lub ze słabymi objawami grypopodobny- mi. Mogą rozwinąć się natomiast groźne powikłania u osób z osłabionym układem odpornościowym. Istotnym problemem jest zarażenie kobiet w ciąży, u których może dojść do poronień lub uszkodzeń mózgu, oczu i innych narządów płodów.
U zwierząt objawy mogą dotyczyć najczę- ściej owiec i kóz (ronienia).
Raport EFSA za 2007 r. nie obejmu- je danych związanych z występowaniem toksoplazmozy u ludzi i zwierząt. Ostat- nie informacje pochodzą z 2004 r., w któ- rym zanotowano 1736 przypadków cho- roby (tab. 1).
Włośnica. Choroba ta u ludzi jest wy- woływana przez włośnie z rodzaju Trichi- nella, należące najczęściej do gatunków T. spiralis, T. nativa, T. britovi, w mniej- szym stopniu przez T. pseudospiralis, T.
nelsoni, T. papuae, T. zimbabwiensis, T.
murelli, T. T6, T. T8 i T. T9. Do zarażenia dochodzi przez spożycie niedogotowane- go lub surowego mięsa zwierząt zarażo- nych włośniami, najczęściej wieprzowi- ny i mięsa dzików. Notowano też chorobę po konsumpcji mięsa końskiego. U ludzi choroba początkowo objawia się nudno- ściami, biegunką, wymiotami, gorączką (faza obecności pasożyta w jelitach), a na- stępnie, po dostaniu się włośni do krwio- biegu i mięśni – pojawiają się bóle głowy,
dreszcze, kaszel, bóle mięśniowe i biegun- ka. W ciężkich stanach obserwuje się za- burzenia ruchu, oddychania, mogące pro- wadzić do zejść śmiertelnych.
Jak wynika z raportu, w 2007 r., dane na temat włośnicy ludzi dostarczyły 24 kraje UE (z wyjątkiem Danii, Luksemburga i Sło- wenii) oraz Norwegia. Odnotowano ogółem 867 przypadków włośnicy u ludzi, w tym 779 potwierdzonych laboratoryjnie. Współ- czynnik zachorowań wynosił 0,2/100 000.
Większość z potwierdzonych zachorowań pochodziła z dwóch krajów – Rumunii (432 osoby) oraz Polski (217 zachorowań).
W porównaniu z 2006 r. liczba przypadków włośnicy utrzymywała się na zbliżonym po- ziomie, ale stwierdzono wzrost liczby przy- padków w Polsce (tab. 1). Spośród innych krajów UE (ogółem 130 przypadków) naj- więcej zachorowań zanotowano w Bułga- rii (62), Hiszpanii (29) i Niemczech (10).
Przypadki włośnicy u ludzi wystąpiły też w Belgii (3), Francji (1), Irlandii (2), na Li- twie (8), Łotwie (4), Słowacji (8) i Szwecji (1) oraz na Węgrzech (2).
Badania zwierząt w kierunku włośni (dane z 25 krajów UE, z wyjątkiem Cypru i Litwy oraz dodatkowo z Norwegii i Szwaj- carii) objęły w 2007 r. łącznie 224 569 190 świń (<0,01% wyników dodatnich), 6615 dzików hodowlanych (0,36% dodatnich) i 443 890 dzików wolno żyjących (0,1%
dodatnich), 6680 lisów (2,56% dodatnich), 224 rysi (19,64% dodatnich), 403 niedźwie- dzi (4,47% dodatnich), 222 szopów (19,37%
dodatnich), 55 wilków (21,82% dodatnich) oraz 96 076 innych zwierząt wolno żyją- cych (0% dodatnich).
Piśmiennictwo
1. http://www.efsa.europa.eu
2. Osek J.: Występowanie chorób odzwierzęcych i ich czyn- ników etiologicznych w 2006 r. w świetle raportu Euro- pejskiego Urzędu do spraw Bezpieczeństwa Żywności.
Życie Wet. 83, 192-201.
3. Dyrektywa 2003/99/EC Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 17 listopada 2003 r. w sprawie monitorowania cho- rób odzwierzęcych i odzwierzęcych czynników chorobo- twórczych, zmieniająca decyzję Rady 90/424/EWG i uchy- lająca dyrektywę Rady 92/117/EWG. Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 2003, L 325, 31-40.
4. Decyzja Parlamentu i Rady Europejskiej 2119/98/EC z dnia 24 września 1998 r. ustanawiająca sieć nadzoru epidemio- logicznego i zwalczania chorób zakaźnych we Wspólno- cie. Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 1998, L 268/1, 62-67.
