UPROSZCZENIE METODY KSYLENOWEJ OZNACZANIA KWASU ASKORBINOWEGO WSTĘP

MARIA SZCZYGŁOWA

UPROSZCZENIE METODY KSYLENOWEJ OZNACZANIA KWASU ASKORBINOWEGO

Z Zakładu Higieny Żywienia PZH

WSTĘP

Najczęściej stosowaną metodą do oznaczania witaminy C jest metoda:

Tillmansa (1), polegająca na miareczkowaniu kwasu l-askorbinowego za pomocą 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu. Barwnik ten reaguje dość wy- biórczo i w określonych warunkach prowadzenia reakcji pozwala na uzy- skanie dostatecznie ścisłych wyników.

Przy użyciu 2,6-dwuchlorofendoindofenolu nie można jednak całkowi- cie wyeliminować szeregu innych związków redukujących, a także ozna-.

czyć kwasu dehydroaskorbinowego. Sprawa komplikuje się ponadto w przypadkach, gdy roztwór zawierający witaminę C jest silnie zabar- wiony, gdyż to maskuje zmianę barwy indofenolu w końcowym etapie miareczkowania. W celu pokonania tej trudności wprowadzono szereg modyfikacji oryginalnej metody Tillmansa.

Modyfikacje metody Tillmansa dla roztworów silnie zabarwionych. Jedna z tych modyfikacji została zapropo- nowana przez R. L. Mindlina i A. M. Butlera (2) i jest dokładnie opisana przez O. A. Besseya (3). Polega ona na tym, że miareczkowanie przepro- wadza się nie wizualnie, lecz za pomocą kolorymetru fotoelektrycznego z filtrem dla długości fali wynoszącej 520 mu. W ten sposób udaje się obiektywnie stwierdzić zmianę barwy odczynnika. Do posługiwania się tą modyfikacją potrzeba jednak dość czułego .kolorymetru. Drugą mody- fikację wprowadził F. Bukatsch (4). Polega ona na spostrzeżeniu, że nie.

zredukowany 2,6-chlorofenoloindofenol rozpuszcza się w ksylenie i za- chowuje potem przez kilkanaście godzin barwę, której natężenie daje się odczytać w kolorymetrze przy filtrze, dla fali długości 500—520 mu.

Oznaczanie witaminy C polega więc na tym, że przy miareczkowaniu dodaje się nadmiar barwnika, nie zredukowany barwnik wyciąga się z roztworu za pomocą ksylenu i oznacza się go kolorymetrycznie. Postę- powanie to jeszcze bardziej uprościł Folkmann (1). Ta modyfikacja roz- szerzyła zakres stosowania metody Tillmansa i na produkty silnie zabar- wione. Inne modyfikacje zmierzające do tego samego celu wymagają przeprowadzania szeregu dość skomplikowanych procesów laboratoryj- nych. Na przykład jedna z nich polega na redukcji naturalnych barwni- ków za pomocą siarkowodoru (1, 5) strącaniu jego nadmiaru i odpedzaniu . resztek za pomocą dwutlenku węgla. W ten sposób można odbarwić nad- miernie zabarwione roztwory, w których chcemy oznaczać witaminę C..

Wydaje się jednak, że z istniejących modyfikacji metody Tillmansa do omawianych celów stosunkowo najprostszą jest metoda ksylenowa.

Ponieważ sezonowe niedobory witaminy € w naszym kraju stanowią

„duże zagadnienie natury zdrowotnej, zachodzi potrzeba oznaczania tego składnika w surowcach, składowanych przez dłuższy czas, w produktach i półproduktach w czasie ich przetwarzania na skalę przemysłową, w po- siłkach wydawanych w zakładach żywienia zbiorowego, w różnych kon- centratach i odżywkach oraz w artykułach wzbogacanych, za pomocą syntetycznych preparatów kwasu askorbinowego. Ponadto witamina C jako składnik nietrwały jest do pewnego stopnia miernikiem jakości me- tod składowania i przetwarzania. Z tych względów oznaczanie witaminy C powinno być stosowane rutynowo nawet w prymitywnie wyposażonych laboratoriach.

