, 96.
16. Scheele W. Kolloid Beih. 1937, 46, 368.
17. S c h e e 1 e W., Schul I e W., Spandau H. - Kolloid—Z. 1935, 72, 301, ibidem 1935. 73. 84. ibidem 1936, 75, 73, ibidem 1936, 77, 312.
18. Scheffer F., P 1 o t h o O., W e 1 t e E. — Landw. Forsch. 1950, 1, 86.
19. Scheffer F., Welte E. — Landw. Forsch., 1950, 1, 81.
20. Simon K. — Zeitschr. für Pfl.-ern., Düng. u. Bodenk. 1929, 14, 252.
21. Simon K- — Zeitschr, für Pfl.-ern., Düng. u. Bodenk. 1930, 18, 323.
22. Springer U. — Zeitschr. für Pfl.-rn., Düng., Bodenk., 1931, 22, 135.
23. Springer U. — Bodenk. u. Pfl.-ernähr., 1938, 312.
24. Thiele FL, Kettner H. — Kolloid—Z. 1953, 130 (3), 131.
25. T h i e s s e n G., E n g e I d e r C. - Chem. Zbl. 1931, I, 291.
26. Trojanowski J. Ann. L'niv. M. C. Skłodowska, Sec. C, Pol., Lublin, 1952, 6, 297.
27. W а к s m a n A. — „Humus1', London. 1936.
28. Weissberger A. — „Physical Methods of Organic Chemistry’1, London, 1949, na str. 1751 i nast.
29. W e 11 e E. Zeitschr. für Pfl.-ernähr., Düng., Bodenk., 1952, 56, 109.
РЕЗЮМЕ
1. Доказана возможность применения метода хроматогра
фии на колонке на порошкообразной целлюлозе Уотмана для разделения и выделения для заготовки препаратов составных элементов фракции гумуса называемой „гиматомелановой (уль- мнновой) кислотой’', растворимых в ацетоне. Для проявления автор использовал систему : п — бутанол — ацетон — вода.
2. Применен метод хроматографии на бумаге для анализа ацетонового экстракта гиматомелановых кислот и их фракций.
Для проявляния была употреблена система: п -бутанол-ацетон- 0,5n HCI. Для определения зон был использован ультрафио
летовый свет, при помощи которого обнаружено от 3 до 5 флюозирующих составных элементов.
3. Введены модификации в ходе экстракции исходного ма
териала и в процессе сгущания полученных экстрактов, чтобы получить, по мере возможности, исчерпывающий, но мягко про
текающий ход экстракции.
4. На хроматограммах экстрактов из разных исходных материалов установлено сближенное размещение зон в 3 пре
делах R,.
I)
SUMMARY
A group of hymatomelanic acids (ulmic acids) is the least inves
tigated fraction of humus till now. The separation method of the com pounds of this fraction soluble in acetone by means of chromatography on the cellulose is described.
Hymatomelanic acids were isolated from several samples of com
post plant residues and peats by introducing some modifications in the conventional method of preparation. The raw material was purified of bitumen with a mixture of benzene and ethanol. The calcium and the iron ion were removed from the experimental material by 0,2 n HCI.
The material washed with HCI and H2O was next extracted with ethanol at the room temperature. Thus one obtained 20 1. of solution of hymatomelanic acids in ethanol from 1 kilogram of the material.
The hymatomelanic acid were then precipitated from the solution by calcium acetate at the pH = 6,8. In order to remove calcium the sediment was washed with 0,5 n HCI and H2O by centrifuging. The washed sediment of hymatomelanic acids was dissolved in acetone, the insoluble remainder being removed by centrifuging. The acetone solution of hymatomelanic acids was separated on a column filled with Whatman cellulose powder produced by W. and R. Balton and described as„B-Qua- lity. Chemically prepared”. Tubes of diameter 3,5 cm. were used. The column was filled with 30 g of cellulose in the form of a slurry saturated with 20 vol. of acetone + 1 vol. H2O. 8 ml. acetone solution containing 6 ml. hymatomelanic acid in 1 ml. was poured on the chromatographic column. The solution was acidified with HCI. The acidity of the solution was controlled by thermionic valve pH Meter. The optimum con
centration for columnar chromatography had in the acetone solution the seeming pH value = 1 against the glass electrode and the saturated calomel electrode. This value is only a relative measure of the potential of the non-aqueous solution which may be useful for comparative purposes (28).