5. Osek J.: Zoonozy i ich czynniki etiologiczne w świetle ra- portu EFSA za 2005 r. Życie Wet. 2007, 82, 294-301.
6. Osek J.: Europejski raport na temat zoonoz i czynników zoonotycznych w 2002 r. Życie Wet. 2005, 80, 400-403.
7. Osek J.: Zoonozy i ich czynniki etiologiczne w krajach Unii Europejskiej oraz w Norwegii w 2004 r. Życie Wet.
2006, 81, 180-187.
Prof. dr hab. Jacek Osek, Zakład Higieny Żywności Po- chodzenia Zwierzęcego, Państwowy Instytut Wetery- naryjny, al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy, e-mail:
josek@piwet.pulawy.pl
P
arwowiroza psów jest ostrą, zaraźliwą chorobą wirusową przebiegającą z za- paleniem jelit, objawiającą się wymiotami, biegunką, podwyższoną temperaturą ciała, nierzadko prowadzącą do śmierci zwierzę- cia. Zakażeniu ulegają psy w każdym wieku, niezależnie od rasy i płci (1). Na zakażenie najbardziej są wrażliwe szczenięta między szóstym tygodniem a szóstym miesiącem życia zwłaszcza, takich ras, jak: rottweiler, doberman, labrador, owczarek niemiecki oraz american staff ordshire (2). Parwowi- roza jest uznawana za najczęściej występu- jącą chorobę zakaźną psów na całym świe- cie i główną przyczynę padnięć szczeniąt przed szóstym miesiącem życia (1).Kliniczna diagnoza parwowirozy psów jest trudna. Główne objawy choroby (wy- mioty i biegunka) stwierdza się w przebie- gu wielu innych chorób zarówno o podłoży zakaźnym, jak niezakaźnym (3, 4, 5). Ide- ałem byłoby gdyby podejrzenie parwowi- rozy było zawsze potwierdzone testami la- boratoryjnymi (3).
Parwowirus psów – CPV-2 (canine par- vovirus type 2) został po raz pierwszy zi- dentyfi kowany w 1978 r. Od tego czasu, do bezpośredniego wykrywania wirusa bądź jego białek czy kwasu nukleinowego (5) w kale zwierząt chorych lub w tkankach zwierząt padłych, albo wykazywania swo- istych dla niego przeciwciał w surowicy
Techniki molekularne w rozpoznawaniu parwowirozy psów
Łukasz Adaszek, Dagmara Twaróg, Stanisław Winiarczyk
z Katedry Epizootiologii i Kliniki Chorób Zakaźnych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Lublinie
Molecular techniques — diagnostic tools for canine parvoviral infections
Adaszek Ł., Twaróg D., Winiarczyk S., Department of Epizootiology and Clinic of Infectious Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Life Sciences in Lublin
Canine parvovirus type 2 (CPV2), is an etiologi- cal agent of severe enteritis in dogs, particular- ly puppies. Clinical signs include vomiting and di- arrhea, often with blood, high fever, dehydration and leukopenia. Mortality rate is high in young puppies, but vaccines are available to prevent par- vovirosis. The disease is usually diagnosed basing on the clinical signs. The aim of this article was to present molecular biology methods useful in lab- oratory diagnostics of parvovirosis. Real-time PCR, PCR and sequencing are very specifi c and they ena- ble to follow changes in fi eld strains of canine par- vovirus type 2 that may help to improve the effi - cacy of vaccines.
Keywords: canine parvovirosis, real time PCR, PCR, sequencing.
Prace poglądowe
385
Życie Weterynaryjne • 2009 • 84(5)
używano wielu testów laboratoryjnych.
Wśród nich wyróżnić należy takie tech- niki, jak mikroskopia elektronowa (EM), izolacja wirusa (VI), aglutynacja lateksowa (LA), hemaglutynacja (HA) czy test ELI- SA (3, 4, 5, 6).
Mikroskopia elektronowa oraz izolacja wirusa są metodami czasochłonnymi i zbyt drogimi w rutynowym użyciu w warunkach klinicznych (4). Mikroskopia elektronowa wymaga długiego okresu inkubacji (5–10 dni) oraz dodatkowego potwierdzenia te- stami immunofl uorescencji lub hemaglu- tynacji. Z kolei metoda izolacji CPV-2 jest mało czuła, a dodatkowo do jej przepro- wadzenia wymagany jest wykwalifi kowa- ny personel oraz posiadanie odpowiednich hodowli komórkowych, z których wirus po namnożeniu jest izolowany (3). Z kolei aglu- tynacja lateksowa jest badaniem szybkim, lecz mniej swoistym. Hemaglutynacja nato- miast traci na wiarygodności bez potwier- dzającego testu inhibicyjnego (4) oraz wy- maga nieprzerwanego dostarczania świe- żych erytrocytów do badanego układu (5).
