Polimorfizm -643C/T genu RANKL i jego związek z osteoporozą u kobiet po menopauzie

PRACA ORYGINALNA

Polimorfizm -643C/T genu RANKL

i jego związek z osteoporozą u kobiet

po menopauzie

-643C/T polymorphism of RANKL gene

and its association with osteoporosis

in postmenopausal women

STRESZCZENIE

W S T Ę P

RANKL jest kluczową cytokiną uczestniczącą w różnicowaniu osteoklastu ze swoich prekursorów oraz aktywacji i przeżyciu samych osteoklastów. Ponie-waż wiąże się z RANK, obecność RANK na komórkach docelowych jest nieo-dzownym warunkiem kontroli komórek docelowych za pośrednictwem RANKL.

C E L P R A C Y

Celem pracy było zbadanie częstości występowania polimorfizmu genu RANKL oraz ocena jego związku z parametrami klinicznymi dotyczącymi obrotu kostne-go i stopnia zaawansowania osteoporozy pomenopauzalnej.

M A T E R IA Ł Y I M E T O D Y

Badania przeprowadzono w grupie 570 kobiet w wieku postmenopauzalnym (404 kobiety) i rozrodczym (166 kobiet). Grupa w wieku postmenopauzalnym obejmowała kobiety z osteoporozą, osteopenią i zdrowe. Kobiety w wieku roz-rodczym były zdrowe.

Zbadano częstość występowania polimorfizmu badanego genu w grupie pacjen-tek z oznaczoną gęstością mineralną kości (bone mineral density – BMD) oraz w grupie kontrolnej. Badanie przeprowadzono metodą RFLP-PCR.

W Y N IK I

Uzyskane wyniki badań nie wykazały korelacji polimorfizmu C-643T genu

RANKL ze zmniejszoną gęstością kości oraz zwiększonym ryzykiem

występo-wania zmian osteoporotycznych po menopauzie.

1_{Katedra i Zakład Histologii Wydziału Lekarskiego}

z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach

2_{Centrum Dydaktyki i Symulacji Medycznej}

Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach

3_{Zakład Komputerowych Systemów Biomedycznych}

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

A D R E S D O K O R E S PO N D E NC J I:

Dr n. med. Dariusz Boroń

Katedra i Zakład Histologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach

ul. Jordana 19 41-808 Zabrze tel. +48 32 272 28 42 e-mail: dariusz@boron.pl

Ann. Acad. Med. Siles. 2014, 68, 6, 415–423 Copyright © Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach eISSN 1734-025X www.annales.sum.edu.pl Received: 29.10.2013 Revised: 02.01.2014 Accepted: 15.03.2014 Published online: 31.12.2014

W N IO S K I

Wydaje się, że homozygota TT polimorfizmu genu receptora RANKL może być czynnikiem zwiększonego ryzyka wystąpienia osteoporozy i jest powiązana ze wzrostem i masą urodzeniową.

S Ł O W A K LU C ZO WE

RANKL, polimorfizm, osteoporoza, kobieta, wiek

ABSTRACT

IN T R O D U C T IO N

RANKL is a key cytokine involved in osteoclast differentiation from its precursors, activation and survival of osteoclasts themselves. Because RANKL binds with RANK, the presence of RANK on target cells is a neces-sary condition of target cell control mediated by RANKL.

A IM O F S T U D Y

The aim of the study was to examine the incidence of RANKL gene polymorphism and evaluate its association with the clinical parameters concerning bone turnover and the degree of postmenopausal osteoporosis develop-ment.

M A T E R IA L A N D M E T H OD S

The study was conducted among a group of 570 women at postmenopausal age (404) and reproductive age (166). The group at postmenopausal age included women with osteoporosis, osteopenia as well as healthy individuals. The women at reproductive age were healthy. The polymorphism incidence of the examined gene in a group of patients with determined bone mineral density (BMD) and in the control group was studied. The study was performed by means of the RFLP-PCR method.

R E S U L TS

The obtained results did not show a correlation of RANKL gene C-643T polymorphism with decreased bone density or increased risk of osteoporotic changes after menopause.

C O N C L U S IO N S

The homozygote of the TT polymorphism of the RANKL receptor gene seems to be an increased risk factor of osteoporosis development and is associated with growth and birth mass.

K E Y W O R D S

RANKL, polymorphism, osteoporosis, women, age WSTĘP

Wiadomo, że osteoporoza jest chorobą uwarunkowaną obecnością licznych polimorfizmów tzw. genów kan-dydujących do rozwoju osteopenii i osteoporozy [1]. Ważna jest także interakcja między tymi genami. W poświęconych temu zagadnieniu badaniach ocenia się zmienność wspomnianych genów w populacjach ludzkich, opierając się przy tym na identyfikacji poli-morfizmów pojedynczego nukleotydu (

single

nuc-leotide polymorphism

na zmienność takich cech, jak gęstość mineralna kości [2]. Dlatego w celu poznania podłoża genetycznego rozwoju osteopenii i osteoporozy niezbędne może okazać się dokładne zbadanie polimorfizmów SNP, takich jak polimorfizmy osteoprotegeryny (OPG – – osteoprotegerin), receptora RANK czy ligandu RANKL oraz innych genów, wpływających na fizjo-logię szkieletu kostnego człowieka [3,4,5,6].