The column chromatogram was developed with 25 ml. of the following solvent-mixture: n-butanol saturated with H2O acetone (1:1 v/v) and next washed with acetone. After washing the column with 50 ml. acetone 5 fluorescent bands may be detected under the ultraviolet light. (Fig. 2-h). The bands Nos. I, 11 and III were eluted with acetone, the band No. IV being washed with the mixture of acetone and water (5:1 v/v). The band No. V was eluted with water. The eluates
from the chromatographic column were then rechromatographed on the Whatman paper No. 1 in order to check their homogeneity. The paper chromatogram was developed with the following solvent-mixture:
water-saturated n-butanol — acetone — 0,5 n HCI (12:12:1,5 v/v).
The filter paper was first impregnated with the mixture of 10 ml water-saturated n-butanol -r 10 ml. acetone + 2 ml. 0,5 n HCI and dried at the room-temperature for 2 hours. Spots on the paper chro
matogram were detected when viewed under utraviolet light. The Rf values were then determined (fig. 3). The paper chromatograms of extracts obtained from various humus materials were worked out.
Various methods were employed in preparing these extracts.
Conclusions
1) The method of column chromatography on the powdered What
man cellulose was applied in order to separate and to isolate on a large scale the compounds of the fraction of humus. The compounds of this fraction called hymatomelanic acid are soluble in acetone. The mixture of water-saturated n-butanol — acetone (1:1 v/v) was used for the development of the column chromatogram.
2. The separation of acetone of hymatomelanic acids was also worked out by the method of paper chromatography. The following solvent-mixture was employed to develop the paper chromatogram:
n-butanol — aceton — 0,5 n HCI (12:12:1,5 v/v). The ultraviolet light was used to indicate the spots. 3 to 5 fluorescent compounds of hyma
tomelanic acid were thus delected. The rechromatography of samples on the paper was applied to control the homogeneity of the efflux from the cellulose column.
3. The conventional methods of producing the preparations of the hymatomelanic acid were modified. The material was extracted directly with ethanol instead of with alkalis. Hymatomelanic acids were pre
cipitated with calcium acetate to condense the obtained ethanol extracts.
4. On the basis of the fact that the spots were "located on the chromatogram in a similar way (in 3 narrow Rf values) one may assume that the chemical structure of the investigated compounds of hymatomelanic acid derived from various source materials is similar.
Papier druk. sat. III. kl. 90 g Fabr. papieru Klucze Format 70 x 100. Ark. druku I 1 4 str.
Annales U.M.C.S. Lublin 1956. Lubelska Drukarnia Prasowa, Lublin, Kościuszki 4, Zam. 4028. 2.1.1957 1100 + 75 egz. A-12. Data otrzymania manuskryptu 21.XI.56. Data ukończenia druku 14.111.1957.
UNIVERSI TATIS MARIAE CURIE-SKLODOWSKA LUBLIN — POLONIA
VOL. X. 19. SECTIO C 15.111.1957
Z Zakładu Anatomii Wydziału Biologii 1 Nauk o Ziemi U. M. C. S.
Kierownik: Prof, dr August Dehnel
Iren« DZIERŻYKRAJ-ROGALSKA
Die saisonale Veränderlichkeit der Schilddrüse bei der Wasserspitzmaus (Neomys fodiens Schreb) Sezonowa zmienność tarczycy u Hzęsorka rzeczka
(Neomys fodiens Schreb.)
Сезонная изменчивость щитовидной железы у Neomys fodiens Schreb.
Einleitung...295
Material und Methode...296
Biologie der Wasserspitzmaus...297
Histologische Beschreibung des Materials . 299 Ergebnisse... 306
Schrifttum... 307
Tafelbeschreibung...308
Streszczenie... 309
Рваюме...310
Einleitung
♦ Die vorliegende Arbeit wurde in der Anstalt für Vergleichende Anatomie U.M.C.S. und für LIistologie und Embriologie der Medizi
nischen Akademie in Bialystok ausgeführt.
* Ich fühle mich verpflichtet Herrn Dr. Zdzisław Nowicki; dem damaligen Leiter der Anstalt für Histologie u. Embriologie der Me
dizinischen Akademie in Bialystok, für Hilfe bei der Bearbeitung des Materiale meinen herzlichsten Dank auszusprechen. Ebenfalls danke ich Frau Doc. Dr. Helene Lewińska dem jetztzeitigen Leiter dieser Anstalt für gefällige Durchsicht des Manuscriptes und kritische An-
merkungen. Speziellen Dank pflichte ich Herrn Professor Dr August Dehnel dem Leiter der Untersuchungsanstalt für Säugetiere des Zoologischen Institutes P.A.N. in Białowieża für die Freistellung des Materials, Leitung der Arbeit und Hilfe bei ihrer Durchführung.