Do najczęściej stosowanych metod szybkiej diagnozy CPV- 2 w próbkach kału należy test ELISA (4), jednak czułość tej techniki może być niższa w porównaniu do mikro- skopii elektronowej (5).
Mizak i Borowski (7), porównywali ta- kie metody wykrywania CPV-2, jak ocena efektu cytopatycznego (CPE) w hodow- lach komórkowych oraz test PLA, polega- jący na wiązaniu się swoistych przeciwciał z antygenami wirusa. Wyniki ich obser- wacji wskazują, iż test PLA ma 4–5-krot- nie wyższą czułość niż odczyt CPE, przy którym interpretacja wyników jest bardzo subiektywna. Ponadto PLA, dzięki znacz- nej powtarzalności uzyskiwanych wyni- ków i możliwości skrócenia czasu bada- nia, znajduje zastosowanie w badaniach diagnostycznych zakażeń parwowiruso- wych psów.
Ostatnio w diagnostyce laboratoryjnej coraz częściej stosuje się reakcję PCR (po- lymerase chain reaction – łańcuchowa re- akcja polimerazy; 5, 6). Technika ta pole- ga na wykorzystaniu starterów (krótkich odcinków oligonukleotydów) oraz spe- cjalnych enzymów do powielania poszu- kiwanego fragmentu kwasu nukleinowe- go. Startery przyłączają się komplementar- nych sekwencji jednoniciowych odcinków DNA (poddanych wcześniej rozpleceniu) i tworzą „ramy”, w obrębie, których termo- stabilny enzym (polimeraza DNA) dobu- dowuje komplementarną do wyjściowej matrycy nić – jest to jeden cykl reakcji.
Powtarzające się cykle łańcuchowej reak- cji polimerazy (na ogół około 30) prowa- dzą do ekspotencjalnego wzrostu ilości produktu PCR (8).
W przebiegu PCR można wyróżnić kil- ka etapów. W fazie wstępnej amplifi kacji
powielanie produktu jest powolne. Wynika to z długiego czasu potrzebnego starterom na odszukanie komplementarnych sekwen- cji w obrębie matrycy (9). W kolejno na- stępującej fazie logarytmicznej (log-linear phase) w warunkach idealnych dochodzi do podwojenia liczby kopii DNA w cza- sie każdego cyklu reakcji. Kiedy niedobór polimerazy, starterów oraz nagromadzo- ne produkty wpływają na coraz mniejszą efektywność amplifi kacji, reakcja wchodzi w fazę przejściową (transition phase), a na- stępnie osiąga fazę plateau (plateau pha- se), gdzie obserwuje się dalsze spowolnie- nie jej tempa aż do całkowitego zahamo- wania powielania DNA.
Badania Mochizuki (6) dowodzą, iż PCR jest metodą czulszą niż izolacja CPV-2 oraz hemaglutynacja i może być stosowana w celu wykazania obecności wirusa w próbkach kału. Ponadto jest to technika szybka, swoista i może być sto- sowana nawet w przypadku próbek za- wierających zinaktywowany wirus. Jed- nak PCR ma też swoje wady, gdyż może dawać fałszywie negatywne wyniki spo- wodowane obecnością w próbkach inhi- bitorów polimerazy.
Według Ho-Seong Cho i wsp. (5) PCR jest czułą, szybką i swoistą metodą badaw- czą, która wymaga jednak specjalistyczne- go sprzętu, rzadko występującego w klini- kach weterynaryjnych. Jako alternatywę dla tej techniki autorzy proponują metodę LAMP, która jest wysoce selektywna, czu- ła, krótsza czasowo niż PCR (trwa około godziny), a jej produkty widoczne są „go- łym okiem”. Ponadto nie wymaga ona po- siadania termocyklera, dlatego wydaje się bardziej użyteczna dla klinik weterynaryj- nych niż PCR.
Z doniesień Senda (10) wynika, iż PCR może być wykorzystane również do bada- nia zanieczyszczenia szczepionek dzikimi szczepami CPV-2 (10).
W przypadku wirusów metoda PCR nie dostarcza jednak informacji o ich zakaź- ności. W dodatku wynik niedostatecznie zoptymalizowanego PCR może być obar- czony dużym błędem, który wynika z po- wielenia nieswoistego fragmentu DNA o wielkości identycznej lub zbliżonej do produktu swoistego (11).