Ponieważ wiele produktów, w których oznacza się tę witaminę jest silnie zabarwionych, zajęłam się badaniami nad uproszczeniem modyfi-

kacji ksylenowej tak, aby można było obejść się i bez kolorymetru.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

W badaniach moich dążyłam do uproszczenia modyfikacji Folkmanna (1). Według tego autora materiał badany należy ekstrahować taką ilością 100/0-0wego kwasu metafosforowego, aby w otrzymanym wyciągu stęże- nie tego kwasu obniżyło się do około 1%. Następnte do ekstraktu o za- wartości 0,1—0,5 mg kwasu 1l-askorbinowego, odpipetowanego do kolbki stożkowej, dodaje się 20 ml wody oraz jako buforu: 1 ml kwasu octo- wego lodowatego i 2 ml nasyconego roztworu szczawianu sodu. Do tak przygotowanego wyciągu dodaje się 0,001-n roztwór 2,6-dwuchlorofeno- loindofenolu, w takiej ilości aby pewna jego część nie została zreduko- wana. Po dodaniu barwnika zawartość kolbki wstrząsa się i po upływie ok. 1 minuty dodaje się 25 ml ksylenu, (najlepiej świeżo przedestylowa- nego). Następnie kolbkę ponownie wstrząsa się, odstawia na pewien czas i po odstaniu, zebrany na wierzchu ksylen zawierający nadmiar od- czynnika Tillmansa, ściąga się, zbiera do innej kolebki stożkowej i osusza bezwodnym siarczanem sodu. To samo wykonuje się ze ślepą próbą, w której zamiast ekstraktu badanej substancji znajduje się odpowiednia ilość kwasu metafosforowego. W modyfikacji Folkmanna pomiar stężenia barwy 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu w ksylenie przeprowadza się w ko- lorymetrze Duboscqa.

Ilość ml nadmiaru barwnika (x) oblicza się wg wzoru:

x КЗ! <

gdzie: K = całkowita ilość ml barwnika dodana do każdej z prób S1 = odczyt w kolorymetrze dla ślepej próby

82 = 5 s „. badanej próby.

Moje badania miały na celu uproszczenie modyfikacji Folkmanna tak, aby ona mogła mieć zastosowanie w każdym prymitywnie urządzonym laboratorium.

Pierwszym zadaniem było stwierdzenie, że kwas metafosforowy można zastąpić kwasem szczawiowym w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie

Nr 5 OZNACZANIE KWASU ASKORBINOWEGO 415

w wyciągu wynosiło ok. 2%. Wprawdzie kwas ten już od dawna był stosowany do robienia wyciągów z produktów roślinnych dla oznaczania w nich witaminy C (6, 7), ale chodziło o to czy można w tego rodzaju roz- tworach przeprowadzać miareczkowanie wg modyfikacji ksylenowej.

Aby się o tym przekonać, przeprowadziłam szereg oznaczeń w nastę- pujący sposób: Z każdej z badanych próbek otrzymywałam po 4 równo- ległe wyciągi — 2 z użyciem 100/0-0wego kwasu metafosforowego tak, aby po rozcieńczeniu stężenie tego kwasu wyniosło około 1%% i 2 z po- mocą 29%/-0wego kwasu szczawiowego, w końcowym rozcieńczeniu około 19/0. Dalej postępowałam wg metody Folkmanna z tą różnicą, że ksylen dodawałam nie po 1 minucie, ale natychmiast po miareczkowaniu. Na- tychmiastowe dodawanie ksylenu miało na celu przeszkodzenie ewentual- nemu działaniu redukcyjnemu innych związków niż kwas 1-askorbinowy.

Miareczkowanie i ekstrakcję ksylenową przeprowadzałam w kolbkach stożkowych na 200 ml z doszlifowanym korkiem. Poza tym do oznaczeń kolorymetrycznych użyłam fotometru Pulfricha, o. czym będę mówiła później.

Dla przykładu podaję w tabeli I wyniki oznaczeń kwasu askorbinowego w obu rodzajach wyciągów z trzech produktów zabarwionych — 2 próbek czerwonej kapusty i 1 próbki galaretki z owoców mieszanych.

Tabela I

Zawartość kwasu askorbinowego w mg °/o

, Wyciąg w kwasie m. Wyciąg w kwasie | Rodzaj _{probki —-—-} fosforowym szczawiowym

. —

w poszczególnych próbach średnio i i w poszczególnych | pritkeck | srednio .. ,..

Kapusta 70,0 719 71,8 718

czerwona I 73,8 71,8 ‘

Kapusta 62,1 60.15 56,3 58,25

czerwona II 58,2 | И 60,2 .

