BIOLOGICZNE METODY WYKRYWANIA ALERGENÓW W YWNOŒCI

(1)

Joanna Jasnowska-Ma³ecka

Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu

BIOLOGICZNE METODY WYKRYWANIA ALERGENÓW W ¯YWNOŒCI

Streszczenie: W artykule przedstawiono komercyjnie dostêpne testy i obecne naukowe opracowania umo¿liwiaj¹ce oznaczenie alergenów w ¿ywnoœci, takie jak metody biologiczne oparte na analizie bia³ka, tj. immunoenzymatyczne testy typu ELISA, testy immunochromatograficzne typu LFA, biosensory oraz metody oparte na analizie DNA wykorzystuj¹ce reakcjê PCR. Scharakteryzowano mo¿liwoœci i ograniczenia dostêpnych rozwi¹zañ analitycznych. Przedstawiono równie¿ potencja³ analityczny metod opartych na spektroskopii mas w analizie alergenów pokarmowych jako metody porównawczej.

S³owa kluczowe: alergeny w ¿ywnoœci, metody biologiczne, ELISA, biosensor, PCR, spektrometria mas.

Wstêp

Alergie pokarmowe s¹ istotnym problemem zdrowotnym zw³aszcza w krajach wysoko rozwiniêtych. Szacunkowo podaje siê, ¿e problem nadwra¿liwoœci na bia³ka pokarmowe dotyczy ok. 1–3% populacji i ok. 4–6% dzieci [Schubert-Ull- rich i in. 2009]. Reakcjê alergiczn¹ u osób nadwra¿liwych mo¿e wywo³aæ spo¿ycie nawet niewielkiej dawki alergennego sk³adnika. Wœród najczêstszych objawów alergicznych wymienia siê np.: reakcje skórne, reakcje z uk³adu oddechowego, objawy ¿o³¹dkowo-jelitowe oraz reakcje neurologiczne. Jednak¿e u niektórych osób kontakt ze specyficznym alergenem pokarmowym mo¿e prowadziæ do reakcji bezpoœrednio zagra¿aj¹cej ¿yciu, tj. w przypadku wyst¹pienia wstrz¹su anafilaktycznego [www.jaalergik.pl/alergia-pokarmowa].

Alergie pokarmowe wraz z nietolerancj¹ pokarmow¹ zosta³y zakwalifiko- wane w 1995 roku przez Europejsk¹ Akademiê Alergologii i Immunologii Kli- nicznej (EAACI) do tzw. grupy nietoksycznych niepo¿¹danych reakcji po spo¿y- ciu pokarmu [Johansson i in. 2001]. O alergii pokarmowej mówimy wówczas, gdy dochodzi do nadmiernej, opacznej (niew³aœciwej, niepo¿¹danej) reakcji uk³adu odpornoœciowego w wyniku spo¿ycia nawet bardzo niewielkiej iloœci

(2)

pokarmu. Natomiast nietolerancji pokarmowej (wynikaj¹cej najczêœciej z defek- tu genetycznego) mog¹ towarzyszyæ podobne objawy kliniczne, ale nie s¹ one udzia³em uk³adu odpornoœciowego. Rozró¿nienie nietolerancji pokarmowej od alergii jest istotne z medycznego punktu widzenia, gdy¿ warunkuje sposób ich leczenia.

Nadwra¿liwoœæ alergiczna jest uwarunkowana osobniczo. Nadmierna, niepo¿¹dana reakcja organizmu wywo³ana jest alergenem, maj¹cym kontakt z uk³a- dem odpornoœciowym organizmu i mobilizuj¹cym go do reakcji obronnej. Ze wzglêdu na rodzaj odpowiedzi immunologicznej reakcje alergiczne wywo³ane sk³adnikami ¿ywnoœci dzieli siê na tzw. alergie IgE-zale¿ne i IgE-niezale¿ne.

Alergie IgE-zale¿ne s¹ zwi¹zane z wydzielaniem swoistych przeciwcia³ – immunoglobulin E; charakteryzuj¹ siê nag³ymi symptomami i ostrym przebiegiem. S¹ to np. alergie na niektóre bia³ka orzeszków ziemnych. Natomiast tzw. alergie IgE-niezale¿ne wywo³ane s¹ reakcj¹ uczulonych limfocytów T. S¹ to podostre i chroniczne jednostki chorobowe takie, jak np. enteropatia wywo³ana przez bia³ka mleka czy celiakia spowodowana nadwra¿liwoœci¹ na gluten [Jêdrychow- ski i Wróblewska 2009]. Alergenami nazywa siê antygeny¹, które zapocz¹tko- wuj¹ reakcje nadwra¿liwoœci i odpowiadaj¹ za ich ujawnienie siê u osób uczulonych. Alergeny wystêpuj¹ce w ¿ywnoœci mo¿na podzieliæ na antygeny naturalnie i nienaturalnie w niej wystêpuj¹ce. Alergeny naturalne to g³ównie bia³ka roœlinne i zwierzêce [Szymkiewicz 2007; Wróblewska 2007]. ród³em alergenów mog¹ byæ te¿ stosowane zabiegi technologiczne prowadz¹ce do powstania tzw. neoa- lergenów np. wskutek prowadzonych procesów termicznych, albo mog¹ byæ wynikiem dodawania preparatów enzymatycznych lub sk³adników utrwalaj¹cych [Jêdrychowski i Wróblewska 2009; Wróblewska, Szymkiewicz i Jêdrychowski 2007].

Alergeny pokarmowe nie maj¹ wspólnej budowy chemicznej, na której podstawie mo¿na by jednoznacznie wskazaæ na ich zdolnoœæ do alergizacji. Wiêkszoœæ naturalnie wystêpuj¹cych alergenów pokarmowych jest zazwyczaj bia³kami pro- stymi lub glikoproteinami o masie cz¹steczkowej od 10 do 40 kDa. Jednak¿e spo- tyka siê równie¿ reakcje alergiczne wywo³ane przez cz¹steczki o masie mniejszej – tj. 3 kDa i wiêkszej – do 100 kDa [Pietrzyk 2009]. Cech¹ charakterystyczn¹ aler- genów pokarmowych, w przeciwieñstwie do alergenów wziewnych² lub jadów owadów, jest doœæ wysoki próg stê¿enia sk³adnika niezbêdnego do wywo³ania

1Antygen – ka¿da substancja, najczêœciej obca, bia³kowa, która wywo³uje produkcjê przeciwcia³ w organizmie oraz ma zdolnoœæ do ³¹czenia siê z przeciwcia³ami i receptorami limfocytów T.

Organizm produkuje równie¿ w³asne antygeny, które s¹ rozpoznawane i akceptowane przez uk³ad odpornoœciowy. Na podstawie budowy antygenów uk³ad odpornoœciowy rozró¿nia komórki w³asne od obcych, które niszczy.

2Alergenami wziewnymi s¹ drobne cz¹stki pochodzenia roœlinnego, zwierzêcego lub substan- cje chemiczne, które przenikaj¹ w g³¹b dróg oddechowych razem z wdychanym powietrzem.

(3)

reakcji, czêsta ekspozycja na alergen oraz jego odpornoœæ na hydrolizê pod wp³ywem enzymów wystêpuj¹cych w przewodzie pokarmowym [Mills i in.

2004]. Jak do tej pory wartoœci dawek progowych wywo³uj¹cych objawy alergii pokarmowej nie s¹ normowane, jednak wed³ug danych klinicznych najbardziej wra¿liwi na bia³ka orzeszków ziemnych, mleka i jajek pacjenci wykazuj¹ reakcje niepo¿¹dane ju¿ po spo¿yciu 0,5–1 mg czynnika alergizuj¹cego [Taylor i Hefle 2005].

W 1995 roku grupa ekspertów FAO po raz pierwszy okreœli³a listê produktów spo¿ywczych stanowi¹cych g³ówne Ÿród³a antygenów odpowiedzialnych za 90%

wszystkich IgE-zale¿nych alergii pokarmowych. S¹ to: mleko krowie, jaja, ryby, skorupiaki, orzechy, orzeszki arachidowe, soja i pszenica. Lista ta zosta³a pot- wierdzona przez Komisjê Kodeksu ¯ywnoœciowego w 1999 roku i zyska³a miano „wielkiej ósemki” alergenów pokarmowych [Wróblewska 2002].

Ze wzglêdu na fakt, i¿ alergie s¹ trudne do wyleczenia, a dawki wywo³uj¹ce reakcje obronne trudne do ustalenia, nale¿y przede wszystkim unikaæ substancji, które je wywo³uj¹ [Mills i in. 2007], st¹d niezbêdne jest posiadanie informacji o zawartoœci potencjalnych alergenów w ¿ywnoœci. Dla ochrony zdrowia i ¿ycia konsumentów w wielu krajach na œwiecie istniej¹ przepisy nakazuj¹ce producen- tom ¿ywnoœci paczkowanej przeznaczonej dla konsumenta finalnego zamiesz- czania na opakowaniach informacji o obecnoœci sk³adników alergennych [van Hengel 2007]. W chwili obecnej w Unii Europejskiej jest ich czternaœcie. S¹ to:

zbo¿a zawieraj¹ce gluten (tj. pszenica, ¿yto, jêczmieñ, owies zwyczajny, pszenica oplewiona – orkisz, kamut lub ich szczepy hybrydowe); skorupiaki; jaja;

ryby; orzeszki ziemne (orzeszki arachidowe); nasiona soi; mleko (³¹cznie z lak- toz¹); orzechy, tj. migda³ (Amygdalus communis L.), orzech laskowy (Corylus avellana), orzech w³oski (Juglans regia), nerkowiec (Anacardium occidentale), orzech pekan (Carya illinoiesis), orzech brazylijski (Bertholletia excelsa), orzech pistacjowy (Pistacia vera), orzech makadamia (Macadamia ternifolia); seler, gorczyca (musztarda); nasiona sezamu; dwutlenek siarki i siarczyny w stê¿eniach powy¿ej 10 mg/kg lub 10 mg/l w przeliczeniu na SO₂; ³ubin oraz miêczaki [Dyrektywa Komisji 2007/68/WE]. W Polsce obowi¹zek znakowania ww.

sk³adników regulowany jest Rozporz¹dzeniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju wsi z dnia 10 lipca 2007 roku w sprawie znakowania œrodków spo¿ywczych [Dz.U. nr 137, poz. 966].

