ROZMIESZCZENIE AMINOKWASÓW POMIĘDZY PŁYN INKUBACYJNY I KRWINKI CZERWONE UZYSKANE Z KRWI ŚWIEŻEJ I KONSERWOWANEJ

DIAGN. LAB., 1982, XVIII, nr 4

+

MAREK STĘPNIEWSKI

ROZMIESZCZENIE AMINOKWASÓW POMIĘDZY PŁYN INKUBACYJNY I KRWINKI CZERWONE UZYSKANE

Z KRWI ŚWIEŻEJ I KONSERWOWANEJ

Z Zakładu Biochemii Klinicznej Instytutu Pediatrii AM w Krakowie Oznaczono wpływ czasu przechowywania krwi konserwowanej na wartość współczynnika rozmieszczenia alaniny, leucyny, waliny i fe- nyloalaniny między wodę wewnątrzkomórkową krwinek czerwonych i płyn inkubacyjny. Badania przeprowadzono na krwinkach wyosob- nionych z krwi konserwowanej przechowywanej od 2 do 30 .dni w płynie konserwującym. Wyniki porównano z wartościami uzyskanymi dla krwinek czerwonych wyosobnionych z krwi świeżo pobranej, Stwier- dzono, że czas przechowywania krwi konserwowanej nie powodował zmian wartości współczynnika rozmieszczenia poszczególnych amino- kwasów. Wykazano także, w przypadku krwinek wyosobnionych. z krwi konserwowanej, że średnie arytmetyczne współczynnika rozmieszczenia poszczególnych aminokwasów różniły się między sobą w sposób zna- mienny. Również w przypadku krwinek pochodzących z krwi świeżo pobranej wartości współczynnika różniły się między sobą w sposób zna- mienny dla większości aminokwasów z wyjątkiem pary leucyna-fenylo- alanina. Porównano średnie arytmetyczne współczynnika rozmieszcze- nia aminokwasów uzyskane dla krwinek pochodzących z krwi konser- wowanej i świeżo pobranej: stwierdzając istnienie znamiennych różnie między wartoścami uzyskanymi dla alaniny i leucyny. Zaobserwowano, ze proces konserwowania krwi utrudnia przenikanie przez błonę krwinkową alaniny, natomiast ułatwia przenikanie leucyny. Uzyskane ' dane świadczą o znacznej biologicznej trwałości układu przenośników aminokwasów zlokalizowanych w błonie krwinkowej.

WSTĘP

Zaburzenia transportu aminokwasów przez błonę komórkową krwinek

czerwonych występują między innymi w stanie niedożywienia (2, 9, 11), a także w przebiegu chorób zakaźnych (6, 7) i nowotworowych (3). Po- nieważ krwinki czerwone spełniają ważną rolę w przenoszeniu amino- kwasów między tkankami (1, 5, 8), zaburzenia takie mogą mieć istotne znaczenie dla prawidłowego metabolizmu ustroju. |

Celem podjętej pracy było zbadanie czy krwinki czerwone wyosobnio-

ne z krwi konserwowanej zachowują zdolność przenoszenia aminokwa-

sów. Miarą tej zdolności mogą być wartości współczynnika rozmieszcze-

nia aminokwasów między wodę wewnątrzkrwinkówą i płyn inkubacyjny,

oznaczone po różnym czasie przechowywania krwi. Wpływ konserwowa-

nia krwi na transport aminokwasów przez błonę krwinkową można rów-

nież zbadać porównując współczynnik rozmieszczenia aminokwasów dla

krwinek konserwowanych i świeżych.