Galaretka z miesza- 2,1 2.25 2,8 26

nych owocow | 2,4 2,4 |

Tabela H

o - o m Ilość kwasu | |

Zawartość askorbinowego EEC ie

Rodzaj _р kwasu askor- dodanego Całkowita ilość jllość odzyskana

3 . 0 obliczona Ww oznaczeniu

próbki binowego mg °/o niq © oj

mg %o | w stos. do ge mę «0 próbki

Kapusta .

czerwona I 73,8 . 80,0 153,8 155,3

Kapusta

czerwona II 67,9 80,0 . 147,9 141,7

Galeretka z owo |

ców mieszanych

Nastepnie do tego samego rodzaju wyciagow dodawałam roztwory czystego kwasu askorbinowego, dla jednych próbek w 1%/o-owym kwa- sie m-fosforowym, dla drugiego w 2°/o-owym kwasie szczawiowym w ta- kich ilościach, aby w 5 ml wziętych do miareczkowania było dane 0,2 mg kwasu askorbinowego. Wyniki podaję w tabeli II. (str. 415).

Z wyników tych można wnioskować, że środowisko kwasu szczawio- wego równie dobrze nadaje się do ekstrakcji ksylenowej, jak i roztwór kwasu metafosforowego.

Następnym krokiem w tych badaniach było zastosowanie do oznaczeń kolorymetrycznych fotometru Pulfricha.

Do tego celu wykreśliłam skalę transmisji dla wzrastających stężeń.

roztworów. Roztwory sporządzałam w ten sposób, że do szeregu kolbek stożkowych z mieszaninami 20 ml wody destylowanej, 1 mil kwasu octo- wego, 2 ml nas. roztworu szczawianu sodu i 5 ml 2°/o-owego roztworu kwasu szczawiowego dodawałam kolejno po 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,7, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 i 4,0 ml 0,0259/0-0wego roztworu barwnika używanego do oznaczeń kwasu askorbinowego i po wymieszaniu szybko wyciągałam do- dany barwnik 25 ml ksylenu, a następnie oznaczałam procent transmisji w kolorymetrze. Krzywa transmisji podana jest na ryc. 1.

100 p.

90 80:

FOr 80|- 30F 40 |

% tnansmieji т 30

Е

90

0204 0810 15 20 25 90 04

mly0,025% roztworu 2,6 7 dwuchlorofenolondofenolu w ksytene

Ryc. 1.

Nr 5 OZNACZANIE KWASU ASKORBINOWEGO 417

Analizując wykreśloną krzywą można stwierdzić, że w miarę wzrostu stężenia roztworu barwnika w ksylenie staje się ona coraz mniej stroma, co świadczy o zmniejszaniu się czułości oznaczeń. Stąd wynikałby wnio- sek, że oznaczenia te są bardziej dokładne przy mniejszych nadmiarach barwnika. W granicach stężenia od 0—1 ml — różnica transmisji wyno- siła 229/6, podczas gdy między 3 i 4 ml — różnica ta wynosiła tylko 11%.

A więc w przypadku użycia fotometru Pulfricha oznaczenie gwaran- tuje większą dokładność, jeżeli zamiast oznaczania transmisji dla całej ilości dodanego 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu, następnie transmisji dla jego nadmiaru niezredukowanego przeprowadzi się oznaczania następują cym sposobem: 1) dodaje się najmniejszy nadmiar 2,6-dwuchlorofeno- loindofenolu. (Jeżeli po dodaniu tego barwnika do roztworu badanego i wyciągnięciu nadmiaru ksylenem okaże się duże stężenie barwy — bie- rze się do oznaczenia drugą porcję i dodaje mniej barwnika, tyle, żeby otrzymać w wyciągu ksylenowym jak najsłabsze różowe zabarwienie (2).

'Wykreśla się krzywą transmisji dla szeregu rosnących stężeń barwnika w ksylenie od 0,1 do 0,5 mli na tej krzywej odnajduje się po odczytaniu transmisji ilość indofenolu niezredukowanego. Krzywa ta może być sto- sowana do wielu oznańczeń pod warunkiem użycia tych samych odczyn- ników i tylko ze względu na możliwości zmiany napięcia prądu w sieci można sprawdzić jakiś jeden z jej punktów.

Przy zastosowaniu otrzymanej krzywej do oznaczeń próbek badanych zawartość mg kwasu askorbinowego w 100 g produktu (x) oblicza się wg wzoru:

(b — a) .c. 100.

x =F FEE EO

m.5.d

godzie: b — oznacza całkowitą ilość ml dodanego 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu, c — ilość ogółna ml wyciągu z substancji badanej,

a — ilość ml barwnika niezredukowanego (znaleziona na krzywej,

m — miano roztworu barwnika czyli ilość ml potrzebnych do utlenienia l mg kwasu askorbinowego,

5 — ilość ml wyciągu wzięta do miareczkowania, 4 — naważka produkiu badanego w gramach.