Die morphologische Analyse der Veränderlichkeit der Schilddrüse im Zusammenhang mit Veränderungen der physiologischen Zu
stände der untersuchten Tiere oder im Zusammenhang mit Einflüssen der Milieufaktoren ist speziell nichts Neues.
Zahlreiche Autoren (E n g e 1 h o r n, F I o r e n t i n, Głę
bina, Chmielarczyk, Soszka und Love) bewiesen die charakteristische Veränderlichkeit der Schilddrüse, welche mit dem Geschlechtszyklus verbunden ist. Terendelenburg untersuchte die Veränderungen der Schilddrüse, welche unter Einfluss von Hunger stattfinden. L u d f о r d und Cramer erwiesen die von Tempe
raturschwankungen abhängigen tatsächlichen Veränderungen.
Dzierżykraj - Rogalska bewies in ihrer Arbeit über Sorex araneus, das wir deutliche Veränderungen in der Aktivität der Schilddrüse nicht nur im Zusammenhang mit der Geschlechts
reife und den Perioden der Geschlechtsaktivität beobachten, aber auch in der Herbstperiode, also in einer Zeit, wo die Tiere ihr Sommerhaar auf Winterhaar wechseln. Eine Zunahme der Schilddrüsenaktivilät in der Periode des herbstlich-winterlichen Sinkens der Temperatur stellte sie jedoch nicht fest.
Die Wasserspitzmaus, welche das Thema der vorliegenden Arbeit bildet, ist verhältnismässig nahe mit der Spitzmaus verwandt. Ihre Biologie ähnelt unter gewissen Umständen mil derjenigen der Spitz
maus, aber aus andern Gründen unterscheidet sie sich gänzlich von ihr. Aus diesem Grunde halte ich es für zweckmässig', -die saisonale Veränderlichkeit der Schilddrüse bei der Wasserspitzmaus durchzu
analysieren, um sie mit der Veränderlichkeit der Drüse bei den Spitzmaus zu vergleichen.
Material und Methode
Das Material zu der vorliegenden Arbeit wurde im Naturstaats
park in Białowieża gesammelt. Die Fangtechnik wurde in den Arbeiten von Dehnel u. Borowski und Dehnel (1949) genau beschrieben, die Präparierungstechnik der Schilddrüse bei Insedinora in der Arbeit von Dzierżykraj-Rogalska (1952).
Die untersuchten Schilddrüsen wurden meistens in überwiegender Menge im lebenden Zustande dem Laboratorium zugestellt, aber auch im Zustande der Todeserstarrung. Das Material wurde in Flüssigkeiten von Bouin, Orth oder neutralem Formol fixiert. Die Paraffinschnitte färbte man in Hämatoxylin-Eosin und nach Azan. Um retikuläre Fasern nachzuweisen silberte ich sie nach Laguess.
Biologie der Wasserspitzmaus
Die Biologie der Wasserspitzmaus war schon mehrfach in wissenschaftlichen Publikationen besprochen. Es scheint mir dennoch dass sie bisher verhältnismässig wenig genau bekannt ist. Nur neuere Arbeiten berücksichtigend, kann man eine Reihe von Angaben bei Dehnel (1950), Price, Rudd und Bazan (1956) vorfinden. Für meine Untersuchungen ist die Arbeit der Letztgenannten besonders effektiv und zwar nicht nur aus dem Grunde, dass sie viele neue Angaben darbietet, aber vor allem daher, dass das Material aus demselben Gelände stammte und teilweise dieselben Individuen von mir ausgewertet wurden. Da nun meine Arbeit nicht nur für Zoologen aber auch für Histologen bestimmt ist, so erlaube ich es mir, in Kürze gewisse Angaben betreffs der Biologie der Wasserspitzmaus darzustellen und zwar mit Beücksichtigcng dessen was sich mit dem Thema meinet Arbeit verknüpft.