178 M. Stępniewski MATERIAŁ I METODYKA

nowym Krebsa-Ringera (12) o pH 74 nasyconym bezpośrednio przed użyciem mieszaniną tlenu i dwutlenku węgla w stosunku objętościowym 95:5 i ogrzanym do temp. 37. Do 0,5 ml zawiesiny krwinek (około 250 mg) dodawano 400 ul' płynu inkubacy jnego, który stanowił ten sam bufor zawierający dodatkowo jeden z następujących aminokwasów: L- -alaninę, L-teucynę, L-walinę lub L-fenyloalaninę znakowane izotopem węgla *C w grupie karboksylowej. Stężenie aminokwasu wynosiło 200

i odmrażanie. Obecne w hemolizacie białko denaturowano ogrzewając

„próbki przez 30 minut w temp. 95°. Po odwirowaniu, "pobierano do oznaczania aktywności, a osad zdenaturowanego Szono do stałej masy. Z. uzyskanych

ności aminokwasu w wodzie wewnątrzkomórkowej

krwinek czerwonych

niką rozmieszczenia podano poprzednio (11).

Aktywność MC i 5H mierzono przy pomocy automatycznego licznika . scyntylacji cieczowej Isocap/300 firmy Nuclear-Chicągo (U.S.A.). Stopień tłumienia mierzono przy pomocy wzorca zewnętrznego. Błąd pomiaru aktywności był mniejszy od 1%. Wyniki oznaczeń aktywności wyrażano w ilości rozpadów na minutę.

WYNIKI I OMÓWIENIE

Nr 4 Rozmieszczenie aminokwasów | . 179

chowywania krwi (ryc. 1). Świadczył o tym brak korelacji między cza- sem przechowywania krwi i wartościami współczynnika rozmieszcżenia dla tych aminokwasów. Wartości współczynnika korelacji wynosiły:

—0,41 dla alaniny, —0,14 dla leucyny, 0,02 dla waliny i —0,1 dla feny- . loalaniny. W żadnym przypadku korelacja nie była znamienna. Uzyskane dane przemawiają za znaczną biologiczną trwałością układu przenośni- ków aminokwasów zlokalizowanych w błonie krwinkowej.

a

= оо

U и —— oe 0 4 2 —_ nu — — — — AB уе. — (EU

"= со

3 о _° ‘ ay , бо °^=-0.097; {=-0,026х+ 0,839 ВЕ

5 о a . H

U a a

Е 4 ва

8 a t

A А ‘ ma

dosk _{a a} Ao. ai NODORANZZCY _{A .}

9 „A

sg A

g ° |

0 5 OT 5 BM mm m. — r TOR O08 1 0231 |

o

l | l | | o |

5 10 15 20 25 30 dni

Czas przechowywania krwi Ryc. 1

Wobec braku związku między okresem przechowywania krwi i tran- sportem aminokwasów przez błonę krwinkową dla każdego aminokwasu obliczono średnią arytmetyczną wartości współczynnika rozmieszczenia alaniny, leucyny, waliny i fenyloalaniny. Przedstawione na ryc. 2 dane dotyczą krwinek czerwonych -wyosobnionych z krwi konserwowanej i świeżo pobranej. Jak podano w tab. I średnie wartości współczynnika rozmieszczenia poszczególnych aminokwasów różniły się znamiennie z wyjątkiem pary leucyna-fenyloalanina. Stwierdzono również, że przecho- wywanie krwinek w płynie ACD powodowało znamienne obniżenie

czynnika rozmieszczenia leucyny (p<0,02). Dla waliny i fenyloalaniny wartości omawianego współczynnika były prawie identyczne, niezależnie od tego czy krwinki pochodziły z krwi konserwowanej czy świeżej.

Zmamienne różnice między średnimi arytmetycznymi współczynnika rozmieszczenia alaniny i leucyny uzyskane dla krwinek wyosobnionych z krwi konserwowanej i świeżo pobranej świadczą o tym, że procedura przygotowywania krwi konserwowanej wpływa w pewnym stopniu na transport tych aminokwasów przez. błonę krwinkową. Przyczyny tego można upatrywać w trzech czynnikach. Po pierwsze, krew od dawców pobierano do płynu konserwującego, natomiast u osobników grupy kon- trolnej jedynym dodatkiem do krwi była heparyna. Po drugie, stosowane w stacjach krwiodawstwa zastępowanie około 1/3 objętości osocza dawcy płynem konserwującym mogło wpłynąć na układ przenośników amino- kwasów obecnych w błonie krwinkowej. Po trzecie, w trakcie przygoto-