Wykonanie oznaczeń bez użycia fotometru

Ponieważ może się zdarzyć konieczność oznaczania kwasu askorbi- nowego w roztworach mocno zabarwionych bez możności posługiwania się jakimkolwiek kolorymetrem, przeprowadziłam badania nad dokładnością tego rodzaju oznaczeń.

Zaczęłam od sporządzenia wyciągów ksylenowych takich jak przy uży- ciu fotometru Pulfricha tzn. od 0,1 do 4 ml barwnika wyciąganego na- stępnie ksylenem.

Wyciągi te nalewałam do szeregu jednakowych probówek w tych | sa- mych ilościach i porównywałam ich barwę na białym tle. Stwierdziłam, że w granicach od 0,1 do 0,5 ml natężenie barw z łatwością daje się od- czytać z dokładnością do 0,1 ml, a nawet przez interpolację — do 0,05 ml 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu, co odpowiada około 0,005 mg kwasu askor- binowego, a więc przy użyciu do oznaczenia 5 ml roztworu o zawartości średnio 0,25 mg dokładność oznaczenia wynosi około 2%. Natomiast nie było możliwe porównywanie barw otrzymanych z wzorcami przy stęże-

niach większych jak 0,5 ml. 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu. To potwier- dza konieczność oznaczeń przy bardzo małych nadmiarach tego barw- nika.

Wydaje się, że uproszczona w opisany sposób metoda może być poży- teczną w pracy rutynowej, gdzie wskutek silnej barwy produktów wy- nikają trudności z oznaczeniem witaminy C. Metodę tę stosujemy od sze- regu lat i oszczędza nam ona skomplikowanych czynności, związanych z innymi metodami. Trzeba jednak dodać, że dotyczy ona tylko tych pro- duktów, których barwnik nie rozpuszcza się w ksylenie, a więc przede wszystkim produktów zabarwionych naturalnie z wyjątkiem zawierają- cych karoten — rozpuszczalny w ksylenie.

WNIOSKI

Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że metodę:

ksylenową do oznaczeń kwasu askorbinowego w roztworach barwnych daje się stosować w każdym laboratorium, nawet przy najbardziej pry- mitywnym wyposażeniu. Daje ona dokładność oznaczeń około 20/0. Wy-

„daje się, że w modyfikacji podanej jest to na razie najprostsza z metod tego rodzaju.

Trzeba jednak zastrzec się, że stwierdzono jej przydatność jedynie w odniesieniu do produktów o zabarwieniu naturalnym, np. jagód, owo- ców itp.

М. Пиглова

УПРОЩЕННЫЙ КСИЛЕНОВЫЙ МЕТОД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Содержание

Труд основан на ксиленовом методе Фолькмала (Коктапи) определения «c корбиновой кислоты в сильно окрашенных продуктах. Изменония и адайтгация идут по направлении далеко идущих упрощений этого метода, которые позворя®т вести исследования в примитивно оборудованных лабораториях.

M.Szczygłowa

MODIFICATION OF XYLENE-EXTRACTION METHOD OF ASCORBIC ACID DETERMINATION

Summary

The author basing on Folkman’s xylenic method of ascorbic acid estimation in strongly coloured foodstuffs has introduced changes and adaptations. The author obtained simple modification of the mentioned method, acceptable for use in primi- tively equipped laboratories.

PISMIENNICTWO

1. Winton A. L., Winton K. B.: The Analysis of Foods, New York 1945. — 2. Mindlin R. Z., Butler A. M.: J. Biol. Chem., 122, 673, 1937. — 3. Bessey O. -A.:

J. Biol. Chem., 126, 771, 1938. — 4. Bukatsch F.: Z. Physiolog. Chem., 262, 20, 1939. — 5. Wsesojuznyj-Naucznoissledowatelskij Witaminnyj Institut. Metody Opredelenija Witaminow, Piszezepromizdat, Moskwa 1951. — 6. Methods of Vitamin Assay The Association of Vitamin Chemists, Interscience Publ. New York 1947. — 7. Szczygio- wa M. Łuczakowa J., Siczkówna J.: Roczn. PZH nr 3—4, str. 523, 1950.