Die Zeugungsperiode der Wasserspitzmaus beginnt im Vorfrühling. Die Ge
schlechtsreife tritt Ende März ein und in der ersten Hälfte des Monates April waren alle eingefangenen Individuen schon geschlechtsaktiv. (Dehnel betitelt solche Individuen als Überwinterlinge). Das sind Tiere, welche im vorhergehenden Kalender jahr geboren wurden. Diese Tiere erleben ähnlich wie wir dieses bei Spitzmäusen beobachten, keinen zweiten Winter und sterben an Altersschwäche im zweiten Ka lenderjahre ihres Lebens. Junge, aus den ersten Frühlingswürfen stammende, W'asserspitzrnäuse werden im Gelände ungefähr ab ersten Juni eingefangen. Wie es die Arbeit von Bazan erwiesen hat, so reifen Individuen aus dem ersten Frühjahrwurf sogleich nach dem Verlassen des Neste an, so dass man schon Ende Juni überall junge schwangere Weibchen antrifft und junge Männchen besitzen voll entwickelte Gonaden. Junge aus dieser Generation verlieren schon im Frühherbst ihre Geschlechtsaktivität und ihre Gonaden unterliegen der Regression. Diejenigen, von ihnen, welche den Winter überleben, werden zum zweiten Mal im frühen Früh
jahr, das ist im zweiten Kalenderjahr ihres Lebens wieder geschlechtsaktiv.
Junge, welche in der ersten Sommerhälfte geboren werden, erleben nur eine kurze Periode der progressiven Entwicklung ihres Geschlechtsapparates, um nach
» dem der Gonadenregression zu unterlingen, ohne vorher die Geschlechtsreife gehabt z.u haben.
Junge aus dem dritten und späteren Würfen, folgedessen Individuen, welche in der zweiten Sommerhälfte oder evtl, im Frühherbst geboren wurden, beginnen überhaupt keine Geschlechtsreifeprocesse und sie reifen erst zum ersten
Alei im Frühjahr als Überwinterlinge an, Überwinterlinge sind den ganzen Sommer lang bis zu ihrem Tode geschlechtsaktiv. Es sei aber vorgemerkt, dass wir bei Individuen welche bis zum Herbst leben einen Rückgang des Geschlechtsapparatcs beobachten können.
Wie es sich aus dem oben Erwähnte ergibt, haben wir im Material ab Vorfrühling bis Juli geschlechtsreife Individuen und zwar Überwinterlinge und Junge aber auch geschlecbtsanreifende Junge oder solche, welche in den anfän
glichen Phasen von progressiven Gonadenveränderungen stehen, aber auch noch Junge vor Anfang von Progressionsveränderungen stehen.
Ab Sommerende bis Herbst einschliesslich haben wir im Material geschlecht- reife Überwinterlinge und Junge aus den Frühlingswürfen, aber auch geschlechts
unreife Junge.
Im Spätherbst u. Winter besitzen wir im Material nur Individuen mit Gonaden vom jugendlichen Typus.
Wasserspitzmäuse haben zweimal einen regulären Haarkleidwechsel. In der frühen Frühlingsperiode beginnt bereits im Monat März das Anwachsen des Sommer-Haares. Im Herbst vollzieht sich bei Jungen der volle Haarkleidwechsel in dem Monaten September u. Oktober (Winterhaar) und im November trift man eingefangene Tiere im vollen Winterpelz an. Überwinterlinge erleben im allgemeinen die Periode des Haarkleidwechsels nicht mehr und bei einigen noch ausnahmweise Überlebenden vollzieht sich diese nur fragmentarisch.
Angaben betreffs der Überwinterung der Wasserspitzmäuse sind recht ka»g.
Man muss annehmen, dass sich diese Tiere in Białowieża an den nichtzugefrorenen Wasserflächen konzentrieren. Alle Versuche diese Tiere im Winter einzufangen gaben jedoch keinen guten Erfolg Meine Beobachtungen betreffs der Veränderlich keit und der Funktion der Schilddrüse in der Periode, wo die Tiere in niedrigen Tem
peratur ihr Dasein fristen, stützen sich auf eine kleine Anzahl des Materials.