Konwencjonalne PCR jest metodą ja- kościową. Analiza potencjalnych produk- tów reakcji ma miejsce po jej zakończeniu, a zatem w fazie plateau. Natomiast efek- tywna amplifi kacja DNA następuje tylko do momentu uzyskania określonej ilości amplikonów w fazie logarytmicznej. Dla- tego też w fazie plateau nie jest zachowa- na proporcjonalna zależność między po- czątkową zawartością matrycowego DNA a ilością uzyskanego produktu. W wyni- ku powielenia matryc zawierających różne początkowe stężenia sekwencji docelowej
otrzymujemy zbliżoną ilość amplikonów.
Z informacji tych jasno wynika, iż nie jest możliwe przeprowadzenie wiarygodnych obliczeń dotyczących początkowych ilo- ści DNA matrycowego poprzez ocenę ilościową produktów na tym etapie re- akcji (12).
Kolejną niedogodnością PCR jest wła- śnie potrzeba oddzielnej analizy uzyska- nych amplikonów po zakończeniu reakcji, w celu potwierdzenia oczekiwanych wyni- ków (13). Detekcja potencjalnie zamplifi - kowanego DNA może być przeprowadzo- na dzięki rozdziałowi elektroforetyczne- mu na żelu agarozowym, wybarwieniu, np.
bromkiem etydyny, i wizualizacji promie- niami UV. Oprócz żeli agarozowych sto- sowane być mogą żele poliakrylamidowe.
Żele agarozowe zapewniają szybszą ana- lizę, jednak ocena wielkości produktu jest mniej dokładna. Żele poliakrylamidowe z kolei wymagają więcej czasu na ich przy- gotowanie i analizę, lecz są tańsze i cechu- ją się wyższą rozdzielczością (14).
Możliwa jest też analiza densytome- tryczna lub badanie amplikonów za pomo- cą metody Southern blot, która jest jednak czasochłonna i składa się z kilku etapów, podczas których może dojść do zanieczysz- czenia laboratorium produktami reakcji.
Innym rozwiązaniem jest zastosowanie me- tody PCR-ELISA z wykorzystaniem znako- wanych biotyną lub digoksygeniną starte- rów, sond lub bezpośrednią inkorporacją digoksygeniny do powstających ampliko- nów (15). Dwie ostatnie metody mogą jed- nocześnie stanowić element weryfi kujący swoistość produktu PCR (11).
Kluczową rolę w PCR odgrywają en- zymy syntetyzujące DNA. Najczęściej używaną polimerazą jest termostabilna polimeraza Taq pochodząca z bakterii Th ermus aquaticus, która nie posiada jednak zdolności sprawdzania powiela- nych fragmentów DNA (proof reading), co skutkuje znacznym poziomem błęd- nie wstawianych przez nią nukleotydów.
Dokładność polimerazy nie jest tak istot- na w analizie wielkości produktu PCR, ma natomiast duże znaczenie w bada- niach obejmujących detekcję polimorfi - zmów i mutacji punktowych (14). Z tego względu w powyższych analizach powin- no się redukować ten problem dzięki za- stosowaniu alternatywnych, termostabil- nych polimeraz DNA posiadających ak- tywność egzonukleazy w kierunku 3’ – 5’, jak np. polimeraza Pfu pochodząca z Py- rococcus furiosus.
Ważnym zagadnieniem w optymalizacji PCR jest zapobieganie powstawaniu nie- swoistych produktów reakcji. Do tego zja- wiska może prowadzić zarówno nadmiar polimerazy DNA, jak i użytych starterów oraz źle dobrana temperatura topnienia lub sekwencja starterów (14).
Prace poglądowe
386 Życie Weterynaryjne • 2009 • 84(5)
Z kolei brak produktu może wynikać z użycia niedostatecznej ilości polimerazy DNA, źle dobranych starterów czy rozkła- du innych ważnych składników reakcji bę- dących substratami, dla polimerazy, jak np.
deoksynukleozydotrifosforanów (dNTP), które są najbardziej wrażliwymi odczynni- kami używanymi w tej metodzie (14).
Bardzo ważny dla przebiegu reakcji jest też odpowiedni bufor, zapewniający optymalne warunki dla działania polime- razy oraz zawierający MgCl2. Jony magne- zu wiązane są w trakcie reakcji przez po- limerazę DNA, startery, matrycę, a także dNTP, dlatego bardzo istotne jest ustalenie ich odpowiedniego stężenia (14).