Ligand RANK (RANKL), główny mediator resorpcji kości w stanach normalnych i patologicznych, ulega ekspresji jako związany z błoną lub rozpuszczalna forma w różnych tkankach, w tym w kości [7,8].

W prawidłowej przemianie kostnej i w przerzutach kostnych RANKL stymuluje tworzenie i aktywność komórek usuwających kość, czyli osteoklastów, przez wiązanie się z jego swoistym receptorem RANK na osteoklastach i ich komórkach progenitorowych. Procesy te są czasem zaburzane przez wiązanie RANKL z OPG, będącą rozpuszczalnym receptorem pułapkowym [9]. Synteza tych substancji jest uwarun-kowana również genetycznie, a odpowiadające za nią geny wykazują polimorfizm.

Ekspresja RANKL jest regulowana na poziomach transkrypcyjnym, translacyjnym i potranslacyjnym przez hormony (np. 1,25-dihydroksywitaminę D3),

czynniki wzrostu i peptydy (np. transformujący czyn-nik wzrostu β1, czynczyn-nik wzrostu fibroblastów-2 oraz białko pokrewne z hormonem przytarczyc), cytokiny (np. interleukiny 1β i 11) oraz inne czynniki [10, 11,12]. RANKL zachowuje biologiczną aktywność w formie rozpuszczalnej o masie 31 kDa (w przeci-wieństwie do formy 40–45 kDa związanej z błoną), która powstaje przez proteolityczne rozszczepienie lub alternatywne składanie. Analiza sygnalizacji RANKL ujawniła alternatywne transkrypty kodujące: związaną z błoną izoformę 287 aminokwasową, z krótką dome-ną wewdome-nątrzkomórkową, i rozpuszczalne białko 199 aminokwasowe, pozbawione fragmentu transbłono-wego oraz wewnątrzkomórkowych domen kanonicz-nego RANKL [11]. Mimo że wszystkie opisane izo-formy RANKL mogą brać udział w osteoklastogene-zie in vitro, to sądzi się, że izoforma najkrótsza w czasie ekspresji w komórkach z innymi izoformami ma działanie hamujące. Jest więc prawdopodobne, że regulowana ekspresja izoform RANKL może przy-czynić się do kontrolowania rozwoju osteoklastów [12,13].

Osteoblasty różnią się względną ekspresją RANKL w kwestii regulacji tworzenia osteoklastów i ich funk-cji. Nadmiar RANKL wiąże się z RANK na prekurso-rach osteoklastów, umożliwiając niektórym czynni-kom związanym z receptorem czynnika martwicy guza (tumor necrosis factor receptor-associated factor – – TRAF) ich łączenie z RANK w domenie wewnątrz-komórkowej [14]. Szlaki te następnie regulują fuzję prekursorów osteoklastów, różnicowanie ich w dojrza-łe osteoklasty oraz – w kon-sekwencji – ich aktywację i przeżycie. Nadmiar OPG wiąże RANKL i zapobiega jego interakcji z RANK, zmniejszając liczbę oraz czynność osteoklastów [15].

Brak dobrze opracowanych danych oraz wieloczynni-kowy charakter osteoporozy wymagają dalszych ba-dań w celu zarówno poszukiwania, jak i weryfikacji nowych czynników etiopatogenetycznych, a także retrospektywnej oceny istniejących danych. Analiza wyników dotychczasowych badań nie pozwala jeszcze na jednoznaczne określenie roli badanych cytokin w etiopatogenezie osteoporozy, dlatego w niniejszej

pracy postanowiono określić rolę powiązań badanego ligandu z procesem osteoporozy pomenopauzalnej, gęstością kości i innymi parametrami osobowymi i klinicznymi.

Celem pracy było zbadanie częstości występowania polimorfizmu RANKL -643C/T ze szlaku cytokinowe-go RANK/RANKL/OPG w grupie kobiet po meno-pauzie. Analizie poddano związek badanych warian-tów genetycznych z zaawansowaniem zmian kostnych oraz parametrami obrotu kostnego, oceniono także znaczenie badanych polimorfizmów genetycznych w etiopatogenezie osteoporozy.

MATERIAŁ I METODY

Grupa badana

Badaniami objęto grupę 570 niespokrewnionych ko-biet populacji kaukaskiej w wieku pomenopauzalnym (404 kobiety) i rozrodczym (166 kobiet) zamieszkują-cych region Wielkopolski (woj. zachodniopomorskie i wielkopolskie), które zgłosiły się do Ginekologicz-no-Położniczego Szpitala Klinicznego Akademii Me-dycznej (GPSK AM) w Poznaniu w latach 2002– –2005. Grupa kobiet w wieku pomenopauzalnym obejmowała 268 kobiet z osteoporozą, 65 z osteopenia i 71 zdrowych. Wszystkie pacjentki poddano bada-niom densytometrycznym w Pracowni Densytometrii GPSK AM, w wyniku których oznaczono gęstość mineralną kości (bone mineral density – BMD) oraz parametry T-score i Z-score, porównano także wskaź-niki średniej BMD badanych za średnią BMD u mło-dych dorosłych kobiet (young adults – YA) oraz ze średnią dla danego wieku (age matched – AM). Dodatkowo dokonano pomiaru masy ciała i wzrostu w celu obliczenia wskaźnika masy ciała (body mass

index – BMI) według wzoru: masa ciała/wzrost.