"wania i przechowywania krwi konserwowanej dochodzi do znacznego za-

180 M. Stepniewski Nr 4

Tabela JI, Znamienność różnie między średnimi arytmetycznymi współczynnika rozmieszczenia aminokwasów między wodę wewnątrzkomórkową nych i płyn inkubacyjny. Dane dotyczą krwinek pochodzących , wanej i świeżo pobrane od osobników grupy kontrolnej EE 1 Świeżo pobrar z krwi konserwo- krwi

Krwinki konserwowane I || Świnki kontrolne _ Krwinki kontrolne

Aminokwasy t a a p< p< | t

Ala/Leu Ala/Val 36,65 12,95 0,001 0,001 14,26 5,02 0,001 0.001 Ala/Fen Leu/Fen Leu/Val Val/Fen 14,87 19,44 2,77 8,53 0,001 0,02 0.001 0,001 3,24 8,29 5,24 1,01 0,02 0,02 0,001 nz.

м

n.z. — różnica nieznamienna statystycznie,

kwaszenia krwinek, co również może wywierać wpływ na proces trans- portu aminokwasów przez błonę krwinkową.

CJ Krwinki z krwi swiezo pobranej

10-

5 *

5

7 dy

8

o Е.

-

- Ą я Ż

3

Ś

ZI 7

A | 7

10 Я 10 |48 10 | 35 10 \46

ALA LEU VAL PHE

Ryc. 2

Godnym podkreśleunia wydaje się fakt, że dla waliny i leucyny, ami-

nokwasów . transportowanych wspólnym układem przenośników „L* (13,

14) wykazano znamienne różnice wartości współczynnika rozmieszcze-

nią i to zarówno dla krwinek pochodzących z krwi konserwowanej jak

i świeżo pobranej. Różnice te sugerują, że transport aminokwasów prze-

noszonych przez błonę krwinkową tym samym układem przenośników

podlega dodatkowej regulacji zależnej od budowy chemicznej danego aminokwasu.

Nr 4 Rozmieszczenie aminokwasów 181

М. Стемпневски

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕЖДУ ИНКУБАЦИОННУЮ жидкость И ЭРИТРОЦИТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ СВЕЖЕЙ

И КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ

‘Содержание

Обозначали влияние времени сохранения консервированной крови на вели- чину коэффициента распределения аланина, лейцина, валина, фенилаланина между внутриклеточную воду эритроцитов и инкубационную жидкость. (Иссле- дования провели на эритроцитах, изолированных из консервированной крови, сохраняемой от 2 до 30 дней в консервирующей жидкости. Результаты сравни- вали`с величинами ‚полученными для эритроцитов, изолированных из крови, только что взятой). Установили, что время сохранения консервированной крови было причиной изменения величин коэффициента‘ распределевия отдельных аминокислот. Доказали также, что в случае эритроцитов, изолированных из консервированной крови, средние арифметические коэффициента распределе- ния отдельных аминокислот отличались друг от друга знаменательным епосо- бом. Также в случае эритроцитов, происходящих из крови, только что взятой, величины коэффициента отличались друг от друга знаменательным способом для большинства аминокислот за исключением пары лейцин-—фенилаланин.

Сравнили средние арифметические коэффициента распределения аминокислот, полученные для эритроцитов, происходящих из консервированной и только что взятой крови, устанавливая существование знаменательных разниц между ве- личинами, полученными для аланина и лейцина. Наблюдали, что процесс кон- сервирования крови мешает проницаемости через эритроцитную оболочку ала- нина, зато облегчает проницаемость лейцина. Полученные данные свидетель- ствуют о значительной биологической стойкости системы переносчиков амино- кислот, локализированных в эритроцитной оболочке.