Ze względu na wiele czynności wyko- nywanych manualnie w tradycyjnym PCR oraz mnogość czynników, od których zale- ży powodzenie doświadczenia, optymali- zacja tego procesu może okazać się żmud- na i długotrwała (16).
Natomiast reakcja PCR z analizą przyro- stu ilości produktu w czasie rzeczywistym, tzw. real-time PCR (ilościowe real-time PCR – Quantitative PCR-QPCR), jest wol- na od większości tych wad. Jest to techni- ka jakościowo-ilościowa o dużym zakre- sie czułości. Umożliwia ona fl uorescen- cyjne wykrywanie produktów już w czasie przebiegu reakcji, co predysponuje stoso- wanie real-time PCR na większą niż do- tychczas skalę (11).
Detekcja w przypadku tej metody prze- biega w czasie rzeczywistym i polega na po- miarze poziomu fl uorescencji emitowanej przez barwniki interkalujące1 do DNA lub sondy molekularne. Im wyższe jest stęże- nie amplikonów, tym wyższy poziom fl uore- scencji. W początkowych cyklach, ze wzglę- du na powolną amplifi kację DNA, obser- wujemy niski poziom emisji fl uorescencji, rejestrowany jako tło (background). W póź- niejszych etapach wzrost stężenia ampliko- nów powoduje wzrost poziomu fl uorescen- cji, aż w końcu przekracza on poziom tła, czyli osiąga wartość progową (Ft– fl uore- scence treshold). Cykl, w którym to zjawisko następuje, nazywamy cyklem progowym (Ct– treshold cycle). Od tego cyklu rozpo- czyna się faza logarytmiczna amplifi kacji.
Im więcej kopii powielanej sekwencji do- celowej znajduje się w badanym materiale, tym mniej cykli potrzeba, aby fl uorescencja osiągnęła wartość progową (9).
W przeciwieństwie do konwencjonal- nej PCR, w przypadku real-time PCR po- miar ilości amplikonów jest przeprowa- dzany podczas fazy ekspotencjalnej (lo- garytmicznej), w której warunki reakcji są optymalne i obserwowana jest naj- efektywniejsza amplifi kacja. Dzięki temu QPCR umożliwia dokładną ocenę ilości
początkowej sekwencji docelowej w ba- danej próbce (15).
Tak, więc stosując QPCR, można okre- ślić np. bezwzględną liczbę drobnoustro- jów w badanym materiale. Aby tego doko- nać należy porównać wartości Ct uzyska- ne w przypadku badanej próbki z krzywą wzorcową, skonstruowaną w trakcie tego samego eksperymentu na podstawie war- tości Ct uzyskanych dla serii prób, zawie- rających różne, znane ilości kopii badanej matrycy. Możliwe jest również porówna- nie liczby drobnoustrojów obecnej w ba- danej próbce do ich liczby w materiale po- chodzącym z innego narządu wewnętrz- nego lub w próbkach pobranych w różnym czasie po zakażeniu (11).
Usunięcie odrębnego procesu detek- cji amplikonów po zakończeniu reakcji (post-PCR detection) czyni z QPCR sys- tem zamknięty (homogeniczny – closed system), co zmniejsza ryzyko zanieczysz- czenia w porównaniu z konwencjonalnym PCR. Jednoetapowość przeprowadzania re- akcji, wraz z użyciem znaczników fl uore- scencyjnych i czułych metod wykrywania ich emisji (wcześniejsze wykrycie produk- tu), pozwala również na zwiększenie szyb- kości real-time PCR. Pewną rolę w zapew- nieniu krótszego czasu trwania tej reakcji mogą odgrywać również mniejsze rozmiary amplikonów rekomendowane przez twór- ców komercyjnych systemów do przepro- wadzania QPCR, jakkolwiek udowodniono, iż zmniejszone rozmiary produktu nie za- wsze prowadzą do zwiększenia wydajność tej techniki (15).
QPCR stanowi nowe spojrzenie na ki- netykę reakcji PCR oraz rolę, jaką odgry- wają niektóre związki chemiczne w ha- mowaniu reakcji amplifi kacji (17). Wyso- ka czułość tej metody pozwala na użycie znacznie mniejszych początkowych ilości sekwencji matrycowej niż wymagają tego inne stosowane powszechnie techniki (17).
Dlatego metoda ta zastępuje często inne
„narzędzia molekularne”, jak sekwencjo- nowanie czy analizę polimorfi zmu frag- mentów restrykcyjnych – RFLP. Obok dia- gnostyki parwowirozy psów stosuje się ją, m.in. w rozpoznawaniu wścieklizny, gruź- licy czy wykrywania oporności na antybio- tyki Staphylococcus aureus (18).