Sich auf die Beobachtungen von Dehnel (1950) und Borowski stützend, sollte man annehmen, dass Wasserspitzmäuse in der Winterperiode keiner so tiefen Depression unterliegen, welche sich durch Körpergewichtsabnahme, Ausmassen
reduktion und Schädelabflachung bemerkbar macht, was man bei Spitzmäusen festgestellt hat. Dehnel klärt dieses wie folgt auf: Erstens sind diese Tiere an Wasserbiotopen gebunden, zweitens leben sie in weit mehr ausgegli
chenen Lebensbedingungen besonders aber im Winter, drittens sind sie stärker und darum haben się eine grössere Möglichkeit bei der Futtererbeutung.
ln meiner Arbeit aus dem Jahre 1952 teilte ich die untersuchten Spitzmäuse in zwei Klassen und zwar auf geschlechtsunreife Junge im ersten Kalenderjahre ihres Lebens und auf geschlechtsreife Überwinterlinge im zweiten Kalenderjahre ihres Lebens. -'Diese Einleitung auf zwei Altersgruppen, welche bei Spitzmäuse ebenen Lebensbedingungen besonders aber im Winter, drittens sind sie stärker nicht angwandt werden. Dehnel teilte sein. Material in drei Klassen:
1) Junge geschlechtsunreife Individuen (M) ungeachtet des Geburtsmonates.
2) Junge Individuen (D), welche die Geschlechtsreife im ersten Kalender jahre ihres Lebens erreicht hatten, ganz gleichgültig in welchem Monate sie eingefan
gen wurden.
3) Geschlechtsreife Individuen (P), im zweiten Kalenderjahre ihres Lebens, anders gesagt Überwinterlinge.
Diese Einteilung erwies sich während meiner Arbeit als zu sehr statisch und sie deckle sich nicht mit den natürlichen physiologischen Gruppierungen der Tiere.
Aus diesem Grunde ordnete ich das untersuchte, histologische Material etwas anders an, als es Dehnel getan hatte und zwar:
I. Junge (M).
II, Geschlechtsreife Junge (D) und Überwinterlinge (P).
III. Individuen, welche im Herbst und Winter und zwar in dem Monaten von Oktober bis Februar eingefangen wurden und welche Gonaden vom jugendlichen Typus aufwiesen (ganz gleich ob mit primären oder re
gressiven Gonaden). Diese Individuen bezeichnete ich mit Symbol — „R“
Ich muss zugeben, dass ich vor allem die Schilddrüsen von Männchen untersucht hatte und zwar aus diesem Grunde, dass ich bei ihnen ver
hältnismässig leicht den jeweiligen Zustand der Gonaden feststellen konnte.
Histologische Beschreibung des Materials I. Gruppe „M” — geschlechtsunreif.
Tiere aus dieser Gruppe haben, ganz gleichgültig in welchem Monat sie eingefangen wurden, Drüsen von folgendem charakteri
stischem Bilde. Die Schilddrüse dieser Tiere besteht aus feinen ziemlich regulär angeordneten Follikeln, welche einen kleinen Tropfen Kolloid enthalten. Im Epithelium, welches die Follikeln bekleidet, be
finden sich die Hauptzellen in Überzahl, ab und zu aber kann man Kolloidalzellen (von Langendorff) feststellen, deren zahlen
mässiges Verhältnis in den verschiedenen Bläschen veränderlich ist.
Die Hauptzellen mit heller und feinkörnigem Cytoplasma haben un
sichtbare Grenzen. Diese Zellen sind würfelförmig und machen den Eindruck, als wenn sie aufgeschwollen wären. Ihre Kerne sind bläschen
förmig und so gross, dass sie fast die ganze Breite und Höhe des Epitheliums einnehmen. Zwischen den Follikeln liegen zahlreiche pa
rafollikuläre Zellengruppen, welche aus 8 bis 12 Zellen bestehen. Sie weisen eine grosse Ähnlichkeit mit den Hauptzellen aus dem Folii kelepithel auf, aber sie kennzeichnen sich jedoch durch eine bedeutend grössere Verwandtschaft mit den basischen Farbstoffen. Die Zellen dieser Inselchen sind vieleckig mit deutlichen Zellengrenzen.
Ihr Cytoplasma ist dickflüssig, aber der Kern ist regulär mit sich stark färbender und kompakter Chromatinstroma.
Das Bindegewebe zwischen den Follikeln ist unauffällig. Es treten jedoch deutliche Uberblutungen auf. Alan kann hier eine grosse Anzahl von erweiterten Kapillaren ersehen, welche die Bläschen umschliessen, aber auch Gefässe von verschiedenem Kaliber, welche mit Blutkörper chen ausgefüllt sind.
Dieses oben beschriebene Schilddrüsenbild junger, geschlechts
unreifer Tiere, welches bei allen Individuen dieser Gruppe auftritt, weist auf den Stand der vollen Aktivität der Schilddrüse hin, was wohl höchstwahrscheinlich mit Entwicklungsprozessen dieser Indivi duen im Zusammenhang steht.