Z każdą pacjentką przeprowadzono szczegółowy wy-wiad, dotyczący przebytych chorób, stosowanych le-ków, wieku wystąpienia pierwszej i ostatniej miesiącz-ki, liczby ciąż, masy urodzeniowej i palenia tytoniu. Do badań genetycznych zakwalifikowano kobiety, u których menopauza wystąpiła przynajmniej przed rokiem, i które nie stosowały terapii wpływającej na masę kostną, w tym takich leków, jak: selektywne modulatory receptora estrogenowego – SERM (selective estrogen-receptor mookulator) kalcytonina, bifosfoniany, heparyna, sterydy, hormony tarczycy, leki przeciwpadaczkowe, analogi GnRH

(gonadotro-pin-releasing hormone), tibolon, oraz nie poddały

się hormonalnej terapii zastępczej (HTZ). Z badań wykluczono pacjentki po zabiegu owariektomii obu-

stronnej, a także cierpiące na zaburzenia endokrynolo-giczne i metaboliczne, schorzenia hematoloendokrynolo-giczne, chorobę nowotworową, choroby nerek, schorzenia autoimmunologiczne, choroby tkanki łącznej, ze względu na możliwość ich wpływu na utratę masy kostnej. Dodatkowo zbadano grupę kobiet populacji kaukaskiej w wieku rozrodczym.

Od wszystkich pacjentek uzyskano zgodę na uczest-nictwo w badaniach, o których zakresie i celu zostały szczegółowo poinformowane. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Poznaniu nr 1415/03 (158/06).

Gęstość mineralna kości została oznaczona w odcinku lędźwiowym kręgosłupa od kręgu L2 do L4, za pomo-cą metody podwójnej absorpcjometrii rentgenowskiej (dual energy X-ray absorptiometry – DXA). Badania densytometryczne przeprowadzono aparatem LUNAR DPX 100 (Lunar Corporation, Madison, USA). Wyniki pomiarów BMD wyrażono w g/cm2 _i

przed-stawiono za pomocą wskaźników T-score i Z-score, które odnoszą się do wartości średnich dla BMD w danej grupie wiekowej. Za prawidłową przyjęto wartość pomiaru BMD metodą DEXA, mieszczącą się między jednym odchyleniem standardowym od średniej wiekowej w odniesieniu do szczytowej masy kostnej (T-score od +1 do −1).

Izolacja DNA

Badania genetyczne przeprowadzono w Zakładzie Badania Jakości Produktów Leczniczych i Suplemen-tów Diety Instytutu Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu oraz w Pracowni Farmakoge-netyki Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, w celu określenia częstości występowania i rozkładu po-szczególnych genotypów analizowanych polimorfi-zmów w grupie badanej i kontrolnej.

Materiałem biologicznym, z którego wyizolowano DNA, była krew obwodowa pobrana w ilości 5 ml z okolicy zgięcia łokciowego i umieszczona w pro-bówkach zawierających sól sodową etylenodiaminote-traoctanu (EDTA-salt). Przed etapem izolacji DNA materiał przechowywano w temperaturze -20°C. Do izolacji DNA wykorzystano komercyjnie dostępny zestaw „QIAamp DNA Blood Mini Kit” (Qiagen). Analizę ilościową i jakościową DNA przeprowadzono mierząc absorbancję na spektrofotometrze Eppendorf. Preparaty rozcieńczono wodą w proporcji 2 l DNA na 98 l wody, wytrząsano i odwirowano. Do kalibra-cji spektrofotometru wykorzystano 100 l wody. Od-czyt przeprowadzano przy trzech długościach fali elektromagnetycznej:

‒ 260 nm – maksimum absorpcji dla DNA, ‒ 280 nm – maksimum absorpcji dla białek,

‒ 320 nm – absorpcja dla drobin komórkowych (tzw. tło).

Do obliczeń posłużono się wartościami gęstości op-tycznej OD260 i OD280 po odjęciu wartości tła (OD320).

Przyjmuje się, że wartość OD260 równa jest 1 dla

dsDNA o stężeniu 50 g/ml, ssDNA o stężeniu 33 g/ml oraz dla RNA o stężeniu 40 g/ml. Stężenie DNA obliczano według wzoru:

Stężenie DNA [g/ml] = OD260 x 50 x R gdzie: R – krotność rozcieńczenia.

Wyznaczone wartości stężeń DNA mieściły się w gra-nicach 75–100 ng/l, przy wartościach współczynnika A260/A280 równych 1,7–2,0.

Jakość uzyskanego DNA sprawdzano techniką roz-działu elektroforetycznego w 0,8% żelu agarozowym w buforze TBE. W tym celu DNA w ilości 0,5 g po wcześniejszym zawieszeniu w końcowej objętości 10 1 i podaniu buforu obciążającego (3 1, 6 x SB – – sodium-borate) nanoszono na żel i rozdzielano elek-troforetycznie przy napięciu 5 V/cm przez około 30 minut. Zgodnie z wymogami procedury, efekt rozdziału obserwowano w świetle UV. DNA geno-mowy był widoczny jako pojedynczy prążek.

Reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR – polymerase chain reaction)

W pracy przeprowadzono reakcję PCR w celu powie-lenia badanych fragmentów sekwencji genu RANKL. Dla analizowanych fragmentów zaprojektowano od-powiednie pary starterów, które nie tworzyły we-wnętrznych sparowań, homodimerycznych czy hete-rodimerycznych struktur typu spinka do włosów. Specyficzność starterów sprawdzono za pomocą gramu do projektowania starterów OLIGO oraz pro-gramu BLAST.

Sekwencje starterów dla: RANKL -643C/T

F: 5’- GGA TGC TTG CTT CTG GCT AC - 3’ R: 5’- ACC CTT CCT GTC CAA CCT CT - 3’ Długość produktu amplifikacji: -246 pz

Reakcje PCR przeprowadzono w termocyklerze PTC- -200 (MJ Research, USA).

Produkty reakcji PCR analizowano poprzez elektrofo-rezę w 1,5% żelu agarozowym. W tym celu do 5 l produktu reakcji PCR dodano 3 l buforu obciążają-cego i prowadzono rozdział przy napięciu 70 V. Ja-kość produktów oceniano poprzez wizualizację w świetle UV, wykorzystując w tym celu system do-kumentacji i komputerowej analizy obrazu UVI- -KS4000/Image PC firmy Syngen Biotech Molecular Biology Instruments.

Analiza polimorfizmów techniką PCR-RFLP

Analiza długości fragmentów restrykcyjnych PCR- -RFLP (restriction fragments length polymorphisms –

Tabela I. Charakterystyka enzymu restrykcyjnego zastosowanego do badania polimorfizmu Table I. Characteristics of restriction enzymes used for studied polymorphism

Enzym

(polimorfizm) Charakterystyka miejsca hydrolizy Wielkości uzyskanych fragmentów restrykcyjnych badanego amplimeru

TscAI

enzym hydrolizuje, gdy występuje T TT (196 pz, 50pz) (TspRI) CT (246 pz, 196 pz, 50pz)

(RANKL -643T/C) nie hydrolizuje, gdy występuje C CC (246 pz)

– RFLP) pozwala wykryć różnice w sekwencji

pro-duktów PCR, polegające na obecności lub braku tzw. miejsca restrykcyjnego, rozpoznawanego przez endo-nukleazy restrykcyjne. Za pomocą techniki PCR- -RFLP analizowano polimorfizm RANKL -643C/T. Do analizy restrykcyjnej zastosowano enzym TscAI. Sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez wyko-rzystane enzymy oraz długości fragmentów DNA uzyskane w wyniku hydrolizy enzymatycznej umiesz-czono w tabeli I.

Produkt reakcji PCR (15 l) inkubowano w obecności enzymu restrykcyjnego i buforu przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Fragmenty DNA uzyskane po analizie restrykcyjnej analizowano podczas roz-działu elektroforetycznego w żelu agarozowym o stężeniu 2,75%, przy napięciu 70 V.

Analiza polimorfizmów techniką real-time PCR

Analiza polimorfizmu genu RANKL została wykonana techniką real-time PCR. W tym celu posłużono się sondami hybrydyzacyjnych (HybProbe), aparatem LightCycler® 480 przeznaczonym do wykonania szybkiej i precyzyjnej łańcuchowej reakcji polimerazy oraz oprogramowaniem LightCycler® 480 Basic So-ftwar do analizy wyników. Do genotypowania, czyli wykrywania pojedynczo-nukleotydowych polimorfi-zmów badanych genów, wykorzystano pomiary fluo-rescencji dokonywane w trakcie analizy krzywej top-nienia po PCR.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną wyników uzyskanych w pracy przeprowadzono za pomocą programu SPSS 17.0 PL dla Windows. W bazie danych zgromadzono parame-try kliniczne pacjentek, częstości występowania po-szczególnych genotypów i alleli badanych polimorfi-zmów.

Częstości genotypów obserwowane w niniejszej pracy porównano z wartościami oczekiwanymi dla rozkładu genotypów w stanie równowagi Hardy’ego-Wein-berga za pomocą testu chi-kwadrat (χ2). Posługiwano się wzorem p2

+ 2pq + q2 = 1. Wyniki zostały podane z 95% przedziałem ufności (95% PU).

Zbadano wpływ badanych polimorfizmów na wartości wskaźników T-score, Z-score, L2–L4 AM, L2– –L4 YA, L2–L4 BMD, BMI oraz innych parametrów

klinicznych, przedstawionych za pomocą średniej arytmetycznej, odchylenia standardowego oraz błędu standardowego średniej. W tym celu zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA. Przyjęto wystąpienie istotności statystycznej dla p < 0,05.