Metody real-time PCR dzielimy na nie- swoiste (niezależne od sekwencji matry- cy) oraz zależne od sekwencji matrycy techniki swoiste. W obu grupach używa się barwników fl uorescencyjnych, zwią- zanych ze starterami lub/i sondami (me- tody swoiste) lub obecnych w roztworze, w którym zachodzi PCR (metody nieswo- iste; 18, 19). Do nieswoistych metod wy- krywania produktów real-time PCR należą
techniki wykorzystujące barwnik SYBR Green I, przy których nie trzeba dyspo- nować specjalnymi starterami ani sonda- mi DNA (18). Dlatego też metoda ta nie wymaga tak specjalistycznej wiedzy, jak w wypadku technik swoistych, potrzeb- nej do ich zaprojektowania. Ponadto na jej wynik nie wpływa w stopniu tak du- żym, jak w przypadku technik zależnych od matrycy, możliwość wystąpienia różnic w sekwencji wyjściowej, które mogą unie- możliwić hybrydyzację sond (15). SYBR Green I, obecny w mieszaninie reakcyjnej, w każdym cyklu QPCR po etapie wydłuża- nia interkaluje do powstałego dwuniciowe- go produktu PCR (9) i wzbudzony emituje światło o długości 520 nm. Wzrost fl uore- scencji jest proporcjonalny do ilości otrzy- manego w reakcji DNA. Zaletami tej me- tody są: stosunkowo niewielki koszt oraz uniwersalność, jednak istnieje też niebez- pieczeństwo uzyskania fałszywie pozytyw- nych lub zawyżonych wyników (14). Aby zweryfi kować wyniki, przeprowadza się analizę krzywej topnienia produktów po- wstałych w reakcji. Temperatura topnie- nia (Tm) specyfi cznego dla danej reakcji amplikonu jest zwykle wyższa niż Tm di- merów starterów, do których może wią- zać się SYBR Green I (9). Techniki real – time PCR, mimo szeregu zalet, posiadają również pewne ograniczenia w porówna- niu do konwencjonalnego PCR. Należą do nich niekompatybilność oprogramowań z niektórymi fl uoroforami oraz względne ograniczenie zdolności multipleksowych używanych obecnie systemów. Ponieważ większość popularnych systemów QPCR opiera się na hybrydyzacji sond do kom- plementarnej sekwencji jednej z nici am- plikonu, użycie większej liczby starterów stwarza korzystniejsze warunki dla wytwa- rzania zwiększonego sygnału fl uorescen- cyjnego. Kolejnym ograniczeniem, mogą- cym mieć duże znaczenie w laboratoriach o małej przepustowości, jest duży, począt- kowy koszt tej metody (13, 15).
W przypadku techniki wykorzystują- cej SYBR Green I, ze względu na możli- wość wiązania się powyższego barwnika z jakimkolwiek dsDNA, technologii tej nie powinno się stosować do analizy dsDNA w tkance, gdyż występujący tu nadmiar ge- nomowego DNA fałszuje sygnał emitowa- ny przez produkt reakcji wysokim sygna- łem tła (17).
Ograniczeniami wspólnymi zarówno dla PCR, jak i QPCR jest konieczność po- siadania wcześniejszej wiedzy o sekwen- cji matrycy, aby móc zaprojektować od- powiednie startery (13) oraz możliwość hamowania reakcji przez niektóre sub- stancje (12), np. SDS, EDTA, DMSO czy
1 Interkalacją nazywane jest zjawisko tworzenia się stabilnych kompleksów pomiędzy DNA a płaskimi ligandami, które dzięki swej konformacji mają zdolność wsunię- cia się pomiędzy sąsiadujące ze sobą pary zasad nukleinowych w DNA (przyp. red.)
Prace poglądowe
387
Życie Weterynaryjne • 2009 • 84(5)
heparynę, co może dawać wyniki fałszy- wie ujemne (14). Ponadto, w obu tych re- akcjach, im większy odcinek DNA ampli- fi kujemy, tym trudniej uzyskać prawidło- wy produkt reakcji.
Tak jak w konwencjonalnym PCR, rów- nież w QPCR istnieje potrzeba optymali- zowania reakcji przez właściwie dobraną koncentrację magnezu, starterów, sond oraz stosowanie odpowiedniej polimera- zy, najlepiej zmodyfi kowanej polimera- zy hot start, która obniża ryzyko genero- wania produktów nieswoistych, ponieważ jest nieaktywna w temperaturze pokojowej.