II. Gruppe — geschlechtsreife Junge und Überwinterlinge.
a) Uberwinterlinge, welche in den Monaten von März bis Juni ge
fangen wurden.
Wie ich es erwahrt habe, tritt im Vorfrühling bei Wasser Spitzmäusen das Geschlechtsreifen ein. Die Frühjahrsbrunst verläuft bei diesen Tieren ähnlich wie bei anderen Soricidae.
Die Schilddrüsen der Wasserspitzmäuse aus dieses Periode enthalten kleine Follikeln, welche mit zylindrischen oder etwas niedrigerem Epithelium ausgekleidet sind. Diese Epithelium- zellen besitzen runde oder bläschenartige Kerne mit deutlicher Chro
matinstroma. Die Epitheliumzellen sind als wie geschwollen, regulär angeordnet und weisen deutliche Grenzen auf. (Phot. 1). Das Cyto
plasma dieser Zellen ist feinkörnig. Neben kleinen Bläschen liegen zahlreiche Gruppen von parafollikulären Zellen, in welche man zahl
reiche Teilungen erblicken kann. (Phot. 2). Das am meisten charakte
ristische Merkmal für diese Frühjahrsperiode ist die immer grösser werdende Vascularisation dieser Drüse. Fast bei jedem Bläschen sieht man ein Netzchen von Kapillargefässen. Zwischen den kleinen, s'ch erst bildenden Follikeln beobachtet man eine enorme Anzahl von Ar- teriolen und Kapillaren, welche mit Blut überfüllt sind. Hier und da kann man Endothelium der Kapillaren beobachten (Phot. 3).
Das oben beschriebene charakteristische Bild der Schilddrüsen von Uberwinterlingen, welche im Frühjahr eingefangen wurden, zeugt von einer angeregten intensiven Tätigkeit der Schilddrüse.
Die Schilddrüsen von frühzeitig, frühjahrlichen Tieren kennzeich
nen sich durch eine als ob noch mehr intensive Drüsenaktivität im Verhältnis zu Tieren, welche später eingefangen wurden. Ich möchte
wohl diese Erscheinung mit dem in dieser Periode verlaufenden Früh
jahrshaarkleidwechsel in Einklang bringen, aber es fällt mir schwer hei dieser Äusserung zu verharren, denn das Material von Überwin
terlingen aus dem Vorfrühjahr war sehr klein.
b) Überwinterlinge und geschlechtsreife Junge, von Juni bis October.
Die Tiere weisen in dieser Periode den mikroskopischen Bau der Schilddrüse von demselben Typus auf.
Es ist schwer die Schilddrüse der genannten Tiere als ein „funk
tionales Ganzes” zu erörtern. Sehr oft liegen neben den Bläschen, deren Kolloid sich sehr intensiv färbt, andere kleine Follikeln mit hellem und vakuolisiertem also viel flüssigerem Kolloid. Dieses zeugt von einer gewissen Autonomie der einzelnen Bläschen. In der Regel jedoch besteht die Peripheriepartie der Drüse in dieser Periode aus grossen Bläschen, welche mit dickflüssigem Kolloid ausgefüllt sind.
In ihnen vollziehen sich auch die Ausscheidungs u. Resorptionsprozesse sehr langsam, wobei sie sich am spätesten erblicken lassen. Seltener sieht man wässeriges Kolloid, was sich beim Färben mit Azan sehr gut erblicken lässt.
Die Peripherie der Drüse besteht aus grossen Randfollikeln, welche mit unvakuolisiertem dickflüssigem und chlorophilen Kolloid ausge
füllt sind. Mit Azan färbt es sich auf rot. Hier und da ist jedoch die Peripheriepartie des Kolloides mehr wässerig und dann nimmt sie eine blaue Farbe an (Phot. 4).
Das Epithelium, welches die Bläschen bekleidet, kann versch’e- den aussehen. Es besteht aus würfelförmigen, gut abgegrentzten Zellen mit runden Kernen. Das Cytoplasma dieser Zellen ist hell und vakuoli- siert. Am häufigsten treffen wir jedoch ein ganz niedriges Epithelium an, welche, dunkle, abgeflachte und fast einheitlich ausgefärbte Kerne aufweist. In vereinzelten Drüsen der beschriebenen Periode tritt sehr oft die Abblätterung der Zellen zum (gegen das) Licht der Bläschen auf. Die abgeblätterten Zellen sind zweierlei Art nämlich: Die Einen besitzen sehr grosse Kerne mit gut erhaltener Chromatinstroma und körnigem Cytoplasma (Phot. 5), die Anderen sind kleine Zelle mit piknotischen Kernen, welche sich intensiv ausfärben.