M. Stepniewski

DISTRIBUTION OF AMINO ACIDS BETWEEN INCUBATION MEDIUM AND RED BLOOD CELLS ORIGINATING FROM FRESH AND PRESERVED

BLOOD

4

Summary

The effect of time of preservation of blood on the values of the coefficient of distribution of alanine, valine, leucine and phenyloalanine between intracellular water of red blood cells and the incubation medium was investigated. Red blood cells were isolated either from preserved blood refrigerated for 2 to 30 days or from fresh blood obtained from healthy volunteers. It was found that the time of preservation of blood had no effect on the values of the coefficient. The values of the coefficient obtained for the particular amino acids differed significantly both in the case of preserved blood and fresh blood, with the only exception: of the pair: leucine chenylanine. The comparison of the values of the coefficient ob- tained for preserved blood and fresh blood showed significant diférences in the case of alanine and leucine. It seems that the preservation of blood made the membrane of red blood cells more permeable for leucine and less permeable for alanine, The results of this study indicate that the carriers of amino acids locali- sed in the red blood cell membrane are stable under usual storage conditions.

PISMIENNICTWO

1. Aoki T. M. Muller W. A., Brennan M. F,, Cahiil G. F.: Blood cell and plas- ma amino acid levels across forearm muscle during a protein meal. Diabetes, 22, 768—775, 1973.

2. Arkammar G., Bjornesjó K. B., Jagenburg O., Mellander O.: Plasma and eryth- rocyte amino acids during treatment of protein-calorie malnutririon. Acta Paed. Scand. 61, 145, 1972.

Bjornesjó K. В, Jarnulf B., Lausing E.: Uptake of labelled amino acids into humanerythrocytes in disease. Clin. Chim. Acta, 20, 23—27, 1968.

182

M. Stępniewski Nr 4

. Byum А.: Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand. Clin. Lab. Inwest. 21, Suppl. 97, 71—89, 1968. J.

Elwyn D. H., Launder W. J., Parikh H. C.: Roles of plasma and erythrocytes in interorgan transport of amino acids in dogs. Am, J, Physiol. 222, 1333—

1342, 1972,

Feigin R, D., Rapopart M. L: Influence of a bacterial toxin on whole blood amino acids. Clin. Res. 14, 339, 1966.

Feigin R. D., Dangerfield H. G.: Whole blood amino acid changes following respiratory acquired Pasteurella tularensis infection in man, J. Infect, Dis,

117, 346, 1967.

10.

11.

12.

13.

14.

АМ

. Felig P, Wahren J., Rój Li: Evidence of interorgan amino acid transport Mikhail M. M., Waslien C. 1, Gabr M. K. Mansour M. M: In vitro uptake of labeled amino acids by red blood cells of children with protein-calorie malnutrition. Am. J. Clin. Nutr, 28, 233, 1975. blood cells in humans. Proc. Natl. Acad. Sci, 70, 1775—1779, 1973. by Rudowski W. Pawelski S. (red.): Transfuzjologia kliniczna. Wyd. II PZWL Warszawa, 1971.

Stępniewski M., Janik A.: Transport leucyny-14C przez błonkę komórkową krwinek czerwonych niemowląt z przerostowym zwężeniem odźwiernika. Przegl, Lek. 37, 561, 1980.

Umbreit W. W., Burris R. H., Stauffer J. F.: Manometric techniques. IV ed, Burgess Publ. Co, Minneapolis 1964,

Winter C. G, Christensen H. N.: Migration of amino acid across the mem- brane of the human erythrocyte. J. Biol, Chem. 239, 827, 1964. .

Young J. D. Jones E. M., Ellory J. C:: Amino acid transport in human and Sheep erythrocytes, Proc. Roy. Soc. London, 209, 355, 1980.

Adres: Dr Marek Stępniewski, Zakład Biochemii Klinicznej Instytutu Pediatrii Kraków-Prokocim, ul. Wielicka 265.