WYNIKI

W tabelach II–IV zamieszczono dane dotyczące czę-stości występowania badanego polimorfizmu (C- -643T) genu kodującego ligand RANK (RANKL) w grupach kobiet zakwalifikowanych do badań. Częstość występowania homozygotycznych genoty-pów CC i TT oraz heterozygotycznego CT w polimor-fizmie -643C/T (C-643T) genu RANKL była porów-nywalna:

‒ u kobiet z osteoporozą oraz bez osteoporozy (ko-biety z osteopenią i zdrowe po menopauzie; tab. II), w obu tych grupach częstszy był heterozy-gotyczny genotyp CT;

‒ u kobiet z osteoporozą oraz u kobiet zdrowych po menopauzie, nie zaobserwowano między nimi różnic istotnych statystycznie, w obu grupach wy-raźnie częstszy był heterozygotyczny genotyp CT (tab. II i III);

‒ u kobiet z osteoporozą oraz u kobiet zdrowych w wieku reprodukcyjnym, nie zaobserwowano między nimi różnic istotnych statystycznie, w obu grupach wyraźnie częstszy był heterozygotyczny genotyp CT (tab. II i IV);

Częstość występowania homozygotycznych genoty-pów CC oraz TT w polimorfizmie -643C/T (C-643T) genu RANKL była porównywalna:

‒ u kobiet z osteopenią oraz u kobiet zdrowych po menopauzie, nie obserwowano między nimi różnic statystycznie znamiennych (tab. III), w przypadku heterozygoty CT ujawniono nieco częstszą obecność tego genotypu u kobiet zdro-wych, w obu badanych grupach kobiet częstszy był heterozygotyczny genotyp CT;

‒ u kobiet z osteopenią oraz u kobiet zdrowych w wieku rozrodczym (tab. III i IV), w obu grupach częstszy był heterozygotyczny genotyp CT. Częstość występowania homozygotycznych genoty-pów CC i TT oraz heterozygotycznego CT w

polimor-fizmie -643C/T (C-643T) genu RANKL była porów-nywalna:

‒ u kobiet z osteoporozą oraz u kobiet z osteopenią (tab. II i III), w obu grupach heterozygotyczny ge-notyp CT wykrywano częściej niż oba pozostałe genotypy;

‒ w grupie badawczej (łącznie kobiety z osteopenią i z osteoporozą) oraz w grupie kobiet zdrowych po menopauzie (tab. III i IV), w obu grupach czę-ściej stwierdzano heterozygotyczny genotyp CT.

‒ w grupie badawczej (łącznie kobiety z osteopenią i z osteoporozą) oraz w grupie kobiet zdrowych w wieku rozrodczym (tab. IV), nie stwierdzono między nimi różnic znamiennie statystycznych, w grupach tych wyraźnie częstszy był heterozygo-tyczny genotyp CT.

‒ w grupie kobiet zdrowych po menopauzie i w grupie kobiet w wieku reprodukcyjnym (tab. III, IV), w obu grupach heterozygotyczny ge-notyp CT był częstszy niż oba pozostałe gege-notypy.

Tabela II. Częstość występowania genotypów polimorfizmu RANKL -643C/T u kobiet z osteoporozą i bez osteoporozy (z osteopenią i zdrowe) Table II. Frequency of occurance of RANKL -643C/T genotype polymorphism in women with osteoporosis and without osteoporosis (with osteopenia

and healthy ones)

Genotyp RANKL

Kobiety z osteoporozą Kobiety bez osteoporozy wartość obserwowana n (%) wartość oczekiwana (%) 95% PU wartość obserwowana n (%) wartość oczekiwana (%) 95% PU CC 40 (18,5) 22,3 20,0–27,3 19 (17,5) 21,5 20,8–32,2 CT 123 (56,9) 49,8 45,3–63,6 61 (57,2) 49,7 50,8–67,6 TT 53 (24,6) 27,9 15,5–21,1 27 (25,3) 28,8 16,6–18,9 Razem 216 (100) 100 107 (100) 100

Tabela III. Częstość występowania genotypów polimorfizmu RANKL -643C/T u kobiet z osteopenią i zdrowych po menopauzie Table III. Frequency of occurrance of RANKL -643C/T genotype polymorphism in women with osteopenia and healthy after menopause

Genotyp RANKL

Kobiety z osteopenią Kobiety zdrowe wartość obserwowana n (%) wartość oczekiwana (%) 95% PU wartość obserwowana n (%) wartość oczekiwana (%) 95% PU CC 10 (20,1) 21,6 15,8–24,7 7 (14,8) 21,3 18,6–31,2 CT 27 (53,2) 49,7 47,9–64,2 30 (62,8) 49,7 56,0–73,3 TT 14 (26,7) 28,7 21,5–35,0 11 (22,4) 29,0 10,4–17,9 Razem 51 (100) 100 48 (100) 100

Tabela IV. Częstość występowania genotypów polimorfizmu RANKL -643C/T u kobiet z osteoporozą i osteopenią oraz kobiet w wieku rozrodczym Table IV. Frequency of occurance of RANKL -643C/T genotype polymorphism in women with osteoporosis and osteopenia and healthy

in reproductive age

Genotyp RANKL

Osteoporoza z osteopenią Kobiety w wieku rozrodczym wartość obserwowana n (%) wartość oczekiwana (%) 95% PU wartość obserwowana n (%) wartość oczekiwana (%) 95% PU CC 55 (17,9) 22,1 18,9–28,2 29 (19,3) 22,0 19,8–29,3 CT 176 (56,7) 49,8 54,5–69,0 87 (58,0) 49,8 44,4–65,2 TT 78 (25,4) 28,1 12,0–20,3 34 (22,7) 28,2 12,8–27,6 Razem 309 (100) 100 150 (100) 100 DYSKUSJA

Prawidłowy stan szkieletu po zakończeniu jego wzro-stu utrzymuje się dzięki sprzężonym procesom resorp-cji i tworzenia kości, nazywanym ich remodelowa-niem [16]. Różne choroby, leki i anomalie metabo-liczne naruszają stan zdrowotny kości, przyczyniając się do rozwoju osteoporozy. Istotnym czynnikiem

w patogenezie utraty masy kostnej oraz złamań jest aktywacja osteoklastycznej resorpcji kości [17]. Ma wówczas miejsce względnie szybka utrata kości z towarzyszącą destrukcją mikroarchitektury tkanki kostnej [18].