Istniej¹ce przepisy prawne dotycz¹ce etykietowania ¿ywnoœci nie reguluj¹ kwestii zwi¹zanych z przypadkowym pojawieniem siê w produktach spo¿ywczych sk³adników o w³aœciwoœciach alergizuj¹cych, pochodz¹cych z zanieczyszczeñ krzy¿owych, np. ze wspólnych linii produkcyjnych. Przypadkowe pojawienie siê tzw. ukrytych alergenów w ¿ywnoœci stwarza ogromne ryzyko dla konsumenta, st¹d na opakowaniach produktów spo¿ywczych pojawi³y siê dodatkowe dobro- wolne napisy informuj¹ce o mo¿liwoœci wyst¹pienia „œladowych iloœci” okreœlo-

(4)

nego alergenu [Soko³owska-Kozie³ i Bugajewska 2007]. Takie praktyki stanowi¹ rodzaj zabezpieczenia firmy produkcyjnej oraz zdrowia konsumenta. Z drugiej jednak strony zbyt swobodne podawanie tego typu informacji ogranicza znacznie ró¿- norodnoœæ produktów, z których mog¹ korzystaæ osoby z alergiami pokarmowymi.

Ograniczenie liczby przypadków niezamierzonej obecnoœci sk³adników alergennych w gotowych produktach, mo¿liwe jest m.in. dziêki posiadaniu odpowiednich narzêdzi analitycznych umo¿liwiaj¹cych ich wykrycie [Taylor i Hefle 2005].

Obecnie dostêpnych jest wiele biologicznych i fizykochemicznych metod detekcji alergenów w ¿ywnoœci. S¹ to metody pozwalaj¹ce na wykrycie samego alergenu lub markera wskazuj¹cego na jego obecnoœæ. Takimi markerami s¹ zwykle bia³ka charakterystyczne dla danej alergizuj¹cej ¿ywnoœci (np. bia³ka zapasowe orzecha ziemnego – Ara h 1) lub charakterystyczne fragmenty DNA – genu koduj¹ce to bia³ko. Wœród metod oznaczania alergenów zdecydowana wiê- kszoœæ to metody biologiczne oparte na reakcji przeciwcia³o – antygen (w przypadku oznaczania bia³ek) lub reakcji hybrydyzacji (w przypadku oznaczania DNA). Obecnie du¿e oczekiwania ³¹czy siê z wykorzystaniem spektroskopii mas w analizie materia³u alergennego w ¿ywnoœci. Spektroskopia mas jest jedn¹ z wysoce zaawansowanych metod fizykochemicznych umo¿liwiaj¹cych oznaczanie budowy zwi¹zków chemicznych oraz sk³adu chemicznego z³o¿onych mieszanin.

W tym artykule przedstawiono najczêœciej stosowane w analizie alergenów ¿yw- noœci metody biologiczne oparte na analizie bia³ka, tj. metody immunometryczne, takie jak testy immunoenzymatyczne ELISA oraz testy immunochromatograficzne w formie pasków LFA, biosensory, jak równie¿ metody oparte na analizie DNA wykorzystuj¹ce reakcjê PCR. Przedstawiono równie¿ zastosowanie jednej z metod fizykochemicznych, tj. spektroskopii mas jako metody porównawczej.

1. Metody immunometryczne

Metody immunometryczne wykorzystuj¹ mono- lub poliklonalne przeciwcia³a³ w celu wykrycia bia³ek – antygenów stanowi¹cych alergeny pokarmowe lub ich markery. Stosuj¹c przeciwcia³a monoklonalne, uzyskuje siê wysok¹ swoistoœæ wzglêdem danego antygenu, gdy¿ wi¹¿¹ siê z nim po rozpoznaniu jednego epitopu⁴. Natomiast przeciwcia³a poliklonalne rozpoznaj¹ wiele epitopów rozmiesz-

3Przeciwcia³a monoklonalne to zbiór przeciwcia³, które wykazuj¹ jednakow¹ swoistoœæ wzglê- dem danego antygenu i takie samo lub podobne powinowactwo do niego. Przeciwieñstwem przeciwcia³ monoklonalnych s¹ przeciwcia³a poliklonalne, czyli takie, które wi¹¿¹ ró¿ne antygeny i wzglêdem tego samego antygenu wykazuj¹ ró¿ne powinowactwo.

4Epitop to fragment antygenu, który ³¹czy siê bezpoœrednio z przeciwcia³em, co wzbudza od- powiedŸ uk³adu odpornoœciowego.

(5)

czonych na bia³ku, co czyni je bardziej „tolerancyjnymi” w stosunku do niewiel- kich zmian w obrêbie danego antygenu. Przeciwcia³a poliklonalne s¹ tañsze i czêœciej wykorzystywane przez firmy produkuj¹ce testy immunoenzymatyczne ELISA [Monaci i Visconti 2010].

Do najczêœciej stosowanych w analizie ¿ywnoœci metod nale¿¹ testy immu- noenzymatyczne fazy sta³ej ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), testy immunochromatograficzne typu LFA (ang. lateral flow assay). Do ozna- czania alergenów pokarmowych stosowane by³y równie¿: immunobloting [Scheibe i in. 2001], immunoelektroforeza rakietowa (ang. rocket immunoelec- trophoresis, RIE) [Malmheden i in. 1994], testy radioalergosorpcji RAST (ang.

radio allergosorbent test), i EAST (enzyme allergosorbent test) [Fremont i in.

1996, Koppelman i in. 1999], metody radioimmunologiczne (ang. radio im- muno assay, RIA), [Poms, Anklam i Kuchn 2004; Monaci i Visconti 2009].

Technika immunoblotingu oraz elektroforeza RIE, testy typu LFA daj¹ mo¿li- woœæ uzyskania tylko wyników jakoœciowych lub pó³iloœciowych. Natomiast pozosta³e metody RAST, EAST oraz ELISA pozwalaj¹ na uzyskanie wyników iloœciowych.

1.1. ELISA

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), czyli test immunoenzyma- tyczny fazy sta³ej s³u¿y do wykrycia okreœlonych bia³ek w badanym materiale z u¿yciem przeciwcia³ poliklonalnych lub monoklonalnych znakowanych enzymem. Od lat 80. ubieg³ego wieku to jeden z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biochemicznych i biomedycznych zarówno dla celów naukowych, jak i diagnostycznych.

Zasada dzia³ania i jednoczeœnie wysoka czu³oœæ testu ELISA zwi¹zana jest z unieruchomieniem badanego bia³ka (alergenu) na pod³o¿u sta³ym (p³ytce), a na- stêpnie na wykryciu go za pomoc¹ przeciwcia³a znakowanego⁵ enzymem (tj.

przeciwcia³a detekcyjnego). Po utworzeniu kompleksu immunologicznego nie- zwi¹zane przeciwcia³a usuwa siê poprzez wyp³ukanie p³ytki. Nastêpnie dodaje siê substrat dla enzymu zwi¹zanego z przeciwcia³em. Wynikiem zajœcia reakcji enzymatycznej jest pojawienie siê barwnego produktu. Spektrofotometryczny pomiar iloœci powstaj¹cego produktu umo¿liwia przeprowadzenie analizy ilo- œciowej wykrytego antygenu.

Istniej¹ ró¿norodne modyfikacje testów ELISA, jednak¿e w analizie ¿ywno- œci zastosowanie g³ównie znalaz³y dwa rodzaje, tj. test podwójnego wi¹zania, tzw. kanapkowy (ang. sandwich ELISA, s-ELISA) i konkurencyjny (ang. competi- tve ELISA, c-ELISA) [Schubert-Ullrich i in. 2009].

5Termin „znakowany” oznacza po³¹czenie przeciwcia³a z substancj¹ (enzymem), której iloœæ lub aktywnoœæ mo¿na zmierzyæ. Przeciwcia³o znakowane enzymem zwane jest inaczej koniugatem.

(6)

Test kanapkowy (s-ELISA) polega na zwi¹zaniu antygenu przez przeciwcia³a umieszczone na p³ytce (tzw. przeciwcia³a wychwytuj¹ce) i wykryciu go przez kolejne przeciwcia³a detekcyjne. Jest to tzw. test bezpoœredni ELISA. Zalet¹ tej metody jest jej szybkoœæ w porównaniu do przedstawionej dalej metody poœred- niej. Warto jednak zauwa¿yæ, ¿e test bezpoœredni wymaga obecnoœci swoistego przeciwcia³a, które dodatkowo musi byæ wyznakowane enzymem, co jest kosz- towne i nie zawsze mo¿liwe do wykonania. Tañszym rozwi¹zaniem, lecz bardziej pracoch³onnym, jest zastosowanie testu poœredniego z podwójnym przeciwcia³em detekcyjnym. W tym przypadku zwi¹zany na p³ytce antygen jest swoiœcie rozpoznany przez pierwsze przeciwcia³o detekcyjne, które nie jest znakowane. Znakowane jest natomiast przeciwcia³o drugorzêdowe przy³¹czaj¹ce siê do przeciwcia³a pierwszorzêdowego, rozpoznaj¹ce dany izotyp immunoglobulin.