Jednak w przypadku QPCR, dzięki jego większemu zautomatyzowaniu i zazwyczaj krótszemu czasowi trwania, optymalizacja ta jest mniej czasochłonna (16).
Inną, obecnie najczęściej używaną w celu identyfi kacji szczepów parwowi- rusów molekularną techniką, jest sekwen- cjonowanie. Powstanie tej szybkiej i sku- tecznej metody analizy DNA, połączonej z PCR, było odpowiedzią na wzrastające potrzeby tworzenia genomowych bibliotek oraz klonowania fragmentów DNA. Cią- gle jest to jeszcze technika zbyt kosztow- na dla przeciętnego laboratorium, jednak cały czas prowadzone są badania nad jej udoskonaleniem i obniżeniem generowa- nych przez nią kosztów (13).
Począwszy od wynalezionej w 1977 r.
przez Maxama i Gilberta metody che- micznej oraz opracowanej w tym samym czasie przez Sangera i Coulsona metody enzymatyczej, sekwencjonowanie ciągle ewoluuje. Obecnie stosowana jest głównie metoda enzymatyczna Sangera, a raczej jej modyfi kacje. Istnieje kilka wariantów se- kwencjonowania. To, który wariant zasto- sujemy, zależy m.in. od długości sekwen- cji, którą chcemy przeanalizować. Wybór metody sekwencjonowania zależy tez od celu, jaki chcemy osiągnąć (14).
Sekwencjonowanie może być stosowane m.in. do bezpośredniej analizy produktów reakcji PCR, co pozwala na szybkie i nisko- nakładowe badanie DNA. Metoda ta jest też bardzo użyteczna przy oznaczaniu pa- togenów, wykrywaniu i charakteryzowaniu mutacji czy przeszukiwaniu i charaktery- zowaniu bibliotek cDNA (14).
W przypadku sekwencjonowania wadą jest fakt, iż, tak jak przy PCR i QPCR, mu- simy mieć wcześniejsze informacje o se- kwencji docelowej. Zaletą jest międzyla- boratoryjna odtwarzalność sekwecjono- wania, której poziom jest zadowalający, podobnie jak w PCR i QPCR (13).
Nowoczesne metody molekularne sto- sowane do detekcji CPV-2, takie jak PCR czy real-time PCR, wymagają drogiego sprzętu, odczynników i wykwalifi kowa- nych użytkowników, dlatego ich zastoso- wanie jako metod w laboratoriach wetery- naryjnych nie jest jeszcze szeroko rozpo- wszechnione (3). Mimo tego, iż techniki te prawdopodobnie nie zastąpią całkowi- cie tradycyjnych metod wykrywania zaka- żeń parwowirusowych czy innych jedno- stek chorobowych, to bez tych niezmier- nie przydatnych „molekularnych narzędzi”
nie można już sobie wyobrazić nowocze- snej diagnostyki (20). Potrzebna jest jed- nak ich standaryzacja oraz przystosowanie do praktyki laboratoryjnej również w przy- padku parwowirozy psów (3).
Trzeba też nadmienić, iż zakażenia psów wywołane wirusem CPV-2, pomimo sto- sowania już od dłuższego czasu szczepień profi laktycznych, stanowią nadal realne za- grożenie dla zdrowia tych zwierząt (7)
Wiele dowodów wskazuje też na to, iż CPV-2 ciągle ewoluuje i zmienia swój profi l antygenowy, co dyktuje nieprzemijającą po- trzebę stosowania badań diagnostycznych wykrywających tego wirusa (7).
Piśmiennictwo
1. Frymus T: Parwowiroza. W: Choroby zakaźne psów. Wy- dawnictwo SI–MA, Warszawa, 1999, s. 7-36.
2. Winiarczyk S., Grądzki Z., Wołoszyn S., Pejsak Z., Żmu- dziński J.F., Gundłach J., Radzikowski A., Osek J. W:
Choroby zakaźne zwierząt z elementami zoonoz. Lublin 2000.
3. Desario C., Decaro N., Campolo M., Cavalli A., Cirone F., Elia G., Martella V., Lorusso E., Camero M., Buona- voglia C.: Canine parvovirus infection: which diagnostic test for virus? J. Virol. Methods. 2005, 126, 179-185.
4. Drane D. P., Hamilton R. C., Cox J. C.: Evaluation of a no- vel diagnostic test for canine parvovirus. Vet. Microbiol.
1994, 41, 293-302.