Analizy molekularne osteoporozy należą do najbar-dziej dynamicznie rozwijających się obszarów badań związanych z biologią kości. Znane są zarówno donie-sienia, w których określa się rolę czynników

gene-tycznych wpływających na powstawanie osteoporozy, jak i strategie poszukiwania genów odpowiedzialnych za to schorzenie. W dwudziestym wieku – na podsta-wie podsta-wielu badań z zakresu genetyki molekularnej kości oraz dzięki zastosowaniu statystycznej genetyki w identyfikowaniu genów dotyczących cech złożo-nych – opisano metody poszukiwania genu(ów) po-wiązanych z osteoporozą.

Badania nad osteoporozą to klasyczny przykład wyko-rzystania metod molekularnych do identyfikowania polimorfizmów genów, które byłyby związane z roz-wojem osteopenii i osteoporozy. Analiza zmienności „genów kandydujących” w populacjach ludzkich opiera się na identyfikacji polimorfizmów SNP, które oznaczają równoczesne występowanie w danej popu-lacji różnych form allelicznych danego genotypu ana-lizowanego genu.

Mezenchymalne komórki zrębu pełnią ważną rolę w różnicowaniu osteoklastów i ścisłej interakcji z prekursorami hematopoetycznymi [19]. Komórki zrębu i dojrzałe osteoblasty uwalniają cytokiny oraz czynniki wzrostu, niezbędne do rozpoczęcia i wspar-cia różnicowania osteoklastu. Błonowy czynnik sty-mulujący kolonie makrofagów (M-CSF) oraz roz-puszczalny RANKL są niezbędne do indukcji osteo-klastogenezy [20].

Skoro główną rolą RANKL jest regulowanie metabo-lizmu kości przez kontrolowanie rozwoju osteokla-stów, to większość badań polimorfizmu genu RANKL skupia się na związku między genetyczną wariacją RANKL i chorobami kości, takimi jak osteoporoza. RANKL eksponowany na powierzchni komórek preosteoblastycznych wiąże się z RANK na komór-kach prekursora osteoblastów. Ligand RANK jest niezmiernie ważny dla różnicowania, a następnie fuzji do komórek wielojądrzastych, a także do aktywacji i przeżycia komórek osteoblastycznych. Zdolność preosteoblastycznych komórek do podtrzymywania rozwoju osteoklastów jest silnie zaburzona podczas różnicowania osteoblastu, głównie z powodu down

regulation ze strony RANKL [21]. Należy pamiętać,

że osteoblasty produkują OPG, która jest receptorem wabikowym dla RANKL.

W niniejszej pracy analizowano związek polimorfi-zmów z patomechanizmem osteoporozy na podstawie rozkładu częstości poszczególnych genotypów w celu znalezienia genotypu, który mógłby warunkować wystąpienie choroby kości. Oceniono również wpływ częstości badanych polimorfizmów na określone pa-rametry osobiste i kliniczne u kobiet w wieku pome-nopauzalnym.

Jedną z przyczyn osteoporozy są zaburzenia w meta-bolizmie kostnym, które podlegają regulacji przez trzy peptydy, tj. RANK, RANKL oraz OPG, tworzące szlak sygnałowy RANK/RANKL/OPG. Poznanie polimorfizmów genetycznych wymienionych genów – – traktowanych jako kandydujące – może ułatwić

zrozumienie mechanizmu powstawania choroby kości, a przez to umożliwić wczesne diagnozowanie i sku-teczne leczenie.

Porównując częstość polimorfizmu RANKL C-643T w grupie pacjentek z osteoporozą i w grupie kobiet o prawidłowych wartościach T-score z parametrami kostnymi nie wykazano jego istotnego związku z wy-stąpieniem choroby. Nie zaobserwowano także wpły-wu badanego polimorfizmu na BMD.

W grupie kobiet o prawidłowych wartościach T-score zaobserwowano istotne statystycznie zależności mię-dzy genotypem a niektórymi parametrami kliniczny-mi. W przypadku polimorfizmu RANKL C-643T wy-kazano istotną statystycznie zależność między po-szczególnymi genotypami a masą ciała oraz BMI w grupie kobiet z osteoporozą. Kobiety o genotypie CC cechowała niższa masa ciała oraz niższe wartości wskaźnika masy ciała BMI.