Konkurencyjne testy ELISA (c-ELISA) pozwalaj¹ na wykrycie cz¹steczek o mniejszych rozmiarach ni¿ w przypadku testów kanapkowych [Schubert-Ull- rich i in. 2009]. Testy te równie¿ wystêpuj¹ w kilku odmianach. Wykorzystuje siê w nich mieszankê znakowanego antygenu, która jest dodawana do badanego materia³u. W celu oznaczenia stê¿enia danego antygenu (alergenu) p³ytkê nale¿y op³aszczyæ skierowanymi przeciwko oznaczanemu alergenowi przeciwcia³ami.

Jeœli na tak przygotowane p³ytki naniesie siê mieszankê przygotowan¹ z badanej próby zawieraj¹cej oznaczane antygeny oraz roztworu antygenów wyznakowa- nych enzymami, to nast¹pi wspó³zawodnictwo pomiêdzy antygenami z próbki a antygenami znakowanymi. W odró¿nieniu od poprzednich metod natê¿enie reakcji enzymatycznej bêdzie odwrotnie proporcjonalne do stê¿enia antygenów w badanej próbie, gdy¿ im wiêksze bêdzie ich stê¿enie, tym mniej znakowanego antygenu przy³¹czy siê do przeciwcia³ umieszczonych na fazie sta³ej.

Testy immunoenzymatyczne swoj¹ popularnoœæ zyska³y dziêki wysokiej spe- cyficznoœci, czu³oœci i prostocie prowadzenia samego oznaczenia. Szybkie testy ELISA daj¹ wynik jakoœciowy i/lub pó³iloœciowy w czasie ok. 30–60 min. Uzy- skanie dok³adnych wyników iloœciowych wymaga zastosowania spektrofotometrycznego czytnika mikrop³ytek. Dostêpne w handlu testy umo¿liwiaj¹ wykrycie znacznej wiêkszoœci alergenów pokarmowych m.in. glutenu, gliadyny, bia³ek mleka, soi, orzeszków ziemnych, orzeszków laskowych, migda³ów, jajek, skoru- piaków itp. Limit detekcji mieœci siê w zakresie od 0,05 do 10 mg/kg, zale¿nie od wykrywanego alergenu i rodzaju produktu spo¿ywczego. Obecne na rynku testy ELISA pozwalaj¹ na wykrycie alergennych sk³adników w ¿ywnoœci na podstawie ca³kowitej zawartoœci bia³ka np. mleka (m.in. test „Alert for Total Milk Allergen” firmy Neogen), grupy bia³ek, np. bia³ek bia³ka jaja kurzego: owoalbu- miny, owomucyny, owotransferyny, lizozymu (test RIDASCREEN FAST Egg firmy R-Biopharm) lub zawartoœci konkretnego bia³ka np. â–laktoglobuliny (test

„Beta Lactoglobulin Residue ELISA” firmy ELISA Systems).

(7)

Testy ELISA mog¹ byæ wykorzystywane w przemyœle spo¿ywczym do rutyno- wych pomiarów, jak i skriningu alergenów w ¿ywnoœci. Dziêki wysokiemu potencja³owi standaryzacji i automatyzacji metoda ta daje mo¿liwoœæ jednoczesnego analizowania du¿ej liczby próbek w kierunku oznaczenia ró¿nych alergenów.

1.2. Testy immunochromatograficzne

Testy immunochromatograficzne typu LFA w formie pasków z bocznym prze- p³ywem (ang. lateral flow analysis) i zanurzeniowych paseczków – „dipstików”

(ang. dipstick) s¹ uproszczon¹ wersj¹ testów ELISA. Testy te sk³adaj¹ siê z patyczka (paska) wykonanego zwykle z polifluorku winilidenu, nylonu lub nitro- celulozy pokrytego membran¹, na której znajduj¹ siê umieszczone immunoreak- tywne cz¹steczki takie, jak przeciwcia³a i antygeny [Schubert-Ullrich i in. 2009].

Testy typu LFA, podobnie jak ELISA, mog¹ byæ wykonywane w technice kanapkowej lub konkurencyjnej. W technice kanapkowej przeciwcia³o wi¹¿¹ce oznaczany alergen jest unieruchomione na membranie w okienku odczytu wyników.

W miejscu nanoszenia próby znajduj¹ siê odczynniki detekcyjne oraz wyznakowane przeciwcia³a. W momencie naniesienia na pasek roztworu badanej próby nastêpuje rozpuszczenie i przenoszenie immunoreaktywnych cz¹steczek wzd³u¿

paska do okienka odczytu wyników. Jeœli w próbie znajdowa³ siê szukany alergen, to utworzy³ siê kompleks alergen – znakowane przeciwcia³o, który zostanie

„wy³apany” i unieruchomiony w miejscu odczytu wyników przez przeciwcia³a osadzone na membranie. Interpretacja wyniku polega na wizualnej ocenie pozwalaj¹cej stwierdziæ obecnoœæ lub brak danego alergenu lub ewentualnie na stwier- dzeniu, czy oznaczony alergen wystêpuje poni¿ej/powy¿ej okreœlonej iloœci.

W sk³ad szybkiego zestawu immunochromatograficznego wchodz¹ fiolki reakcyjne zwieraj¹ce znakowane przeciwcia³a w postaci suchej; paski testowe – do wykrywania kompleksu antygen – przeciwcia³o; buteleczki z zakraplaczem zawieraj¹ce bufor oraz kontrola pozytywna, czyli zawieraj¹ca badany alergen.

Wykonanie oznaczenia polega na pobieraniu wymazu przy u¿yciu czystej bawe³nianej wymazówki zwil¿onej w buforze, np. PBS-Tween z badanej powierzchni. Nastêpnie przygotowuje siê roztwór próby badanej poprzez przenie- sienie próbki z wymazówki do okreœlonej objêtoœci buforu np. PBS-Tween. Do analizy pobiera siê okreœlon¹ iloœæ przygotowanej próbki oraz buforu i przenosi siê je do fiolki reakcyjnej i dobrze miesza. Nastêpnie zanurza siê w otrzymanym roztworze pasek testowy i po okreœlonym czasie, najczêœciej po 5 minutach odczytuje siê wynik. Interpretacja wyniku sprowadza siê do wizualnej oceny pojawiaj¹cych siê na teœcie pasków. W polu reakcyjnym paska mog¹ siê pojawiæ 1 lub 2 kolorowe pr¹¿ki. Pr¹¿ek po³o¿ony wy¿ej to pr¹¿ek kontrolny, œwiadcz¹cy o prawid³owym wykonaniu testu. Pr¹¿ek po³o¿ony ni¿ej jest pr¹¿kiem testowym.

Pojawienie siê obu pr¹¿ków interpretuje siê jako wynik pozytywny wskazuj¹cy

(8)

na obecnoœæ alergenu w próbce. Obecnoœæ pr¹¿ka kontrolnego interpretuje siê jako wynik negatywny. Przeprowadzenie analizy zabiera od 3 do 15 minut.

Dipstick test dzia³a na podobnej zasadzie jak szybkie testy LFA z t¹ ró¿nic¹,

¿e nie ma fazy poruszaj¹cej siê wzd³u¿ paska. Pasek, którego koñcówka pokryta jest specjaln¹ membran¹ zanurza i inkubuje siê przez okreœlony czas w roztworze badanej próby oraz kolejnych roztworach reakcyjnych. Czas analizy z u¿yciem testu dipstick waha siê od 10 minut do 3 godzin i zale¿y od liczby koniecznych inkubacji i czasu ich trwania [Schubert-Urllich i in. 2009].

Immunochromatograficzne testy typu LFA swój pocz¹tek mia³y w latach 80.

ubieg³ego wieku, gdy Leuvering i in. [1980] zaproponowali tego typu rozwi¹zanie do oznaczania gonadotropiny kosmówkowej (HCG) dla wykrycia ci¹¿y. Pierwszy opracowany test typu LFA dla wykrywania alergenów w ¿ywno- œci, tj. orzeszków ziemnych na podstawie wykrywania bia³ka konarachiny przed- stawia³ Mills i in. [1997]. W ostatnim czasie znacznie zwiêkszy³a siê liczba komercyjnie dostêpnych szybkich testów immunochromatograficznych typu LFA i pasków zanurzeniowych do wykrywania alergenów [Schubert-Ullrich i in.

2009]. W 2003 roku dostêpne w handlu by³y tylko dwa testy. Obecnie mo¿liwy jest zakup zestawów do oznaczenia m.in. orzecha migda³owego, brazylijskiego, nerkowca, kokosowego, pistacjowego, ziemnego, sezamu, mleka, musztardy [www.fabimex.com.pl/oferta] oraz orzecha laskowego, skorupiaków, jaj i kaze- iny [www.nuscana.pl] z limitem detekcji miêdzy 1 i 25 mg alergenu na kg badanego produktu.

Testy immunochromatograficzne s¹ bardzo szybkie, porêczne i nie wymagaj¹ technicznych umiejêtnoœci w przeprowadzeniu analizy. Testy te stanowi¹ nie- drogi sposób skriningu ¿ywnoœci i otoczenia produkcyjnego bez potrzeby posiadania aparatury, tzn. czytnika spektrofotometrycznego p³ytek, jak to ma miejsce w przypadku testów ELISA. W przemyœle spo¿ywczym znalaz³y zastosowanie do jakoœciowego i iloœciowego wykrywania obecnoœci alergenów w próbkach

¿ywnoœci i na liniach produkcyjnych. S¹ one wykorzystywane w zak³adach produkuj¹cych ¿ywnoœæ, posiadaj¹cych tzw. plan monitoringu alergenów w celu unikniêcia krzy¿owego zanieczyszczenia ¿ywnoœci tzw. ukrytymi alergenami.