Die Zeńlralpartie der Driise kennzeichnet in dieser Periode das Erscheinen einer grossen Menge von ausserfollikulärem Kolloid. In den Drüsen in welchen der Ausflussprozess des Kolloides ausserhalb der Bläschen nur einen Teil der Drüse miteinbegriffen hat, erhalten sich noch in der Zentralpartie grosse Bläschen, welche mit stark va- kuolisiertem, flüssigem Kolloid ausgefüllt sind. Ihr Epithelium besteht aus Hauptzellen und Kolloidzellen (Zellen von Bangendorff). Die Hauptzellen des Epitheliums sind sehr vergrössert und besitzen ein sich blass ausfärbendes, gewöhnlich stark vakuolisiertes Cytoplasma.
Die Haupt—wie auch die Koiloidzellen besitzen auf ihren Gipfelpunkten zahlreiche Ausbeutungen von verschiedener Gestalt und Ausmassen.
Die Gipfelpartien dieser Zellen werden entweder durch stark ge
wässerte und vakuolisierte Cytoplasma gebildet, oder sie stellen sich als kleine Gebilde dar, welche sich so wie Kolloid färben (Phot. 6).
Manchmal ist die ganze Gipfelpartie aufgedunsen und nimmt das Aus
sehen einer einzigen grossen Blase an.
Im mehr avancierten Stadium dieses Prozesses beobachten wir eine immer kleinere Anzahl von regulär gebauten Bläschen und eine immer grösser werdende Fläche der Drüse, welche durch das sich ausgeschie
dene Kolloid eingenommen wird. In vereinzelten Follikeln, welche noch Kolloid enthalten, verbleiben nur noch etliche Zellen von der Epithel- Bekleidung (Phot. 7), der Rest aber drang in das Licht des Blä
schens und erlag dort der Auflösung. Durch eine Lücke, welche in der Follikelwand entstand, bildet sich der Weg für das, sich ausserhalb der Bläschen, ausgiessende Kolloid. Gleichzeitig sieht man in der stark vakuolisierten Zellenmasse, welche ab und zu feinkörnig ist, schwim
mende Epithelschnüre (Phot. 8), welche von ehemaligen Blä
schen stammen und welche aus Zellen bestehen, deren Kerne sich einheitlich und intensiv ausfärben (Phot. 8). In manchen Drüsen ver
bleiben grosse regulär geformte Bläschen nur noch auf der Peripherie'.
Die Zentralpartie der Drüse weist keinen follikelförmigen Bau auf und sie ist mit Kolloid übergrossen.
Die mikroskopischen Schilddrüsenbilder der Tiere aus der be
schriebenen Gruppe (Juni—Oktober) weisen ganz gewiss auf eine volle ja sogar verstärkte Aktivität der Drüse hin.
Man kann zwar hier und dort regressive Erscheinungen beobach ten, welche auf der Verkleinerung und Abflachung der Drüsenzellen aber auch auf der Kernpyknose beruhen, aber diese treten jedoch, wenn
man das ganze Driisenbild in Anspruch nimmt auf den weiteren Plan.
Die Bläschen können in dieser Periode zusammenschrumpfen und ihre Wände können sich biegen und platzen. Auf solche Weise entstehen Epitheliumschniire und sich dunkel färbende Kerngruppen, welche, direkt in dem überall ausgegossenen ausserbläslichen Kolloid „schwim- , men”. Dank den im Follikelepithelium entstandenen Spalten durch
trieft das Kolloid durch das schwache Bindegewebe, welches ein System von Lücken und Spalten hat, in die Gefässe und es gleicht höchstwahrscheinlich auf diese Weise den grösseren Bedarf an Hor
monen im Organismus aus. Während der Zeit der erhöhten Tätigkeit beobachtet man nicht eine gleichzeitige Vermehrung der Blutgefässe.
Die peripherisch liegenden Bläschen sind zwar mit einem deutlichen Kapillarennetzchen umgeben, aber in Tier Medialpartie der Drüse, welche nur von der Kolloidmasse eingenommen ist, sieht man keine Gefässe.