W badaniu polimorfizmu RANKL C-643T stwierdzo-no częstsze występowanie gestwierdzo-notypu TT oraz niższą frekwencję genotypu CT zarówno w grupie kobiet chorych na osteoporozę w porównaniu z kobietami zdrowymi w wieku pomenopauzalnym, jak i zestawia-jąc łącznie grupę kobiet chorych na osteopenię i osteoporozę z grupą o prawidłowych wartościach

T-score. Ponadto porównując częstości genotypów TT

i CT w grupie pacjentek ze zdiagnozowaną osteopenią oraz w grupie kobiet w wieku rozrodczym nie zano-towano znaczących różnic, przy czym nadal u chorych kobiet po menopauzie genotyp TT był częstszy, a heterozygota CT rzadsza. W wyniku analizy często-ści występowania alleli zaobserwowano, że allel T pojawiał się częściej zarówno w grupie kobiet z osteoporozą, jak i ogólnie w grupie pacjentek z T-score < −1 w porównaniu z osobami, u których wartości tego współczynnika były prawidłowe. W ze-stawieniu grupy osób chorych po menopauzie (T-score < −1) z grupą kontrolną w wieku reproduk-cyjnym allel T również był częstszy.

Przegląd danych literaturowych pozwala wnioskować, że nie ma jednoznacznych wyników opisujących wpływ badanych polimorfizmów RANKL na BMD i ewentualne wystąpienie osteoporozy. Uzyskany w pracy rozkład częstości genotypów polimorfizmu

RANKL C-643T jest jednak analogiczny z rozkładem

uzyskanym w badaniach innych populacji kaukaskich [22,23,24].

Godne uwagi są słoweńskie badania kobiet po meno-pauzie [23], w których również nie zanotowano związku między BMD w odcinku lędźwiowym kręgo-słupa oraz biodra a polimorfizmem C-643T. Zanoto-wano jednak wyższą wartość BMD szyjki kości udo-wej w przypadku genotypu TT w porównaniu z geno-typem CC. Grupa słoweńska oprócz polimorfizmu RANKL C-643T analizowała również polimorfizmy C-290T, G-693C i G-1594A w rejonie promotorowym genu RANKL. W przypadku polimorfizmu C-290T

obserwowano jego związek z BMD szyjki kości udo-wej. Genotyp CC tego polimorfizmu badacze wiązali z niższą wartością BMD w porównaniu z genotypem TT. Natomiast istotne zmiany w BMD szyjki kości udowej i stawu biodrowego zarejestrowali w przypad-ku polimorfizmu G-693C w grupie kobiet po meno-pauzie, które nie stosowały terapii i zabiegów modyfi-kujących masę kości. Wyniki te sugerują, że genotypy TT z polimorfizmu RANKL C-290T i C-643T oraz genotyp CC polimorfizmu G-693C mogą wiązać się z większym tempem utraty masy kostnej [23].

Porównanie wyników badań populacji polskiej oraz słoweńskiej [22,25] wykazuje u kobiet słoweńskich w wieku pomenopauzalnym z osteopenią lub osteopo-rozą tendencję do częstszego niż u kobiet zdrowych po menopauzie występowania homozygoty TT. Porównanie wyników badań polskiej populacji uzy-skanych w niniejszej pracy z rozkładem genotypów w populacji słoweńskiej [25] wskazują na większe u pacjentek słoweńskich różnice w częstości genotypu RANKL TT między grupami z osteopenią i/lub osteo-porozą po menopauzie a kobietami w wieku rozrod-czym. Z kolei w populacji polskiej zanotowano więk-sze różnice w częstości genotypu TT między grupą

kobiet z osteopenią a grupą kobiet zdrowych w wieku pomenopauzalnym [25].

Wpływ polimorfizmów RANKL na metabolizm kost-ny, BMD oraz częstość występowania złamań u kobiet po menopauzie badali również autorzy węgierscy. Przedmiotem analizy było kilka polimorfizmów li-gandu RANK, w tym polimorfizm rs9533156 (C- -643T). Wszystkie badane genotypy SNP były w sta-nie równowagi Hardy-Weinberga i wykazały korelację z BMD. W niniejszej pracy potwierdzono doniesienia Mencej i wsp. [22,23] o związku polimorfizmu C- -643T genu RANKL z BMD biodra oraz odcinka lędźwiowego kręgosłupa, co obserwowano w badaniu węgierskim [24].

Dong i wsp. [26] przebadali amerykańską populację białych kobiet w USA w celu określenia powiązań szlaku RANKL/RANK/OPG ze wskaźnikiem kom-presji kości udowej, który jest parametrem integrują-cym gęstość i masę kości oraz szerokość szyjki kości udowej, a także pomagającym w ocenie ryzyka zła-mań biodra. Znaleziono trzy polimorfizmy genu RANKL istotnie związane z ryzykiem wystąpienia złamania stawu biodrowego. Badania te sugerują, że polimorfizmy genu RANKL mogą podwyższać ryzyko złamania biodra [26].

PIŚM IEN NI CT WO

1. Ralston S.H. Genetics of osteoporosis. Proc. Nutr. Soc. 2007; 66: 158–165.

2. Eghbali-Fatourechi G., Khosla S., Sanyal A., Boyle W.J., Lacey D.L., Riggs B.L. Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women. J. Clin. Invest. 2003; 111: 1221–1230.

3. Takahashi N., Udagawa N., Suda T. A new member of tumor necrosis factor ligand family, ODF/OPGL/TRANCE/RANKL, regulates osteoclast differentiation and function. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 256: 449–455.