Testy tego typu s¹ równie¿ rutynowo stosowane do detekcji ¿ywnoœci genetycznie modyfikowanej, dodatków GM oraz oznaczania mikotoksyny w surowcach i gotowych produktach spo¿ywczych [Linkiewicz, Wiœniewska i Sowa 2006;

www.fabimex. com.pl/oferta; www.nuscana.pl].

1.3. Zalety i ograniczenia metod immunologicznych

Wœród zalet metod immunologicznych nale¿y podkreœliæ ich wysok¹ czu³oœæ.

Wiêkszoœæ komercyjnych testów ELISA i LFA posiada limity detekcji rzêdu 1–2,5 mg/kg, a limit oznaczeñ iloœciowych ok. 5 mg/kg badanego produktu.

(9)

Z punktu widzenia ochrony zdrowia konsumentów wra¿liwych na alergeny pokarmowe czu³oœæ obecnie dostêpnych w handlu testów typu ELISA i LFA wy- krywa sk³adniki alergenne w iloœci równej dawkom progowym, co pozwala chro- niæ prawdopodobnie wiêkszoœæ konsumentów cierpi¹cych na alergie pokarmowe [Taylor i Hefle 2005].

Metody immunologiczne wykrywania alergenów ¿ywnoœci s¹ stosunkowo

³atwe do przeprowadzenia. Testy ELISA zosta³y na potrzeby przemys³u spo¿ywczego zaadoptowane w przyjaznych formatach, takich jak paski testowe i wyma- zówki. Mo¿liwoœæ prowadzenia analizy i otrzymania wyniku poza laboratorium jest szczególnym udogodnieniem w kontroli produkcji ¿ywnoœci.

Wyniki uzyskiwane za pomoc¹ metody ELISA s¹ odtwarzalne, zw³aszcza gdy s¹ prowadzone z wykorzystaniem tego samego rodzaju zestawów analitycznych.

Ró¿nice w wynikach mog¹ siê pojawiæ, gdy stosowane s¹ testy ró¿nych produ- centów. Rozbie¿noœci s¹ konsekwencj¹ zarówno u¿ytego w teœcie przeciwcia³a, jak i sposobu jego kalibracji [Taylor i Hefle 2005].

Do g³ównych ograniczeñ metod immunometrycznych wynikaj¹cych z braku separacji oznaczanych bia³ek jest mo¿liwoœæ wyst¹pienia reakcji krzy¿owych z innymi alergenami lub sk³adnikami produktu, w którym alergen jest oznaczany.

W takiej niekorzystnej sytuacji mo¿e dojœæ do uzyskania fa³szywie dodatniego wyniku, np. gdy oznaczane s¹ alergeny ró¿nych spokrewnionych gatunków, np.

orzechów lub ryb [van Hengel 2007]. Poniewa¿ zasada metody ELISA opiera siê na reakcji rozpoznania przez przeciwcia³o wychwyconego z próby bia³ka, to w produktach, w których mog³o dojœæ do zmian fizykochemicznych w obrêbie epitopu, mo¿e nast¹piæ zani¿enie wyniku testu ELISA. Natomiast zmiany te nie musz¹ byæ jednoznaczne z obni¿eniem alergennoœci danego sk³adnika alergennego [Taylor i in. 2009]. St¹d testy ELISA maj¹ ograniczone zastosowanie do oceny produktów, w których oznaczane bia³ko mog³o ulec hydrolizie lub proteo- lizie, tj. np. w produktach fermentowanych czy uzyskanych z udzia³em kultur probiotycznych. Fa³szywie negatywne wyniki mog¹ byæ determinowane wie- loma czynnikami pochodz¹cymi z matrycy, w której oznaczany jest antygen.

Sk³adniki matrycy mog¹ hamowaæ reakcjê tworzenia kompleksu antygen – przeciwcia³o lub reagowaæ z epitopem oznaczanego bia³ka. Mog¹ te¿ zak³ócaæ przebieg reakcji enzymatycznej i odczyt wyniku, zw³aszcza gdy koñcowy etap opiera siê na obserwacji odpowiedniego zabarwienia. Przyk³adem jest oznaczanie testem ELISA w czerwonym winie alergennych bia³ek jaja kurzego i mleka u¿y- wanych do klarowania wina [Weber, Steinhart i Paschke 2007]. Rodzaj matrycy determinuje równie¿ wydajnoœæ ekstrakcji oznaczanego bia³ka. W czasie prze- twarzania produktu mo¿e dojœæ do zmniejszenia rozpuszczalnoœci bia³ek na skutek zmiany pH, temperatury, procesów fizycznych, chemicznej modyfikacji czy agregacji. Rodzaj matrycy warunkuje równie¿ postaæ i rozmieszczenie sk³adni- ków alergennych w produkcie (produkty jednorodne, np. napoje, m¹ka, pasty, lub

(10)

niejednorodne, np. sa³atki, ciastka z bakaliami). Wynik analizy bêdzie uzale¿nio- ny od reprezentatywnego poboru prób.

1.4. Biosensory

Rozwijaj¹c¹ siê technologi¹ w analizie alergenów pokarmowych jest wykorzystanie biosensorów. Biosensory daj¹ mo¿liwoœæ szybkiej i czu³ej detekcji analitu dziêki zastosowaniu biocz¹steczek w po³¹czeniu z czu³ymi przetwornikami fizykochemicznymi (por. opracowanie M. Tichoniuka oraz J. Jasnowskiej-Ma³eckiej i M. Filipiaka w tym wydaniu Zeszytów Naukowych). Biocz¹steczka pe³ni¹ca rolê detektora jest odpowiedzialna za selektywne po³¹czenie siê z analitem. Bio- sensory przeznaczone do oznaczania alergenów jako biocz¹steczki mog¹ wyko- rzystywaæ przeciwcia³a reaguj¹ca z danym alergentem, b¹dŸ pojedyncze nici DNA zdolne do hybrydyzacji z fragmentami DNA specyficznymi dla danych alergenów. Detekcjê reakcji wychwycenia analitu przeprowadza siê z wykorzystaniem takich technik fizykochemicznych, jak m.in. pomiar rezonansu plazmo- nów powierzchniowych (ang. surface plasmon resonance, SPR) [Homola 2008], badanie zaniku fluorescencji czy zmiany opornoœci [Huang, Bell i Suni 2008].

Znaczna wiêkszoœæ zaproponowanych biosensorów do oznaczania alergenów pokarmowych opiera siê na pomiarze rezonansu plazmonów powierzchniowych [Jonsson i Hellenas 2001; Mohammed i in. 2001; Yman i in. 2006; Homola 2008]. Jest to g³ównie zwi¹zane z handlow¹ dostêpnoœci¹ specjalnych platform SPR oferowanych m.in. przez firmy Biacore Q, GE Helthcare and Spectra, Texas Instruments, nLab. Zjawisko SPR ma miejsce na granicy dwóch oœrodków o ró¿- nej gêstoœci optycznej, podczas zjawiska ca³kowitego wewnêtrznego odbicia.

W praktyce najlepszy efekt SPR uzyskano poprzez wprowadzenie na granicê oœrodków metalu, tj. poprzez napylenie warstewki z³ota na np. szklany dysk. Tak zmodyfikowana granica oœrodków czu³a jest na zmiany wartoœci sta³ej dielek- trycznej oœrodka optycznie rzadszego, a przez to i na zmianê masy przy powierzchni granicznej. Umo¿liwia to badanie zjawisk zachodz¹cych na powierzchni oraz w przylegaj¹cej warstwie roztworu o gruboœci ok. 300–400 nm [www.lkb.pl, www.nlab.pl/spr.html]. Dziêki pomiarowi zmiany wspó³czynnika refrakcji lub k¹ta rezonansu mo¿na w czasie rzeczywistym monitorowaæ procesy

³¹czenia siê bia³ek z przeciwcia³ami czy obserwowaæ hybrydyzacjê fragmentów DNA. Dodatkowa zalet¹ metody jest mo¿liwoœæ rezygnacji z nieobojêtnych dla zdrowia znaczników fluorescencyjnych czy radioaktywnych [Schubert-Ullrich i in. 2009].

Atrakcyjnoœæ zastosowania biosensorów w przemyœle spo¿ywczym wi¹¿e siê z ich wysok¹ czu³oœci¹, prostot¹ przeprowadzenia analizy i wysokim stopniem miniaturyzacji i automatyzacji procesu analitycznego [Kress-Rogers 2001;

Suzuki i in. 2001]. Kilka tego typu urz¹dzeñ znalaz³o ju¿ zastosowanie w prze-

(11)

myœle spo¿ywczym, jednak, jeœli chodzi o wykrywanie alergenów, s¹ to na chwi- lê obecn¹ rozwi¹zania na etapie prac badawczych. Przyk³adem s¹ biosensory do oznaczania bia³ek orzeszków ziemnych [Mohammed i in. 2001; Huang, Bell i Suni 2008], mleka [Dupont i Muller-Renaud 2006; Indyk, Filonzi i Gapper 2006], jajek [Maier i in. 2008], skorupiaków, sezamu [Yman i in. 2006], orze- chów laskowych [Yman i in. 2006; Brehmer, Smits i Haashoot 2009]. Czu³oœæ przedstawionych urz¹dzeñ jest porównywalna z tradycyjnymi testami ELISA i mieœci siê w przedziale od 1 do 10 mg/kg.