III. Gruppe mit regressivem Geschlechtsapparat, welche von Okto
ber bis Februar eingefangen wurden.
Alle Individuen aus dieser Gruppe befinden sich in der Vorberei
tungsphase zum Winter. Wie ich es schon erwähnt habe, so rechne ich.
zu dieser Gruppe junge Tiere, welche im ersten Kalenderjahre ihres Lebens noch nicht geschlechtsreif waren wie auch diejenigen Jungen, welche geschlechtlich reiften und sogar geschlechtsaktiv waren und welche im Spätherbst regressive Gonaden aufwiesen. Nebenbei sei be
merkt, dass der Geschlechtsapparal im Winter einer so starken Re gression unterliegt, dass er sogar kleinere Ausmassen hat, als wir dieses bei jungen geschlechtsunreifen Individuen im Sommer beo bachten (Bazan 1955).
Die Schilddrüse der Tiere aus dem Monat Oktober kennzeichnet sich in ihrem ganzen Durchschnitt durch einen einheitlichen Bau. Es hebt sich hier die Grenze zwischen der Drüsenperipherie und ihrer Medialpartie nicht so deutlich ab. Ihre Struktur ist im allgemeinen den bekannten Buchbeschreibungen der Schilddrüse angenähert (Phot. 9).
Fast alle Bläschen sind mit hypostatischem, dickflüssigem Kolloid ausgefüllt, welches sich mit Azan dunkelrot ausfärbt. Ее weist keine Vakualisation auf, aber es ist dagegen stark aufgesprungen. Das Blä- schenepithelium ist vielmehr niedrig und besteht aus Wenig differen
zierten Zellen mit fast durchsichtigem Protoplasma.
Ans der oben erwähnten Beschreibung könnte man die Folgerung ziehen, dass in dieser Periode sich ein allmählicher Schwund der Drü
senfunktion vollzieht. In den Monaten November und Dezember treffen wir eine immer stärker werdende Regression der Schilddrüse an. Die Schilddrüse aus dem Winter kennzeichnet sich durch ein dickflüssiges, sich stark ausfärbendes Kolloid. Gleichzeitig beobachten wir eine Ver
minderung der Vakularisation und einen Anwuchs der Bindegewe
bebasis.
Wir treffen hier auf eine Invasion von fremden Zellenelementen mit länglichen Kernen von mezenchymatischer Abstammung, welche durch ihr Anwachsen gewisse Partien der Drüse einnehmen.
Bei einem im Januar eingefangenen Individuum (es muss unter
strichen werden, dass im Jahre 1955 im Januar in Białowieża fast Frühlingswetter herrschte) hat das Drüsenbild ein schon etwas anderes Aussehen. Auf der Peripherie treffen wir wiederum grössere Folli
kel in deren Licht sich die Zellen des Epitheliums abbläl tern. Das Epithelium dieser Zellen ist noch flach. Sie bestehen aus homogenen Zellen mit dunklen verlängerten Kernen, welche parallel zur Längsachse der Zelle liegen. In den Zentralpartien (Medialpartien) der Drüsen beginnen parafollikuläre Gruppen zu erscheinen.
Aus diesem Bau folgernd, könnte man in diesem Falle behaupten, dass wir hier mit irgendwelchen einleitenden Vorbereitungen für die zukünftige intensive Drüsenfunktion zu tun haben. Es fällt aber schwer irgendwelche Behauptungen auf Grund nur eines Falles und während eines so untypischen Winters, wie im Jahre 1955, aufzustellen.
Wie es aus der Beschreibung des histologischen Materials, was schliesslich vorauszusehen war, hervorgeht, besteht ein enger Zusam
menhang zwischen dem Geschlechtszyklus der Tiere (Männchen) und der morphologischen Veränderlichkeit der Schilddrüse. Diese Er
scheinung ist ganz unabhängig vom Alter des Tieres (Dieselben Bil der bei Exemplaren ,,D” u. bei „P”. Folgendes ist aber interessant, dass bei frühjahrlichen Überwinterlingen in der Zeitspanne ihrer ersten Brunst und Geschlechtsreifung die Aktivität der Schilddrüse viel stärker ist als in der Sommer u. Herbstperiode, wo wir gleichfalls Individuen in der Brunstperiode (P) oder Geschlechtsanreifungs u. Brunstperibde (D) antreffen. Diese Erscheinung könnte man auf verschiedene Weise auslegen. Es kann sein, dass sie nur mit dem Ge-