5. Cho H.-S., Kang J.-I., Park N.-Y.: Detection of canine pa- rvovirus in fecal samples using loop-mediated isother- mal amplifi cation. J. Vet. Diagn. Invest. 2006, 18, 81-84.
6. Mochizuki M., San Gabriel M. C., Nakatani H., Yoshida M.: Comparison of polymerase chain reaction with virus isolation and haemaglutination assays for the detection of
canine parvoviruses in faecal samples. Res. Vet. Sci. 1993, 55, 60-63.
7. Mizak B., Borowski A.: Zastosowanie testu PLA do oce- ny namnażania wirusa nosówki, adenowirusa typu 1 oraz parwowirusa psów w hodowlach komórkowych. Medy- cyna Wet. 1998, 54, 753-756.
8. Griffi ths A. J. F, Miller J. H., Lewontin R. C., Suzuki D. T., Gelbart W. M.: An Introduction to Genetic Analysis. W. H.
Freeman and Company, New York 2000, s. 2130-2144.
9. Studzińska A., Tyburski J., Daca P., Tretyn A.: PCR w cza- sie rzeczywistym. Istota metody i strategie monitorowa- nia przebiegu reakcji. Biotechnologia 2008, 1, 71-85.
10. Senda M., Parrish C. M., Harasava R., Gamoh K., Mu- ramatsu M., Hirayama N., Itoh O.: Detection by PCR of wild-type canine parvovirus which contaminates dog vac- cines. J. Clin. Microbiol. 1995, 33, 110–113.
11. Stadejek T.: Postęp w rozwoju techniki cyklicznej polime- ryzacji DNA in vitro – Real-Time PCR. Medycyna Wet.
2006, 62, 390-394.
12. Valasek M.A., Repa J.J.: Th e power of real-time PCR. Adv.
Physiol. Educ. 2005, 29, 151–159.
13. Pereira F., Carneiro J., Amorim A.: Identifi cation of Spe- cies with DNA-Based Technology: Current Progress and Challenges. Recent Patents on DNA & Gene Sequences.
2008, 2, 187-200.
14. Słomski R.W: Przykłady analiz DNA. Wydawnictwo Aka- demii Rolniczej w Poznaniu, Poznań, 2002, s.13-18.
15. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A.: Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1292–1305.
16. Espy M. J., Uhl J. R., Sloan L. M., Buckwalter S. P., Jones M. F., Vetter E.A, Yao J.D., Wengenack N.L., Rosenblatt J.E., Cockerill F.R. 3rd, Smith T.F.: Real-time PCR in cli- nical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19, 595-610.
17. Wiedro K., Stachowska E., Chlubek D.: Łańcuchowa re- akcja polimerazy z analizą w czasie rzeczywistym (RT- PCR). Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szcze- cinie. 2007, 53, 5-9.
18. Orłowska A., Smreczak M., Trębas P., Żmudziński J. F.:
Zastosowanie Real time PCR z uwzględnieniem przydat- ności w diagnostyce wścieklizny. Medycyna Wet. 2008, 64, 1280-1282.
19. Mackay I.M.: Real-time PCR in the microbiology labora- tory. Clin. Microbiol. Infect. 2004, 10, 190–212.
20. Dziubek Z., Janeczko J., Juszczyk J., Kajfasz P., Liberski P.P., Magdzik W., Olszyńska-Krowicka M., Pawłowski Z., Ślusarczyk J., Wierzbicka M: Choroby zakaźne i pasożyt- nicze. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003, s. 51-60.
Dr Łukasz Adaszek, ul Głęboka 30.20-612 Lublin, e-mail:
ukaszek0@wp.pl
Ośrodek Szkoleniowo Wypoczynkowy Krajowej Izby Lekarsko-Weterynaryjnej Wisła
zaprasza lekarzy weterynarii oraz ich rodziny.
Gwarantowany miły wypoczynek w pięknym Beskidzie Śląskim. Ośrodek jest czynny przez cały rok.
Niskie ceny.
Rezerwacja: ul. Jawornik 1, 43-460 Wisła, tel./faks: 033 855 12 00 kierownik – Małgorzata Pastucha
Errata
W numerze 3/2009 r. w artykule Adama Dzierżawskie- go: 25 lat zwalczania warrozy w Polsce, znalazł się błąd w danych adresowych autora. Adres ten jest następujący:
dr Adam Dzierżawski, Zakład Farmacji Weterynaryjnej, Pań- stwowy Instytut Weterynaryjny, al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy.
Przepraszamy.
Prace poglądowe
388 Życie Weterynaryjne • 2009 • 84(5)