2. Metody oparte na analizie DNA

Wiêkszoœæ metod oznaczania sk³adników alergennych w ¿ywnoœci oparta jest na wykrywaniu bia³ek bêd¹cych bezpoœredni¹ przyczyn¹ alergii pokarmowych.

Alternatyw¹ mog¹ byæ metody pozwalaj¹ce na wykrycie alergennego materia³u na podstawie obecnoœci charakterystycznych fragmentów DNA. Metody umo¿liwiaj¹ce wykrycie fragmentów DNA stanowi¹cych markery obecnoœci alergen- nych sk³adników opieraj¹ siê na ³añcuchowej reakcji polimerazy (ang. polime- rase chain reaction, PCR). Podstaw¹ techniki PCR jest amplifikacja (powielenie) zdefiniowanych sekwencji DNA przy u¿yciu enzymu polimerazy DNA (por.

opracowanie M. Ligaj, S. Sacharowskiego oraz B. Rogoziñskiego w tym wydaniu Zeszytów Naukowych). Specyficznoœæ reakcji uzyskuje siê dziêki dwóm starterom, które warunkuj¹ amplifikacjê szukanych fragmentów DNA wyizolowanych z ¿ywnoœci. S¹ to syntetyczne oligonukleotydy, które projektuje siê w taki sposób, by by³y komplementarne do fragmentów matrycy DNA znajduj¹cych siê na obu koñcach wykrywanego genu. Po³¹czenie siê starterów z matryc¹ DNA i utworzenie odcinków dwuniciowych jest warunkiem koniecz- nym reakcji polimerazy. Czu³oœæ reakcji pozwala amplifikowaæ DNA pojedyn- czych genów ponad miliard razy mimo obecnoœci innych sekwencji. Mieszanina reakcyjna zawiera matrycê DNA, parê starterów komplementarnych do matrycy DNA i ograniczaj¹cych d³ugoœæ syntetyzowanego ³añcucha, trifosforany deoksy- rybonukleozydów (dNTP) bêd¹ce substratami reakcji oraz dostarczaj¹ce energii do jej przebiegu, bufor stanowi¹cy œrodowisko reakcji oraz jony magnezu Mg²⁺

bêd¹ce aktywatorami polimerazy [S³omski 2008]. Zalet¹ tej metody jest fakt, i¿

reakcja PCR zachodzi w ma³ej objêtoœci mieszaniny reakcyjnej (5–20 ìl) znajduj¹cej siê w jednej probówce umieszczonej w termocyklerze. Termocykler jest urz¹dzeniem umo¿liwiaj¹cym zajœcie kolejnych cykli reakcji enzymatycznej poprzez zapewnienie ustalonych temperatur w zadanych interwa³ach czasowych.

Ka¿dy cykl reakcji trwa zaledwie kilka minut i obejmuje trzy etapy. Na pocz¹tku jest to denaturacja matrycy badanego DNA (w temperaturze ok. 90–95^oC), nastêpnie w temperaturze 50–65^oC do powsta³ych jednoniciowych fragmentów

(12)

DNA przy³¹czaj¹ siê startery (ang. anealing) i w ostatnim etapie polimeraza kata- lizuje syntezê nowych nici na matrycy (tzw. elongacja) (w temperaturze 68–

–72^oC). Reakcja PCR obejmuje zwykle 30–45 powtarzaj¹cych siê cykli.

W ka¿dym cyklu nastêpuje podwojenie matrycy, czyli po 30 cyklach liczba kopii DNA powinna przekraczaæ miliard (2³⁰= 1 073 741 824).

Pe³na analiza obejmuje ekstrakcjê DNA z badanego materia³u (czas ok. 2 godzin) i jego powielenie w termocyklerze (ok. 1 godziny). Przy technice PCR konieczne jest potwierdzenie obecnoœci produktów amplifikacji, które trwa od kilkudziesiêciu minut (metod¹ ELISA) do kilku godzin (sekwencjonowanie).

Najczêœciej sprawdzenie wyniku reakcji PCR (wykrycie obecnoœci powielo- nego fragmentu DNA) dokonuje siê za pomoc¹ wizualizacji amplifikonów⁶roz- dzielonych w czasie elektroforezy w ¿elu poliakrylamidowym lub agarozowym lub wykrycia ich za pomoc¹ testu ELISA [Holzhauser, Stephan i Vileths 2002].

W celu jakoœciowej identyfikacji powielonych fragmentów DNA stosuje siê ana- lizê miejsc restrykcyjnych, sekwencjonowanie DNA, hybrydyzacjê z sondami DNA lub z sondami PNA [Germini i in. 2005; van Hengel 2007]. W zale¿noœci od oczekiwanych rezultatów analitycznych istniej¹ bardzo ró¿ne odmiany i modyfikacje reakcji PCR. Znaczne skrócenie czasu analizy iloœciowej mo¿na osi¹gn¹æ, stosuj¹c technikê PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR).

Rozwi¹zanie to wymaga jednak posiadania odpowiedniego zaplecza laboratoryjnego [Monaci i Visconti 2010].

Do tej pory metody oparte na reakcji PCR znalaz³y zastosowanie w analizie

¿ywnoœci g³ównie do wykrywania ska¿enia mikrobiologicznego, genetycznych modyfikacji oraz wykrywania jej zafa³szowañ np. wykrywanie dodatku mleka krowiego w serach kozich, identyfikacji przynale¿noœci gatunkowej miêsa i jego przetworów [Reid, O’Donnell i Downey 2006; Fajardo i in. 2010]. Obecnie obserwuje siê wprowadzanie na rynek zestawów PCR do jakoœciowego i iloœcio- wego oznaczania genów alergenów w ¿ywnoœci.

Oznaczanie obecnoœci okreœlonych sekwencji DNA jako markerów alergenów wzbudza jednak wiele kontrowersji, poniewa¿ zale¿noœæ pomiêdzy obecnoœci¹ genów a szukanym bia³kiem w próbce nie jest sta³a i jednoznaczna. Zale¿noœæ ta mo¿e byæ zak³ócona przez przynajmniej cztery przyczyny. Po pierwsze, ekspresja alergenu mog³a byæ zak³ócona przez czynniki œrodowiskowe. Po drugie, procesy technologiczne stosowane podczas produkcji ¿ywnoœci w ró¿ny sposób i w ró¿- nym stopniu wp³ywaj¹ na degradacjê bia³ek i kwasów nukleinowych [Stephan i Vieths 2004]. Po trzecie, izolaty bia³kowe, czy frakcje bia³kowe wykorzystywane w procesie produkcyjnym mog¹ nie zawieraæ DNA. I wreszcie wykrywalnoœæ DNA i bia³ek mo¿e byæ zak³ócona przez obecnoœæ ró¿norodnych sk³adników znajduj¹cych siê w badanej próbce [Popping, Diaz-Amigo i Hoenicke 2009].

6Amplikon to fragment DNA powstaj¹cy w wyniku amplifikacji; tu: produkt reakcji PCR.

(13)

Przeprowadzone do tej pory badania porównuj¹ce metody ELISA i PCR dla tych samych alergenów oznaczanych w ró¿nych produktach wskazuj¹ generalnie na zadowalaj¹c¹ korelacjê i wskazuj¹ na porównywaln¹ czu³oœæ obu metod [Holzhauer, Stephan i Vieths 2002; Stephan i Vieths 2004; Bettazzi i in. 2008;

Demmel i in. 2008]. S¹ równie¿ prace wskazuj¹ce na wy¿sz¹ czu³oœæ metod PCR od metody ELISA [Kõppel i in. 1998]. Testy ELISA s¹ zdecydowanie czulsze wobec produktów, które naturalnie zawieraj¹ mniejsze liczby kopii DNA, tj.

mleko i jaja [Popping, Diaz-Amigo i Hoenicke 2009].

Metody wykrywania alergenów oparte na analizie DNA maj¹ wiele zalet w stosunku do metod immunometrycznych. Metody wykorzystuj¹ce przeciwcia³a wymagaj¹ identyfikacji i scharakteryzowania bia³ek alergennych w celu wyprodukowania specyficznych immunoglobulin, a takie informacje nie zawsze s¹ dostêpne. Ponadto produkcja i charakterystyka przeciwcia³ jest stosunkowo d³ugotrwa³a. Nie wszystkie wyhodowane przeciwcia³a, ze wzglêdu na uzyskan¹ czu³oœæ i specyficznoœæ, mog¹ zostaæ wykorzystane do konstrukcji testów. Nato- miast testy oparte na analizie DNA mo¿na opracowywaæ w znacznie krótszym czasie. Daje to mo¿liwoœæ tworzenia narzêdzi analitycznych pozwalaj¹cych pro- ducentom ¿ywnoœci adaptowaæ siê do zmieniaj¹cych siê przepisów prawnych zwi¹zanych z w³¹czaniem do obowi¹zkowego znakowania coraz wiêkszej grupy alergenów. Ponadto metody oparte na analizie DNA stwarzaj¹ mo¿liwoœæ otrzymania wysokiego stopnia specyficznoœci wykrywanych markerów podczas analizy produktów spo¿ywczych o wysokim stopniu podobieñstwa gatunkowego, jak w przypadku mieszanek orzechów, ryb czy skorupiaków, co jest trudne w przypadku metod immunologicznych [Pafundo, Gull i Marmiroli 2010; Pop- ping, Diaz-Amigo i Hoenicke 2009].