4. Lacey D.L., Tan H.L., Lu J., Kaufman S. et al. Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in vitro and in vivo. Am. J. Pathol. 2000; 157: 435–448.

5. Chen X.W., Garner S.C., Anderson J.J. Isoflavones regulate interleukin-6 and osteoprotegerin synthesis during osteoblast cell differentiation via an estrogen-receptor-dependent pathway. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 295: 417–422.

6. Bord S., Ireland D.C., Beavan S.R., Compston J.E. The effects of estrogen on osteoprotegerin, RANKL, and estrogen receptor expression in human osteoblasts. Bone 2003; 32: 136–141.

7. Fleurence R.L., Iglesias C.P., Johnson J.M. The cost effectiveness of bisphosphonates for the prevention and treatment of osteoporosis: a structured review of the literature. Pharmacoeconomics 2007; 25: 913–933.

8. Boonen S., McClung M.R., Eastell R., El-Hajj Fuleihan G., Barton I.P., Delmas P. Safety and efficacy of risedronate in reducing fracture risk in osteoporotic women aged 80 and older: implications for the use of antiresorp-tive agents in the old and oldest old. J. Am. Geriatr. Soc. 2004; 52: 1832–1839.

9. Fili S., Karalaki M., Schaller B. Therapeutic implications of osteopro-tegerin. Cancer Cell Int. 2009; 12: 9–26.

10. Brown J.M., Zhang J., Keller E.T. OPG, RANKL, and RANK in cancer

metastasis: Expression and regulation. Cancer Treat. Res. 2004; 118: 149–172.

11. Ikeda T., Kasai M., Utsuyama M., Hirokawa K. Determination of three

isoforms of the receptor activator of nuclear factor B ligand and their differential expression in bone and thymus. Endocrinology 2001; 142: 1419–1426.

12. Suzuki J., Ikeda T., Kuroyama H. et al. Regulation of osteoclastogenesis

by three human RANKL isoforms expressed in NIH3T3 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 314: 1021–1027.

13. Ikeda T., Kasai M., Suzuki J. et al. Multimerization of the receptor

activator of nuclear factor-B ligand (RANKL) isoforms and regulation of osteoclastogenesis. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47217–47222.

14. Feng X. RANKing intracellular signaling in osteoclasts. IUBMB Life

2005; 57: 389–395.

15. Blair J.M., Zhou H., Seibel M.J., Dunstan C.R. Mechanisms of disease:

Roles of OPG, RANKL and RANK in the pathophysiology of skeletal metastasis. Nat. Clin. Pract. Oncol. 2006; 3: 41–49.

16. Raisz L.G. Pathogenesis of osteoporosis: concepts, conflicts, and

pro-spects. J. Clin. Invest. 2005; 115: 3318–3325.

17. Robbins J.A., Schott A.M., Garnero P., Delmas P.D., Hans D., Meunier

P.J. Risk factors for hip fracture in women with high BMD: EPIDOS study. Osteoporos. Int. 2005; 16: 149–154.

18. Dufresne T.E., Chmielewski P.A., Manhart M.D., Johnson T.D., Borah

B. Risedronate preserves bone architecture in early postmenopausal women in 1 year as measured by three-dimensional microcomputed tomography. Calcif. Tissue. Int. 2003; 73: 423–432.

19. Lyritis G.P., Georgoulas T., Zafeiris C.P. Bone anabolic versus bone

anticatabolic treatment of postmenopausal osteoporosis. Ann. NY Acad. Sci. 2010; 1205: 277–283.

20. Hodge J.M., Kirkland M.A., Nicholson G.C. Multiple roles

of M-CSF in human osteoclastogenesis. J. Cell. Biochem. 2007; 102: 759– –768.

21. Gori F., Hofbauer L.C., Dunstan C.R., Spelsberg T.C., Khosla S., Riggs

B.L. The expression of osteoprotegerin and RANK ligand and the support of osteoclast formation by stromal-osteoblast lineage cells is developmentally regulated. Endocrinology 2000; 141: 4768–4776.

22. Mencej S., Albagha O.M., Prezelj J., Kocjan T., Marc J. Tumour

necro-sis factor superfamily member 11 gene promoter polymorphisms modulate promoter activity and influence bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis. Mol. Endocrinol. 2008; 40: 273–279.

23. Mencej S., Prezelj J., Kocijancic A., Ostanek B., Marc J. Association

of NFSF11 gene promoter polymorphisms with bone mineral density in postmenopausal women. Maturitas 2006; 55: 219–226.

24. Takacs I., Lazary A., Kosa J.P. et al. Allelic variations of RANKL/OPG

signaling system are related to bone mineral density and in vivo gene expres-sion. Eur. J. Endocrinol. 2010; 162: 423–431.

25. Mencej-Bedrac S., Prezelj J., Kocjan T. et al. The combinations

of polymorphisms in vitamin D receptor, osteoprotegerin and tumour necrosis factor superfamily member 11 genes are associated with bone mineral densi-ty. J. Mol. Endocrinol. 2009; 42: 239–247.

26. Dong S.S., Liu X.G., Chen Y. et al. Association analyses of

RANKL/RANK/OPG gene polymorphisms with femoral neck compression strength index variation in Caucasians. Calcif. Tissue Int. 2009; 85: 104–112.