Konstrukcja metod opartych na analizie DNA wymaga oznaczenia sekwencji genów koduj¹cych dane alergeny oraz wi¹¿e siê z wyborem odpowiednich starte- rów reakcji polimerazy. Startery wp³ywaj¹ zarówno na czu³oœæ, jak i specyficz- noœæ metody. Podkreœliæ trzeba jednak fakt, ¿e specyficznoœæ metody jest ele- mentem nadrzêdnym, poniewa¿ pojawienie siê w reakcji niespecyficznych produktów amplifikacji (o takiej samej liczbie zasad) mo¿e prowadziæ do wyni- ków fa³szywie pozytywnych. Z drugiej strony odpowiednie zaprojektowanie starterów (np. w technice multiplex PCR) daje mo¿liwoœæ jednoczesnego wykrycia wielu genów koduj¹cych alergenne bia³ka [Mustrop i in. 2008; Monaci i Visconti 2010; Pafundo, Guli i Marmiroli 2010], co pozwala na zaoszczêdzenie czasu, kosztów i eliminacjê ryzyka krzy¿owych zanieczyszczeñ prób.

W handlu obecnie dostêpne s¹ testy typu PCR – ELISA do jakoœciowego oznaczania genu m.in. migda³a, soi, orzecha laskowego i ziemnego lub testy typu real-time PCR do iloœciowego oznaczania genu bia³ek wiêkszoœci alergennych produktów, tj. np. seler, ³ubin, ryby, skorupiaki, miêczaki, sezam, orzech ziemny,

(14)

soja, orzechy (tj. laskowy, w³oski migda³y, pistacja, nerkowiec), gorczyca [www.

r-biopharm.com/product_site.php; www.nuscana.pl].

3. Metody oparte na spektroskopii mas (MS)

Jednym z g³ównych ograniczeñ metod biologicznych jest mo¿liwoœæ wyst¹pienia zanieczyszczeñ krzy¿owych, które bêd¹ skutkowa³y fa³szywie pozytywnym wynikiem. Rozwi¹zanie tego problemu mo¿na osi¹gn¹æ poprzez wykorzystanie do oznaczania biologicznie aktywnych peptydów i bia³ek w ¿ywnoœci spektome- trii mas (ang. mass spectrometry, MS). Spektrometria mas jest uniwersaln¹ tech- nik¹ analityczn¹ pozwalaj¹c¹ na jednoznaczn¹ identyfikacjê zwi¹zków na podstawie analizy stosunku ich masy do ich ³adunku elektrycznego. Efekt ten uzyskuje siê poprzez jonizacjê cz¹steczek lub atomów, a nastêpnie detekcjê liczby powstaj¹cych jonów i okreœlenie stosunku ich masy do ³adunku (m/z).

Wyniki dzia³ania spektrometru mas s¹ przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.

W proteomice do okreœlania sekwencji aminokwasowej peptydów u¿ywa siê zwykle tandemowych spektrometrów mas (MS/MS, MS²). S¹ to spektrometry mas wyposa¿one w dwa analizatory. Pierwszy analizator pozwala na przejœcie tylko jonów o okreœlonym stosunku masy do ³adunku elektrycznego (jony macie- rzyste). Za pierwszym analizatorem zwykle znajduje siê urz¹dzenie pozwalaj¹ce na fragmentacjê badanych jonów (np. przez zderzenia z cz¹steczkami gazu obo- jêtnego). W ten sposób z jonu macierzystego powstaj¹ jony potomne. Drugi analizator takiego spektrometru rejestruje stosunki mas do ³adunków jonów potom- nych (widmo masowe).

Identyfikacja i iloœciowe oznaczenie bia³ek i biologicznie czynnych pepty- dów odbywa siê na podstawie porównania widm mas tych cz¹steczek z inten- sywnoœci¹ widm MS wzorców lub informacjami zawartymi w bazach danych⁷ przeszukiwanych za pomoc¹ specjalnych programów [Kirsch i in. 2009; Monaci i Visconti 2009, 2010]. Wykorzystywane do analizy wzorce powinny charaktery- zowaæ siê w³aœciwoœciami fizykochemicznymi podobnymi do analitu. Za najlep- sze wzorce uznaje siê oznaczane bia³ka znakowane izotopowo, poniewa¿ cechuj¹ siê one przybli¿onym odzyskiem z ekstrakcji, czasem elucji podczas rozdzia³u chromatograficznego, reakcj¹ na jonizacjê oraz widmem. W praktyce dodaje siê sta³¹ znan¹ iloœæ wzorca do próbki. Zale¿noœæ sygna³u analitu i wzorca wew- nêtrznego w funkcji stê¿enia analitu wykorzystuje siê do oznaczeñ iloœciowych [Czerwenka i in. 2007; Kirsch i in. 2009].

7Najczêœciej wykorzystywanymi bazami danych s¹np. SDAP, PROTALL, BIFS, FARP, CSL, SWISS-PORT, ALLALLERGY.

(15)

W analizie alergennych bia³ek stosuje siê dwa zasadnicze podejœcia wyboru formy analitu. W pierwszym, identyfikowany analit, w tym wzorzec, to nienaru- szone, wyekstrahowane z próby bia³ka, ewentualnie poddane wstêpnemu frak- cjonowaniu. Drugie podejœcie polega na analizowaniu peptydów uzyskanych z proteolitycznego trawienia (np. trypsyn¹) wyizolowanych bia³ek. Podejœcie drugie dodatkowo wymaga rozdzia³u otrzymanych peptydów [Monaci i Visconti 2009]. Rozdzia³ bia³ek i peptydów przeprowadza siê zwykle za pomoc¹ chromatografii cieczowej, wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz elektroforezy kapilarnej [Czerwenka i in. 2007; Sancho i Mills 2010].

Zalet¹ tych uniwersalnych metod analitycznych jest mo¿liwoœæ oznaczenia alergennych bia³ek niezale¿nie od zmiany epitopu czy struktury przestrzennej bia³ka wywo³anej np. termicznym procesem obróbki produktu spo¿ywczego.

Fizykochemiczne metody analizy zwi¹zków oparte na spektroskopii mas s¹ wysoce zaawansowane technologicznie, wymagaj¹ wykwalifikowanego personelu oraz bardzo kosztownej aparatury. Zaawansowanie prac badawczych nad wykorzystaniem metod opartych na spektrometrii mas do jakoœciowej i iloœcio- wej analizy bia³kowych alergenów pokarmowych przedstawiono w pracy przeg- l¹dowej Monaci i Visconti [2009].

Zakoñczenie

Na skutek wejœcia w ¿ycie dyrektywy unijnej dotycz¹cej obowi¹zkowego znakowania ¿ywnoœci paczkowanej na obecnoœæ alergenów znacznie wzros³o zaintere- sowanie szybkimi i wiarygodnymi metodami oznaczania tych zwi¹zków w ¿yw- noœci i otoczeniu produkcyjnym. W ostatnich piêciu latach rynek zestawów do szybkiego oznaczania alergenów pokarmowych znacznie siê rozwin¹³. Dostêpne testy oparte s¹ zarówno na rozwi¹zaniach immunometrycznych, jak i na analizie DNA.

Metody immunometryczne typu ELISA i LFA umo¿liwiaj¹ szybkie, czu³e wykrycie bia³ek bêd¹cych bezpoœredni¹ przyczyn¹ reakcji alergennych. S¹ ³atwe do przeprowadzenia i nie wymagaj¹ stosowania skomplikowanej aparatury ani niebezpiecznych dla zdrowia odczynników. Wystêpuj¹ w przyjaznych dla u¿yt- kownika formach paseczków testowych i wymazówek. Pozwalaj¹ na przeprowadzenie analizy poza laboratorium, co stanowi znaczne udogodnienie w kontroli procesu produkcyjnego. S¹ wykorzystywane do oznaczania iloœciowego alerge- nów w produktach rolno-spo¿ywczych, jak i wykrywania ich w œrodowisku produkcyjnym. Wynik analizy uzyskiwany jest w krótkim czasie (poni¿ej 60 min w przypadku p³ytkowych testów ELISA, a po ok. 10 min dla pasków testowych typu LFA). Metody te charakteryzuj¹ siê limitem detekcji w przedziale od 1–25 ppm. Koszt jednego paska testowego typu LFA do szybkiego wizualnego

(16)

sprawdzania czystoœci powierzchni pod k¹tem pozosta³oœci alergenu oraz jego wykrywania w próbkach to obecnie kwota ok. 48 z³ [www.fabimex.com.pl/

/oferta]. Oznaczenie iloœciowe danego alergenu metod¹ ELISA jest kilkakrotnie dro¿sze, oprócz zestawu odczynników wymaga posiadania odpowiedniego czytnika p³ytek. Koszt zleconego oznaczenia metod¹ ELISA jednego alergenu w jednej próbie w akredytowanym laboratorium wynosi ok. 500 z³ [www.nuscana.pl].

Wyniki testów immunometrycznych charakteryzuj¹ siê wysok¹ odtwarzalno- œci¹. Mo¿liwoœæ zajœcia reakcji krzy¿owych prowadz¹cych do fa³szywie pozytywnych wyników zosta³a znacznie zredukowana [Schubert-Ullrich i in. 2009].

Uzyskane wyniki ró¿ni¹ siê w przypadku stosowania testów ró¿nych producen- tów. Zale¿nie od rodzaju danego zestawu analitycznego otrzymywane wyniki odnosz¹ siê do ca³kowitej zawartoœci bia³ek w produkcie lub pozwalaj¹ na wykrycie konkretnego alergenu.

G³ównym problemem, jaki mo¿na napotkaæ w oznaczaniu alergenów w ¿yw- noœci metodami immunometrycznymi, s¹ trudnoœci wynikaj¹ce z ekstrakcji i/lub rozpuszczalnoœci bia³ek alergennych. Metody te maj¹ ograniczone zastosowanie do produktów przetworzonych, w których mog³o dojœæ do zmian w obrêbie epitopu bia³ka, np. produktów fermentowanych lub posiadaj¹cych sk³adniki wp³y- waj¹ce na przebieg oznaczenia i odczyt wyniku.

Metody oparte na analizie DNA umo¿liwiaj¹ stosunkowo szybkie i bardzo selektywne wykrycie sk³adników alergennych za pomoc¹ technik biologii mole- kularnej (reakcji PCR). Oznaczenie trwa od 2 do kilku godzin zale¿nie od czasu ekstrakcji DNA oraz metody analizy wyniku reakcji PCR. Rozwi¹zanie to wymaga jednak posiadania odpowiedniej aparatury – termocyklera, wykwalifikowanego personelu oraz zaplecza laboratoryjnego. Obecnie koszt zlecenia wykonania oznaczenia danego sk³adnika alergennego w jednej próbie wynosi od 600–800 z³ [www.nuscana.pl; www.fabimex.com.pl/oferta].

Ze wzglêdu na wysok¹ czu³oœæ metody istnieje koniecznoœæ wyeliminowania ryzyka zanieczyszczenia próby na etapie jej przygotowania. Uzyskane wyniki zale¿¹ od jakoœci matrycy DNA wyekstrahowanej z badanej próby. Metoda ma ograniczone zastosowanie do produktów przetworzonych, w których dosz³o do np. mechanicznej, termicznej degradacji DNA. Istnieje równie¿ mo¿liwoœæ wyst¹pienia wyników fa³szywie ujemnych na skutek inhibicji reakcji polimerazy przez niektóre sk³adniki badanego produktu.

Niew¹tpliwie zalet¹ reakcji PCR jest mo¿liwoœæ jednoczesnego wykrywania wielu markerów alergenów w jednej próbie (multiplex PCR) oraz analizowania wielu prób w czasie jednego oznaczenia⁸. Informacje uzyskane z reakcji PCR mog¹ pos³u¿yæ do skriningu produktów, przestrzeni produkcyjnej i w razie

8Termocyklery, w zale¿noœci od konstrukcji, umo¿liwiaj¹ analizê co najmniej 96 prób jedno- czeœnie.

(17)

koniecznoœci mog¹ byæ potwierdzone za pomoc¹ metod immunologicznych [Schubert-Ullrich i in. 2009; Pafundo, Guli i Marmiroli 2010]. Metody oparte na reakcji PCR s¹ rozwi¹zaniem w przypadku braku metod immunologicznych. Dla potwierdzenia przydatnoœci danej metody do oznaczania okreœlonego alergenu lub jego markera w konkretnym produkcie spo¿ywczym czy próbie œrodowisko- wej, a tym samym zagwarantowania wiarygodnoœci otrzymywanych wyników analitycznych stosowane metody wymagaj¹ walidacji [Poms i in. 2005, van Hen- gel i in. 2006; Monaci i Visconti 2010]. Spoœród dostêpnych na rynku metod detekcji alergenów pokarmowych trzy testy do oznaczania orzeszków ziemnych jako pierwsze otrzyma³y w 2003 roku pozytywn¹ aprobatê AOAC Research Institute. S¹ to: BioKits Peanut Assay Kit oraz Veratox® for Peanut Allergen firmy Neogen oraz RIDASCREEN®FAST Peanut firmy R-Biopharm. W 2006 roku do tej listy do³¹czy³ drugi test firmy R-Biopharm do oznaczania gliadyny (RIDASCREEN® Gliadin) [www.aoac.org/testkits/testedmethods. html]. Pozy- tywne certyfikaty zawieraj¹ wykaz produktów, dla których metoda zosta³a zwali- dowana. Obecnie lista zwalidowanych metod oznaczania alergenów roœnie, ale jest ich stosunkowo ma³o.

Du¿y potencja³ analityczny i mo¿liwoœæ opracowania metody odniesienia

³¹czy siê z wykorzystaniem do badania alergenów pokarmowych spektroskopii mas. Metodyka ta dla oznaczenia sekwencji aminokwasów badanego bia³ka wymaga jednak kosztownej aparatury, profesjonalnej obs³ugi ze wzglêdu na bardzo zaawansowan¹ analizê otrzymanych wyników (widm).

Podsumowuj¹c, mo¿na stwierdziæ, ¿e dziêki takim zaletom metod biologicznych do oznaczania alergenów w ¿ywnoœci, jak wysoka czu³oœæ, prostota wykonania, szybkoœæ uzyskania wyniku, bezpieczeñstwo u¿ywanych reagentów, metody te stanowi¹ cenne narzêdzie analityczne do kontroli surowców, produk- tów i procesu produkcyjnego.

Bibliografia

Bettazzi, F., Lucarelli, F., Palchetti I., Berti, F., Marrazza, G., Mascini M., 2008, Dispos- able Electrochemical DNA-array for PCR Amplified Detection of Hazelnut Allergens in Foodstuffs, Analytica Chimica Acta, vol. 614, s. 93–102.

Brehmer, M.G.E.G., Smits, N.G.E., Haasnoot, W., 2009, Biosensor Immunoassay for Traces of Hazelnut Protein in Olive Oil, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol.

395, s. 119–126.

Czerwenka, C., Maier, I., Potocnik, N., Pittner, F., Lindner, W., 2007, Absolute Quantita- tion of beta-Lactoglobulin by Protein Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

(18)

and Its Application to Different Milk Products, Analytical Chemistry, vol. 79, s.

5165–5172.

Dahinden, I., von Büren, M., Lüthy, J., 2001, A Quantitative Competitive PCR System to Detect Contamination of Wheat, Barley or Rye in Gluten-free Food for Coeliac Patients, European Food Research and Technology, vol. 212, s. 228–233.

Demmel, A., Hupfer, C., Hampe, E.I., Busch, U., Engel, K., 2008, Development of a Real-time PCR for the Detection of Lupine DNA (Lupinus Species) in Foods, Jour- nal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, s. 4328–4332.

Dupont, D., Muller-Renaud, S., 2006, Quantification of Proteins in Dairy Products Using an Optical Biosensor Journal of AOAC International, vol. 89, s. 843–848.

Dyrektywa Komisji 2007/68/WE z dnia 27 listopada 2007 roku zmieniaj¹ca za³¹cznik IIIa do dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, zawieraj¹cy wykaz sk³adników, które nale¿y obowi¹zkowo umieœciæ na etykietach œrodków spo¿ywczych, Dz.U. UE L 310/11.

Dz.U. nr 137, poz. 966, Rozporz¹dzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju wsi z dnia 10 lipca 2007 roku w sprawie znakowania œrodków spo¿ywczych.

Fajardo, V., González, I., Rojas, M., García, T., Martín, R., 2010, A Review of Current PCR-based Methodologies for the Authentication of Meats from Game Animal Spe- cies, Trends in Food Science & Technology, vol. 21, s. 408–421.

Fremont, S., Kanny, G., Bieber, S., Nicolas, J.P., Moneret-Vautrin, D.A., 1996, Identifi- cation of a Masked Allergen, Alphalactalbumin, in Baby-food Cereal Flour Guaran- teed Free of Cow’s Milk Protein, Allergy, vol. 51, s. 749–754.

Germini, A., Scaravelli, E., Lesignoli, F., Sforza, S., Corradini, R., Marchelli, R., 2005 Polymerase Chain Reaction Coupled with Peptide Nucleic Acid High-performance Liquid Chromatography for the Sensitive Detection of Traces of Potentially Aller- genic Hazelnut in Foodstuffs, European Food Research Technology, vol. 220, s. 619–624.

Holzhauser, T., Stephan, O., Vieths, S., 2002, Detection of Potentially Allergenic Hazel- nut (Corylus avellana) Residues in Food: a Comparative Study with DNA PCR-ELISA and Protein Sandwich-ELISA, Journal of Agricultural and Food Chemis- try, vol. 50, s. 5808–5815

Homola, J., 2008, Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and Biological Species, Chemical Reviews, vol. 108, s. 462–493.

Huang, Y., Bell, M.C., Suni, I.I., 2008, Impedance Biosensor for Peanut Protein Ara h 1, Analytical Chemistry, vol. 80, s. 9157–9161.

Indyk, H.E., Filonzi, E.L., Gapper, L.W., 2006, Determination of Minor Proteins of Bovine Milk and Colostrum by Optical Biosensor Analysis, Journal of AOAC Inter- national, vol. 89, s. 898–902.

Jêdrychowski, L., Wróblewska, B., 2009, Nietolerancja pokarmowa bia³ek roœlinnych – aspekty zdrowotne i ¿ywieniowe, w: Dziuba, J., Fornal, £. (red.), Biologicznie aktywne peptydy i bia³ka ¿ywnoœci, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, s. 271–369.

Johansson, S.G.O., Hourihane, J.O’B., Bousquet, J., Bruijnzeel-Koomen, C., Dreborg, S., Haahtela, T., Kowalski, M.L., Mygind, N., Ring, J., Van Cauwenberge, P., Van Hage-Hamsten, M., Wüthrich B., 2001, Position Paper. A Revised Nomenclature for

(19)

Allergy. An EAACI Position Statement from the EAACI Nomenclature Task Force, Allergy, vol. 56, s. 813–824.

Jonsson, H., Hellenas, K.E. 2001, Optimizing Assay Conditions in the Detection of Food Allergens with Biacore’s SPR Technology, Biacore Journal, vol. 2, s. 16–18.

Kirsch, S., Fourdrilis, S., Dobson, R., Scippo, M.L., Maghuin-Rogister, G., De Pauw, E., 2009, Quantitative Methods for Food Allergens: a Review, Analytical and Bioanaly- tical Chemistry, vol. 395, s. 57–67.

Köppel, E., Stadler, M., Lüthy, J., Hübner, P., 1998, Detection of Wheat Contamination in Oats by Polymerase Chain Reaction (PCR) and Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und Forschung A, vol. 206, s. 399–403.

Koppelman, S.J., Knulst, A.C., Koers, W.J., Penninks, A.H., Peppelman, H., Vlooswijk, R., Pigmans, I., van Duijn, G., Hessing, M., 1999, Comparison of Different Immuno- chemical Methods for the Detection and Quantification of Hazelnut Proteins in Food Products, Journal of Immunological Methods, vol. 229, s. 107.

Kress-Rogers, E., 2001, Instrumentation for food quality assurance, w: Kress-Rogers, E., Brimelow, C.J.B., Instrumentation and Sensors for the Food Industry, Woodhead Publishing Limited, 2001, s. 1–24.

Leuvering, J.H.W., Thal, P.I.H.M., van der Waart, M., Schuurs, A.H.W.M., 1980, Sol particle immunoassay (SPIA), J Immunoassay, vol. 1, s. 77–91.

Linkiewicz, A., Wiœniewska, I., Sowa, S., 2006, Molekularne metody wykrywania i identyfikacji organizmów genetycznie zmodyfikowanych (GMO), Biotechnologia, vol. 74, s. 44–53.

Maier, I., Morgan, M.R., Lindner, W., Pittner, F., 2008, Optical Resonance-Enhanced Absorption-Based Near-Field Immunochip Biosensor for Allergen Detection, Ana- lytical Chemistry, vol. 80, s. 2694–2703.

Malmheden Yman, I., Eriksson, A., Everitt, G., Yman, L., Karlsson, T., 1994, Analysis of Food Proteins for Verification of Contamination or Mislabeling, Food and Agricul- tural Immunology, vol. 6, s. 167–172.

Mills, E.N.C., Mackie, A.R., Burney, P., Beyer, K., Frewer, L., Madsen, C., Botjes, E., Crevel, R.W.R., Van Ree, R., 2007, The Prevalence, Cost and Basis of Food Allergy Across Europe, Allergy, vol. 62, s. 717–722.

Mills, E.N.C., Jenkins, J.A., Alcocer, M.J.C., Sherry, P.R., 2004, Structural, Biological, and Evolutionary Relationships of Plant Food Allergens Sensitizing via the Gastroin- testinal Tract, Critical Reviews in Food Science & Nutrtion, vol. 44, s. 379–407.

Mohammed, I., Mullett, W.M., Lai, E.P.C., Yeung, J.M., 2001, Is Biosensor a Viable Me- thod for Food Allergen Detection? Analytica Chimica Acta, vol. 444, s. 97–102.

Monaci, L., Visconti, A., 2009, Mass Spectrometry-based Proteomics Methods for Anal- ysis of Food Allergens, Trends in Analytical Chemistry, vol. 28, s. 581–591.

Monaci, L., Visconti, A., 2010, Immunochemical and DNA-based Methods in Food Allergen Analysis and Quality Assurance Perspectives, Trends in Food Science &

Technology, vol. 21, s. 272–283.

Mustorp, S., Engdahl-Axelsson, C., Svenson, U., Holck, A., 2008, Detection of Celery (Apium graveolens), Mustard (Sinapis alba, Brassica juncea,Brassicanigra) and

(20)

Sesame (Sesamum indicum) in Food by Real-time PCR. European Food Research and Technology, vol. 226, s. 771–778.

Pafundo, S., Gullì, M., Marmiroli, N., 2010, Multiplex Real-time PCR Using SYBR®

GreenER™ for the Detection of DNA Allergens in Food, Analytical and Bioanaly- tical Chemistry, vol. 396, s. 1831–1839.

Pietrzyk, S., 2009, Alergeny w ¿ywnoœci, cz.1, Laboratorium, vol. 7–8, s. 25–29.

Poms, R.E., Agazzi, M.E., Bau, A., Brohée, M., Capelletti, C., Nørgaard, J.V., Anklam, E., 2005, Inter-laboratory Validation Study of Five Commercial ELISA Test Kits for the Determination of Peanut Proteins in Biscuits and Dark Chocolate, Food Addi- tives and Contaminants, vol. 22, s. 104–112.

Poms, R.E., Anklam, E., Kuhn, M., 2004, Polymerase Chain Reaction Techniques for Food Allergen Detection, Journal of AOAC International, vol. 87, s. 1391–1397.

Popping, B., Diaz-Amigo, C., Hoenicke, K., 2009, Molecular Biological and Immuno- logical Techniques and Applications for Food Chemists, John Wiley and Sons, New Jersey.

Reid, L.M., O’Donnell, C.P., Downey, G., 2006, Recent Technological Advances for the Determination of Food Authenticity, Trends in Food Science & Technology, vol. 17, s. 344–353.

Sancho, A.I., Mills, E.N.C., 2010, Proteomic Approaches for Qualitative and Quantita- tive Characterisation of Food Allergens, Regulatory Toxicology and Pharmacology, vol. 58, s. 42–46.

Scaravelli, E., Brohée, M., Marchelli, R., Van Hengel, A.J., 2008, Development of Three Real-time PCR Assays to Detect Peanut Allergen Residue in Processed Food Prod- ucts, European Food Research and Technology, vol. 227, s. 857–869.

Scheibe, B., Weiss, W., Rueff, F., Przybilla, B., Gorg, A., 2001, Detection of Trace Amounts of Hidden Allergens: Hazelnutand Almond Proteins in Chocolate, Journal Chromatography B, vol. 756, s. 229–237.

Schubert-Ullrich, P., Rudolf, J., Ansari, P., Galler, B., Führer, M., Molinelli, A., Baumgartner, S., 2009, Commercialized Rapid Immunoanalytical Tests for Determi- nation of Allergenic Food Proteins: an Overview, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 395, s. 69–81.

S³omski, R., 2008, Reakcja ³añcuchowa polimerazy (PCR), w: Ryszard, S. (red.), Anali- za DNA. Teoria i praktyka, Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Ciesz- kowskiego w Poznaniu, Poznañ, s. 131–143.

Soko³owska-Kozie³, D., Bugajewska, A., 2007, Alergeny – problemy znakowania ¿ywno- œci i kontrola ryzyka wystêpowania substancji alergennych w zak³adzie produkcyj- nym, Przegl¹d Piekarski i Cukierniczy, vol. 6, s. 62–66.

Stephan, O., Vieths, S., 2004, Development of a Real-time PCR and a Sandwich ELISA for Detection of Potentially Allergenic Trace Amounts of Peanut (Arachis hypogaea) in Processed Foods, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 52, s. 3754–

3760.

Suzuki, M., Ozawa, F., Sugimoto, W., Aso, S., 2001, Miniaturization of SPR Immuno- sensors, Analytical Science, 17 Supplement I, s. 265–267.

(21)

Szymkiewicz, A., 2007, Alergeny pokarmowe pochodzenia roœlinnego, Przemys³ Spo-

¿ywczy, vol. 7, s. 35–37.

Taylor, S.L., Hefle, S.L., 2005, Allergen control, Food Technology, vol. 59, s. 40–43.

Taylor, S.L., Nordlee, J.A., Niemann, L.M., Lambrecht, D.M., 2009, Allergen Immuno- assays – Considerations for Use of Naturally Incurred Standards, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 395, s. 83–92.

van Hengel, A.J., Capelletti, C., Brohée, M., Anklam, E., 2006 Validation of Two Com- mercial Lateral Flow Devices for the Detection of Peanut Proteins in Cookies:

Interlaboratory Study, Journal of AOAC International, vol. 89, s. 462.

van Hengel, A.J., 2007, Food Allergen Detection Methods and the Challenge to Protect Food-allergic Consumers, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 389, s.

111–118.

Weber, P., Steinhart, H., Paschke, A., 2007, Investigation of the Allergenic Potential of Wines Fined with Various Proteinogenic Fining Agents by ELISA, Journal of Agricul- tural and Food Chemistry, vol. 55, s. 3127–3133.

Wróblewska, B., 2002, Wielka ósemka alergenów pokarmowych, Alergia, vol. 4, s. 15.

Wróblewska, B., 2007, Bia³ka pochodzenia zwierzêcego jako alergeny pokarmowe, Przemys³ Spo¿ywczy, vol. 12, s. 14–17.

Wróblewska, B., Szymkiewicz, A., Jêdrychowski, L., 2007, Wp³yw procesów technolo- gicznych na zmiany alergennoœci ¿ywnoœci, ¯ywnoœæ. Nauka. Technologia. Jakoœæ, vol. 6, s. 7–19.

Yman, I.M., Eriksson, A., Johansson, M.A., Hellenaes, K.E.J., 2006, Food Allergen De- tection with Biosensor Immunoassays, Journal of AOAC International, vol. 89, s. 856–861.

www.aoac.org/testkits/testedmethods.html [dostêp: 20.12.2010].

www.fabimex.com.pl/oferta.php?i=11 [dostêp: 7.01.2011].

www.jaalergik.pl/alergia-pokarmowa_aktualnosci-tresc_101.html [dostêp: 20.12.2010].

www.lkb.pl [dostêp: 20.12.2010].

www.nlab.pl/spr.html [dostêp: 7.01.2011].

www.nuscana.pl [dostêp: 7.01.2011].

www.r-biopharm.com/product_site.php [dostêp: 7.01.2011].

BIOLOGICAL METHODS OF ALLERGEN DETECTION IN FOOD

Summary: The article concerns the commercially available and the latest scientific developments in food allergen analysis e.g. rapid enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), lateral-flow immunochromatographic assays (LFA), biosensors and methods based on DNA analysis, e.g. PCR. The analytical potential of mass spectrometry as a rel- ative method for food allergen detection is presented.